Анти-рак: научные исследования

Глутамин-зависимый фенотип опухоли: метаболическая уязвимость и терапевтические возможности

Введение

Современная онкология рассматривает опухоль как динамическую систему, использующую различные источники энергии и строительных материалов для выживания и пролиферации. Наряду с гликолитическим и окислительным типами метаболизма, выделяют особый глутамин-зависимый фенотип, при котором ключевую роль в энергетике и биосинтезе играет аминокислота глутамин.

Глутамин является одной из самых универсальных молекул клеточного метаболизма. Он служит не только источником азота для синтеза аминокислот и нуклеотидов, но и — после превращения в глутамат и α-кетоглутарат — поставщиком углеродного скелета в цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса). Для многих опухолей глутамин становится буквально «второй глюкозой», обеспечивая рост даже в условиях ограниченного доступа к сахарам и кислороду.

Поэтому ингибирование глутаминового обмена сегодня рассматривается как одно из перспективных направлений метаболической терапии рака, особенно в сочетании с препаратами, действующими на митохондрии или гликолиз.

Метаболические особенности глутамин-зависимого фенотипа

Глутамин-зависимые опухоли характеризуются выраженным глутаминолизом — процессом расщепления глутамина до α-кетоглутарата, который поступает в цикл Кребса и поддерживает окислительное фосфорилирование или биосинтетические реакции.

Основные характеристики фенотипа:

1. Активное поглощение глутамина через транспортер SLC1A5 (ASCT2) и менее специфичный SNAT2 (SLC38A2).

2. Повышенная экспрессия фермента GLS1 (глутаминазы 1), катализирующего превращение глутамина в глутамат.

3. Интенсивная активность фермента GDH (глутаматдегидрогеназы), обеспечивающего переход глутамата в α-кетоглутарат.

4. Адаптация к глюкозному дефициту — клетки переключаются с гликолиза на использование глутамина как основного топлива.

5. Поддержание антиоксидантного баланса — глутамин участвует в синтезе глутатиона (GSH), защищая опухоль от окислительного стресса.

6. Участие в биосинтезе липидов и нуклеотидов — продукты глутаминолиза служат строительными блоками для быстрого деления клеток.

В условиях гипоксии или глюкозного голодания глутамин становится основным источником энергии. Опухолевые клетки с глутамин-зависимым метаболизмом нередко устойчивы к гликолитическим ингибиторам, но, наоборот, чувствительны к блокаде ферментов глутаминолиза.

Роль глутамина в опухолевом росте

Глутамин выполняет сразу несколько критических функций в онкогенезе:

1. Энергетическая функция. Через образование α-кетоглутарата глутамин подпитывает цикл Кребса, обеспечивая выработку NADH и FADH₂ для дыхательной цепи митохондрий.

2. Пластическая функция. Глутамин служит источником углерода и азота для синтеза нуклеотидов, аминокислот, липидов и гексозаминов.

3. Редокс-функция. Поставляя субстраты для синтеза глутатиона, глутамин защищает клетки от ROS-индуцированного повреждения.

4. Регуляторная функция. Активирует сигнальные пути mTOR и MYC, поддерживающие рост и деление клеток.

Таким образом, блокада глутаминового обмена одновременно лишает опухоль энергии, строительных ресурсов и антиоксидантной защиты, что делает этот путь исключительно привлекательной терапевтической мишенью.

Диагностика глутамин-зависимого фенотипа

Для определения глутаминовой зависимости опухоли применяются несколько подходов:

1. RT-qPCR (реальная-временная ПЦР) — количественное определение экспрессии генов GLS1 и GLS2. Повышенная экспрессия GLS1 характерна для злокачественных опухолей, тогда как GLS2 чаще ассоциируется с нормальными тканями.

2. Иммуногистохимия (ИГХ) — выявление экспрессии транспортёров SLC1A5 (ASCT2) и фермента GLS1 в опухолевых образцах.

3. Метаболический профайлинг (¹³C-трейсинг) — использование меченого глутамина для оценки его включения в метаболиты цикла Кребса.

4. МР-спектроскопия in vivo — определение уровней глутамата и α-кетоглутарата.

5. Оценка чувствительности клеток к ингибиторам GLS1 — функциональный способ подтверждения глутаминовой зависимости.

Терапевтические стратегии

Основная цель терапии при глутамин-зависимом фенотипе — ингибировать ключевые ферменты глутаминолиза, прежде всего глутаминазу 1 (GLS1), и блокировать транспорт глутамина в клетку.

Направления воздействия включают:

1. Ингибирование глутаминазы (GLS1).
   Это основной катализатор превращения глутамина в глутамат. Его подавление ведёт к истощению субстратов цикла Кребса и снижению энергетического обмена.

2. Блокада транспортёров глутамина (ASCT2/SLC1A5).
   Ограничение поступления глутамина препятствует подпитке митохондрий и синтезу антиоксидантов.

3. Ингибирование глутаматдегидрогеназы (GDH) и аниаплеротических путей.
   Это усиливает дефицит α-кетоглутарата и усиливает окислительный стресс.

4. Комбинирование с прооксидантами.
   Так как блокада глутаминолиза снижает уровень глутатиона, комбинация с препаратами, генерирующими ROS (например, витамин C или арсенат триоксида), даёт синергетический эффект.

Препараты с высокой доказанностью

1. CB-839 (телагленастат)

Телагленастат — мощный селективный ингибитор GLS1, прошедший клинические испытания I–II фаз (включая NCT02071862, NCT03428217).

Механизм действия:

• связывается с активным центром глутаминазы 1, предотвращая превращение глутамина в глутамат;

• истощает пул α-кетоглутарата и нарушает цикл Кребса;

• снижает уровень NADH и АТФ;

• ослабляет антиоксидантную защиту за счёт уменьшения глутатиона.

Результаты исследований:

• в моделях рака почки, поджелудочной железы и тройного негативного рака молочной железы CB-839 приводил к выраженному замедлению роста;

• комбинация с ингибиторами mTOR (рапамицин, эвэролимус) или метформином усиливала эффект за счёт двойного ограничения энергетического обмена;

• препарат продемонстрировал хорошую переносимость, с минимальной системной токсичностью.

2. V-9302

V-9302 — антагонист транспортёра SLC1A5 (ASCT2), разработанный для ограничения поступления глутамина в опухолевые клетки.

Механизм:

• конкурентно блокирует перенос глутамина через ASCT2;

• вызывает внутриклеточное голодание и энергетический стресс;

• снижает экспрессию HIF-1α и MYC, что подавляет метаболическую адаптацию.

Данные исследований:

• в культурах рака лёгких, поджелудочной железы и колоректального рака V-9302 значительно уменьшал скорость пролиферации;

• при комбинировании с CB-839 наблюдалась выраженная синергия;

• также усиливал чувствительность клеток к прооксидантным агентам (аскорбат, арсенат).

Препараты со средней доказанностью

1. BPTES

BPTES — один из первых аллостерических ингибиторов GLS1, широко применяемый в доклинических моделях.

Механизм:

• связывается с тетрамерной формой фермента и препятствует его активации;

• снижает уровень α-кетоглутарата и АТФ;

• усиливает накопление ROS и апоптоз.

Особенности:

• в экспериментальных исследованиях показал эффективность при глиобластоме, меланоме, раке лёгких;

• в комбинации с метформином или DCA эффект усиливается, так как блокируется альтернативная энергетическая компенсация через митохондрии;

• имеет ограниченную растворимость, поэтому чаще используется как прототипное соединение.

2. L-аспарагиназа

Хотя L-аспарагиназа известна как фермент для лечения лейкозов, она также способна ограничивать доступ опухоли к аминокислотам, в том числе к глутамину.

Механизм:

• гидролизует аспарагин и частично глутамин, вызывая аминокислотный стресс;

• активирует пути аутофагии и апоптоза;

• снижает уровень глутатиона.

Данные:

• используется при остром лимфобластном лейкозе (ALL), но активно изучается и для солидных опухолей;

• комбинация L-аспарагиназы с ингибиторами GLS1 (CB-839, BPTES) демонстрирует потенциал синергии;

• побочные эффекты включают гипераммониемию и гепатотоксичность, что требует строгого дозирования.

Перспективы комбинированных подходов

Глутамин-зависимый фенотип редко встречается в чистом виде: многие опухоли демонстрируют гибридный метаболизм, сочетая использование глутамина и глюкозы. Поэтому оптимальным направлением считается комбинированная метаболическая терапия, нацеленная на несколько путей одновременно.

Перспективные схемы включают:

• CB-839 + метформин — одновременное ингибирование глутаминолиза и митохондриального дыхания, вызывающее энергетический коллапс;

• V-9302 + DCA — блокада поступления глутамина и усиление использования пирувата в митохондриях, что нарушает энергетический баланс;

• CB-839 + высокодозный витамин C — усиление прооксидантного стресса на фоне истощения антиоксидантной системы;

• BPTES + арсенат триоксида — двойное увеличение ROS и подавление цикла Кребса;

• L-аспарагиназа + кетогенная диета — ограничение азотистых и углеродных источников для опухолевого метаболизма.

Комбинированный подход позволяет воздействовать на разные звенья глутаминового обмена и предотвратить метаболическую адаптацию опухоли.

Заключение

Глутамин-зависимый фенотип представляет собой один из ключевых вариантов метаболической организации опухоли, особенно характерный для агрессивных, резистентных и метастатических форм рака. Глутамин служит не только источником энергии, но и защитным щитом от окислительного стресса, поэтому его блокада открывает широкие возможности для терапии.

Современные препараты, такие как CB-839 (телагленастат) и V-9302, доказали способность вызывать метаболический кризис в глутамин-зависимых клетках, снижая их жизнеспособность и повышая чувствительность к другим видам лечения. Среднеподтверждённые средства (BPTES, L-аспарагиназа) продолжают изучаться как компоненты комбинированных схем.

Таким образом, ингибирование глутаминового обмена становится важным направлением метаболической онкологии, объединяя биохимические, фармакологические и нутритивные подходы. В перспективе персонализированные протоколы, основанные на определении метаболического фенотипа опухоли, позволят сделать лечение более точным, безопасным и эффективным.

Окислительный (OXPHOS-зависимый) фенотип опухоли: энергетическая адаптация и терапевтические возможности

Введение

Современные исследования подтверждают, что опухолевые клетки могут использовать разные типы энергетического обмена для поддержания роста, инвазии и выживания в неблагоприятных условиях. Наряду с классическим гликолитическим фенотипом, при котором преобладает аэробный гликолиз (эффект Варбурга), существует и другой, не менее важный тип — окислительный или OXPHOS-зависимый фенотип.

OXPHOS (oxidative phosphorylation — окислительное фосфорилирование) — это основной митохондриальный путь синтеза энергии, при котором АТФ образуется благодаря передаче электронов по дыхательной цепи и работе АТФ-синтазы. В опухолях с этим фенотипом митохондрии не только активны, но и играют ключевую роль в выживании и агрессии клеток.

Ранее считалось, что раковые клетки в целом «отказываются» от митохондрий в пользу гликолиза, но сегодня ясно, что OXPHOS-зависимые опухоли — это отдельный метаболический класс, встречающийся в ряде новообразований, включая меланому, рак поджелудочной железы, молочной железы (особенно подтип Luminal A), а также в метастатических формах рака лёгких и яичников.

Метаболические особенности OXPHOS-зависимого фенотипа

Главная особенность данного фенотипа — высокая активность митохондриального дыхания и зависимость клеток от окислительного фосфорилирования как основного источника энергии.

Ключевые характеристики:

1. Повышенное потребление кислорода — клетки демонстрируют высокие значения OCR (oxygen consumption rate), что отражает активность дыхательной цепи.

2. Усиленная активность комплекса I митохондрий — основной источник образования АТФ и реактивных форм кислорода (ROS).

3. Низкий уровень гликолитических ферментов (LDHA, HK2) и повышенная экспрессия митохондриальных ферментов (CS, SDHA, COXIV).

4. Гибкость энергетического обмена — OXPHOS-опухоли могут использовать не только глюкозу, но и глутамин, жирные кислоты и кетоновые тела как источники энергии.

5. Умеренная гипоксия — такие опухоли часто формируются в относительно хорошо васкуляризованных зонах, где есть доступ к кислороду.

6. Высокая митохондриальная масса — подтверждается окрашиванием MitoTracker и повышенной экспрессией митохондриального ДНК.

OXPHOS-зависимый фенотип часто ассоциируется с медленно растущими, но терапевтически устойчивыми опухолями, особенно в случаях, когда они подвергались длительной химиотерапии или таргетной терапии. Это объясняется тем, что клетки с активным митохондриальным дыханием обладают развитой антиоксидантной системой и эффективной утилизацией ROS.

Диагностика

Определение OXPHOS-зависимого фенотипа требует специальных методов оценки митохондриальной активности.

1. Seahorse XF-анализатор — «золотой стандарт» для оценки дыхательной активности клеток. Измеряется показатель OCR (oxygen consumption rate) и рассчитывается соотношение OCR/ECAR (гликолиз). Преобладание OCR указывает на митохондриальную зависимость.

2. Спектрофотометрия и флуоресцентная микроскопия — позволяют оценить активность комплексов I–IV дыхательной цепи и количество митохондрий.

3. Иммуногистохимия (ИГХ) — маркеры SDHA, NDUFS1, COXIV, TOMM20, CPT1A (для жирных кислот) указывают на активность окислительного обмена.

4. МР-спектроскопия in vivo — позволяет оценить уровень NAD⁺/NADH, фосфокреатина и других метаболитов митохондриального происхождения.

5. Генетические панели — определяют экспрессию генов, регулирующих митохондриальную биогенез (PGC-1α, TFAM, NRF1).

Терапевтические стратегии при OXPHOS-зависимых опухолях

Цель метаболической терапии в данном случае противоположна подходу к гликолитическому фенотипу. Если при гликолизе важно активировать митохондрии и усилить окислительный стресс, то при OXPHOS-зависимом типе требуется ингибировать митохондриальное дыхание, вызвать энергетический кризис и увеличить прооксидантную нагрузку до токсического уровня.

Основные направления терапии:

1. Ингибирование комплекса I митохондрий — ведёт к снижению синтеза АТФ и накоплению ROS.

2. Нарушение транспорта электронов и мембранного потенциала — приводит к апоптозу.

3. Снижение синтеза жирных кислот и глутаминолиза — ограничивает альтернативные источники топлива.

4. Усиление прооксидантного стресса — комбинирование ингибиторов дыхания с высокими дозами аскорбата или прооксидантных препаратов.

Препараты с высокой доказанностью

1. Метформин

Метформин, широко известный как противодиабетический препарат, проявил выраженные митохондриально-направленные антиопухолевые свойства.

Механизм действия:

• ингибирует комплекс I дыхательной цепи (NADH-дегидрогеназу);

• активирует AMPK, что тормозит mTOR и синтез белков;

• вызывает энергетическое истощение и повышает уровень ROS;

• усиливает апоптоз в условиях дефицита питательных веществ.

Эффекты:

• снижение роста опухоли и метастазирования в моделях меланомы, рака лёгких, молочной железы;

• повышение чувствительности к химиотерапии и облучению;

• благоприятный профиль безопасности и переносимости.

2. Фенформин

Фенформин — структурный аналог метформина, обладающий более выраженным митохондриальным действием.

Механизм:

• мощное ингибирование комплекса I, вызывающее резкое снижение АТФ и повышение AMP/ATP-соотношения;

• усиление прооксидантного стресса и активация апоптоза;

• подавление сигнальных путей HIF-1α и mTOR.

Преимущества:

• более сильное антиопухолевое действие, чем у метформина;

• активность против резистентных клеток с высоким уровнем OXPHOS.

Ограничения:

• риск лактатацидоза при высоких дозах, что требует осторожности при клиническом применении.

3. IACS-010759

IACS-010759 — инновационный ингибитор комплекса I дыхательной цепи, разработанный специально для онкологических исследований (MD Anderson Cancer Center).

Механизм:

• селективное связывание с NADH-дегидрогеназой, блокада потока электронов;

• снижение митохондриального потенциала и синтеза АТФ;

• накопление ROS и активация апоптоза.

Доказательная база:

• продемонстрировал выраженный противоопухолевый эффект в моделях рака лёгких, острого миелоидного лейкоза (AML) и глиобластомы;

• при применении в низких дозах не оказывает существенного влияния на нормальные клетки;

• проходит клинические испытания фазы I/II (NCT03291938).

Препараты со средней доказанностью

Арсенат триоксида (As₂O₃)

Арсенат триоксида — соединение, традиционно применяемое в терапии промиелоцитарного лейкоза, но также обладающее митохондриально-направленным действием.

Механизм:

• ингибирует комплекс II и III дыхательной цепи;

• вызывает потерю митохондриального мембранного потенциала;

• усиливает образование ROS;

• подавляет экспрессию антиапоптотических белков (Bcl-2, Mcl-1).

Эффекты:

• в низких дозах проявляет селективность к клеткам с высоким уровнем митохондриального дыхания;

• вызывает апоптоз в клетках рака яичников, лёгких и гепатоцеллюлярной карциномы;

• в комбинации с метформином или фенформином усиливает прооксидантный стресс.

Перспективы комбинированной терапии

OXPHOS-зависимые опухоли отличаются устойчивостью к традиционной химиотерапии, но уязвимы при комплексном воздействии на митохондрии и антиоксидантные системы. Наиболее перспективными считаются следующие стратегии:

• Метформин + арсенат триоксида — двойное ингибирование дыхательной цепи (комплексы I и II) и усиление ROS-стресса;

• Фенформин + DCA — фенформин нарушает дыхательную цепь, а DCA, активируя PDH, способствует перераспределению пирувата в митохондрии, усиливая митохондриальную нагрузку;

• IACS-010759 + ингибиторы глутаминазы (CB-839) — комбинированное ограничение митохондриального метаболизма и глутаминолиза;

• Метформин + высокодозный аскорбат — потенцирование прооксидантного эффекта и разрушение опухолевых клеток через окислительное повреждение.

Такие схемы позволяют вызывать селективный метаболический коллапс в опухолевых клетках без значительного вреда для здоровых тканей.

Заключение

Окислительный (OXPHOS-зависимый) фенотип опухоли представляет собой метаболическую стратегию выживания, основанную на активной работе митохондрий. Эти опухоли менее подвержены гипоксии, устойчивы к ряду химиопрепаратов, но уязвимы к митохондриально-направленным ингибиторам.

Современные препараты — метформин, фенформин и IACS-010759 — доказали свою эффективность в подавлении митохондриального дыхания, индуцировании апоптоза и повышении чувствительности опухолевых клеток к терапии. Среднеподтверждённые агенты, такие как арсенат триоксида, также находят своё место в комбинированных протоколах, усиливая окислительный стресс.

Таким образом, метаболическая терапия OXPHOS-фенотипа открывает новое направление в онкологии, позволяющее воздействовать на энергетические основы опухолевого роста. Понимание различий между гликолитическим и окислительным фенотипами становится ключом к персонализированному выбору метаболических препаратов и повышению эффективности противоопухолевого лечения.

Гликолитический фенотип опухоли (эффект Варбурга): метаболические особенности и подходы к терапии
Введение

Современная онкология рассматривает опухоль не только как генетическое нарушение, но и как метаболическую систему с изменённым типом энергетического обмена. Одним из наиболее изученных и характерных вариантов является гликолитический фенотип, известный также как эффект Варбурга. Этот феномен был описан ещё в 1920-х годах немецким биохимиком Отто Варбургом, который впервые обратил внимание на то, что злокачественные клетки активно расщепляют глюкозу до лактата, даже при наличии достаточного количества кислорода.

Такой тип обмена энергии называется аэробным гликолизом, и именно он лежит в основе повышенной выживаемости, агрессивности и устойчивости опухолевых клеток.

Метаболические особенности гликолитического фенотипа

Опухоли с гликолитическим фенотипом отличаются рядом ключевых характеристик:

Аэробный гликолиз — глюкоза превращается в лактат даже в присутствии кислорода, что позволяет клетке получать энергию быстро, хотя и менее эффективно по количеству вырабатываемого АТФ.

Повышенная экспрессия LDHA (лактатдегидрогеназы-А) — фермента, который катализирует превращение пирувата в лактат, обеспечивая поддержание гликолитического потока.

Активность пируват-дегидрогеназной киназы (PDK) — фермента, который ингибирует пируват-дегидрогеназу и блокирует превращение пирувата в ацетил-КоА, препятствуя входу углерода в цикл Кребса.

Высокий уровень лактата и ацидоз микроокружения — результат накопления молочной кислоты, что создаёт условия для инвазии и подавления иммунного ответа.

Гиперактивация сигнальных путей HIF-1α, PI3K/AKT/mTOR и MYC — факторов, стимулирующих гликолитическую активность.

В результате клетка переходит на «быстрый» способ получения энергии, что обеспечивает ей преимущество при гипоксии, низком питании и стрессовых условиях.

Диагностика гликолитического фенотипа

Диагностировать гликолитический фенотип можно с помощью комплекса лабораторных и инструментальных методов:

Иммуногистохимия (ИГХ) — определение экспрессии ферментов LDHA, PDK, GLUT1, HK2 (гексокиназа 2).

Измерение уровня лактата в опухолевых тканях или крови — отражает активность гликолиза.

ПЭТ-КТ с 18F-ФДГ (фтордезоксиглюкозой) — позволяет визуализировать зоны повышенного поглощения глюкозы, характерные для гликолитических опухолей.

МР-спектроскопия — помогает оценить уровень метаболитов (пируват, лактат, глутамин).

Комбинация этих методов даёт возможность не только подтвердить тип метаболизма опухоли, но и выбрать наиболее рациональную терапевтическую стратегию.

Основные принципы терапии гликолитического фенотипа

Главная задача метаболической терапии при гликолитическом фенотипе — нарушить гликолитический поток, создать окислительный стресс и снизить адаптацию опухоли к гипоксии.

Такой подход включает несколько взаимосвязанных направлений:

Блокировка гликолиза — уменьшение потребления глюкозы и выработки лактата.

Активация митохондриального дыхания — переключение клеточного метаболизма с гликолиза на окислительное фосфорилирование.

Создание прооксидантного стресса — усиление образования активных форм кислорода (АФК) для индукции апоптоза.

Нормализация микроокружения опухоли — снижение ацидоза и подавление ангиогенеза.

Таким образом, лечение направлено не на прямое уничтожение клетки, а на изменение её энергетической логики, что делает опухоль более уязвимой к химиотерапии и лучевому воздействию.

Препараты с доказанной эффективностью
1. 2-дезоксиглюкоза (2-DG)

2-DG — структурный аналог глюкозы, который проникает в клетку через транспортеры GLUT1 и фосфорилируется гексокиназой, но не может быть далее утилизирован. Это приводит к блокаде гликолиза и энергетическому дефициту.

Механизм действия:

конкурентное ингибирование гексокиназы;

подавление синтеза АТФ;

усиление чувствительности опухоли к облучению и химиотерапии.

Результаты исследований:
2-DG показал эффективность в экспериментальных моделях глиобластомы, карциномы лёгких, молочной железы и сарком. В клинических испытаниях комбинированное применение с доксорубицином и лучевой терапией приводило к снижению объёма опухоли и задержке её роста.

2. Метформин

Метформин — противодиабетический препарат, который проявил мощные антипролиферативные и метаболические свойства.

Механизм действия:

ингибирование комплекса I дыхательной цепи митохондрий;

активация AMPK (фермента энергетического контроля клетки);

снижение продукции АТФ и торможение гликолиза через ингибирование mTOR.

Эффекты в онкологии:

уменьшение роста опухоли;

усиление действия химиопрепаратов;

снижение риска рецидивов при раке молочной железы, простаты и яичников.

3. Дихлорацетат натрия (DCA)

DCA — один из ключевых препаратов метаболической терапии. Он воздействует на фермент пируват-дегидрогеназную киназу (PDK), которая блокирует превращение пирувата в ацетил-КоА.

Механизм действия:

ингибирование PDK1;

активация пируват-дегидрогеназы (PDH);

восстановление потока углерода в митохондрии;

снижение лактата и ацидоза.

Результаты:
DCA восстанавливает митохондриальные функции и стимулирует апоптоз. В ряде клинических наблюдений отмечено замедление роста опухоли при глиомах, карциномах лёгких и молочной железы.

Препараты со средней доказанностью
1. Амигдалин

Амигдалин — природный цианогенный гликозид, содержащийся в косточках абрикоса. В ряде стран используется в составе метаболической терапии, включая внутривенные формы.

Механизм действия:

высвобождение цианидных радикалов под действием β-глюкозидаз, присутствующих в опухолевых тканях;

усиление окислительного стресса и повреждение мембран раковых клеток;

синергия с аскорбатом и DCA.

Амигдалин рассматривается как средство, усиливающее прооксидантное направление метаболической терапии, особенно при гликолитическом фенотипе, где высокий уровень лактата сопровождается снижением антиоксидантной защиты.

2. Оксамат

Оксамат — структурный аналог пирувата и конкурентный ингибитор лактатдегидрогеназы-А (LDHA).

Механизм действия:

блокада превращения пирувата в лактат;

уменьшение выработки молочной кислоты;

снижение внутриклеточного NADH/NAD+ соотношения, что препятствует продолжению гликолиза.

Терапевтическое значение:
Применение оксамата в экспериментальных моделях рака молочной железы, лёгких и печени приводило к уменьшению уровня лактата и повышению чувствительности опухоли к дихлорацетату.

Перспективы комбинированных подходов

Гликолитический фенотип требует многоуровневого терапевтического подхода, поскольку гликолиз — не изолированный процесс, а часть сложной сети взаимодействий между митохондриальным дыханием, аминокислотным и липидным обменом.

Перспективными считаются комбинации:

DCA + метформин — одновременное восстановление митохондриального дыхания и подавление синтеза АТФ;

2-DG + аскорбат или амигдалин — усиление прооксидантного стресса;

Оксамат + DCA — блокада LDHA и активация PDH.

Такой подход позволяет атаковать опухоль сразу по нескольким метаболическим осям, снижая риск адаптации.
2-Дезоксиглюкоза (2-DG) — это структурный аналог глюкозы, который проникает в опухолевые клетки через транспортеры GLUT1 и фосфорилируется гексокиназой, но не может далее участвовать в гликолизе. В результате происходит энергетический дефицит, накопление неутилизируемых метаболитов и блокада синтеза АТФ. Применение 2-DG особенно эффективно при гликолитическом фенотипе опухоли (эффект Варбурга), где клетки зависят от быстрого гликолитического потока. В сочетании с оксаматом (ингибитором лактатдегидрогеназы-А) препарат усиливает торможение образования лактата и снижает уровень ацидоза в опухолевом микроокружении. Комбинация с дихлорацетатом натрия (DCA) обеспечивает двойное воздействие: 2-DG подавляет гликолиз на раннем этапе, а DCA восстанавливает активность пируват-дегидрогеназы и активирует митохондриальное дыхание. Такое сочетание позволяет эффективно подавлять энергетические пути опухоли, снижая выработку лактата.

Заключение

Гликолитический фенотип опухоли — это не просто метаболическая особенность, а фундаментальный механизм её выживания. Воздействие на этот фенотип с помощью метаболических препаратов открывает реальную возможность контролировать рост опухоли, уменьшать метастатическую активность и повышать эффективность классических методов лечения.

Наиболее перспективными средствами остаются дихлорацетат, метформин и 2-дезоксиглюкоза, дополняемые препаратами со средней доказанностью — амигдалином и оксаматом. Все они направлены на одну цель: лишить опухоль её главного источника энергии — гликолиза.

Метаболическая терапия в контексте эффекта Варбурга становится важным направлением современной онкологии, где энергия опухоли превращается в её слабое место.

Примеры статей с данными по сочетаниям и отдельным препаратам

1. “Dichloroacetate and metformin synergistically suppress the growth and enhance the apoptosis of ovarian cancer cells”

   • Авторы исследовали SKOV3 и OVCAR3 клетки (яичниковый рак). PMC

   • Они показали, что сочетание 40 мМ DCA + 10 мМ метформин снижает жизнеспособность клеток сильнее, чем любой препарат сам по себе. PMC

   • В in vivo модели (ксенотрансплантаты в иммунодефицитных мышах) сочетание DCA + метформин значимо подавляло рост опухолей по сравнению с контролем или одиночным применением. PMC

2. “Metformin and sodium dichloroacetate effects on proliferation …” / PLOS ONE

   • В этой работе рассмотрено воздействие DCA и метформина по отдельности и в комбинации на человеческие опухолевые и фибробластные культуры. PMC+1

   • Сочетание (например, 3 мМ DCA + 1–5 мМ метформин) приводило к более выраженному снижению клеточной пролиферации и метаболической активности, чем каждый препарат отдельно. PMC

   • Анализ «Bliss» показал позитивные значения (то есть синергия) для многих сочетаний в исследованных линиях. PMC+1

3. “Metformin and Dichloroacetate Suppress Proliferation of Liver Cancer Cells”

   • Исследование in vitro и in vivo на клетках гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2, PLC/PRF5) и модели мышей. PubMed+1

   • Они применяли 10 мМ метформин + 8 мМ DCA для оценок. Сочетание подавляло выработку лактата и внутриклеточные уровни АТФ сильнее, чем каждый компонент по отдельности. MDPI+1

   • Индекс комбинации (CI) получился ~0,63 и 0,58 для двух линий (HepG2 и PLC/PRF5), что указывает на синергию (CI < 1). MDPI

   • В животной модели сочетание значимо подавляло рост опухолей без токсичности к нормальным гепатоцитам. MDPI

4. “Inhibition of LDH-A by oxamate induces G2/M arrest, apoptosis … non-small cell lung cancer cells”

   • Исследование, в котором оксамат (ингибитор LDHA) вызывал арест клеточного цикла, апоптоз и усиливал чувствительность клетки к цисплатину. spandidos-publications.com

   • Это подтверждает, что оксамат имеет антипрофилеративный эффект при гликолитическом фенотипе. spandidos-publications.com

5. “Lactate Dehydrogenase Inhibition With Oxamate Exerts Anticancer Effects”

   • В данном исследовании использовали панель ингибиторов гликолиза: 2-ДГ, DCA, 3-бромопируват и натриевый оксамат (OXA). PMC+1

   • В клетках костных тканей (osteoprogenitors) оценивали токсичность и сдвиг биоэнергетики (уменьшение гликолиза, увеличение окислительного фосфорилирования). PMC

   • Упоминается, что оксамат (OXA) в исследуемых концентрациях не проявлял существенной токсичности в сравнении с другими ингибиторами. PMC

6. “Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics” (обзор)

   • Обзор, описывающий использование 2-DG, а также сочетания 2-DG с таргетной терапией (например, trastuzumab) для усиления эффекта через ингибирование гликолиза. Nature

   • Авторы показывают, что комбинации, включающие 2-DG, могут усиливать чувствительность устойчивых к терапии линий. Nature

7. “Review Oxamate targeting aggressive cancers …”

   • В обзоре рассматриваются данные применения оксамата в агрессивных опухолях (например, глиобластома, клетки U87, T98) с акцентом на блокаду LDHA. ScienceDirect

   • Указывается, что оксамат и 2-DG приводят к снижению лактатного обмена и торможению пролиферации в таких клетках. ScienceDirect

8. “Positive feedback regulation between glycolysis and histone lactylation”

   • В работе показано, что обработка клеток панкреатической карциномы (линии MIA PaCa-2, AsPC-1) ингибиторами DCA, оксамат и 2-DG существенно снижает миграцию клеток в тестах wound healing и транзитных миграций. molecular-cancer.biomedcentral.com

   • Это демонстрирует, что гликолитические ингибиторы влияют не только на пролиферацию, но и на подвижность клеток. molecular-cancer.biomedcentral.com

     DCA + метформин

     • Dichloroacetate and metformin synergistically suppress the growth and enhance the apoptosis of ovarian cancer cells.
       In vitro (SKOV3/OVCAR3) и in vivo: метформин ослабляет защитную аутофагию, индуцируемую DCA, а DCA уменьшает метформин-индуцированное накопление лактата; итог — синергичное подавление роста и усиление апоптоза. PMC

     • Metformin and Dichloroacetate Suppress Proliferation of Liver Cancer Cells (HCC).
       Механизмы: подавление mTORC1, рост ROS и апоптоз; в ксенографтах комбинирование существенно тормозит опухолевый рост (синергия по CI<1). MDPI+1

     • DCA + метформин в глиоме/ДИПГ и лейкемии (доп. данные).
       Для глиомы/ДИПГ отмечено синергичное повышение оксидативного стресса и остановка пролиферации; для B-CLL — усиление антипролиферативного эффекта в первичных клетках. PMC+1

     • Обзор/кросс-ссылки на разные опухоли.
       Подтверждается синергизм метформина с DCA в ряде моделей (молочная железа, яичник, лёгкое); полезно как «зонтичная» ссылка. Nature

     2-DG + аскорбат (витамин C) / амигдалин

     • Cytotoxic activity of high-dose ascorbic acid is enhanced by 2-DG in glycolytic melanoma cells.
       В меланоме 2-DG усиливает прооксидантную цитотоксичность высокодозного аскорбата, снижая энергетическую компенсацию — больше ROS, меньше выживаемость. PubMed+1

     • Высокодозный аскорбат + метаболические модификаторы (смежные механистические данные).
       Работы по аскорбату показывают усиление эффектов при подавлении систем утилизации H₂O₂/гликолиза — полезно как механистическая опора для стратегий с 2-DG. PMC

     • Амигдалин: современный обзор.
       Сводка по механизмам (β-глюкозидазы, прооксидантный стресс, подходы к доставке) и перспективам — как база для обоснования сочетаний с гликолитическими ингибиторами (клинических данных по паре 2-DG+амигдалин мало, но механистическая логика подтверждается). PMC

     • 2-DG — обзор по комбинированным стратегиям.
       Современный обзор: перечисляет препараты и опухоли, где 2-DG усиливает эффект в комбинациях (в т.ч. с прооксидантами/митохондриальными ингибиторами). PMC

     Оксамат + DCA (LDHA-блокада + активация PDH)

     • Оксамат (ингибитор LDHA) — антипрофилеративные эффекты и сенсибилизация.
       Показаны G2/M-арест, апоптоз и повышение чувствительности (напр., к цисплатину), что логично сочетается с DCA, «проталкивающим» пируват в митохондрии. spandidos-publications.com

     • Обзор по оксамату в агрессивных опухолях (глиобластома и др.).
       Подтверждает снижение LDH-активности, миграции и ростовые эффекты — полезный источник по дозам/моделям для обоснования комбинации с DCA. ScienceDirect

     • Оксамат + DCA: патентные и доклинические данные.
       Комбинированное ингибирование PDK и LDH (в т.ч. через конъюгаты) усиливает противоопухолевый ответ; концептуально подтверждает вашу схему «LDHA-блокада + PDH-активация». Патенты Google

     • Метаболическая гибкость: одновременное ингибирование гликолиза/дыхания.
       Обсуждается усиливающее подавление пролиферации при совместном воздействии на LDH/PDK/ETC; подходит как механизм-ориентированная ссылка под «оксамат + DCA». PMC

Метаболическая терапия рака: мировая практика, мишени и перспективы

Введение

Современная онкология стремительно развивается. За последние два десятилетия внедрение молекулярно-таргетных препаратов, иммунных ингибиторов контрольных точек и персонализированного подбора терапии изменили представления о возможностях лечения злокачественных опухолей. Однако даже самые современные подходы сталкиваются с ограничениями: лекарственная резистентность, токсичность, высокая стоимость.

На этом фоне всё большую известность получает метаболическая терапия рака — направление, которое рассматривает опухоль не только как генетически изменённую ткань, но и как структуру с нарушенным энергетическим обменом. Воздействие на эти особенности открывает новые возможности для замедления прогрессирования болезни и повышения эффективности стандартного лечения.

Почему метаболическая терапия актуальна

Опухолевые клетки обладают метаболическими отличиями от здоровых. Наиболее известное из них — так называемый эффект Варбурга: предпочтение гликолиза как основного источника энергии даже при нормальном поступлении кислорода. Дополнительные особенности включают:

• глутаминовую зависимость — многие опухоли используют глутамин как источник азота и углерода;

• переключение на липидный обмен — некоторые опухоли активно окисляют жирные кислоты;

• повышенное образование активных форм кислорода — опухолевые клетки балансируют на грани прооксидантного стресса;

• сниженную гибкость метаболизма — в отличие от нормальных клеток, опухоль часто «заперта» в одном энергетическом пути.

Эти особенности создают «ахиллесову пяту», на которую можно воздействовать фармакологическими и нутритивными методами.

География применения метаболической терапии

Метаболические подходы активно изучаются и применяются в различных странах:

• Европа — Германия, Австрия и Чехия известны клиническими программами с применением дихлорацетата (DCA), кетогенной диеты, внутривенных высоких доз витамина С и амигдалина для инъекций.

• Северная Америка — в США и Канаде исследуются комбинации метформина, 2-дезоксиглюкозы и кетогенного питания; в онкологических центрах также применяются высокодозные аскорбатные инфузии.

• Южная Америка — в Бразилии и Аргентине используют внутривенный витамин С и амигдалин, а также диетологические программы для контроля уровня глюкозы.

• Азия — Япония, Южная Корея и Китай сосредоточены на растительных метаболических модуляторах (куркумин, ресвератрол, экстракты зелёного чая), а также на митохондриально-направленных препаратах.

Основные направления и их мишени

1. Ингибирование гликолиза

• Препараты: 2-дезоксиглюкоза, дихлорацетат.

• Мишени: ферменты гликолиза, пируват-дегидрогеназная киназа.

• Эффект: снижение потребления глюкозы опухолью, истощение энергетических запасов, повышение чувствительности к радиации и химиотерапии.

2. Влияние на митохондрии и окислительный стресс

• Препараты: метформин, фенформин, высокие дозы аскорбата, амигдалин для внутривенного введения.

• Мишени: дыхательная цепь митохондрий, прооксидантный баланс.

• Эффект: запуск апоптоза, накопление активных форм кислорода, ослабление опухолевых клеток при сохранении жизнеспособности нормальных тканей.

3. Регуляция аминокислотного обмена

• Препараты: ингибиторы глутаминазы (BPTES, CB-839), ограничение глутамина в диете.

• Мишени: зависимость опухоли от глутамина.

• Эффект: блокировка роста глутамин-зависимых опухолей, усиление эффективности иммунотерапии.

4. Модификация липидного метаболизма

• Препараты: этомоксир (ингибитор β-окисления жирных кислот), диетические программы с низким содержанием жиров.

• Мишени: использование жиров в качестве источника энергии.

• Эффект: энергетическое «обеднение» опухолей с липидной зависимостью.

5. Нутритивные стратегии

• Кетогенная диета — перевод организма в состояние кетоза, снижение уровня глюкозы, использование кетоновых тел.

• Ограничение метионина и глутамина — создание неблагоприятных условий для синтеза нуклеотидов и белков опухолевыми клетками.

• Эффект: ослабление роста опухоли при сохранении питания нормальных клеток.

Роль амигдалина

Амигдалин — природный цианогенный гликозид, содержащийся в семенах некоторых растений (например, абрикоса). В ряде стран он применяется в виде внутривенных инъекций как дополнительное средство метаболической терапии.

Предполагаемые механизмы действия включают:

• локальное образование цианидных радикалов в опухолевых тканях, где активны определённые β-глюкозидазы;

• усиление прооксидантного стресса в раковых клетках;

• возможное повышение чувствительности опухоли к классическим видам лечения.

Хотя данные остаются противоречивыми и требуют строгих клинических исследований, амигдалин продолжает использоваться в ряде протоколов как дополнительный метаболический агент.

Перспективы и вызовы

Несмотря на растущий интерес, у метаболической терапии есть свои трудности:

• неравномерность доказательной базы: одни подходы (метформин, кетогенная диета) имеют больше подтверждений, другие (амигдалин, 2-дезоксиглюкоза) требуют дополнительных исследований;

• различия в законодательстве: препараты, разрешённые в одной стране, могут быть под запретом в другой;

• необходимость персонализации: разные опухоли используют разные метаболические пути, поэтому универсального метода не существует;

• вопросы безопасности: избыточное вмешательство в обмен веществ может повлиять и на здоровые клетки.

В то же время возможности огромны. Метаболическая терапия способна усиливать стандартные методы, снижать токсичность лечения, повышать качество жизни пациентов и открывать новые пути для персонализированной медицины.

Заключение

Метаболическая терапия — это не альтернатива классической онкологии, а её дополнение. Она объединяет фармакологию, нутрициологию и молекулярную биологию, создавая условия, в которых опухолевые клетки становятся более уязвимыми.

Применение препаратов вроде дихлорацетата, метформина, высоких доз витамина С, а также амигдалина для внутривенных инъекций демонстрирует, что воздействие на энергетические пути опухоли способно усиливать результаты хирургического, химиотерапевтического и иммунного лечения.

Метаболическая терапия уже сегодня становится важным подспорьем современной онкологии, а в будущем, по мере развития персонализированных подходов, её роль будет только возрастать.

Амигдалинин дуцирует апоптоз через регуляцию экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP

Хён-Кён Чанг, Мал-Сун Шин, Хе-Ян Ян, Джин-Ву Ли, Ён-Сик Ким, Мён-Хва Ли, Джулия Ким, Кхе-Хван Ким и Чанг-Джу Ким*

*Кафедра физиологии, Медицинский колледж, Университет Кён Хи; #1 Хоиги-дон, Донгдэмун-гу, Сеул 130–701, Южная Корея. Получено 8 сентября 2005; принято 1 марта 2006*

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Амигдалин является одним из нитрилозидов, природных веществ, содержащих цианид, в изобилии содержащихся в семенах растений семейства пруназин, которые использовались для лечения раков и облегчения боли. В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. Апоптоз, запрограммированная клеточная смерть, является важным механизмом в лечении рака. В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen (семена абрикоса) и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. В настоящих результатах, клетки DU145 и LNCaP, обработанные амигдалином, проявляли несколько морфологических характеристик апоптоза. Обработка амигдалином увеличивала экспрессию Bax, проапоптотического белка, уменьшала экспрессию Bcl-2, антиапоптотического белка, и увеличивала активность фермента каспазы-3 в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Здесь мы показали, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP путем активации каспазы-3 через down-регуляцию (подавление экспрессии) Bcl-2 и up-регуляцию (усиление экспрессии) Bax. Настоящее исследование показывает, что амигдалин может предложить ценный вариант для лечения раков предстательной железы.

Ключевые слова амигдалин; рак предстательной железы; апоптоз; Bcl-2; Bax; Каспаза-3

Амигдалин (витамин B1717​; ранее называвшийся лаэтрилом) является одним из многих нитрилозидов, которые являются природными веществами, содержащими цианид, в изобилии содержащимися в семенах семейства пруназин, растений, таких как абрикосы, миндаль, персики, яблоки и другие розоцветные растения. Среди пруназинов, Armeniacae semen (семена абрикоса) использовались для лечения астмы, бронхита, эмфиземы, проказы, колоректального рака, витилиго и боли. 1−31−3 Амигдалин состоит из двух молекул глюкозы, одной бензальдегида, который индуцирует анальгезирующее действие, и одной синильной кислоты, которая является противоопухолевым соединением. Помимо вышеуказанных показаний, амигдалин использовался для лечения раков и облегчения боли. 4−64−6 В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. 77

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Эта злокачественная опухоль чаще всего возникает в наружной части предстательной железы, и по мере роста опухоли она метастазирует в ткани вокруг предстательной железы или в семенные пузырьки. 88

Апоптоз, также известный как запрограммированная клеточная смерть, происходит в нескольких патологических ситуациях у многоклеточных организмов и составляет часть общего механизма замены клеток, ремоделирования тканей и удаления поврежденных клеток. Апоптоз представляет собой сложный процесс, характеризующийся сморщиванием клеток, конденсацией хроматина, интернуклеосомной фрагментацией ДНК и образованием «апоптотических тел». 99

Две важные группы белков, вовлеченных в апоптотическую гибель клеток, это члены семейства Bcl-2 1010 и класс цистеиновых протеаз, известных как каспазы. 1111 Семейство Bcl-2 можно классифицировать на две функционально различные группы: антиапоптотические белки и проапоптотические белки. Bcl-2, антиапоптотический белок, как известно, регулирует апоптотические пути и защищает от клеточной смерти. Bax, проапоптотический белок этого семейства, экспрессируется обильно и избирательно во время апоптоза и способствует клеточной смерти. Увеличение соотношения Bcl-2 к Bax обычно использовалось для определения индукции апоптоза в нескольких тканях. 1212 Каспазы являются аспартат-специфичными цистеиновыми протеазами, которые emerged as (проявились как) центральный исполнитель апоптоза. Среди каспаз, активация каспазы-3 рассматривается как первичный механизм апоптоза. 1313 Каспаза-3 может быть активирована через цитозольный выброс цитохрома c белком Bax. 1414

Многочисленные исследования задокументировали, что индукция апоптоза является очень важным механизмом в спонтанном регрессе опухолей и в разработке противоопухолевых агентов. 1515 Апоптоз опухолевых клеток способствует уменьшению опухоли и promotes (способствует) регрессии опухоли. 1616 Более того, известно, что противораковые препараты индуцируют апоптоз опухолевых клеток, повреждая их ДНК, ингибируя синтез ДНК, истощая внутриклеточный пул нуклеотидов и разрушая митотический аппарат. 17,1817,18

В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. Для этого исследования использовались анализ с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ), окрашивание 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), анализ мечения ник-концов dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) (TUNEL-анализ), обратная транскриптаза-полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Вестерн-блоттинг анализ и анализ активности фермента каспазы-3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экстракция амигдалина Armeniacae semen, использованные в этом эксперименте, были получены с рынка Кёндон (Сеул, Корея). 500 г Armeniacae semen, вылущенных из скорлупы, и 10 л 4% раствора лимонной кислоты упаривали в течение 2 ч. После фильтрования в горячем состоянии, фильтрат пропускали через колонку, заполненную HP-20. Вещество, поглощенное в колонке, концентрировали после его элюирования этанолом. Амигдалин (4,2 г для получения выходной скорости 0,84%) был получен путем перекристаллизации экстракта с этанолом. Амигдалин использовали после того, как чистота была

• Кому следует направлять корреспонденцию. e-mail: changju@khu.ac.kr

© 2006 Фармацевтическое общество Японии

===== Страница 2 =====

1598 Vol. 29, No. 8

определена как >99,0% с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ; Shiseido, Токио).

Препараты и реагенты МТТ и DAPI были получены от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, МО, США). TUNEL-анализ был получен от Boehringer Mannheim (Маннхайм, Германия), и набор для анализа каспазы-3 от CLONTECH (Пало-Альто, Калифорния, США).

Культура клеток Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP были purchased (приобретены) из Корейского банка клеточных линий (KCLB, Сеул, Корея). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Jell Biotechservices Inc., Тэгу, Корея) с добавлением 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) при 37°C во влажном клеточном инкубаторе с атмосферой 5% CO22​-95% O22​. Среду меняли каждые 2 дня. Клетки высевали на чашки для культивирования при плотности 2$\times$1044 клеток/см22 за 24 ч до обработок амигдалином.

Анализ цитотоксичности МТТ Клетки рака предстательной железы DU145 и LNCaP выращивали в конечном объеме 100 мкл культуральной среды на лунку в 96-луночных планшетах. Для определения цитотоксичности амигдалина, клетки обрабатывали амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Клетки контрольной группы оставляли необработанными. После добавления 10 мкл меточного реагента МТТ, содержащего 5 мг/мл МТТ в фосфатно-солевом буфере (PBS), в каждую лунку, планшеты инкубировали в течение 4 ч. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора для солюбилизации, содержащего 10% додецилсульфат натрия (SDS) в 0,01 М соляной кислоте (HCl), и клетки инкубировали еще в течение 12 ч. Затем оптическую плотность (ОП) измеряли с помощью микропланшетного ридера (Bio-Tek, Уинуски, Вермонт, США) при тестовой длине волны 595 нм с референсной длиной волны 690 нм. Оптическая плотность (O.D.) рассчитывалась как разница между поглощением на референсной длине волны и наблюдаемым на тестовой длине волны. Процент жизнеспособности рассчитывали как (O.D. обработанного препаратом образца/контрольный O.D.)$\times$100.

Окрашивание DAPI Клетки сначала культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International, Нейпервилл, Иллинойс, США). После обработки амигдалином клетки собирали и фиксировали путем инкубации в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин. После промывки в PBS клетки инкубировали в 1 мкг/мл DAPI в метаноле в течение 30 мин в темноте. Затем клетки наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Zeiss, Оберкохен, Германия).

Окрашивание TUNEL Для in-situ детекции апоптотических клеток, TUNEL-анализ проводили с использованием набора для детекции апоптоза in situ ApoTag® пероксидаза. Клетки культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International) при плотности 2$\times$1044 клеток/камеру. После обработки амигдалином клетки промывали PBS и фиксировали путем инкубации в 4% PFA при 4°C в течение 10 мин. Затем фиксированные клетки инкубировали с конъюгированным с дигоксигенином dUTP в реакции, катализируемой TdT, при 37°C во влажной атмосфере в течение 60 мин и погружали в стоп/промывочный буфер при комнатной температуре на 10 мин. Затем клетки инкубировали с анти-дигоксигениновым антителом, конъюгированным с пероксидазой, в течение 30 мин. Фрагменты ДНК окрашивали с использованием 3,3-диаминобензидина (DAB; Sigma Chemical Co., США) в качестве субстрата для пероксидазы.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР Для идентификации экспрессии мРНК Bcl-2 и Bax, проводили ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли из клеток DU145 и LNCaP с использованием RNAzoI™B (TEL-TEST, Френдсвуд, Техас, США). Два микрограмма РНК и 2 мкл случайных гексамеров (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) добавляли вместе, и смесь нагревали при 65°C в течение 10 мин. Затем один микролитр AMV обратной транскриптазы (Promega), 5 мкл 10 мМ dNTP (Promega), 1 мкл RNasin (Promega) и 5 мкл 10× буфера для AMV RT (Promega) добавляли к смеси, и конечный объем доводили до 50 мкл водой, обработанной диметилпирокарбонатом (DEPC). Затем реакционную смесь инкубировали при 42°C в течение 1 ч.

ПЦР-амплификацию проводили в реакционном объеме 40 мкл, содержащем 1 мкл соответствующей кДНК, 1 мкл каждого набора праймеров в концентрации 10 пМ, 4 мкл 10× ПЦР буфера, 1 мкл 2,5 мМ dNTP и 2 единицы Taq ДНК-полимеразы (TaKaRa, Сига). Для человеческого Bcl-2, последовательности праймеров были 5'-CGAGACTTCTCCGGCGGCTACCGCA-3' (25-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 334) и 5'-CGGCATGTGGGGCCGTACAGTTCC-3' (25-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 628). Для человеческого Bax, последовательности праймеров были 5'-GTGCACAAAGTGGCGGAAAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 375) и 5'-TCAGCCATCTTCTCCAGAT-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 560). Для циклофилина, внутреннего контроля, использованного в этом исследовании, последовательности праймеров были 5'-ACCCCACCGTTCTTCTGAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 52) и 5'-CATTTGCCATGGACAAGATG-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 332). Ожидаемый размер ПЦР-продукта составлял 318 п.н. для Bcl-2, 205 п.н. для Bax и 299 п.н. для циклофилина.

Для Bcl-2 и Bax, процедуры ПЦР проводили с использованием системы ПЦР GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer, Норуолк, Коннектикут, США) в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 30 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 58°C в течение 30 с и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Для циклофилина, процедура ПЦР выполнялась в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 25 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 55°C и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Конечное количество продукта ОТ-ПЦР для каждого вида мРНК рассчитывали денситометрически с использованием Molecular Analyst™ версия 1.4.1 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).

Вестерн-блот анализ Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP лизировали в ледяном буфере для лизиса целых клеток, содержащем 50 мМ HEPES (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 1% Тритон X-100, 1,5 мМ гексагидрат хлорида магния, 1 мМ этиленгликоль-бис-(β-аминоэтиловый эфир)-N,N'-тетрауксусная кислота (EGTA), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 2 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин, 1 мМ ортованадат натрия и 100 мМ фторид натрия. Смесь инкубировали при 4°C в течение 30 мин. Клеточный дебрис удаляли путем микроцентрифугирования, с последующей быстрой заморозкой супернатанта. Концентрацию белка измеряли с использованием колориметрического набора для определения белка Bio-Rad (Bio-Rad). Сорок микрограмм белка разделяли на SDS-полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher & Schuell GmbH, Дассель, Германия). Мышиные анти-актин, анти-Bcl-2 и анти-Bax ан-

===== Страница 3 =====

Август 2006 1599

титела (1:1000; Santa Cruz Biotech, Калифорния, США) использовали в качестве первичных антител. Конъюгированное с пероксидазой хрена кроличье анти-мышиное антитело (1:2000; Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Фрайбург, Германия) использовали в качестве вторичного антитела. Детекцию полос проводили с использованием системы детекции с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech GmbH).

Анализ активности фермента каспазы Активность фермента каспазы измеряли с использованием набора для анализа каспазы-3 ApoAlert® в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, после обработки амигдалином клетки лизировали 50 мкл охлажденного буфера для лизиса клеток. Пятьдесят микролитров 2× реакционного буфера (содержащего DTT) и 5 мкл соответствующего конъюгированного субстрата в концентрации 1 мМ добавляли к каждому лизату. Смесь инкубировали в водяной бане при 37°C в течение 1 ч, и поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера при тестовой длине волны 405 нм.

Статистический анализ Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.). Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим пост-хок тестом Дункана с использованием SPSS. Различия считались статистически значимыми при $p<0,05$.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние амигдалина на жизнеспособность клеток рака предстательной железы Для оценки цитотоксического эффекта амигдалина на клетки рака предстательной железы человека, клетки DU145 и LNCaP культивировали с амигдалином в конечных концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, после чего проводили анализы МТТ. Клетки, культивируемые в средах без амигдалина, использовали в качестве контроля.

Жизнеспособность человеческих клеток DU145, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 82,67±2,22% ($n=8,p<0,05$), 77,25±2,06% ($n=8,p<0,05$), 76,09±1,90% ($n=8,p<0,05$) и 45,63±1,65% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Жизнеспособность человеческих клеток LNCaP, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 96,68±1,11% ($n=8,p<0,05$), 91,33±1,57% ($n=8,p<0,05$), 57,11±0,81% ($n=8,p<0,05$) и 45,02±0,73% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Тенденция к снижению жизнеспособности с увеличением концентрации амигдалина была достоверно observed (наблюдаема) при 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в обоих типах клеток DU145 и LNCaP. Результаты анализа МТТ показали, что амигдалин оказывает дозозависимый цитотоксический эффект на клетки рака предстательной железы.

Морфологические изменения, индуцированные амигдалином Анализ DAPI выявил возникновение конденсации ядра, фрагментации ДНК и перинуклеарных апоптотических тел при обработке амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Апоптотические тельца, один из строгих морфологических критериев апоптоза, характерно присутствовали в обработанных амигдалином клетках DU145 и LNCaP, окрашенных DAPI (Рис. 2).

Разрывы цепей ДНК происходят во время апоптоза, и известно, что ники в молекулах ДНК могут быть обнаружены с помощью TUNEL-анализа. TUNEL-позитивные клетки были окрашены в темно-коричневый цвет при световой микроскопии, и конденсация ядра наблюдалась в клетках, обработанных 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл амигдалина. В настоящем исследовании, TUNEL-позитивные клетки, которые указывали на возникновение апоптоза, наблюдались среди обработанных амигдалином клеток DU145 и LNCaP (Рис. 2).

Влияние амигдалина на экспрессию мРНК Bcl-2 и Bax Анализ ОТ-ПЦР уровней мРНК Bcl-2 и Bax был performed (проведен) для оценки относительных уровней экспрессии этих генов. В настоящем исследовании, уровень мРНК Bcl-2 и Bax в контрольных клетках был установлен как 1,00.

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках DU145, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,89±0,05 ($n=4,p<0,05$), 0,69±0,03 ($n=4,p<0,05$) и 0,21±0,03 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно increased (увеличен) до 1,08±0,07 ($n=4,p<0,05$), 2,07±0,17 ($n=4,p<0,05$) и 2,43±0,15 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках LNCaP, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,78±0,20 ($n=4,p<0,05$), 0,52±0,20 ($n=4,p<0,05$) и 0,48±0,38 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно увеличен до 2,25±0,25 ($n=4,p<0,05$), 2,42±0,27 ($n=4,p<0,05$) и 3,64±0,50 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

Настоящие результаты показали, что амигдалин оказывает снижающее действие на экспрессию мРНК Bcl-2 и ускоряющее действие на экспрессию мРНК Bax дозозависимым образом на обе клеточные линии рака предстательной железы DU145 и LNCaP.

Вестерн-блот анализ белков Bcl-2 и Bax Эф-

===== Страница 4 =====

1600 Vol. 29, No. 8

A B C D
DAPI

TUNEL

A B C D
DAPI

TUNEL

Рис. 2. Морфологические наблюдения клеток, обработанных амигдалином (A) Контрольная группа; (B) группа, обработанная амигдалином 0,1 мг/мл; (C) группа, обработанная амигдалином 1 мг/мл; (D) группа, обработанная амигдалином 10 мг/мл. Эксперименты повторялись по крайней мере четыре раза. Вверху: Влияние амигдалина на клетки DU145, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL. Внизу: Влияние амигдалина на клетки LNCaP, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL.

фекты амигдалина на экспрессию белков Bcl-2 и Bax были исследованы. Уровень экспрессии актина indicated (указывал), что количество образца было загружено одинаково. После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл на клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP, экспрессия белка Bcl-2 (25 кДа) дозозависимо снижалась, тогда как экспрессия белка Bax (26 кДа) дозозависимо увеличивалась (Рис. 4).

Анализ активности фермента каспазы-3 Активность фермента каспазы-3 измеряли с использованием DEVD-пептид-нитроанилида (pNA). После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках DU145 было достоверно increased (увеличено) с контрольного значения 5,25±0,50 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 9,47±0,11 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 11,66±0,67 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 11,62±0,59 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 7,28±0,35 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk. DEVD-fmk является ингибитором каспазы-3 (Рис. 5)

После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках LNCaP было достоверно увеличено с контрольного значения 4,21±0,07 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 6,82±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 7,36±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 7,50±0,24 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 4,26±0,28 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk (Рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Разнообразные сигналы могут запускать апоптотический процесс во время развития опухоли. В некоторых случаях, истощение факторов роста/выживания, гипоксия, радиация, потеря клеточно-матриксных взаимодействий, повреждение ДНК и нарушения теломер могут быть включены в число триггеров апоптоза.20 Исследование действий большинства противоопухолевых агентов было сосредоточено на их внутриклеточных сигналах-мишенях, которые индуцируют гибель опухолевых клеток. Противоопухолевые действия подразумевают клеточные ответы, происходящие во время взаимодействий, которые индуцируют гибель опухолевых клеток.21,22 Индукция апоптоза в раковых клетках нарушает инициацию, прогрессию и метастазирование опухолевых клеток.23

В настоящем исследовании, оценка жизнеспособности клеток с использованием анализа МТТ подтвердила, что амигдалин в высоких концентрациях проявляет дозозависимую цитотоксичность в отношении клеток рака предстательной железы DU145 и LNCaP (Рис. 1). Более того, амигдалин индуцировал характерные апоптотические изменения в морфологии клеток рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Разрывы цепей ДНК, которые происходят во время апоптоза,24 наблюдались как TUNEL-позитивные клетки в обработанных амигдалином клетках. Кроме того, апоптотические тельца были обнаружены с помощью окрашивания DAPI в клетках DU145 и LNCaP, обработанных амигдалином (Рис. 2).

Bcl-2, антиапоптотический белок семейства Bcl-2, как известно, способствует неопластической прогрессии, усиливая выживаемость опухолевых клеток через ингибирование апоптоза.26 В большинстве андроген-независимых раков предстательной железы можно наблюдать сверхэкспрессию Bcl-2.27,28 Экспрессия Bcl-2 также значительно усилена при ранних раках предстательной железы.29 В доклинических моделях рака предстательной железы, ингибирование экспрессии Bcl-2 потенцировало химиотерапевтический эффект путем увеличения апоптоза в

===== Страница 5 =====

клетках рака предстательной железы.[30, 31] В настоящем исследовании, амигдалин подавлял экспрессию мРНК Bcl-2, а также down-регулировал (подавлял) экспрессию белка Bcl-2 в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP дозозависимым образом.

Многочисленные исследования сообщали, что сверхэкспрессия белка Bax вызывает выброс цитохрома c, активацию каспазного пути и апоптоз в большинстве клеточных линий рака предстательной железы.[32, 33] Модуляция экспрессии Bax имеет широкое применение для индукции терапевтического апоптоза в лечении рака. Марчелли и др.[34] сообщили, что сверхэкспрессия Bax может индуцировать апоптотическую гибель клеток в нескольких клетках рака предстательной железы, таких как линии клеток DU145 и PC-3, которые устойчивы к некоторым типам химически индуцированного апоптоза. Более того, Лоу и др.[35] сообщили, что сверхэкспрессия белка Bax с помощью промотора, специфичного для предстательной железы, может индуцировать апоптоз в клетках карциномы предстательной железы человека LNCaP, предполагая, что генная терапия Bax является перспективным подходом для лечения раков предстательной железы. В настоящем исследовании, амигдалин усиливал экспрессию мРНК Bax и up-регулировал (усиливал) экспрессию белка Bax в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP дозозависимым образом.

Каспазы, семейство цистеиновых протеаз, как известно, образуют неотъемлемые части апоптотического пути. В частности, каспаза-3 имеет множество клеточных мишеней, и активация этого белка производит типичные морфологические особенности апоптоза.[11] Активированная каспаза-3 расщепляет свой субстрат, и этот процесс знаменует начало расщепления ДНК.[36] В настоящем исследовании, активность фермента каспазы-3 была increased (увеличена) обработкой амигдалином в клетках DU145 и LNCaP, что позволяет предположить, что амигдалин оказывает противораковый эффект, индуцируя апоптоз в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP.

В настоящем исследовании, обработка высокими концентрациями амигдалина клеток рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP индуцировала апоптотическую гибель клеток. Наиболее сильный апоптотический

Рис. 4: Вестерн-блот анализ уровней белка Bcl-2 и Bax

Рис. 5: Активность фермента каспазы-3

Рис. 3: Результаты анализа ОТ-ПЦР уровней мРНК Bcl-2 и Bax

===== Страница 6 =====

эффект наблюдался при 10 мг/мл амигдалина в этом исследовании. В некоторых клинических исследованиях, $2-9\text{г/кг}$ амигдалина вводили внутривенно для достижения противораковых эффектов у мужчин. Следовательно, возможно, что высокие дозы амигдалина, использованные в этом исследовании, могут совпадать с клиническими дозировками для пациентов. Недавно сообщалось, что \textit{Armeniacae semen}, содержащие abundant (обильное количество) амигдалина, проявляют анальгезирующий и противовоспалительный эффекты, показывая, что низкие дозы амигдалина могут облегчать боль.11 Было предложено много гипотез для объяснения противораковых эффектов амигдалина. Например, амигдалин может быть специфично расщеплен бета-глюкозидазой, которая в изобилии содержится в раковых клетках, и, следовательно, цианид высвобождается на раковые поражения, где он оказывает токсичность на раковые клетки.37−3937−39 Другое предположение заключается в том, что амигдалин усиливает функции панкреатических ферментов, которые могут предотвращать трансформацию первичных зародышевых клеток рака.4,384,38 Третья гипотеза состоит в том, что амигдалин (витамин B1717​) восстанавливает дефицит витаминов, который мог привести к метаболическим нарушениям у больных раком.4040 В частности, Бхатти и др.4141 сообщили, что амигдалин может стимулировать иммунную систему для производства противораковой активности у пациентов с раком предстательной железы.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток путем активации каспазы-3 через down-регуляцию антиапоптотического белка Bcl-2 и up-регуляцию проапоптотического белка Bax в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Основываясь на этих результатах, амигдалин показывает considerable (значительные) перспективы в лечении раков предстательной железы.

Благодарности Это исследование было поддержано грантом проекта по разработке восточной медицины, Министерство здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея. (0405-OD00-0815-В050049)

ЛИТЕРАТУРА

1. Chang H. K., Yang H. Y., Lee T. H., Shin M. C., Lee M. H., Shin M. S., Kim C. J., Kim O. J., Hong S. P., Cho S., \textit{Biol. Pharm. Bull.}, 28, 449—454 (2005).

2. Hwang D. R., Kang Y. S., Kim S. S., Kim D. H., Shin M. K., Song H. J., \textit{Kor. J. Herbol.}, 18, 201—208 (2003).

3. Pak J. U., Moon S. J., Moon K., Won J. H., \textit{J. Kor. Orient. Oncol.}, 5, 137—150 (1999).

4. Ellison N. M., Byar D. P., Newell G. R., \textit{New Engl. J. Med.}, 299, 549—552 (1978).

5. Fukuta T., Ito H., Mukainaka T., Tokuda H., Nishino H., Yoshida T., \textit{Biol. Pharm. Bull.}, 26, 271—273 (2003).

6. Shim B. S., Park J. K., Choi S. H., \textit{J. Kor. Orient. Oncol.}, 6, 19—28 (2000).

7. Koo J. Y., Hwang E. Y., Cho S., Lee J. H., Lee Y. M., Hong S. P., \textit{J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.}, 814, 69—73 (2005).

8. Landis S. H., Murray T., Bolden S., Wingo P. A., \textit{Cd Cancer J. Clin.}, 49, 8—31 (1999).

9. Wylie A. H., Kerr J. F., Currie A. R., \textit{Int. Rev. Cytol.}, 68, 251—306 (1980).

10. Korsmeyer S. J., \textit{Cancer Res.}, 59, 1693—1700 (1999).

11. Cohen G. M., \textit{Biochem. J.}, 326, 1—16 (1997).

12. Oliva Z. N., Milliman C. L., Korsmeyer S. J., \textit{Cell.}, 74, 609—619 (1993).

13. Nagata S., \textit{Cell.}, 88, 355—365 (1997).

14. Communal C., Sumandea M., de Tombe P., Narula J., Solano R. J., Hajjar R. J., \textit{Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.}, 99, 6252—6256 (2002).

15. Thompson C. B., \textit{Science}, 267, 1456—1462 (1995).

16. Lowe S. W., Lin A. W., \textit{Corcinogenesis}, 21, 485—495 (2000).

17. Fisher D. E., \textit{Cell.}, 78, 539—542 (1994).

18. Steller H., \textit{Science}, 267, 1445—1449 (1995).

19. Wright S. C., Wei Q. S., Kinder D. H., Larrick J. W., \textit{J. Exp. Med.}, 183, 463—471 (1996).

20. Raff M. C., \textit{Nature} (London), 356, 397—400 (1992).

21. Dive C., Hickman J. A., \textit{Br. J. Cancer}, 64, 192—196 (1991).

22. Eastman A., \textit{Cancer Cells}, 2, 275—280 (1990).

23. Frisch S. M., Francis H., \textit{J. Cell Biol.}, 124, 619—626 (1994).

24. Qiao L., Hanif R., Sphicas E., Shiff S. J., Rigas B., \textit{Biochem. Pharmacol.}, 55, 53—64 (1998).

25. Eastman A., Barry M. A., \textit{Cancer Invest.}, 10, 229—240 (1992).

26. Tsujimoto Y., Croce C. M., \textit{Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.}, 83, 5314—5218 (1986).

27. Colombel M., Symmans F., Gil S., O’Toole K. M., Chopin D., Benson M., Olsson C. A., Korsmeyer S., Buttyan R., \textit{Am. J. Path.}, 143, 390—400 (1993).

28. McDonnell T. J., Navone N. M., Troncoso P., Pisters L. L., Conti C., von Eschenbach A. C., Brisbay S., Logothetis C. J., \textit{J. Urol.}, 157, 569—574 (1997).

29. McDonnell T. J., Troncoso P., Brisbay S. M., Logothetis C., Chung L. W., Hsieh J. T., Tu S. M., Campbell M. L., \textit{Cancer Res.}, 52, 6940—6944 (1992).

30. Gleave M. E., Tolcher A., Miyake H., Nelson C., Brown B., Beraldi E., Goldie J., \textit{Clin. Cancer Res.}, 5, 2891—2898 (1999).

31. Miyake H., Monia B. P., Gleave M. E., \textit{Int. J. Cancer}, 86, 855—862 (2000).

32. Du C., Fang M., Li Y., Li L., Wang X., \textit{Cell.}, 102, 33—42 (2000).

33. Verdagren A. M., Ekert P. G., Pakusch M., Silke J., Connolly L. M., Reid G. E., Moritz R. M., Simpson R. J., Vaux D. L., \textit{Cell.}, 102, 55—66 (2000).

34. Marcelli M., Marani M., Li X., Sturgis L., Haidacher S. J., Trial J. A., Mannucci R., Nicoletti I., Denner L., \textit{Prostate}, 42, 260—273 (2000).

35. Lowe S. L., Rubinchik S., Honda T., McDonnell T. J., Dong J. Y., Norris J. S., \textit{Gene Therapy}, 8, 1363—1371 (2001).

36. Hoshi T., Sasano H., Kato K., Yabuki N., Ohara S., Konno R., Asaki S., Toyota T., Tateno H., Nagura H., \textit{Anticancer Res.}, 18, 4347—4353 (1998).

37. Dorr R. T., Paxinos J., \textit{Ann. Intern. Med.}, 89, 389—397 (1978).

38. Greenberg D. M., \textit{Cancer}, 45, 799—807 (1980).

39. Herbert V., \textit{Am. J. Clin. Nutr.}, 32, 1121—1158 (1979).

40. Young V. R., Newberne P. M., \textit{Cancer}, 47, S1226—1240 (1981).

41. Bhatti R. A., Ablin R. J., Guinan P. D., \textit{IRCS Med. Sci. Biochem.}, 9, 19 (1981).

Совместное лечение дихлорацетатом и омепразолом оказываетсинергическоеантипролиферативноедействиена злокачественные опухоли

TATSUAKIISHIGURO1,2,MIYUISHIGURO1,RYUMEIISHIGURO1иSAYURIIWAI1

1Отделениеэкспериментальнойтерапии,KamuiMedicalCo.,Ltd.,Токио 1120002;

2КлиникаХибияУчисайвайчо,Токио1050004,ЯпонияПоступила 14 ноября 2011 г.; принята 28 декабря 2011 г. DOI: 10.3892/ol.2012.552

Аннотация. Сообщалось, что обработка раковых клеток дихлорацетатом (ДХА), одобренным для лечения врожденного молочнокислого ацидоза, обращает эффект Варбурга и подавляет рост опухоли). Кроме того, омепразол (OMP) - хорошо известный агент, усиливающий действие противораковых препаратов. Целью данного исследования было найти клинически используемые препараты, усиливающие действие DCA. Комбинация DCA и OMP проявляла более мощную противоопухолевую активность, чем только DCA, в отношении клеток фибросаркомы HT1080 и рака толстой кишки RKO, при этом препараты не влияли на пролиферацию фибробластов человека WI-38. Ингибирующий эффект DCA в сочетании с OMP был отменен витамином Е и Z- VAD-FMK, поэтому в качестве механизма ингибирования было предложено традиционное каспазозависимое ингибирование клеточного роста через производство супероксида. Комбинация этих препаратов также оказывала действие на клеткифибросаркомыHT1080,инокулированныемышам.ПосколькуOMP и DCA могут применяться перорально и уже несколько лет используются в клинической практике без серьезных побочных эффектов, мы считаем, что эта комбинированная терапия может быть легко применена для лечения злокачественных опухолей.

Введение

Варбург впервые заметил, что даже в присутствии достаточного количества кислорода раковые клетки предпочитают метаболизировать глюкозу и вырабатывать молочную кислоту (1- 4). Сопутствующее увеличение поглощения глюкозы может быть использовано в клинических условиях для выявления большинства солидных злокачественных опухолей с помощью позитронно- эмиссионной томографии с фтордезоксиглюкозой (ФДГ-ПЭТ).Одна из возможных причин того, что раковые опухоли используют этот менее эффективный путь производства аденозинтрифосфата (АТФ) по сравнению с окислительным фосфорилированием

Запись по адресу: Д-р Тацуаки Исигуро, Kamui Medical Co., Ltd., 2-20-13 Koishikawa Bunkyo-ku, Tokyo 1120002, Japan.

E-mail:ti227241@ka3.so-net.ne.jp

Сокращения: DCA - дихлорацетат; PPI - ингибитор протонной помпы;OMP - омепразол; SOD - супероксид; ROS - реактивные видыкислорода.

Ключевыеслова:фибросаркома,рактолстойкишки,дихлорацетат,омепразол

являетсяегопреимуществомдлявыживанияипролиферациив уникальной гипоксической среде опухоли (5). Предпочтение анаэробного дыхания также считается причиной устойчивости раковых клеток к противораковым препаратам, вызывающим апоптоз по митохондриальному пути. Bonnet et al. сообщили, что обработкараковыхклетокдихлорацетатом(ДХА),одобреннымдля лечения врожденного молочнокислого ацидоза, обращает эффект Варбурга и подавляет рост опухоли (3,4,6-8). ДКА увеличивает приток пирувата в митохондрии за счет ингибирования киназы пируватдегидрогеназы и способствует преобладанию окисления глюкозы над гликолизом. В результате DCA снижает выработку молочной кислоты опухолью и повышает внутриклеточный pH. ДКА вызывает апоптоз по двум путям: в митохондриях, где деполяризация и выработка супероксида (SOD) активируют митохондрий-зависимый апоптоз, ина уровне плазмалеммы, где активация/регуляция каналов Kv1.5 снижает (K+)i, активируя каспазы (6). DCA является перспективным противораковым препаратом благодаря удобству перорального применения, низкой стоимости, малому количеству побочных эффектов и большому опыту клинического использования (7,8). Несмотря на то что он представляется перспективным средством для лечения злокачественных опухолей, его действие ограничено в продолжающихся отчетах о клинических испытаниях. Поэтому мы задались целью найти клинически используемые препараты,

усиливающиедействие DCA.

Омепразол (ОМП) является ингибитором протонной помпы (ИПП) и, как известно, усиливает действие противораковых препаратов (9). ОМП ингибирует активность V-АТФазы, а также воздействует на кислотный насос желудка. Сообщалось, что он подавляет пролиферацию опухолевых клеток, возможно, за счет подщелачивания лизосом и пермеабилизации мембран лизосом с последующим образованием реактивных форм кислорода (ROS) (10,11).

Как уже говорилось, считается, что DCA и OMP ингибируют ростопухолевыхклетокчерезобщийпутьпроизводстваROSпутем влияния на внутриклеточный уровень pH. Поскольку эти два препарата используются в клинической практике с незначительными побочными эффектами, мы считаем, что их комбинацияявляетсяперспективным протоколомдлялечения рака.

Материалы иметоды

Химические вещества. DCA и витамин Е (токоферола ацетат) были приобретены у компании Wako Chemical Industries, Ltd. (Токио, Япония). (Токио, Япония). OMP был приобретен у Astra Zeneca Japan (Осака, Япония). Z-VAD-FMK был приобретен у Peptide Institute, Inc. (Осака, Япония).

Культура клеток. Клетки фибросаркомы человека HT1080, клетки фибробластов человека WI-38 и клетки рака толстой кишки RKO высевали и выращивали в модифицированной среде Дульбекко Орла, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и выдерживали в инкубаторе.

при37˚Cи5%CO2.Дляэкспериментовпопролиферацииклетоких высевали в 12-луночные планшеты и инкубировали в тех же условиях. Через 7 дней клетки обрабатывали трипсином-ЭДТА и подсчитывали под микроскопом.

Эксперименты на животных. Клетки HT1080 (5x106) подкожно прививали мышам nude (самки 8w). Препараты добавляли в питьевую воду для достижения суточной дозы, аналогичной той, которая используется в клинических условиях (DCA 50 мг/кг, OMP 2 мг/кг). Размер каждой опухоли измеряли штангенциркулем, а объем опухоли рассчитывали путем умножения трех диаметров.

Результаты

Комбинированное лечение DCA и OMP подавляло пролиферацию клеток. Клетки фибросаркомы человека HT1080 культивировали с возрастающимиконцентрациямиDCAиOMPвтечение7дней,что приводило к дозозависимому ингибированию пролиферации (рис. 1). Как показано на рис. 2А, комбинация DCA и OMP заметно блокировала пролиферацию HT1080.

фибросаркомы, в то время как эта же комбинация не влияла на пролиферацию нормальных клеток фибробластов человека WI-38.

Витамин Е подавлял действие DCA и OMP. Хотя механизм каспазозависимого ингибирования роста клеток под действием OMP вызывает споры (10,11), сообщалось, что DCA и OMP подавляют рост опухолевых клеток за счет выработки СОД (6,10). Чтобы выяснить, действует ли тот же механизм в клетках фибросаркомы HT1080, мы использовали витамин Е в качестве ингибитора СОД. Витамин Е успешно ингибировал действие DCAи OMP, что позволило предположить участие СОД в торможении роста опухолевых клеток (рис. 2В). Пан-каспазный ингибитор Z- VAD-FMK также подавлял действие этих препаратов, поэтому можно предположить, что в этих процессах, по крайней мере частично, задействован каспазозависимый противоопухолевый механизм (рис. 2В). В целом, DCA и OMP подавляют рост клеток фибросаркомы HT1080, возможно, через каспазозависимый путь посредством выработки SOD. В результате при совместном применении препараты могут проявлять синергетический эффект. ЭтотсинергетическийэффектиингибирующийэффектвитаминаЕ также наблюдался в клетках рака толстой кишки RKO (рис. 3).

Мыпровелиэкспериментынаживотных,чтобыизучитьдействие DCA и OMP in vivo. Как показано на рис. 4, противоопухолевый эффект комбинации DCA и OMP также был выше, чем у одного из препаратов.

Обсуждение

Мы показали, что комбинированное лечение DCA и OMP более эффективно, чем лечение одним из препаратов в клетках фибросаркомы человека HT1080 и клетках рака толстой кишки RKO. Комбинированная терапия была также эффективна в экспериментах на животных.

DCAиOMPбезопасноиспользуютсявтечениенесколькихлет, нонеотносятсякпротивораковымпрепаратам.DCAиспользовался для лечения врожденного метаболического ацидоза, а OMP - для лечения кислотозависимых заболеваний, причем оба препарата не вызывали серьезных побочных эффектов (7,8,12,13). Ожидается,что комбинация DCA и OMP позволит снизить необходимую дозу каждого препарата и сопутствующие риски.

Сообщалось, что пероральный прием 20 мг ОМП один раз в день приводит к максимальной концентрации в плазме крови у пациентов

~2,5 мкг/мл (7 мкМ) через 2 часа после приема (14). Доза 120 мг ОМП три раза в день использовалась для лечения синдрома Золлингера-Эллисона, при этом даже при длительном применении наблюдалисьлишьредкиеи слабыепобочныеэффекты(15,16).Эта доза соответствует гипотетической пиковой концентрации in vivo

~15 мкг/мл (42 мкМ). Передозировка до 2400 мг [гипотетическая пиковаяконцентрациявплазме300мкг/мл(840мкМ)]переносится с незначительными побочными эффектами (17). ДКА уже зарекомендовал себя в клинической практике. Значение Cmax DCA у взрослых после 6 месяцев непрерывного лечения (пероральные дозы 25 мг/кг/день) составило 53±18 мкг/мл (0,35±0,12 мМ) (18). Пациенты благополучно переносили хроническое лечение ДКА в максимальной дозе 50 мг/кг/сут (19). Ряд детей с молочнокислым ацидозом получали ДКА в дозе >100 мг/кг в сутки в течение длительного периода времени (8). Исходя из этих данных, мы считаем, что необходимая доза этих двух препаратов является переносимой. Более того, кандидаты в аналоги ДКА, обладающие меньшей токсичностью и лучшим связывающим сродством, были

(20). Таким образом, комбинация DCA и OMP рассматривается как потенциальный вариант терапии злокачественных опухолей и может привести к разработке новой терапевтической стратегии.

Ссылки

1. Warburg O: Ueber den Stoffwechsel der Tumoren, Constable, London,
2. WarburgO: Onthe origin ofcancer cells. Science123: 309-314,
3. Hsu PP и Sabatini DM: Метаболизм раковых клеток: Варбург и нетолько. Cell 134: 703-707, 2008.
4. MichelakisED,WebsterLandMackeyLR:Dichloroacetate(DCA)asapotential metabolic-targeting therapy for cancer. Br J Cancer 99: 989-994,2008.
5. Plas DR и Thompson CB: Клеточный метаболизм в регуляциизапрограммированной клеточной смерти. Trends Endocrinol Metab13: 75-78, 2002.
6. Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C,Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, et al: Amitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and itsnormalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. CancerCell 11: 37-51, 2007.
7. Stacpoole PW: The pharmacology of dichloroacetate. Метаболизм 38:1124-1144,2006.
8. Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE, Carney PR, Valenstein E,Theriaque DW and Shuster JJ: Evaluation of long-term treatment ofchildrenwithcongenitallacticacidosiswithdichloroacetate.Педиатрия121: 1223-1228, 2008.
9. Luciani F, Spada M, Milito AD, Molinari A, Rivoltini L, Montinaro A,Marra M, Lugini L, Logozzi M, Lozupone F, et al: Effect of protonpump inhibitor prereatment on resistance of solid tumors to cytotoxicdrugs. J Natl Cancer Inst 96: 1702-1713, 2004.
10. Milito AD, Iessi E, Logozzi M, Lozupone F, Spada M, Marino ML,Federici C, Perdicchio M, Matarrese P, Lugini L, et al: Proton pumpinhibitors induce apoptosis of human B-cell tumors through a caspase-independent mechanism involving reactive oxygen species. Cancer Res67: 5408-5417, 2007.
11. DeMilitoA,CaneseR,MarinoML,BorghiM,IeroM,VillaA,VenturiG, Lozupone F, Iessi E, Logozzi M, et al: pH-зависимаяпротивоопухолевая активность ингибиторов протонной помпыпротив меланомы человека опосредована ингибированиемкислотности опухоли. Int J Cancer 27: 207-219, 2010.
12. Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, Webster L, Haromy A, NivenE, Maguire C, Gammer TL, Mackey JR, Fulton D, et al: Metabolicmodulation of glioblastoma with dichloroacetate. Sci Trasl Med 2: 31-34,2010.
13. Shi S and Klotz U: Ингибиторы протонной помпы: обновленнаяинформация об их клиническом применении и фармакокинетике.Eur J Clin Pharmacol 64: 935-951, 2008.
14. Katagiri F, Inoue S, Itoh H и Takayema M: Омепразол повышаетуровень соматостатина и мотилина в плазме крови человека. BiolPharm Bull 28: 370-372, 2005.
15. FruchtH,MatonPNиJensenRT:Применениеомепразолаупациентовс синдромом Золлингера-Эллисона. Dig Dis Sci 36: 394-404, 1991.
16. Thomson ABR, Sauve MD, Kassam N и Kamitakahara H:Безопасность длительного применения ингибиторов протоннойпомпы. World J Gastroenterol 16: 2323-2330, 2010.
17. Udelnow A, Kreyes A, Ellinger S, Landfester K, Walther P,Klapperstueck T, Wohlrab J, Henne-Bruns D, Knippschild U and WürlP: Omeprazole inhibits proliferation and modulates autophagy inpancreatic cancer cells. PLoS One 6: e20143, 2011.
18. ShroadsAL,GuoX,DixitV,LiuHP,JamesMOиStacpoolePW:Age-dependent kinetics and metabolism of dichloroacetate: possiblerelevance to toxicity. J Pharmacol Exp Ther 324: 1163-1171, 2008.
19. Stacpoole PW, Henderson GN, Yan Z, Cornett R и James MO:Фармакокинетика,метаболизмитоксикологиядихлорацетата.DrugMetab Rev 30: 499-539, 1998.
20. Subramanian K и Ramaian AS: Разработка менее токсичного аналогадихлорацетата с помощью докинга и дескрипторного анализа.Биоинформация 5: 73-76, 2010.

Дихлорацетат подавляет рост нейробластомы, действуя специфически против злокачественных недифференцированных клеток

Авторы:
Серена Велла¹*, Маттео Конти²*, Роберта Тассо¹, Раньери Канчедда¹,³, Альдо Пагано¹,³

¹ Департамент онкологии, биологии и генетики (DOBiG), Университет Генуи, Генуя, Италия
² Лаборатория клинической фармакологии и токсикологии, Госпиталь Святой Марии делле Крочи, Равенна, Италия
³ Национальный институт онкологических исследований (IST), Генуя, Италия
* S.V. и M.C. внесли равный вклад в работу

Аннотация:

Маленькая, водорастворимая молекула дихлорацетат (DCA) вызывает все больший интерес в онкотерапии, так как продемонстрировала способность ингибировать рост опухолей человека, воздействуя специфически на митохондрии раковых клеток, не нарушая при этом физиологию нормальных клеток. Ранее нейробластома считалась нечувствительной к DCA, поскольку клетки этой опухоли не демонстрируют выраженных митохондриальных аномалий. Однако нейробластома состоит из различных типов клеток, отличающихся по метаболизму, фенотипу и злокачественности. В настоящей работе мы показали, что:

1. DCA оказывает неожиданный противоопухолевый эффект на клетки нейробластомы;
2. этот эффект селективно направлен против высокозлокачественных, недифференцированных клеток, тогда как более дифференцированные, менее злокачественные клетки устойчивы к лечению DCA.

Эти данные указывают на необходимость более глубокого изучения противораковых свойств DCA в отношении нейробластомы с целью возможного клинического применения.

Ключевые слова:

дихлорацетат, нейробластома, митохондрии

Введение (перевод):

DCA — это небольшая молекула/препарат-сирота, которая недавно привлекла внимание благодаря способности ограничивать рост глиобластомы (GBM) в дозах, не вызывающих побочных эффектов. Благодаря хорошей переносимости и низкой стоимости DCA активно изучается как потенциальное средство лечения различных опухолей.

Хотя его эффективность была продемонстрирована для рака лёгкого, груди, предстательной железы, эндометрия и клеточных линий глиобластомы, в клинике она пока подтверждена лишь для GBM. Ввиду механизма действия предполагается, что DCA неэффективен в опухолях с низкой митохондриальной поляризацией, таких как мелкоклеточный рак лёгкого, лимфомы, нейробластома и саркомы.

DCA ингибирует пируватдегидрогеназукиназу (PDK), активируя пируватдегидрогеназу (PDH), и тем самым усиливает окисление глюкозы и снижает гликолиз. Ранее было показано, что эта стимуляция окислительного фосфорилирования избирательно запускает апоптоз в раковых клетках. Несмотря на ранние предположения об устойчивости нейробластомы к DCA, мы обнаружили, что пролиферирующие клетки нейробластомы поддерживают гликолитический фенотип. Мы проверили эффективность DCA в подавлении роста опухолей у мышей NOD-SCID и обнаружили значительное замедление роста опухоли in vivo.

Дихлорацетат подавляет рост нейробластомы, действуя специфически против злокачественных недифференцированных клеток

Авторы:
Серена Велла¹*, Маттео Конти²*, Роберта Тассо¹, Раньери Канчедда¹,³, Альдо Пагано¹,³

¹ Департамент онкологии, биологии и генетики (DOBiG), Университет Генуи, Генуя, Италия
² Лаборатория клинической фармакологии и токсикологии, Госпиталь Святой Марии делле Крочи, Равенна, Италия
³ Национальный институт онкологических исследований (IST), Генуя, Италия
* S.V. и M.C. внесли равный вклад в работу

Аннотация:

Маленькая, водорастворимая молекула дихлорацетат (DCA) вызывает все больший интерес в онкотерапии, так как продемонстрировала способность ингибировать рост опухолей человека, воздействуя специфически на митохондрии раковых клеток, не нарушая при этом физиологию нормальных клеток. Ранее нейробластома считалась нечувствительной к DCA, поскольку клетки этой опухоли не демонстрируют выраженных митохондриальных аномалий. Однако нейробластома состоит из различных типов клеток, отличающихся по метаболизму, фенотипу и злокачественности. В настоящей работе мы показали, что:

1. DCA оказывает неожиданный противоопухолевый эффект на клетки нейробластомы;
2. этот эффект селективно направлен против высокозлокачественных, недифференцированных клеток, тогда как более дифференцированные, менее злокачественные клетки устойчивы к лечению DCA.

Эти данные указывают на необходимость более глубокого изучения противораковых свойств DCA в отношении нейробластомы с целью возможного клинического применения.

Ключевые слова:

дихлорацетат, нейробластома, митохондрии

Введение (перевод):

DCA — это небольшая молекула/препарат-сирота, которая недавно привлекла внимание благодаря способности ограничивать рост глиобластомы (GBM) в дозах, не вызывающих побочных эффектов. Благодаря хорошей переносимости и низкой стоимости DCA активно изучается как потенциальное средство лечения различных опухолей.

Хотя его эффективность была продемонстрирована для рака лёгкого, груди, предстательной железы, эндометрия и клеточных линий глиобластомы, в клинике она пока подтверждена лишь для GBM. Ввиду механизма действия предполагается, что DCA неэффективен в опухолях с низкой митохондриальной поляризацией, таких как мелкоклеточный рак лёгкого, лимфомы, нейробластома и саркомы.

DCA ингибирует пируватдегидрогеназукиназу (PDK), активируя пируватдегидрогеназу (PDH), и тем самым усиливает окисление глюкозы и снижает гликолиз. Ранее было показано, что эта стимуляция окислительного фосфорилирования избирательно запускает апоптоз в раковых клетках. Несмотря на ранние предположения об устойчивости нейробластомы к DCA, мы обнаружили, что пролиферирующие клетки нейробластомы поддерживают гликолитический фенотип. Мы проверили эффективность DCA в подавлении роста опухолей у мышей NOD-SCID и обнаружили значительное замедление роста опухоли in vivo.

Рисунок 1a. Рост опухоли при лечении DCA (в миллиметрах кубических)

• Контрольная группа (вода): непрерывный рост опухоли до ~480 мм³ за 4 недели.
• DCA 2.5 мг/кг: рост замедлен, объем ~330 мм³.
• DCA 25 мг/кг: значительно ингибирует рост — до ~210 мм³.

Это подтверждает дозозависимый эффект подавления роста опухоли.

Рисунок 1c. Масса тела мышей

• В течение 4 недель масса тела в обеих группах оставалась стабильной.
• Легкое повышение в контрольной группе, возможно, связано с увеличением массы опухоли.
• Лечение DCA переносится без значительных побочных эффектов, включая потерю массы тела.

Результаты

DCA эффективен против клеток нейробластомы человека

Чтобы проверить, влияет ли DCA на рост узлов нейробластомы (НБ) так же, как на глиобластому, мы протестировали его способность ограничивать рост опухолевой массы НБ in vivo.

В 37 мышей NOD-SCID были введены клетки SKNBE2 — линия клеток нейробластомы человека с амплификацией гена N-myc и высокой злокачественностью. Когда диаметр опухолей достигал 5 мм, часть животных получала DCA:

• 5 мышей — 2.5 мг/кг,
• 14 мышей — 25 мг/кг,
• 13 — контрольная группа (вода),
• 5 — умерщвлены до начала лечения (группа до лечения).

DCA вводили интрагастрально. Литературные данные указывали, что парентеральное введение менее эффективно для ингибирования роста опухолей.

Экспериментальные и терапевтические испытания амигдалина

Авторы:

Рагга Х. Салама¹⁵, Абд эль-Рахман Г. Рамадан², Тасним А. Альсанури³, Мохаммед О. Хердан², Омния М. Фатхаллах², Ая А. Альсанури²
¹Кафедра медицинской биохимии и молекулярной биологии, Медицинский факультет, Университет Асьют, Египет
²Студенты, Медицинский факультет, Университет Асьют, Египет
³Студент, Фармацевтический факультет, Университет Асьют, Египет

Информация о статье

Корреспондирующий автор:
Рагга Х. Салама
Профессор
Заведующий кафедрой медицинской биохимии и молекулярной биологии
Содиректор Медицинского исследовательского центра
Медицинский факультет
Университет Асьют
Египет
Тел.: +201063492008
E-mail: ragaa_2002@yahoo.com

Поступила: 16 сентября 2019 г.
Принята: 18 октября 2019 г.
Опубликована: 28 октября 2019 г.

Цитирование: Salama RH, Ramadan AEG, Alsanory TA, Herdan MO, Fathallah OM, Alsanory AA. Experimental and Therapeutic Trials of Amygdalin. Int J Biochem Pharmacol. 2019; 1(1): 21–26. doi: 10.18689/ijbp-1000105

Авторское право © 2019 Автор(ы). Данная работа лицензирована согласно Creative Commons Attribution 4.0 International License, что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинала.

Опубликовано издательством Madridge Publishers

Аннотация

Природные вещества и альтернативные лекарства, такие как амигдалин, приобрели огромную популярность в лечении различных заболеваний благодаря широкой доступности и относительно низкой стоимости. Тем не менее, их использование может вызывать серьезные побочные эффекты, если не учитывать соответствующие дозы. Следовательно, этот обзор иллюстрирует предполагаемую противораковую активность амигдалина, а также его другие эффекты на различные системы организма. Например, эндокринную, мочевыделительную, половую и дыхательную системы, учитывая его токсические побочные эффекты. Также в этом обзоре упоминаются различные клинические испытания с использованием амигдалина как на людях, так и на животных.

Ключевые слова:

Амигдалин; Витамин B17; Цианогенная токсичность; Противоопухолевое; Бета-глюкуронидаза; Роданеза.

Введение

История

Хотя обычно амигдалин называют лаэтрилом, они не являются одним и тем же продуктом с биомедицинской точки зрения. Более того, амигдалин известен под ошибочным названием витамин B17, что неверно, так как ни амигдалин, ни лаэтрил не являются витаминами [1]. Интересно, что египетские папирусы 5000 лет назад упоминали полезное использование производных горького миндаля для лечения кожных опухолей. Также римляне и греки связывали некоторые терапевтические свойства с этими производными [2]. Впоследствии эти производные стали известны как амигдалин или витамин B17, поскольку горький миндаль считается одним из самых богатых их источников [3,4]. Более того, было замечено, что у некоторых народов и изолированных племен по всему миру не было случаев рака, таких как абхазы, индейцы хопи и навахо, хунзы, эскимосы и каракорум. Оказалось, что их объединяет диета, богатая амигдалином [2]. В результате многие исследователи и ученые по всему миру провели различные исследования и клинические испытания, чтобы доказать его противораковую активность, и они обнаружили, что амигдалин может избирательно атаковать раковые клетки, не затрагивая другие здоровые клетки [5], снижать активность теломеразы [6] и блокировать рост клеток рака мочевого пузыря [7]. С другой стороны, амигдалин показал серьезные побочные эффекты, вызванные цианидными соединениями, высвобождающимися после распада амигдалина [8,9].

Источники амигдалина

Амигдалин имеет растительное происхождение и присутствует в семенах около 800 растений. Семена Prunus являются одним из самых богатых источников амигдалина. Более того, семена горького миндаля, абрикосов, вишни, черешни, персиков, слив, нектаринов и яблок также богаты амигдалином. Кроме того, семена оливок, винограда и гречихи содержат амигдалин. Помимо амигдалина, эти семена богаты белками, полиненасыщенными жирами и другими питательными веществами и содержат до 2% или более нитрилозида [3,4,10].

Химия

Структура, формула и физические свойства:
Амигдалин (C20H27NO11) принадлежит к группе ароматических цианогенных гликозидов. Химическое название амигдалина - (R)-α-[(6-O-β-D-глюкопиранозил-b-D-глюкопиранозил)-окси]-(фенил)ацетонитрил, также называемый d-(-)-манделонитрил-β-d-гентобиозид. Между тем, активной формой амигдалина является R-амигдалин с правовращающей структурой, которая является природной формой (Рисунок 1). Амигдалин бесцветен, имеет молекулярную массу 457.4 г/моль, температуру плавления 213°C, а его номер CAS (Chemical Abstracts Service) - 29883-15-6. Хотя амигдалин нерастворим в неполярных растворителях, таких как хлороформ, он хорошо растворим в этаноле и умеренно растворим в воде. Амигдалин также называют лаэтрилом или витамином B-17. Но названия лаэтрил, витамин B-17 и амигдалин не обозначают один и тот же продукт. Поскольку амигдалин является цианогенным гликозидом, а его очищенная форма называется лаэтрил, что относится к терминам левовращающий и манделонитрил. В то время как лаэтрил является полусинтетическим цианогенным глюкуронидом, поэтому он структурно отличается от амигдалина. Лаэтрил в США и Мексике различается по процессу синтеза. В США лаэтрил является частично синтетической (искусственной) формой амигдалина, тогда как в Мексике его получают из измельченных косточек абрикоса. Э.Т. Кребс-младший дал название витамин B-17 лаэтрилу, обозначив его как витамин или пищевую добавку, а не как лекарство. Но на самом деле, ошибочно называют его витамином B17, поскольку это соединение не является витамином [5,8,11].

Биосинтез амигдалина:
В амигдалине аминокислота фенилаланин подвергается гидроксилированию ферментом CYP79 в фенилацеталдоксим, который далее гидроксилируется ферментом CYP71 в манделонитрил. Последующее присоединение одной молекулы глюкозы к α-гидроксильной группе манделонитрила, катализируемое уридиндифосфат глюкозо-глюкозилтрансферазой (UGT), приводит к образованию пруназина (d-(-)-манделонитрил-β-d-глюкозид, номер CAS 99-18-3, 295.3 г/моль). При добавлении другой молекулы глюкозы к 6'-гидроксильной группе он окончательно превращается в амигдалин, образуя диглюкозид генциобиозу (Рисунок 2). Биосинтез амигдалина в растениях следует общей схеме для CNG, то есть последовательного гидроксилирования аминокислоты ферментами цитохрома P450 (CYP) до оксима и последующего α-гидроксинитрила, за которым следует гликозилирование последнего [1].

Экстракция

Амигдалин получали из семян и белковых изолятов. Процесс экстракции амигдалина проводили следующим образом: первый шаг - смешивание 550 мг семян с 15 мл MeOH или 40 мг белковых изолятов с 5 мл MeOH для приготовления раствора, из которого экстрагировали амигдалин. Второй шаг - накрытие раствора и его выдерживание в течение 24 часов в водяной бане с перемешиванием при 60 ± 2°C. Затем раствор центрифугировали в течение 10 минут при 4000 g. После этого супернатанты вводили в высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) серии 1100. Хроматографические условия были следующими: изократическая элюция с водой:MeOH 65:35; скорость потока 1 мл/мин; температура 25°C; объем инъекции 10 мкл; УФ-детектирование при 218 нм [10].

Способ введения

Существует два способа введения амигдалина; его можно давать перорально в виде таблеток или путем инъекции (внутривенно или внутримышечно). Однако наиболее распространенным способом введения является первоначальное внутривенное введение в течение определенного периода времени с последующей поддерживающей пероральной терапией. Считается, что пероральное введение амигдалина вызывает гораздо более высокие уровни отравления цианидом, в то время как инъекция амигдалина приводит к незначительному распаду с образованием цианистого водорода. Это связано с тем, что лаэтрил гидролизуется в кишечнике ферментами (бета-глюкозидазами), которые активируют высвобождение цианида из лаэтрила и превращают лаэтрил в токсичное вещество (цианистый водород). Этот фермент присутствует в кишечных бактериях и некоторых часто употребляемых растениях [5].

Фармакокинетика

После приема лаэтрила или амигдалина оба они метаболизируются путем гидролиза с помощью ферментов двенадцатиперстной и кишечной щелочной жидкости, производя D-глюкуроновую кислоту и L-манделонитрил, последний далее гидролизуется до бензальдегида и цианистого водорода (синильной кислоты или HCN), который при приеме в большом количестве приведет к цианогенной токсичности [11]. Кроме того, каталитическое разложение амигдалина внеклеточными ферментами Aspergillus niger привело к четырем продуктам, которые были идентифицированы как манделонитрил, пруназин, бензальдегид и фенил-(3,4,5-тригидрокси-6-метил-тетрагидро-пиран-2-илокси)-ацетонитрил (PTMT) [12].

В эксперименте, проведенном Li et al. [13], после перорального введения крысам 20 мг/кг амигдалина фармакокинетические результаты показали короткое Tmax (менее 2 часов), что указывало на то, что амигдалин может быстро всасываться после перорального введения с немедленным обнаружением амигдалина в плазме в течение 5 минут. Между тем, у крыс было длительное значение t1/2 амигдалина, приблизительно 8,45 часов, что указывало на то, что выведение амигдалина может быть медленным.

В другом исследовании на здоровых китайских добровольцах, проведенном Li et al. [14], исследователи использовали лиофилизированный порошок для инъекций Huoxue-Tongluo (HTLPI), в котором амигдалин является биологически активным компонентом, поскольку HTLPI представляет собой смесь Paeoniae Radix Rubra и Persicae semen. Исследование показало, что пол не влиял существенно на фармакокинетические свойства амигдалина. Между тем, фаза однократного введения исследования показала, что средняя максимальная концентрация в плазме, а также средняя площадь под кривой "концентрация-время" амигдалина пропорционально увеличивались с каждым увеличением дозы, тогда как после многократного введения 6 г HTLPI стабильная концентрация была достигнута к 4 дню. Также не было замечено значительного системного накопления после повторного введения 6 г HTLPI, так как средние фармакокинетические параметры, достигнутые на 1 день, были аналогичны тем, которые были на 7 день. Более того, исследование показало, что приблизительно 79,6% введенного амигдалина выводилось в неизмененном виде с мочой в течение 24 часов. В конечном итоге, исследователи не наблюдали каких-либо серьезных неблагоприятных событий в течение всего исследования.

Также Shalayel [11] заключил, что содержание амигдалина в горьких абрикосовых косточках может влиять на контроль организмом различных минералов, азота и, возможно, также на кислотно-щелочной баланс. Хотя 42-дневное введение абрикосовых косточек в дозе 60 мг/кг массы тела значительно снизило выведение кальция с мочой, это снижение переместило повышенное среднее значение в контрольном сборе в обычный физиологический диапазон, кроме того, были обнаружены изменения в моче в отношении уровней мочевины и фосфора.

Теории, объясняющие его предполагаемую противораковую активность

Сторонники лаэтрила предложили различные теории, объясняющие его предполагаемую противораковую активность.

• Одна из них - "трофобластическая теория рака". Эта теория утверждает, что все раковые заболевания возникают из первичных половых клеток (клеток, которые в норме дают начало яйцеклеткам или сперматозоидам), некоторые из которых распространяются по всему телу во время эмбриогенеза и, соответственно, они не ограничены яичками или яичниками. Использование лаэтрила объясняется предположением, что злокачественные клетки особенные тем, что имеют уровни выше нормы фермента под названием бета-глюкуронидаза и что они дефектны в другом ферменте под названием роданеза (тиосульфат-сератрансфераза). Другое мнение гласит, что лаэтрил модифицируется в печени, а затем фермент бета-глюкуронидаза расщепляет модифицированное соединение, производя цианид. После этого роданеза превращает цианид в относительно безвредное соединение тиоцианат. Таким образом, дисбаланс в этих двух ферментах показывает, что раковые клетки более подвержены токсическому действию лаэтрила, чем нормальные клетки.
• Другая теория утверждает, что лаэтрил, или амигдалин/витамин B-17, является недостающим витамином, необходимым организму для восстановления здоровья. Соответственно, эта теория предполагает, что рак - это метаболическое расстройство, вызванное дефицитом витамина. Несмотря на экспериментальные данные, которые указывают на то, что уровень потребления отдельных витаминов может влиять на развитие рака, нет доказательств того, что лаэтрил необходим для нормального метаболизма.
• Также есть теория, которая предполагает, что цианид, высвобождаемый из лаэтрила, увеличивает кислотное содержание опухолевых клеток, приводя к разрушению лизосом с высвобождением их содержимого. Тем самым прекращая рост опухоли и разрушая раковые клетки. Согласно этой теории, другим следствием лизосомального разрушения является стимуляция иммунной системы [5].
• Более того, амигдалин мог значительно снижать действие фермента теломеразы, который присутствует в более высоких уровнях в раковых клетках (в 13 раз). Поэтому он снижает экспрессию обратной транскриптазы теломеразы и РНК-компонента теломеразы. В результате это вызвало подавление роста раковых клеток. Поэтому Moon et al. [6] рассматривали амигдалин как мощное средство для лечения рака.

Токсичность амигдалина

Разложение 1 г амигдалина высвобождает 59 мг цианистого водорода (HCN), который присутствует в его диссоциированной форме как цианид [1,15]. Несмотря на то, что цианид оказывает благотворное действие в борьбе с раком, он считается большим риском из-за его токсических побочных эффектов, главным образом, когда амигдалин принимается перорально, поскольку цианид, высвобождаемый после перорального приема, намного больше, чем высвобождаемый при внутривенном пути введения, не только из-за быстрого действия бактерий кишечной микрофлоры в высвобождении цианида [9,16], но также в результате жевания или измельчения [1].

Максимальная доза амигдалина, которая не вызывала каких-либо неприемлемых побочных эффектов у мышей, кроликов и собак, составляла 3 г/кг при внутривенном и внутримышечном введении и 0,075 г/кг при пероральном введении; также максимальная переносимая доза амигдалина при внутривенном введении человеку составляла около 0,07 г/кг. Кроме того, после лечения мышей путем ингибирования кишечных бактерий пероральное введение 300 мг/кг не приводило к смерти, с другой стороны, смертность увеличивалась на 60% при использовании той же дозы у нелеченых мышей. Более того, системная токсичность у людей возникала после перорального введения амигдалина в дозе 4 г в день в течение периода половины месяца или месяца внутривенных инъекций. Тем не менее, после прекращения приема амигдалина или когда ежедневная пероральная доза снижалась до 0,6~1 г, токсичность исчезала. Кроме того, реакция токсичности пищеварительной системы более частая и сопровождается изменениями предсердных преждевременных сокращений [16].

В клиническом случае, описанном Sauer et al. [8], у 4-летнего ребенка, получавшего дополнительное и альтернативное лечение по поводу злокачественного заболевания головного мозга, родители давали ему амигдалин внутривенно и перорально в виде абрикосовых косточек, что привело к острому отравлению цианидом, которое в конечном итоге привело к тяжелой энцефалопатии. После этого состояние ребенка быстро улучшилось после введения тиосульфата натрия. Более того, согласно Sauer et al. [8], токсичность цианида приводит к нарушению процесса окислительного фосфорилирования в клетках, следовательно, клинические симптомы легкого отравления цианидом - это тошнота, сонливость, головная боль, металлический привкус, головокружение, гиперпноэ, тревога и раздражение слизистых оболочек. Поэтому Milazzo и Horneber [9] считали, что баланс риска и пользы от использования амигдалина для лечения рака был соответственно отрицательным.

Кроме того, важно учитывать употребление абрикосов среди дифференциальных диагнозов у пациентов с тяжелым лактоацидозом с нормальной сатурацией кислорода. Как в клиническом случае, описанном Dalk et al. [17], родители пациента сообщили, что пациент извлек и съел ядра 3 абрикосовых косточек перед тем, как проявился тяжелый ацидоз. Более того, pH крови пациента и сердечно-сосудистые функции показали значительное улучшение после начала гемодиализа. Поэтому клинический случай заключил, что в тяжелых случаях отравления цианидом, когда нет доступа к гидроксокобаламину и нет ответа на поддерживающую терапию, гемодиализ можно рассматривать как подход для избавления от токсических метаболических побочных продуктов и свободного цианида в крови.

Экспериментальные испытания амигдалина

В целом, было показано, что амигдалин оказывает множество благотворных эффектов на многие системы и заболевания, такие как: пищеварительная система, где он проявляет успокаивающее и защитное действие; мочевыделительная система, так как он способствует апоптозу человеческих почечных фибробластов и улучшает функцию почек; дыхательная система, использовалась для лечения астмы, бронхита, эмфиземы и проказы, в дополнение к противокашлевому эффекту [18]. Также при таких заболеваниях, как рак, противоречивые отчеты показывают, что он может уменьшать плевральный выпот у пациентов с раком легких. При воспалении амигдалин подавляет как его ответ в человеческих эпидермальных кератиноцитах, так и экспрессию TNF-α и IL-1β в LPS-обработанных клетках RAV 264.7. Кроме того, сообщалось, что амигдалин предотвращает аллоксан-индуцированный диабет [19].

Эндокринная система

Различные дозы амигдалина вызывали высвобождение эстрадиола-17β, но не прогестерона, овариальными гранулезными клетками в зависимости от дозы. Он также регулировал выработку стероидов в яичниках свиней. Более того, амигдалин входит в фармакологические компоненты сырых ингредиентов Keishi-bukuryo-gan, японского растительного лекарственного средства, используемого для индукции овуляции у женщин с бесплодием. Грубый компонент Keishi-bukuryo-gan влиял на стероидогенез в преовуляторных фолликулах и желтом теле в яичниках крыс как in vivo, так и in vitro. Следовательно, природное вещество в семенах горького миндаля может быть вовлечено в механизмы фолликулогенеза в яичниках кроликов через репрессию ФСГ [11,20]. Однако внутримышечное и пероральное применение амигдалина не оказывало значительного влияния на уровни в плазме некоторых эндокринных регуляторов (прогестерон, 17β-эстрадиол, тестостерон), щитовидной железы (трийодтиронин, тироксин, тиреотропный гормон), передних гипофизарных гормонов (пролактин, лютеинизирующий гормон) или среднюю массу тела кроликов, использованных в эксперименте [15].

Мочеполовая система

Блокирование фиброза при хроническом заболевании почек: Было доказано, что амигдалин обладает сильной антифибротической активностью и может использоваться для лечения пациентов с фиброзом почек. Поскольку культивированные интерстициальные фибробластные клетки при обработке амигдалином показали уменьшенную пролиферацию и продукцию трансформирующего фактора роста (TGF)-β1. Кроме того, в испытаниях на крысах с обструктивной нефропатией после обструкции мочеточника применение амигдалина немедленно устраняло накопление внеклеточного матрикса. Также на 21 день амигдалин уменьшал почечное повреждение в целом. Следовательно, амигдалин мог ослаблять активацию почечных фибробластов и интерстициальный фиброз почек у крыс [21].

Снижение роста рака мочевого пузыря: Было показано, что амигдалин может останавливать прогрессирование рака путем подавления cdK2 и циклина A. Поскольку амигдалин, зависимо от дозы, ингибировал рост и пролиферацию клеточных линий рака мочевого пузыря и значительно задерживал прогрессирование клеточного цикла с остановкой в фазе G0/G1. Кроме того, молекулярная оценка подразумевала уменьшенную фосфорилированную Akt, фосфоRictor и потерю компонентов CdK и циклина [22].

Индукция апоптоза в клетках рака шейки матки человека in vivo: Применение амигдалина останавливало рост ксенографтов клеток HeLa через апоптоз, так как он значительно ингибировал жизнеспособность клеточной линии HeLa при раке шейки матки. Используя иммуногистохимию, увеличенная активность каспазы-3 подтвердила развитие апоптоза в этих клетках. Дальнейшие исследования показали снижение антиапоптотического белка Bcl-2 и увеличение проапоптотического белка Bax в клетках HeLa, обработанных амигдалином, подразумевая процесс апоптоза [23].

Влияние на клеточный цикл рака простаты in vitro: С оптимальными результатами при 10 мг/мл амигдалин уменьшал рост опухолевых клеток и апоптоз PC3 и LNCaP, но не клеток DU-145 (которые являются классическими клеточными линиями рака простаты), полностью останавливая образование колоний в клеточных линиях. Он также демонстрировал высокую противоопухолевую активность как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-резистентных клеточных линиях PCa [24].

Кроме того, амигдалин значительно модулировал хемотаксис и адгезию андроген-резистентных клеточных линий рака простаты, DU-145 и PC3. Тем не менее, воздействие амигдалина привело к совершенно разным ответам в двух клеточных линиях. С одной стороны, в клеточной линии DU-145 амигдалин уменьшал взаимодействие опухоль-эндотелиальные клетки, адгезию к коллагену, хемотаксис и миграцию. С другой стороны, адгезия PC3 увеличивалась после 2-недельного длительного воздействия амигдалина [25].

Влияние на рак молочной железы in vitro

Амигдалин показал противоопухолевую активность против клеток рака молочной железы через их сенсибилизацию к окислительному стрессу in vitro. Также амигдалин вызывал дифференциальное ингибирование пролиферации клеточных линий рака молочной железы MCF-7 и T47D. Это дифференциальное ингибирование может быть связано с разницей в его способности сенсибилизации к окислительному стрессу. Следовательно, механизм действия амигдалина против клеток рака молочной железы в основном заключается в индукции окислительного стресса [26].

Дыхательная система

Амигдалин обладает противокашлевым и противоастматическим действием при условии, что он вводится перорально, потому что синильная кислота, образующаяся в результате гидролиза амигдалина, может подавлять дыхательный центр. Следовательно, уменьшать дыхательные движения. Кроме того, эксперимент на животных с респираторным дистресс-синдромом показал, что амигдалин может усиливать образование легочного сурфактанта и облегчать заболевание [16]. Кроме того, амигдалин обладает подавляющим действием на липополисахарид-индуцированное острое повреждение легких путем ингибирования путей передачи сигналов NF-kB (ядерный фактор каппа-легкая цепь-энхансер активированных B-клеток) и NLRP3 [19].

Более того, амигдалин может использоваться в качестве лекарственного средства для лечения ХОБЛ. Поскольку амигдалин, в определенной степени, мог ингибировать процесс эпителиально-мезенхимального перехода, индуцированного курением, как in vivo, так и in vitro. Этот эффект может быть связан со способностью амигдалина ингибировать как экспрессию TGF-β1, так и фосфорилирование smad2/3, что связано с ингибированием пути TGF-β/smad [27].

Влияние на пищеварительную систему

Когда крыс лечили перорально 500 мг/кг пепсинового гидролизата водного раствора миндаля на тетрахлориде углерода, действие пепсина ингибировалось бензальдегидом, полученным в результате распада амигдалина. Кроме того, уровень AST и ALT снижался, содержание гидроксипролина повышалось, и удлинение времени эуглобулинолиза уменьшалось. Также он мог уменьшать пролиферацию соединительной ткани печени крыс. Более того, амигдалин оказался эффективным лекарственным средством для лечения хронического гастрита и атрофического гастрита у крыс [16].

Кроме того, амигдалин обладал значительным защитным эффектом при хроническом повреждении печени у крыс. Более того, потребление амигдалина обращало вспять большинство патологических изменений LPS-индуцированного повреждения печени у крыс. Кроме того, благотворные эффекты амигдалина могут быть связаны с его сильным противовоспалительным действием и улучшением печеночной дисфункции через ингибирование путей передачи сигналов PI3K/AKT, JAK2/STAT3 и NF-kB [28].

Более того, амигдалин уменьшал продукцию воспалительных факторов фиброза поджелудочной железы и улучшал микроциркуляторные нарушения, ослабляя активацию звездчатых клеток поджелудочной железы. Вероятный механизм заключается в регуляции экспрессии ET-1 и CGRP in vivo [29].

Улучшение иммунной функции организма

Амигдалин мог значительно увеличивать полигидроксиалканоаты, которые стимулируют периферические кровяные T-лимфоциты к секреции IL-2 и IFN-y, а затем уменьшают секрецию TGF-β1. Более того, он усиливает экспрессию регуляторных T-клеток при лечении атеросклероза. Следовательно, амигдалин играет ценную роль в улучшении иммунной функции [16].

Влияние на нейродегенеративные заболевания

Согласно Cheng et al. [30], амигдалин играет положительную роль в лечении нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона, потому что он усиливает NGF-индуцированный рост нейритов, а также защищает клетки от нейротоксичности, вызванной 6-гидроксидофамином, путем индукции экспрессии кальретикулина.

Заключение

Амигдалин приобрел широкую популярность благодаря своей предполагаемой противораковой активности и природному присутствию в семенах многих фруктов. Поэтому теории пытались объяснить эту активность наличием определенного фермента в раковых клетках и его отсутствием в других нормальных клетках. Этот фермент расщепляет амигдалин на активное противораковое соединение - цианид. Несмотря на благотворное действие цианида против рака, он может вызывать множество вредных побочных эффектов и приводить к токсичности, особенно при пероральном приеме. Тем не менее, амигдалин показал другие благотворные эффекты на различные системы организма, помимо своей противораковой активности, такие как ингибирование почечного фиброза, противоастматическое действие, улучшение иммунной функции и антипаркинсонический эффект. Следовательно, амигдалин демонстрирует многообещающие результаты в качестве противоракового лечения, но с учетом его побочных эффектов необходимы соответствующие дозы и хорошее управление его вредными последствиями. Более того, необходимы дальнейшие исследования, чтобы найти способ, с помощью которого мы можем преодолеть эти побочные эффекты и обеспечить его безопасность в качестве надежного противоракового лечения.

Разработка пероральной формы DCA и Тиамина

Заголовок:
Development of an Oral Drug Formulation for Dichloroacetate and Thiamine
Авторы: George N. Henderson, Patrick O. Wraicn, Rebecca A. Darr, Stephen H. Curry, Hartmut Derendorf, Thomas G. Baumgarmer, Peter W. Stacpoole
Организации: University of Florida и другие
Журнал: Drug Development and Industrial Pharmacy, 1994

Аннотация (перевод):
Дихлорацетат (DCA) — это исследуемый препарат для лечения ряда метаболических и сердечно-сосудистых нарушений. До сих пор он использовался преимущественно в виде внутривенных краткосрочных схем терапии. Хроническое применение препарата может быть токсичным, частично из-за истощения запасов тиамина в тканях. Мы разработали стабильную жидкую форму натриевой соли DCA и тиамина гидрохлорида, подходящую для хронического перорального применения. Смесь DCA-тиамин представлена в виде приятного на вкус раствора, содержащего глицерин, бензоат натрия и аспартам в фосфатном буфере с pH 3.5. Ускоренное термическое исследование разложения препарата показало срок годности около 5 лет при 4°C и около 156 дней при 25°C. Стабильность также контролировалась в течение 1 года при температуре хранения 4°C.

Исследования стабильности в фосфатных буферах (с аспартамом):

Были приготовлены следующие стандартные растворы:

• 1 М раствор монобазового фосфата (1 л),
• 1% раствор бензоата натрия (100 мл),
• 10% раствор тиамина (10 мл),
• 1% раствор аспартама (100 мл),
• 10% раствор красителя (10 мл).

Были приготовлены пять различных тестовых растворов (A–E) путём смешивания различных компонентов:

• A–E: 2,5 мл фосфатного буфера, 5 мл бензоата натрия, 10 мл глицерина, 5 мл аспартама;
• C–E: 1 мл тиамина;
• B, D и E: 2,5 г DCA;
• E: 100 мкл ароматизатора, 50 мкл красителя.

Затем pH доводили до 3,5 с использованием фосфорной кислоты, а объём – до 50 мл. Раствор E представляет собой финальную пероральную формулу, а растворы A–D – варианты с отсутствием одного или нескольких компонентов.

Четыре пробы по 10 мл каждого раствора (A–E) нагревались при 100, 95, 80 и 60°C. Объёмы по 500 мкл отбирались в различные моменты времени (от 0 до 48 часов) и замораживались при –20°C для последующего анализа методом ВЭЖХ (HPLC). Дополнительные исследования при 25°C и 4°C не показали изменений в концентрациях DCA, тиамина и аспартама в течение 30 дней.

Рисунок 2:

Влияние pH на разложение тиамина при 110°C:

• В отсутствие (A) и
• В присутствии (B) 10% DCA в 0,1 M фосфатном буфере.

Обозначения pH:

• 9.0 (пустой круг),
• 7.4 (закрашенный круг),
• 6.0 (пустой треугольник),
• 5.5 (закрашенный треугольник),
• 5.0 (пустой квадрат),
• 2.5 (закрашенный квадрат).

Устойчивость DCA и тиамина:

DCA оказался стабильным в исследованном диапазоне pH, и добавление тиамина не влияло на его стабильность. Интересно, что на всех уровнях pH разложение тиамина замедлялось в присутствии DCA (см. рисунок 2B). Разложение витамина было заметным только при pH 6 и 9. Из вида графиков (логарифм концентрации против времени) можно заключить, что разложение тиамина подчиняется кинетике первого порядка.

Пероральные формы DCA:

Начальные препараты перорального DCA/тиамина были приготовлены на основе коммерческих сиропов с вишнёвым вкусом и нейтральных сиропов (10% DCA). Предварительные дегустационные тесты показали недостаточное маскирование горько-солёного вкуса формулы DCA/тиамин. Исследования стабильности при повышенных температурах показали, что DCA оставался стабильным. Однако компоненты сиропов мешали анализу тиамина методом ВЭЖХ, после чего было принято решение использовать аспартам как безопасный и сладкий компонент.

Таблица 2:

Значения констант скорости (k) разложения аспартама
в растворе фосфатного буфера и в составе пероральной формулы DCA:

Таблица 3:

Прогнозируемый срок хранения пероральной формы DCA:

Выводы:

На рисунках 3A и 3B представлены графики log k против 1/T (1000/T) для аспартама в буфере и в растворе DCA соответственно. Линейность графиков позволяет с уверенностью оценить сроки хранения, приведённые в таблице 3.

Дополнительные исследования при рекомендуемом условии хранения (4°C в течение 1 года) не выявили признаков разложения компонентов препарата и отсутствия бактериального или грибкового роста. Следовательно, формулу можно хранить в холодильнике как минимум 1 год.

Список литературы (основные источники):

1. Stacpoole P.W. Metabolism, 38, 1124 (1989).
2. Wargovich T.J. et al. Am. J. Cardiol., 61, 65 (1988).
3. Stacpoole P.W. et al. N. Engl. J. Med., 309, 390 (1983).
4. DeVivo D.C. et al. Ann. Neurol., 28, 437 (1990).
5. Stacpoole P.W. et al. N. Engl. J. Med., 298, 526 (1978).
6. Stacpoole P.W. et al. Fund. Appl. Toxicol., 14, 327 (1990).
7. Levhuk J.W. et al. Am. J. Hosp. Pharm., 45, 1311 (1988).
8. Bronson M.H. et al. J. Parenter. Enteral Nutr., 12, 25 (1988).
9. Curry S.H. et al. Clin. Pharmacol. Ther., 37, 89 (1985).
10. Wells P.G. et al. Diabetologia, 19, 109 (1980).
11. Somogyi I.C. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 22 (Suppl), 29 (1976).
12. Hilker D.L. & Clifford A.J. J. Chromatogr., 231, 433 (1982).
13. Gaines S.M. & Bada J.L. J. Chromatogr., 389, 219 (1987).
14. Maeda Y. et al. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 72, 244 (1989).
15. Chu P.I. Pharmacokinetics of sodium dichloroacetate, Ph.D. диссертация, University of Florida, Gainesville, FL (1987).
16. Farrer K.L.H. Biochem. J.

Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии

дихлорацетатом натрия (отчет о клиническом случае)

Акбар Хан 1, Дуглас Эндрюс 1, Аннеке С. Блэкберн 1

• PMID: 27803917

• PMCID: PMC5067498

• DOI: 10.12998/wjcc.v4.i10.336

Аннеке С. Блэкберн, Школа медицинских исследований Джона Кертина, Австралийский национальный университет, Канберра, ACT 2601, Австралия 

Вклад авторов: Хан А. лечил пациента и написал большую часть отчета о случае; Эндрюс Д. лечил пациента, разработал протоколы естественной терапии и был соавтором отчета о случае; Блэкберн А.С. выполнил работу in vitro и in vivo, продемонстрировав эффекты DCA как цитостатического средства, и написал части отчета о случае, посвященные исследованию DCA in vitro и in vivo.

Заявление институционального наблюдательного совета: Неприменимо. 

Заявление об информированном согласии: Пациентка, описанная в данной рукописи, дала согласие на публикацию своего случая анонимно. 

Заявление о конфликте интересов: Один из авторов (Хан) проводит терапию дихлорацетатом для онкологических больных через онкологические центры Medicor Cancer Centres за плату и без получения прибыли. Клиника принадлежит члену семьи этого автора. Другим авторам нечего раскрывать.

Открытый доступ: эта статья является статьей открытого доступа, которая была выбрана внутренним редактором и полностью проверена внешними рецензентами. Она распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), которая позволяет другим распространять, перерабатывать, адаптировать, строить на основе этой работы некоммерческие работы и лицензировать свои производные работы на других условиях, при условии, что оригинальная работа должным образом цитируется и использование является некоммерческим. См.: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Адрес для корреспонденции: Акбар Хан, доктор медицины, медицинский директор, 
Medicor Cancer Centres Inc., 4576 Yonge St., Suite 301, Toronto, 
ON M2N 6N4, Canada. akhan@medicorcancer.com
Телефон: +1-416-2270037
Факс: +1-416-2271915

 Получено:  30 апреля 2016 г.
  Начало рецензирования:  3 мая 2016 г.
  Первое решение:  17 июня 2016 г.
  Исправлено:  23 июля 2016 г.
  Принято:  6 августа 2016 г.
  Статья в печати:  8 августа 2016 г.
  Опубликовано онлайн:  16 октября 2016 г.

Абстрактный

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) исследовался как новая метаболическая терапия для различных видов рака с 2007 года на основе данных Боннета и др. о том, что DCA может вызывать апоптоз клеток рака легких, молочной железы и мозга человека. Ответ на терапию в исследованиях на людях измеряется стандартными критериями оценки ответа для определений солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации.

Однако Блэкберн и др. продемонстрировали, что DCA также может действовать как цитостатический агент in vitro и in vivo, не вызывая апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Представлен случай, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины в течение почти 4 лет без серьезной токсичности. Поскольку естественное течение рака толстой кишки 4 стадии представляет собой неуклонное прогрессирование, приводящее к инвалидности и смерти, этот случай демонстрирует новое применение DCA в качестве цитостатического средства с потенциалом поддержания долгосрочной стабильности рака на поздней стадии.

Ключевые слова: Дихлорацетат; Рак; Толстая кишка; Колоректальный; Цитостатик; Стабилизация; Ингибирование роста; Внутривенный

© Автор(ы) 2016. Опубликовано Baishideng Publishing Group Inc. Все права защищены.

Основной совет: Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) был исследован как новая метаболическая терапия для различных видов рака. Ответ на терапию в исследованиях на людях измеряется стандартными критериями оценки ответа для определений солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации.

Однако DCA может также действовать как цитостатический агент, не вызывая апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Представлен случай, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации опухоли рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины на период почти 4 года без серьезной токсичности.

Хан А., Эндрюс Д., Блэкберн А.К. Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии дихлорацетатом натрия. World J Clin Cases 2016; 4(10): 336-343

Доступно по адресу: URL: http://www.wjgnet.com/2307-8960/full/v4/i10/336.htm  
DOI: http://dx.doi.org/10.12998/wjcc.v4.i10.336

ВВЕДЕНИЕ

Препарат дихлорацетат натрия (DCA) исследовался как новая метаболическая терапия для различных видов рака с 2007 года, когда Боннет и др. [1] опубликовали комбинированное исследование in vitro/in vivo на крысах, демонстрирующее эффективность DCA в лечении рака легких, молочной железы и мозга человека путем ингибирования киназы митохондриальной пируватдегидрогеназы. Stacpoole и др . [2-4] ранее опубликовали несколько исследований с использованием DCA для лечения врожденного лактоацидоза, который состоит из набора наследственных митохондриальных заболеваний [5] .

Эти исследования установили профиль безопасности перорального DCA у людей. Было обнаружено, что DCA является безопасным препаратом, не оказывающим токсического воздействия на сердце, легкие, почки или костный мозг [4] . Наиболее серьезным распространенным побочным эффектом является периферическая невропатия, которая является обратимой [6] . Сообщалось о делирии, который является обратимым после прекращения приема DCA [7] . У небольшого процента пациентов было зарегистрировано бессимптомное и обратимое повышение уровня печеночных ферментов [3] .

Предшествующие работы по врожденному лактатацидозу способствовали быстрому прогрессированию DCA в онкологической клинике. В настоящее время опубликовано четыре отчета о клинических испытаниях рака с использованием DCA, что указывает на растущее признание потенциальной полезности DCA [8-11] . Однако эти испытания, в которых лечили пациентов на поздней стадии, смогли сообщить только о лечении в течение относительно коротких периодов времени.

В первоначальной статье 2007 года Боннета и др . [1] сообщалось, что DCA снижает потенциал митохондриальной мембраны, что приводит к избирательному апоптозу в раковых клетках. Выявленный механизм заключается в ингибировании аэробного гликолиза (эффект Варбурга) и активации митохондриальных калиевых ионных каналов [1] .

Дальнейшие исследования DCA подтвердили противораковую активность при нескольких типах рака, включая рак толстой кишки [12] , предстательной железы [13] , яичников [14] , нейробластому [15] , карциноид легких [16] , шейки матки [17] , эндометрия [18] , холангиокарциному [19] , саркому [20] и Т-клеточную лимфому [21] .

Также были предложены другие противоопухолевые действия DCA. Они включают блокаду ангиогенеза [22] , изменения в экспрессии HIF1-α [23] , изменение регуляторов pH V-АТФазы и MCT1, а также других регуляторов выживания клеток, таких как PUMA, GLUT1, Bcl2 и p53 [24] .

Однако в поисках цитотоксической активности многие отчеты in vitro используют концентрации DCA, которые вряд ли будут достигнуты клинически [25] . В некоторых исследованиях использовались ограниченные концентрации и было обнаружено, что DCA является цитостатическим, а не цитотоксическим, но способным усиливать апоптоз с другими агентами [26-28] .

В отчете об успешном лечении рака молочной железы in vivo с помощью DCA Сан и др . [26] обнаружили, что DCA является цитостатическим средством, ингибирующим пролиферацию без увеличения апоптоза. DCA смог значительно снизить метастатическую нагрузку в легких крыс в высокометастатической модели рака молочной железы in vivo. Это предполагает новую роль DCA как стабилизирующего рак агента, аналогичного антиангиогенной терапии.

Однако, насколько известно авторам, пока не опубликовано никаких данных по человеку, подтверждающих использование DCA для долгосрочного поддержания стабильного заболевания. В результате новаторской публикации Боннета о DCA в начале 2007 года Хан начал клиническое использование DCA для лечения онкологических больных с плохим прогнозом или тех, кто не отреагировал на одобренные методы лечения рака.

Протокол натуральных лекарств был разработан для решения проблемы ограничивающей дозу неврологической токсичности в сотрудничестве с врачом-натуропатом (Эндрюс). Разработанный пероральный режим DCA включал три натуральных лекарства: ацетил L-карнитин [29-31] , R-альфа-липоевую кислоту [32-34] и бенфотиамин [35-37] , для основной цели профилактики невропатии.

Данные наблюдений, собранные у более чем 300 онкологических больных с запущенным заболеванием, показали измеримые преимущества терапии DCA в 60%-70% случаев. Риск нейропатии при включении натуральных нейропротекторов составил примерно 20% при дозировке 20-25 мг/кг в день в течение 2 недель приема/1 неделя перерыва. Обратимое повышение уровня печеночных ферментов было отмечено примерно у 2% в этой группе пациентов (данные клинических наблюдений опубликованы онлайн на www.medicorcancer.com).

Представлен случай пациента, иллюстрирующий цитостатические эффекты перорального лечения DCA, поддерживаемые в течение нескольких лет. У этого пациента был плохой прогноз (медианная выживаемость 9-12 месяцев при колоректальном раке 4 стадии с использованием агрессивной традиционной паллиативной химиотерапии) [38] . Пациента лечил Хан в сотрудничестве с врачом-натуропатом Эндрюсом, который разработал протокол, состоящий из натуральных нейропротекторов.

ОТЧЕТ О ДЕЛЕ

Женщина 57 лет обратилась в клинику автора (Khan) в марте 2012 года в поисках терапии метастатического колоректального рака. Первоначально рак прямой кишки был диагностирован у пациентки в середине 2010 года, когда она обратилась к врачу по поводу нового запора и боли в пояснице. Была предпринята попытка провести колоноскопию, но колоноскоп не удалось провести из-за наличия частично перекрывающей ректальную опухоль. Биопсия подтвердила умеренно дифференцированную колоректальную аденокарциному.

Компьютерная томография (КТ) того времени выявила заболевание 4 стадии с множественными метастазами в печени диаметром до 3 см, возможными мелкими метастазами в легких и кольцевидной карциномой прямой кишки, которую было трудно измерить (края рака было трудно отличить от окружающих тканей при КТ).

Пациенту была проведена петлевая илеостомия для обхода обструкции, а опухоль прямой кишки не была удалена. После операции была проведена химиотерапия, состоящая из 5-фторурацила, иринотекана, лейковорина и бевацизумаба (FOLFIRI + бевацизумаб). Первоначально пациент отреагировал на химиотерапию уменьшением метастазов в печени, уменьшением первичного поражения прямой кишки и уменьшением маркера карциноэмбрионального антигена крови (CEA) с 260,9 нг/мл до химиотерапии до 3,5 нг/мл непосредственно перед началом терапии DCA. Затем реакция на химиотерапию начала выходить на плато. К тому времени, как пациент обратился в клинику автора, химиотерапия вызывала минимальное уменьшение заболевания и по сути просто поддерживала стабильность.

Пациентка ранее была здорова и курила в течение 20 лет. Алкоголь употребляла время от времени. В семейном анамнезе был положительный анамнез рака толстой кишки и рака желудка. Лекарства включали текущую химиотерапию, как описано, клизмы с перекисью водорода, пероральный витамин С, иногда пероральный витамин D, гидроморфон замедленного высвобождения 32 мг два раза в день и гидроморфон короткого действия 2-4 мг перорально по мере необходимости при «прорывной» боли. Аллергий не было.

Функциональное обследование выявило несколько легких язв во рту, связанных с продолжающейся химиотерапией, легкую диарею (ожидаемую при илеостомии) и легкое прерывистое ректальное кровотечение. Была ноющая/жгучая боль в пояснице и крестце интенсивностью до 6 из 10, а также легкая боль в правом плече, усугубленная химиотерапией (по ощущениям, это была отраженная боль, связанная с метастазами в печени).

Поскольку химиотерапия все еще была эффективна, и у пациента не наблюдалось серьезных побочных эффектов, первоначальный подход заключался в поддержке существующей терапии пациента, а не в ее замене. Интегративный план был разработан совместно с врачом-натуропатом (Эндрюс).

План состоял из добавления высокой дозы перорального витамина D в размере 10 000 международных единиц в день, замены перорального витамина C на витамин C 50 г внутривенно (iv) еженедельно и добавления дихлорацетата натрия (DCA) 3000 мг внутривенно (49 мг/кг) еженедельно (производитель: Tokyo Chemical Industry, США). Для снижения риска побочных эффектов DCA были назначены 3 натуральные добавки: альфа-липоевая кислота (рацемическая) 500 мг внутривенно с каждой дозой DCA, пероральная R-альфа-липоевая кислота 150 мг 3 раза в день, пероральный ацетил L-карнитин 500 мг 3 раза в день и пероральный бенфотиамин 80 мг два раза в день.

Инфузии планировались вокруг инфузий химиотерапии (отделенных как минимум на 2 дня от химиотерапии), чтобы избежать любых потенциальных помех или лекарственных взаимодействий. Липоевая кислота не вводилась в дни химиотерапии или в течение 1 дня до или после химиотерапии, поскольку она является мощным антиоксидантом и может снижать эффективность химиотерапии. Интегративная терапия началась в марте 2012 года. Побочных эффектов не было отмечено, поэтому DCA была увеличена до 4000 мг внутривенно (66 мг/кг) в неделю. Единственным побочным эффектом, отмеченным при более высокой дозе DCA, была легкая постинфузионная седация.

Таблица 1 Анализ крови до терапии дихлорацетатом натрия

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

Пероральный метформин был добавлен, чтобы помочь сенсибилизировать рак к химиотерапии, начиная с 500 мг перорально один раз в день с титрованием до 500 мг 3 раза в день [39] . Прегабалин был добавлен, чтобы помочь контролировать невропатическую крестцовую боль (начало с 50 мг в день, титрование до 50 мг 3 раза в день). Побочные эффекты химиотерапии включали тошноту и рвоту (до начала приема метформина), и метформин пропускали в дни, когда пациент чувствовал себя плохо, чтобы предотвратить потенциальную токсичность, если у пациента возникнет обезвоживание.

Были получены стандартные базовые анализы крови, включая полный подсчет клеток, стандартную метаболическую панель, ферменты печени и билирубин (таблица 1). Была доступна базовая КТ, которая была выполнена за 2 месяца до начала интегративной терапии с DCA. 

После 4 месяцев интегративной терапии, как описано, было проведено новое КТ-сканирование (рисунок 1), которое было сообщено как «стабильное и неизмененное», но никаких измерений предоставлено не было. Было отмечено случайное обнаружение желчного камня (также стабильного с предыдущего сканирования). Пациент был расстроен тем, что не было отмечено никакого улучшения, и в отчете КТ не было указано никаких подробных измерений. Была предпринята попытка получить позитронно-эмиссионную томографию, чтобы прояснить живые или некротические опухоли, но государственное финансирование получить не удалось, и пациент отказался платить за сканирование в частном порядке.

После некоторого обсуждения пациент решил продолжить терапию и пройти будущие КТ-сканирования в другой больнице. К сентябрю 2012 года были отмечены усиливающиеся побочные эффекты химиотерапии, включая усталость, тошноту и рвоту. Новое КТ-сканирование показало, что все поражения печени были «либо меньше, либо больше не определялись». Однако наибольшее уменьшение опухоли составило всего 2 мм (маркерное поражение 2,5 см в сегменте печени 4a уменьшилось до 2,3 см). Новых поражений не было выявлено.

Рисунок 1. Абдоминальная компьютерная томография через 4 месяца интегративной терапии дихлорацетатом натрия, 5-фторурацилом и натуральными препаратами.  Показаны три среза с различными измеримыми метастазами печени. A: метастаз печени 23 мм × 33 мм; B: метастаз печени диаметром 15 мм; C: метастаз печени 11,2 мм × 25 мм 
.

Таблица 2 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, январь 2013 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

После обзора КТ пациент решил прекратить всю химиотерапию, а также бевацизумаб и метформин. Введение DCA внутривенно было продолжено, и доза была увеличена до 4500 мг внутривенно в неделю. Тошнота и рвота прекратились. Боль оставалась под контролем.

Новое КТ-сканирование было получено через 3 месяца, которое показало остаточную опухоль прямой кишки со стриктурой и проксимальной фекальной нагрузкой (без изменений), а также «метастазы в печени, без существенных изменений». Пациент сообщил о легком онемении пальцев рук и ног. Было отмечено дальнейшее увеличение бессимптомных повышений печеночных ферментов (таблица 2). Оба эти явления были диагностированы как побочные эффекты DCA. Во время терапии до этого момента CEA показывал легкие колебания, но в целом считался стабильным (рисунок 2).
Терапия DCA была прервана на 3 месяца, чтобы разрешить побочные эффекты DCA.

В это время применялись только натуральные методы лечения (прописанные Эндрюсом). Ацетил L-карнитин, бенфотиамин и альфа-липоевая кислота были продолжены для ускорения восстановления нейропатии DCA. Пероральный куркумин [40] и хонокиол (экстракт магнолии) были добавлены в попытке поддерживать контроль над раком [41] . В период, когда DCA был остановлен, CEA увеличился с 4,1 до 5,1 нг/мл (рисунок 2). Легкая нейропатия DCA разрешилась, и печеночные ферменты начали улучшаться.

К марту 2013 года из-за беспокойства о стоимости инфузионной терапии было решено начать оральную терапию DCA. Новое базовое КТ показало увеличение на 1 мм маркерного поражения сегмента печени 7 и увеличение на 1 мм маркерного аортокавального лимфатического узла, но было сообщено как «стабильный вид толстой кишки» и «стабильные метастазы в печени».

Пероральный DCA был начат в дозе 500 мг (8,2 мг/кг) два раза в день, и нейропротекторные добавки, состоящие из перорального ацетил L-карнитина, бенфотиамина и R-альфа-липоевой кислоты, были продолжены. Добавки давались непрерывно, а DCA давался по циклу 2 недели приема/1 неделя отдыха.

В декабре 2013 года в качестве обезболивающего средства был произведен переход с гидроморфона на метадон по 10 мг 3 раза в день для простоты, улучшения контроля боли и экономии средств.

Пациентка продолжила этот режим с регулярными КТ-сканированиями каждые 3–6 месяцев. Пациентка стала менее приверженной регулярным анализам крови из-за плотного рабочего графика. Она оставалась высокофункциональной (уровень ECOG 1) с легкой хронической нейропатией DCA, которая была контролируемой и не влияла на ее повседневную деятельность.

Была сделана попытка увеличить дозу DCA до 500 мг 3 раза в день, но это привело к значительному бессимптомному повышению уровня печеночных ферментов и усилению невропатии. В результате доза DCA 500 мг два раза в день была возобновлена ​​после кратковременного перерыва в терапии.

Продолжающиеся КТ-сканирования продолжали выявлять стабильное заболевание (рисунок 3), без появления новых очагов. Общий CEA существенно не изменился с начала терапии DCA (CEA 3,5 в начале терапии DCA до CEA 3,7 после почти 4 лет терапии). Общий анализ крови также был благоприятным на отметке 3 года (таблица 3) и после отметки 4 года (таблица 4).

Вкратце, после получения обычной химиотерапии в течение приблизительно 18 месяцев пациентка получала внутривенную терапию DCA с сопутствующей химиотерапией в течение приблизительно 6 месяцев, после чего последовала внутривенная и пероральная терапия DCA без сопутствующей обычной терапии рака в течение почти 4 лет. Во время лечения пероральным DCA у пациентки наблюдалась стабильная болезнь по данным КТ и стабильная болезнь по данным измерения опухолевого маркера CEA. Она также была клинически стабильна без эскалации дозы метадона, сохраняла функцию ECOG уровня 1, стабильную легкую нейропатию DCA, и она смогла успешно вести свой собственный бизнес.

Рисунок 2. График карциноэмбрионального антигена в ходе терапии. РЭА: карциноэмбриональный антиген.Рисунок 3. Абдоминальное компьютерное томографическое сканирование после 3 дополнительных месяцев интегративной терапии (дихлорацетат натрия + 5-фторурацил + натуральные лекарства), за которыми последовали почти 4 года дихлорацетата натрия без какой-либо сопутствующей традиционной терапии рака. Сканирование демонстрирует отсутствие повторного роста рака и отсутствие новых метастазов в печени. Показаны те же срезы, что и на рисунке 1. A: метастаз в печени 11,3 мм × 27,5 мм; B: метастазы не видны; C: метастазы не видны.

Таблица 3 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, май 2015 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

Таблица 4 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, апрель 2016 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.ОБСУЖДЕНИЕ

В данном случае применения DCA-терапии у пациента с раком толстой кишки четвертой стадии по клиническим, биохимическим и рентгенологическим критериям продемонстрирована долгосрочная стабильность заболевания.

Продолжительность стабильности при использовании DCA без другой активной химиотерапии в настоящее время составляет 46 месяцев (почти 4 года), а продолжительность жизни с момента первоначальной диагностики колоректального рака 4 стадии составляет 6 лет.

Согласно обзору статистики рака SEER Национального института рака за 1975-2011 гг., 5-летняя относительная выживаемость женщин с диагнозом рак толстой кишки/прямой кишки IV стадии составила 14,4% (http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/). Хотя нельзя сделать окончательный вывод об эффективности DCA, выживаемость в течение этого периода времени при отсутствии постоянной химиотерапии была бы относительно маловероятной.

Было отмечено, что DCA оказывает цитостатическое, а не цитотоксическое действие на колоректальные и другие раковые клетки, что подтверждает этот клинический вывод [ 23 , 27 , 42-44 ] . На сегодняшний день состояние пациентки остается клинически хорошим, и она продолжает получать терапию DCA.

Помимо поддержания стабильного течения заболевания, этот случай демонстрирует переносимость перорального DCA у онкологического пациента в течение гораздо более длительных периодов времени, чем те, о которых в настоящее время сообщают из опубликованных клинических испытаний у онкологических пациентов. Чу и др. [11] сообщили о 24 пациентах, получавших лечение в течение медианного времени 2 месяца в дозе 6,25 или 12,5 мг/кг два раза в день, на непрерывном пероральном DCA без нейропротекторных добавок.

Они пришли к выводу, что рекомендуемая доза для фазы 2 составляет 6,25 мг/кг два раза в день (12,5 мг/кг в день), при этом необходим тщательный мониторинг невропатии. Данбар и др. [9] рекомендовали 5 мг/кг два раза в день в качестве начальной дозы для большинства пациентов, при этом в их исследовании вводили 4, 8 или 12,5 мг/кг два раза в день непрерывно (медианное время на DCA 34 дня), также без нейропротекторных добавок.

Пациент в этом отчете принимал 500 мг два раза в день, что эквивалентно 8,2 мг/кг два раза в день, 2 недели приема/1 неделя перерыва, но не мог переносить эту дозу три раза в день (всего 25 мг/кг в день). Данбар и др. [9] предполагают, что генотипирование полиморфизмов в GSTZ1, ферменте метаболизма DCA в печени, который инактивируется при продолжающемся использовании DCA [45] , следует учитывать при определении начальной дозы для пациентов.

Однако необходима дальнейшая работа для сбора убедительных данных о генотипах и переносимости дозы. В настоящее время проводится клиническое исследование DCA у пациентов с множественной миеломой, чтобы внести вклад в этот пул данных (Реестр клинических испытаний Австралии и Новой Зеландии #ACTRN12615000226505, http://www.anzctr.org.au).

Необходимы дальнейшие исследования для определения оптимального режима дозировки для максимально переносимого острого или хронического лечения с помощью DCA, а также для определения дозы, необходимой для обеспечения эффективности.

Представленный случай показывает, что DCA имеет большие перспективы в качестве терапии рака. Пациентка получила значительную пользу от своей терапии, с легкими побочными эффектами и без гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичности. Наблюдалась некоторая гепатотоксичность (таблица 2), которая легко купировалась прерыванием терапии DCA с последующей корректировкой дозы.

Сообщалось о легкой обратимой периферической нейротоксичности. Натуральные методы лечения, которые сочетались с DCA (ацетил L-карнитин, альфа-липоевая кислота и бенфотиамин), помогли пациенту уменьшить побочные эффекты, но, как известно, не действуют как методы лечения рака.

На момент написания статьи не проводилось активных клинических испытаний, изучающих использование DCA в качестве цитостатического средства у людей. Поскольку DCA не имеет патента, сбор достаточных средств для поддержки крупномасштабных испытаний на людях является серьезной проблемой. Надеемся, что этот случай, иллюстрирующий преимущества перорального DCA, послужит стимулом для дальнейших клинических исследований.

На основании нашего клинического опыта в сочетании с существующими публикациями можно сделать вывод, что терапия DCA не по назначению является вариантом для пациентов с ограниченными возможностями традиционного лечения, если они понимают и принимают риски и преимущества терапии.

Этот отчет о случае показывает, что даже на поздней стадии заболевания DCA имеет потенциал для продления жизни без ущерба для качества жизни пациента по сравнению с химиотерапией с ее частыми изнурительными побочными эффектами или нарушением физиологических функций. Учитывая его разумную стоимость и умеренную токсичность, DCA заслуживает дальнейшего изучения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентку за ее поддержку и согласие опубликовать ее случай.

КОММЕНТАРИИ 

Характеристика случая
Пациентка 57 лет обратилась с жалобами на запор и боли в пояснице.

Клинический диагноз
У пациента диагностирован рак прямой кишки с частичной обструкцией. 

Лабораторная диагностика.
Повышенный уровень раково-эмбрионального антигена, онкомаркера.

Диагностика с помощью визуализации:
опухоль прямой кишки, обнаруженная при колоноскопии толстой кишки.

Патологический диагноз:
Умеренно дифференцированная колоректальная аденокарцинома. 

Лечение
Петлевая илеостомия с последующей химиотерапией, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, лейковорина и бевацизумаба, затем добавление дихлорацетата натрия (ДХА), затем ДХА без химиотерапии в течение почти 4 лет.

Сопутствующие отчеты
Отчеты компьютерной томографии демонстрируют снижение заболеваемости раком при комбинированной химиотерапии + DCA, а затем стабилизацию заболевания в течение почти 4 лет при DCA и отсутствии химиотерапии.

Объяснение термина 
DCA: Дихлорацетат натрия; RECIST: Критерии оценки ответа на солидные опухоли; ECOG: Восточная кооперативная онкологическая группа; SEER: Наблюдение, эпидемиология и конечные результаты.

Опыт и уроки
DCA не только является проапоптотическим препаратом, но и может действовать как цитостатический агент, и, таким образом, может обеспечить долгосрочную стабилизацию запущенного рака без серьезных побочных эффектов, как показано на примере этого случая рака прямой кишки. 

Рецензируемый
DCA, натриевая соль дихлорацетата, является дешевым химическим соединением, которое показало некоторый явный потенциал в качестве альтернативного лечения рака, которое использовалось в ряде испытаний с людьми, страдающими раком мозга или глиобластомой. Это хорошо написанный отчет о случае, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации опухоли рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины на период более 3 лет, без серьезной токсичности. Этот отчет охватывает то, что он обещает.

Авторы проделали солидную работу по объяснению основ терапии DCA и ее роли в различных типах опухолей. Наряду с добавлением механизмов действия против раковых клеток и терапевтического потенциала DCA, авторы предоставляют хороший ресурс для читателей, которые не знакомы с терапией DCA, но также предоставляют детали.