Влияние дихлорацетата натрия как отдельного препарата, так и в составе комбинированной терапии на рост и метастазирование опухолей легких
Айя Аль-Азави
1, Шахразада Сулейман
1, Холуд Арафат
1, Джавед Ясин 2
, Абдеррахим Неммар 3,4
и Самир Аттуб 1,4,5,*
- Кафедра фармакологии и терапии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных
Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; 201870001@uaeu.ac.ae (AA-A.); sharazadjeffy@uaeu.ac.ae (SS); kholoud.arafat@uaeu.ac.ae (KA)
- Кафедра медицины, Колледж медицины и медицинских наук, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; yasin@uaeu.ac.ae Кафедра
- физиологии, Колледж медицины и медицинских наук, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; anemmar@uaeu.ac.ae Центр
- медицинских наук имени Заида, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские
- Эмираты Национальный институт здравоохранения и медицинских исследований (INSERM), 75013 Париж,
Франция * Адрес для корреспонденции: samir.attoub@uaeu.ac.ae
Комбинированная терапия легких Рост опухоли и метастазы. Int. J. Молекулярные науки 2021, 22, 12553. https:// doi.org/10.3390/ijms222212553
Получено: 24 октября 2021 г.
Принято: 17 ноября 2021 г.
Опубликовано: 21 ноября 2021 г.
Аннотация: Метаболическое перепрограммирование признано важнейшим признаком нового рака. Сообщалось, что дихлорацетат (DCA), ингибитор киназы пируватдегидрогеназы (PDK), обладает противораковыми эффектами, обращая вспять гликолиз, связанный с опухолью. Это исследование было проведено с целью изучения противоракового потенциала DCA при раке легких как отдельно, так и в сочетании с химиотерапией и таргетной терапией с использованием двух клеточных линий немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), а именно A549 и LNM35.
DCA заметно вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности и роста колоний клеток A549 и LNM35 in vitro. DCA также снижал рост опухолевых ксенотрансплантатов как в хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, так и в моделях голых мышей in vivo. Кроме того, DCA снижал ангиогенную способность эндотелиальных клеток пупочной вены человека in vitro. С другой стороны, DCA не ингибировал клеточную миграцию и инвазию in vitro , а также заболеваемость и рост метастазов подмышечных лимфатических узлов in vivo у голых мышей. Лечение DCA не показало никакой токсичности у куриных эмбрионов и голых мышей. Наконец, мы продемонстрировали, что DCA значительно усиливал противораковый эффект цисплатина в LNM35. Кроме того, сочетание DCA с гефитинибом или эрлотинибом приводит к аддитивным эффектам на ингибирование роста колоний LNM35 после семи дней лечения и к синергетическим эффектам на ингибирование роста колоний A549 после 14 дней лечения. В совокупности это исследование демонстрирует, что DCA является безопасным и перспективным терапевтическим средством для лечения рака легких.
Рак легких является вторым по частоте встречаемости видом рака с самым высоким уровнем смертности в мире, составив 2,2 миллиона случаев и 1,8 миллиона смертей в 2020 году. Прогнозируется, что заболеваемость и смертность продолжат расти примерно на 60%, до предполагаемых 3,6 миллиона и 3 миллионов соответственно в 2040 году [1]. Большинство случаев рака легких — это НМРЛ, на которые приходится 80–85% всех случаев рака легких [2]. Развитие таргетной и иммунотерапии произвело революцию в лечении НМРЛ. Однако побочные эффекты, резистентность и эффективность в небольшой терапевтически чувствительной группе пациентов создают неравенство в доступе к таким агентам [3–5]. Таким образом, это подчеркивает необходимость более безопасных и эффективных агентов. Метаболическое перепрограммирование является одним из признаков рака, который является многообещающей целью для разработки эффективных терапевтических подходов [6]. По сравнению с
Нормальные клетки, которые в основном полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) в аэробных условиях, раковые клетки отклоняются от этого нормального метаболического фенотипа, полагаясь в основном на цитозольный гликолиз и молочную ферментацию, даже в присутствии кислорода, чтобы удовлетворить потребности высокой пролиферации [7]. Это явление известно как эффект Варбурга, который использовался в качестве терапевтической мишени для подавления роста опухоли PDK входит в число основных ферментов, контролирующих гликолиз и OXPHOS [9]. Он отключает митохондриальный OXPHOS, фосфорилируя и ингибируя пируватдегидрогеназу (PDH), ключевой фермент, катализирующий окислительное превращение пирувата в ацетилкофермент А в митохондриях [10]. DCA — это препарат с небольшой молекулярной массой, который использовался при лактоацидозе, врожденных митохондриальных дефектах и диабете [11]. Интересно, что DCA продемонстрировал способность переключать метаболизм опухоли с цитозольного аэробного гликолиза на митохондриальный OXPHOS путем ингибирования PDK и повышения активности PDH [12]. Следовательно, сообщалось, что DCA оказывает противораковое действие за счет увеличения оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, а также повышения уровня ROS с последующей гибелью раковых клеток [11,13 15]. Однако в клинических исследованиях профиль безопасности DCA вызывал беспокойство. Тем не менее, Гарон и др. (2014), которые провели клиническое исследование с DCA на пациентах с раком легких, пришли к выводу, что: «в отсутствие более крупного контролируемого исследования четкие выводы относительно связи между неблагоприятными событиями у пациента и DCA неясны». Они рекомендовали рассматривать DCA с химиотерапией на основе платины при гипоксических опухолях, а не как единственный агент при распространенном немелкоклеточном раке легких [16]. Считается, что DCA является мощной молекулой , которая требует дальнейшего изучения ее противоракового потенциала при НМРЛ. Целью данного исследования было изучение влияния DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ, рост колоний, миграцию и инвазию клеток in vitro, а также на рост опухоли, метастазирование и токсичность in vivo. Кроме того, непосредственное влияние DCA на ангиогенез оценивалось in vitro. Кроме того, мы исследовали влияние DCA в комбинированной терапии с химиотерапией и первым поколением ингибиторов тирозинкиназы EGFR (EGFR-TKi). 2. Результаты 2.1 Влияние DCA на жизнеспособность клеток и рост колоний линий клеток НМРЛ Эффект увеличения концентрации DCA (3,125–100 мМ) был исследован на двух линиях клеток NSCLC, а именно A549 и LNM35. Как показано на рисунке 1, DCA снижал жизнеспособность A549 (рисунок 1A) и LNM35 (рисунок 1B) в зависимости от концентрации и времени. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC50) DCA через 48 ч составляет приблизительно 25 мМ для обеих линий клеток. Для дальнейшей оценки противоракового эффекта DCA было исследовано его влияние на рост предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. Для этого обе клеточные линии выращивали при определенной плотности в течение 1 недели для формирования колоний, а затем обрабатывали возрастающей концентрацией DCA в течение 1 недели. Как показано на рисунке 1, DCA вызывал зависимое от концентрации сокращение числа колоний для обеих клеточных линий, с более высокой чувствительностью, показанной в колониях LNM35 (рисунок 1D,E) по сравнению с колониями A549 (рисунок 1C,E). Эти результаты подтверждают противораковый эффект DCA in vitro
Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие A549 (A) и LNM35 (B)
Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие раковые клетки A549 (A) и LNM35
(B) инкубировали в отсутствие или в присутствии увеличивающихся концентраций DCA (3,125–100 мМ) в течение 24, 48 и 72 ч. Жизнеспособность клеток оценивали, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее трех раз. Формы представляют средние значения, столбцы представляют SEM. Раковые клетки A549 (C) и LNM35 (D) выращивали в течение 7 дней для формирования колоний, которые обрабатывали различными концентрациями DCA (6,25–50 мМ) в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». (E) Репрезентативные фотографии контрольных и обработанных DCA колоний показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Результаты представлены в виде процента колоний (среднее значение ± SEM) обработанных клеток по сравнению с контролем. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.
- Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухоли НМРЛ в курином эмбрионе CAM и голых мышах in vivo
Для подтверждения фармакологической значимости наших результатов in vitro противораковый эффект DCA оценивали in vivo с использованием анализа CAM куриного эмбриона.
Ксенотрансплантированные опухоли A549 и LNM35 на CAM обрабатывали 50 мМ DCA каждые 48 ч в течение 1 На E17 опухоли были извлечены из верхней части CAM и взвешены. Как показано на рисунке 2, 50 мМ
DCA значительно снизили рост ксенотрансплантатов опухоли A549 примерно на 40% (рисунок 2A), в то время как не показали значительного снижения роста ксенотрансплантатов опухоли LNM35 (рисунок 2B). Поэтому 100 мМ DCA были исследованы на ксенотрансплантатах опухоли LNM35, и они значительно снизили рост примерно на 40% (рисунок 2C). Токсичность также оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах. На E17 DCA не показал цитотоксичности, поскольку процент живых эмбрионов был схож с контрольной и обработанной DCA (рисунок 2D–F).
Рисунок 2. Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухолей A549 и LNM35 в CAM куриного эмбриона in vivo. (A)
Масса опухоли раковых клеток A549, ксенотрансплантированных на CAM с плотностью 1 миллион клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ) в течение 1 недели. (B, C) Масса опухоли раковых клеток LNM35, ксенотрансплантированных на CAM с плотностью 0,3 миллиона клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ и 100 мМ). (D) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах A549. (E, F) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах LNM35. Столбцы — средние значения; полосы — SEM *** Значительно отличается при <0,001. **** Значительно отличается при <0,0001. ns — незначимо.
Влияние DCA на опухолевые ксенотрансплантаты также оценивалось in vivo с использованием бестимусных мышей, инокулированных клетками A549 и LNM35. Сообщалось, что средние летальные дозы (LD50) DCA составляли 4,5 г/кг и 5,5 г/кг у крыс и мышей соответственно [17]. Поэтому мыши с опухолевыми ксенотрансплантатами A549 получали перорально ежедневно (5 дней в неделю) 50 мг/кг и 200 мг/кг DCA в течение 38 последовательных дней. Лечение DCA (50 мг/кг) не вызвало значительного уменьшения объема опухолевых ксенотрансплантатов A549, в то время как DCA (200 мг/кг) значительно
уменьшил объем примерно на 45% (рисунок 3A). Аналогичная разница наблюдалась также в весе опух Не было выявлено никаких явных признаков токсичности или каких-либо проявлений нежелательного воздействия DCA на поведение животных, массу тела (рисунок 3C), компоненты крови, функцию
печени и почек (рисунок 3D).
Рисунок 3. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата A549, привитого голым мышам in vivo. (A) Объем опухоли ксенотрансплантата A549, привитого подкожно голым мышам и леченного DCA (50 и 200 мг/кг) перорально или только контрольным раствором- носителем в течение 38 дней. (B) Вес опухоли, полученный от тех же контрольных и обработанных DCA голых мышей. (C) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. (D) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции
печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. * Значительно отличается при <0,05.
** Значимое различие при <0,01. ns — несущественно.
С другой стороны, наблюдался рост ксенотрансплантатов опухоли LNM35, и мыши получали перорально 200 мг/кг и 500 мг/кг DCA каждый день (5 дней в неделю) в течение 10 и 24 дней соответственно. Лечение DCA (200 мг/кг) вызвало незначительное уменьшение объема ксенотрансплантатов опухоли LNM35 (рисунок 4A), в то время как DCA (500 мг/кг) значительно уменьшил объем опухоли почти на 75% (рисунок 4B). Почти такие же различия были замечены в весе опухоли в конце экспериментов (рисунок 4C). Никаких признаков токсичности не наблюдалось в поведении животных или не было обнаружено по весу мышей (рисунок 4D,E), компонентам крови, печени и функции почек (рисунок 4F)
Рисунок 4. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата LNM35, привитого голым мышам in vivo. (A, B) Объем опухоли ксенотрансплантата LNM35, привитого подкожно голым мышам и обработанного соответственно DCA (200 и 500 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем ежедневно в течение 10 и 24 дней. (C) Вес опухоли, полученный от контрольных и голых мышей, получавших DCA в дозе 500 мг/кг. (D, E) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. (F) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение
± SEM для 9–11 мышей/группу. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при
<0,001. ns — статистически незначимо.
- Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур и прорастание HUVEC in vitro
Ангиогенез является одним из признаков рака, который обеспечивает поставку питательных веществ и кислорода для роста и распространения раковых клеток. Влияние DCA на ангиогенез было исследовано in vitro с использованием HUVEC, которые могут образовывать капилляроподобные структуры при засевании
на Матригель. Как показано на рисунке 5A, HUVEC образовали организованные капилляроподобные структуры
структуры в отсутствие DCA, и эта организация была нарушена после добавления DCA.
Длины трубок измеряли вручную (рисунок 5B) и с помощью анализа изображений Wimasis (рисунок 5C), и было обнаружено, что 25 мМ DCA способны значительно ингибировать способность HUVEC формировать нитевидные структуры примерно на 30–40%. Это ингибирование наблюдалось при концентрациях
Рисунок 5. Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур HUVEC in vitro. (A) Формы ангиогенеза , индуцированные в HUVEC, культивируемых на матрице Matrigel в 96-луночном планшете в отсутствие и в присутствии различных концентраций DCA. Для контрастной фотографии использовался инвертированный микроскоп (4×) , а для уточнения изображений использовалось программное обеспечение Wimasis. (B,C) Количественная оценка тубулярного ангиогенеза, индуцированного в клетках HUVEC, культивируемых в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–
25 мМ) вручную и с использованием программного обеспечения Wimasis соответственно. (D) Жизнеспособность клеток HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы», в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ). Эксперименты повторяли не менее 3 раз.
Столбцы представляют средние значения; полосы представляют SEM *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.
В анализе прорастания сфероиды HUVECs были встроены в 3D коллагеновую матрицу в присутствии и отсутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или комбинации VEGF и DCA. Рисунок 6A показывает в репрезентативном эксперименте, что проростки, образованные в
присутствии VEGF, были ингибированы DCA, 25 мМ. Были измерены общие длины проростков, и было обнаружено, что общая длина была значительно увеличена в присутствии VEGF, а
DCA значительно уменьшил длину проростков, индуцированных VEGF (Рисунок 6B). Это ингибирование наблюдалось при концентрации, которая не показала никакого снижения жизнеспособности HUVECs (Рисунок 6C).
Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование ангиогенеза в опухолях может быть потенциальным механизмом, выходящим за рамки противоракового действия DCA.
Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков встроенными сфероидами HUVECs in vitro. (A) Представитель Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков встроенными сфероидами HUVECs in vitro. (A) Представительные изображения предварительно окрашенных
сфероидов HUVEC через 24 часа после встраивания в коллагеновую матрицу в присутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или VEGF + DCA. Использовался инвертированный микроскоп с 20-кратным увеличением. (B) Среднее значение общей длины ростков различных сфероидов для каждого условия из одного представительного эксперимента. (C) Жизнеспособность HUVECs определялась, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты были повторены 2 раза. Столбцы представляют средние значения 12 сфероидов; столбцы представляют SEM **** Значительно отличается при <0,0001. #### Значимое отличие при <0,0001. ns: незначимо.
- Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro
Метастазирование — многоступенчатый процесс, включающий отделение клеток от первичной опухоли, миграцию клеток в соседние ткани с последующей инвазией клеток в кровь или лимфатическую систему до колонизации этих клеток в отдаленных органах. Влияние DCA на метастазирование у мышей, которым ксенотрансплантировали клетки рака легких с высокой степенью метастазирования, а именно LNM35, оценивали путем проверки веса и частоты подмышечных лимфатических узлов в контрольной и обработанной DCA группах. DCA снижает рост метастазов в лимфатических узлах, не достигая статистической значимости (рисунок 7A).
Кроме того, он не влияет на частоту метастазов в лимфатических узлах (рисунок 7B).
Для оценки способности DCA инвазировать и миграцию клеток A549 и LNM35 in vitro использовались анализ инвазии в камере Бойдена и анализ миграции при заживлении ран. Чтобы убедиться, что потенциальное влияние DCA на миграцию и инвазию не обусловлено гибелью клеток, мы использовали более низкие концентрации DCA. В этих условиях 6,25 мМ и
12,5 мМ DCA не смогли ингибировать клеточную инвазию LNM35 (рисунок 7C) и A549 (рисунок 7D). Аналогичным образом, эти концентрации не смогли ингибировать клеточную миграцию обеих клеточных линий (рисунок 7E–H).
- Обсуждение
Несмотря на недавние достижения в скрининге, диагностике и лечении рака легких, в дополнение к замечательному прогрессу в понимании его молекулярной биологии, рак легких является вторым наиболее часто диагностируемым видом рака с самым высоким уровнем смертности во всем мире в 2020 году [1].
Поэтому прилагаются различные усилия для разработки эффективных агентов и подходов с хорошими запасами безопасности для воздействия на рак легких в попытке обеспечить излечение или улучшить общую выживаемость пациента. Целью данного исследования было изучение влияния метаболического препарата DCA на рост, миграцию, инвазию и ангиогенез рака легких in vitro и рост опухоли и метастазы in vivo, а также влияние целевого метаболизма DCA на цитотоксический эффект одобренной химиотерапии и таргетной терапии в качестве шага к достижению лучшей эффективности и лучшего профиля безопасности.
Настоящее исследование показало, что DCA (3,125–100 мМ) вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности клеток и роста предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. IC50 DCA через 48 ч составлял приблизительно 25 мМ в обеих
клеточных линиях. Наши результаты согласуются с другими отчетами, в которых DCA (10–90 мМ) ингибировал
жизнеспособность клеток линий колоректального рака (КРР), а именно, SW620, LS174t, LoVo и HT-29, в зависимости от концентрации через 48 ч с диапазоном IC50 30–50 мМ в зависимости от типа клеточной линии [18]. Аналогичным образом, DCA (20 мМ) значительно снизил жизнеспособность клеток КРР, а именно, SW480, LoVo и HT-29 через 48 ч, с большим эффектом на плохо дифференцированные клетки SW480 и метастатические клетки LoVo по сравнению с хорошо дифференцированными клетками HT-29 [19]. С другой стороны, более высокая IC50 была зарегистрирована в клетках рака шейки матки, клетках Hela и SiHa [20], в то время как DCA (20 мМ) не смог ингибировать жизнеспособность клеток линии клеток рака молочной железы MCF-7 [21].
Наши данные in vitro были подтверждены путем тестирования влияния DCA на прогрессирование опухоли in vivo с использованием моделей CAM куриного эмбриона и бестимусных мышей. Во-первых, мы продемонстрировали, что значительное снижение роста было достигнуто в A549 и LNM35, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона, при использовании доз DCA 50 мМ и 100 мМ соответственно. Во время написания этой рукописи было опубликовано исследование, в котором изучалось
влияние натрия DCA на линии клеток глиобластомы U87 MG и PBT24, ксенотрансплантированных на CAM куриного Авторы сообщили об изменении роста опухолей U87 MG и PBT24 в ответ на различные концентрации натрия DCA. Сообщалось, что 10 мМ натрия DCA были эффективны в снижении роста опухоли PBT24,
но не роста опухоли U87, что отражает некоторые различия в биологии двух клеточных линий [22]. Во-вторых, мы продемонстрировали, что лечение DCA в дозах 200 мг/кг ежедневно (5 дней в неделю) вызвало значительное снижение роста ксенотрансплантированной опухоли A549 на 40%, в то время как для значительного снижения роста ксенотрансплантированной опухоли LNM35 требовалась более высокая доза DCA (500 мг/кг) . В этом контексте ранее сообщалось, что DCA (100 мг/кг) увеличил время удвоения опухолей A549 и H1975 NSCLC примерно с 3 до 6,5 дней [15], но не оказал значительного ингибирующего эффекта на мышей с опухолью MDA-MB-231 [23]. С другой стороны, значительная задержка роста также наблюдалась в ксенотрансплантатах HT-29, обработанных пероральным DCA (200 мг/кг) ежедневно в течение четырех дней [24].
Исследование токсичности потенциальных противораковых препаратов так же важно, как и исследование их эффективности, поскольку тяжелая токсичность может помешать их использованию в клинике. DCA не показал цитотоксичности для куриных эмбрионов и бестимусных мышей. Процент живых эмбрионов был одинаковым в группах, получавших DCA, и контрольных группах. Кроме того, DCA не повлиял на поведение мышей, вес, общий анализ крови, параметры функции печени и почек по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с предыдущими доклиническими и клиническими отчетами, которые не показали никаких доказательств тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности при лечении DCA [13,14]. Немногие пациенты, получавшие лечение DCA, жаловались на общие желудочно-кишечные эффекты. Кроме того, наиболее распространенным ограничением для введения DCA является обратимая периферическая невропатия, которую можно свести
к минимуму путем снижения дозы или дополнительного введения антиоксидантов [11]. Включение DCA в системы доставки лекарств (СДЛ), такие как наночастицы, является перспективным подходом для сохранения противораковой активности DCA с минимальными побочными эффектами [25–27].
Сообщалось, что противораковый эффект DCA частично обусловлен индукцией апоптоза, как это наблюдалось в клетках колоректального рака [19] и клетках НМРЛ [15] , или ингибированием ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза, такие как антитело к VEGF бевацизумаб и блокатор рецепторов VEGF рамуцирумаб, были клинически одобрены для лечения рака легких [28]. Несмотря на их подтвержденную эффективность, их скромные общие терапевтические эффекты с сопутствующими побочными эффектами подчеркивают очевидную необходимость в более эффективном подходе, нацеленном на ангиогенез [28]. Наше исследование показало, что DCA (25 мМ) является перспективным антиангиогенным средством, поскольку он способен значительно ингибировать образование и прорастание эндотелиальных клеток in vitro. Кроме того, более низкие концентрации DCA (6,25 и 12,5 мМ) не влияли на образование трубок HUVEC. Эти результаты согласуются с отчетом Шунджанса и его коллег, которые продемонстрировали, что 5 мМ и 10 мМ DCA не повлияли на формирование трубок HUVEC in vitro [29]. В соответствии с нашими данными, DCA вызвал снижение плотности микрососудов опухоли у обработанных крыс, у которых также было отмечено подавление HIF1α в опухолевых клетках [30]. С другой стороны, Чжао и его коллеги
Недавно сообщалось, что DCA стимулирует ангиогенез в модели сосудистой деменции у крыс за счет улучшения функции эндотелиальных клеток-предшественников [31].
Примерно у 30–40% пациентов с НМРЛ на момент постановки диагноза наблюдалось метастатическое заболевание . Отдаленные метастазы отрицательно влияют на варианты лечения, ответ и выживаемость
[32] и являются основной причиной смерти от рака легких [33]. Метастазирование — это многоступенчатый процесс, включающий отсоединение раковых клеток, миграцию, инвазию и колонизацию в отдаленных участках. Поэтому терапевтические агенты и схемы, уменьшающие такой отличительный признак рака, имеют большое значение в терапии рака. Несмотря на продемонстрированную антиангиогенную активность DCA, это исследование не показало влияния DCA на метастазирование клеток LNM35, ксенотрансплантированных бестимусным мышам, получавшим перорально эффективную дозу. В этом исследовании клетки LNM35, ксенотрансплантированные путем подкожной инокуляции бестимусным мышам, вызвали 90% случаев метастазов в подмышечных лимфатических узлах, и DCA не смог снизить частоту и рост этих метастазов в лимфатических узлах. Линия клеток LNM35 была создана в 2000 году как первая линия клеток рака легких человека, имеющая лимфогенные метастатические свойства со 100% частотой после подкожной инъекции в боковой бок голых мышей [34]. Кроме того, DCA не показал никаких ингибирующих эффектов на миграционные и инвазивные свойства клеток LNM35 и A549 in vitro. Аналогичным образом сообщалось, что монотерапия DCA не была эффективна в снижении метастазов в легких из метастатических клеток рака молочной железы, ксенотрансплантированных голым мышам [23].
Комбинированная терапия является фундаментальным подходом в лечении рака. Объединение различных противораковых препаратов позволяет воздействовать на различные основные сигнальные пути для усиления терапевтических преимуществ, избегания приобретенной резистентности и снижения тяжести побочных эффектов [35]. Химиотерапия играет неотъемлемую роль в лечении пациентов с НМРЛ. Обычно используется схема с платиной (цисплатин или карбоплатин) плюс паклитаксел, гемцитабин , доцетаксел, винорелбин, иринотекан или пеметрексед [36]. Неселективные характеристики химиотерапевтических агентов приводят к скромному увеличению выживаемости при значительной токсичности для пациента [37]. Это подчеркивает необходимость в более эффективных стратегиях для улучшения результатов лечения пациентов с минимальными побочными эффектами. В настоящем
исследовании DCA не удалось усилить противораковый эффект камптотецина и гемцитабина в обеих линиях клеток Н Кроме того, DCA не смог значительно усилить противораковые эффекты цисплатина в клеточной линии
A549 in vitro, но он усилил цитотоксический эффект цисплатина в клеточной линии LNM35, что отражает роль генетического фона раковых клеток в определении пути гибели клеток, вызванного препаратами. Ким и др. сообщили, что клетки A549 имеют более низкую скорость аэробного гликолиза по сравнению с клетками H460 из-за дифференциальной экспрессии некоторых метаболических ферментов [38]. Аэробный
гликолиз при раке был связан с химиорезистентностью, и ингибирование связанных путей было предложено в качестве механизма преодоления такой резистентности. Например, сверхэкспрессия PDK4 при раке мочевого пузыря высокой степени злокачественности заставляет совместное введение DCA с цисплатином вызывать резкое снижение роста опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [39].
Аналогичным образом, введение DCA с паклитакселом было описано как успешный подход к преодолению резистентных к паклитакселу клеток НМРЛ из-за сверхэкспрессии PDK2 [40]. Кроме того, Галгамува и др. заявили, что предварительное лечение DCA значительно ослабило нефротоксичность, вызванную цисплатином у мышей, сохранив противораковые эффекты цисплатина [41].
Открытие таргетной терапии помогло врачам адаптировать варианты лечения для пациентов с НМРЛ. Было разработано много таргетных препаратов, которые стали частью первой линии лечения НМРЛ, например, гефитиниб и эрлотиниб, которые считаются первым поколением EGFR-TKi [42]. Гефитиниб и эрлотиниб были одобрены более 10 лет назад для лечения пациентов с прогрессирующим мутантным EGFR НМРЛ, не получавших химиотерапию, в качестве первой линии лечения. Они также используются в качестве второй линии терапии после неудачи химиотерапии [43]. Некоторые отчеты показали, что эрлотиниб имеет хорошую эффективность у пациентов с EGFR - диким типом НМРЛ [44]. Поддерживающая доза может принести пользу этим пациентам после химиотерапии на основе платины, которая считается основной терапией при диком типе EGFR НМРЛ [45]. Несмотря на замечательные преимущества, многие пациенты приобрели терапевтическую резистентность через 10–14 месяцев лечения из-за вторичной мутации в гене EGFR [46].
В этом исследовании мы стремились изучить способность DCA сенсибилизировать линии клеток NSCLC дикого типа EGFR при сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. DCA значительно усилил ингибирующий эффект гефитиниба и эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35. Это исследование также показало аддитивные эффекты на рост колоний LNM35 при сочетании DCA с гефитинибом или эрлотинибом в течение семи дней лечения. Более того, эта комбинация оказала синергическое действие на рост колоний A549 после четырнадцати дней лечения. Кроме того, все эти протоколы комбинирования привели к существенному снижению клеточной плотности отдельных колоний как A549, так и LNM35. В этом контексте сообщалось, что DCA с гефитинибом или эрлотинибом синергически подавляет жизнеспособность и способность к образованию колоний мутантных клеток EGFR (NCI-H1975 и NCI-H1650) из-за синергического эффекта в продвижении апоптоза. В клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI- H460) они показали, по сравнению с индивидуальными обработками, что комбинация вызывала повышенное значение фракции, затронутой (Fa), в жизнеспособности клеток, не достигая уровня синергизма в клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460), и эта комбинация не подавляла значительно образование колоний этих линий клеток [47]. Различия в экспериментальных условиях между вышеупомянутым отчетом и нашим исследованием могут объяснить такие переменные результаты. В своем клоногенном анализе исследователи обрабатывали отдельные клетки в течение трех последовательных дней, а затем инкубировали в среде без лекарственных средств в течение 15 дней для формирования колоний; Однако в наших экспериментах клетки сначала инкубировали в течение десяти дней для формирования колоний, а затем подвергали обработке в течение семи и четырнадцати дней.
Подводя итог, можно сказать, что это исследование продемонстрировало, что DCA является перспективным противораковым средством для лечения НМРЛ, подавляя жизнеспособность клеток и рост колоний клеток НМРЛ in vitro , а также рост опухолей у эмбрионов цыплят CAM и голых мышей, в которых также оценивалась безопасность этого средства. DCA подавляет способность эндотелиальных клеток образовывать капилляроподобные структуры и прорастать in vitro, что позволяет предположить ингибирование ангиогенеза как потенциальный механизм противоракового эффекта. Это исследование также выявило потенциальную ценность DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro.
Результаты этого исследования прокладывают путь для подтверждения влияния комбинации DCA с гефитинибом или эрлотинибом на рост опухоли in vivo, в дополнение к исследованию влияния DCA в сочетании с EGFR-TKi второго и третьего поколения.
- Материалы и методы 4.1.Клеточная культура и реагенты
Клетки NSCLC, A549 и LNM35, поддерживались в среде RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) в увлажненном инкубаторе при температуре 37 C и 5% CO2. Среда была дополнена 1% раствора пенициллина- стрептомицина (Hyclone, Cramlington, UK) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Cramlington, UK). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) поддерживались в полном наборе сред EndoGROTM-VEGF (Merck Millipore, Massachusetts, USA) в увлажненном инкубаторе при температуре 37 C и 5% CO2 в колбах , покрытых 0,2% желатином. Культуральную среду всех клеток меняли каждые 3 дня, а клетки пересевали один раз в неделю, когда культура достигала 95% конфлюэнтности для раковых клеток и 80% для HUVEC.
Натрий DCA, цисплатин, камптотецин, гемцитабин HCl, эрлотиниб HCl и гефитиниб были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). DCA был свежерастворен в воде HyPure (Hyclone, Крамлингтон, Великобритания) перед началом любого эксперимента для приготовления исходного раствора 1 М, который затем был разбавлен до требуемых концентраций для лечения.
4.2. Жизнеспособность
клеток Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночный планшет.
Через 24 часа клетки обрабатывали возрастающей концентрацией DCA (3,125–100 мМ) в двух повторностях в течение 24, 48 и 72 часов, тогда как контрольные клетки обрабатывали лекарственным средством ( вода Hypure), смешанным со средой. В указанные временные точки использовали анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) для определения
влияния DCA на жизнеспособность клеток путем количественной оценки АТФ, которая будет пропорциональна
к числу метаболически активных клеток. Люминесцентный сигнал измеряли с помощью люминометра GloMax® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность клеток представляли в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности клеток, обработанных DCA, с контрольными клетками, жизнеспособность которых предполагалась равной 100%.
Во втором наборе экспериментов клетки обрабатывали в течение 48 ч возрастающей концентрацией гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ). Кроме того, клетки обрабатывали в течение 48 ч комбинацией DCA и других противораковых агентов, а именно цисплатина, камптотецина,
гемцитабина , гефитиниба и эрлотиниба. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo® Анализ люминесцентной жизнеспособности клеток и люминометр GloMax® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность была представлена в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности обработанных лекарством клеток с контрольными клетками.
4.3. Клоногенный анализ
В 6-луночный планшет высевали клетки A549 и LNM35, соответственно, по 50 и 100 клеток на лунку. Клетки выдерживали для роста в колонии в течение 7–10 дней во влажной атмосфере при 37 C и 5% CO2, при этом среду меняли каждые три дня. Образованные колонии обрабатывали каждые 3 дня в течение 7 дней возрастающими концентрациями DCA (6,25–50 мМ). После этого колонии промывали три раза 1× PBS, фиксировали и окрашивали в течение 2 часов 0,5% кристаллическим фиолетовым, растворенным в 50% метаноле (об./об.). Наконец, колонии промывали 1× PBS и фотографировали, и подсчитывали колонии с более чем 50 клетками . Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных DCA, с контрольными колониями. Плотность клеток колоний оценивали путем фотографирования колоний в каждой группе с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа (4×).
Во втором наборе экспериментов сформированные колонии обрабатывались каждые 3 дня в течение 7 или 14 дней комбинацией DCA и гефитиниба или DCA и эрлотиниба. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных препаратом, с контрольными колониями.
4.4 Анализ роста опухоли in ovo
Оплодотворенные яйца леггорнов инкубировали в инкубаторе для яиц, установленном на температуру 37,5 C и влажность 50% в течение первых 3 дней после оплодотворения. На 3-й день эмбрионального развития (E3) САМ был удален путем просверливания небольшого отверстия в яичной скорлупе напротив круглого, широкого конца с последующей аспирацией ~1,5–2 мл альбумина с помощью шприца объемом 5 мл с иглой 18G. Затем в яичной скорлупе над САМ было вырезано небольшое окно с помощью тонких ножниц, которое было заклеено полупроницаемой клейкой пленкой (Suprasorb® F). Яйца снова содержались в инкубаторе до 9-го дня эмбрионального развития (E9), на котором раковые клетки были трипсинизированы, центрифугированы и суспендированы в 80% матрице Matrigel® (Corning, Bedford, UK) для получения 1 × 106 клеток/100 мкл для A549 и 0,3 ×
106 клеток/100 мкл для LNM35. 100 мкл инокулята добавляли на САМ каждого яйца, в общей сложности 10–13 я
На 11-й день эмбрионального развития (E11) образовавшиеся опухоли обрабатывали местно, капая 100 мкл DCA, приготовленного на 0,9% NaCl для первой группы, или лекарственного носителя для контрольной группы. Обработку повторяли на E13 и E15. Все описанные шаги выполняли в асептических условиях.
Наконец, на 17-й день эмбрионального развития (E17) эмбрионы гуманно умерщвляли путем местного добавления 10–30 мкл пентобарбитона натрия (300 мг/мл, Jurox, Окленд, Новая Зеландия). Опухоли осторожно извлекали из нормальных верхних тканей CAM, промывали 1× PBS и взвешивали для определения влияния DCA на рост опухолей. Данные представлены в виде сравнений среднего веса опухолей в контрольной группе и группе, обработанной DCA. Токсичность препарата оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах в конце эксперимента.
Живость эмбрионов определялась путем проверки их произвольных движений, а также целостности и пульсации кровеносных сосудов.
Этот анализ представляет собой рандомизированный открытый анализ, который был проведен в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных в Университете Объединенных Арабских Эмиратов . Согласно Европейской директиве 2010/63/EU о защите животных, используемых
Для проведения научных экспериментов с использованием куриных эмбрионов на E18 и ранее не требуется одобрения со стороны Комитета по уходу и использованию животных (IACUC).
4.5 Анализ роста опухоли и метастазирования
Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, утвержденным
комитетом по этике работы с животными Университета ОАЭ в марте 2019 года (код протокола ERA_2019_5872).
Шести-восьминедельных бестимусных мышей-самцов линии NMRI nude (nu/nu, Charles River,
Германия) содержали в ламинарных шкафах с фильтруемым воздухом и соблюдали асептические условия.
Клетки A549 (5 × 106 клеток/200 мкл PBS) и клетки LNM35 (0,4 × 106 клеток/200 мкл PBS) вводили
подкожно в боковой бок голых мышей. Спустя десять дней, когда опухоли достигли объема приблизительно 50 мм3, животные с ксенотрансплантатами A,549 были случайным образом
разделены на три группы по 9–10 мышей в каждой. Эти группы получали перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 50 мг/кг или 200 мг/кг или лекарственный носитель в течение 38 дней. С другой стороны, животные с ксенотрансплантатами LNM35 получали перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 200 мг/кг или лекарственный носитель в течение 10 дней и DCA 500 мг/кг или лекарственный носитель в течение 24 дней. Размеры опухолей и вес животных проверяли каждые три или четыре дня. Кроме того, физические признаки и поведение проверялись каждый день. Объем опухоли рассчитывался по формуле V = L × W2 ×
0,5, где L представляет собой длину , а W — ширину опухоли. В конце экспериментов животных анестезировали и умерщвляли путем смещения шейных позвонков, а опухоли удаляли и взвешивали. Влияние DCA на рост опухоли было представлено путем сравнения среднего веса опухоли в конце эксперимента между контрольной группой и группой, получавшей DCA. Его также оценивали путем сравнения объема опухоли между контрольной и группой, получавшей DCA, на протяжении всего эксперимента. Образцы крови собирали у каждой мыши и анализировали с помощью счетчика крови животных SCIL VET ABC™ Animal Blood Counter для полного анализа крови. Кроме того, плазму крови отделяли центрифугированием для биохимического анализа. Для изучения влияния DCA на метастазирование подмышечные
лимфатические узлы были вырезаны и взвешены у животных с ксенотрансплантатами LNM35 в конце
- Анализ формирования
сосудистых трубок Матрикс Matrigel® (Corning, Bedford, UK) размораживали и добавляли 40– 50 мкл в лунки 96-луночного планшета для покрытия. Для того чтобы Матригель затвердел, планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37 C и 5% CO2 в течение 1 ч. HUVEC
трипсинизировали и высевали на покрытый планшет с плотностью 2,5 × 104 клеток/100 мкл/ лунку в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA. Через 8 ч инкубации сети
трубок в разных лунках фотографировали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Влияние DCA на способность HUVEC формировать капилляроподобные структуры оценивали путем измерения общей длины сформированных трубок в контрольных и обработанных DCA лунках. Общая длина трубок измерялась вручную и с помощью программного обеспечения для онлайн-анализа изображений, разработанного Wimasis (https://www.wimasis.com/ en/products/13/WimTube - дата доступа 1 марта 2019 г.). Влияние различных концентраций DCA
на жизнеспособность HUVEC определялось с помощью анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), как ранее описано в разделе о жизн
- Анализ прорастания сфероидов HUVEC
Сфероиды HUVEC были приготовлены путем первого окрашивания клеток путем инкубации 190 000 клеток с 2 мкМ раствором красителя CellTrackerTM Green CMFDA (Invitrogen Molecular probes, Paisley, UK) в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе, установленном на 37 C и 5% CO2, с последующим центрифугированием в течение 5 мин и удалением супернатанта. Осадок HUVEC был суспендирован в дополненной среде HUVEC (5 мл), смешанной с раствором метоцела (1,25 мл), который должен быть приготовлен ранее [48]. Затем 25 мкл клеточной суспензии пипеткой наносили на крышку чашки Петри. Примерно 50 капель пипеткой наносили в каждую чашку Петри.
Наконец, капли держали перевернутыми в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе, установленном на 37
Образованные сфероиды в каждой чашке (~50 сфероидов) собирали отдельно с 1× PBS и центрифугировали при 150× g в течение 5 мин. Тем временем рабочий раствор коллагена I готовили на льду путем осторожного смешивания исходного коллагена I из хвоста крысы (1500 мкл) (Millipore, MA, США) с 10× средой 199 (150 мкл) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, США) и ледяным стерильным 1N NaOH (34 мкл), который приобрел красный цвет. Каждый сфероидный осадок покрывали слоем раствора метоцела, содержащего 4% FBS (0,25 мл), рабочего раствора коллагена I (0,25 мл) и 60 мкл базальной среды или VEGF 30 нг/мл или DCA 25 мМ или их комбинации.
Сразу после осторожного перемешивания смесь добавляли в предварительно нагретый 24-луночный планшет и инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37 C и 5% CO2 в течение 24 часов, что позволяло полимеризовать коллаген и прорасти сфероидам. Через 24 часа сфероиды были захвачены с помощью инвертированного микроскопа с 20-кратным увеличением. Длина проростков в 12 сфероидах в каждом состоянии была измерена с помощью ImageJ.
- Анализ подвижности при
заживлении ран Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 1 × 106 клеток/лунку в 6-луночный планшет. Через 24 часа с помощью наконечника объемом 200 мкл делали царапину в сливающемся монослое . После этого клетки дважды промывали 1× PBS с последующим добавлением свежей среды с добавлением лекарственного носителя или DCA. В верхней части планшета были отмечены два места для мониторинга уменьшения размера раны с течением времени с использованием инвертированного микроскопа при объективе 4× (Olympus 1X71, Токио, Япония). Планшеты инкубировали во влажной атмосфере при 37 C и 5% CO2 , а ширину раны измеряли через 0, 2, 6 и 24 часа после инкубации.
Расстояние миграции выражалось как среднее значение разницы между измерениями в нулевой момент времени и в периоды времени 2, 6 и 24 часа.
- Анализ камер инвазии в матригеле
Согласно протоколу производителя (Corning, Bedford, MA, USA), в нижние камеры добавляли 0,5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS. После этого раковые клетки высевали с плотностью 1 × 105 клеток/ 0,5 мл в верхние камеры в среде без FBS в присутствии и отсутствии DCA. Планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37 C и 5% CO2 в течение 24 часов. Инвазивные клетки разрушают матригель и проходят через поры вставки размером 8 мкм. Непроникающие клетки верхних камер удаляли, осторожно протирая область ватным тампоном. Затем полупроницаемую мембрану удаляли с помощью очень тонких ножниц.
Инвазивные клетки были обнаружены с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), ранее описанного в разделе жизнеспособности клеток. Влияние DCA на клеточную инвазию было представлено в процентах (%) путем сравнения инвазирующих клеток в присутствии DCA с контролем.
- Статистический анализ
Помимо анализа in ovo и экспериментов на голых мышах, каждый эксперимент проводился не менее трех раз. Данные выражены как среднее значение ± SEM Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 8.3.1 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния,
США). Для оценки разницы между двумя группами использовался непарный t-тест . Для сравнения 3 или более групп с контрольной группой использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Даннетта . Кроме того, для комбинированных экспериментов
использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного*сравнения Тьюки. p
** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001 указывают на значимые различия.
Вклад авторов: Концептуализация, SA; методология, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; валидация, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; формальный анализ, SA и AA-A.; расследование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; курирование данных, SA; написание — подготовка первоначального черновика, SA и AA-A.; написание — рецензирование и редактирование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; визуализация, SA, AA-A. и AN; руководство, SA; администрирование проекта, SA; получение финансирования, SA Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.
Финансирование: Это исследование частично финансировалось за счет гранта Центра медицинских наук имени Зайеда, Университета Объединенных Арабских Эмиратов, № 31R136.
Заявление институционального наблюдательного совета: Исследование на голых мышах проводилось в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации и протоколом, одобренным Комитетом по этике обращения с животными Университета Объединенных Арабских Эмиратов (код протокола ERA_2019_5872).
Заявление об информированном согласии: Неприменимо.
Заявление о доступности данных: Неприменимо.
Благодарности: Авторы выражают благодарность Такаши Такахаши за предоставление клеток LNM35.
Конфликты интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не принимали участия в разработке исследования, в сборе, анализе или интерпретации данных, в написании рукописи или в решении опубликовать результаты.