Анти-рак: научные исследования

Антимутагенный, антирекомбиногенный и противоопухолевый эффект амигдалина в тесте на основе дрожжевых клеток и клеточных линий млекопитающих

оригинал статьи: https://www.yeastgenome.org/reference/S000204830

Med Food. 2017 Apr;20(4):360-366. doi: 10.1089/jmf.2016.0108. Epub 2017 Feb 1.

Атанаска Тодорова 1, Маргарита Пешева 1, Иван Илиев 2, Крум Бардаров 3, Теодора Тодорова 4

Амигдалин является основным компонентом семян растений семейства розоцветных, таких как абрикосы, персики, вишня, нектарины, яблоки, сливы и т. д., а также миндаль. Он используется в альтернативной медицине для профилактики рака, облегчения лихорадки, подавления кашля и утоления жажды. Целью настоящего исследования является определение мутагенных и рекомбиногенных эффектов амигдалина в тестовой системе Saccharomyces cerevisiae и оценка его потенциального противоопухолевого эффекта в тесте на основе дрожжевых клеток и клеточных линиях рака толстой кишки. Полученные результаты показывают, что концентрации 25, 50 и 100 мкг/мл не оказали никакого цитотоксического, мутагенного и канцерогенного эффекта в тестах на основе дрожжевых клеток. Предварительная обработка амигдалином в концентрации 100 мкг/мл приводит к примерно двукратному повышению выживаемости клеток и снижению частоты обратных мутаций, вызванных алкилирующим агентом метилметансульфонатом. Частота генной конверсии и митотического кроссинговера примерно в три раза ниже. Антиканцерогенный потенциал амигдалина в той же концентрации представлен примерно четырехкратным снижением ретротранспозиции Ty1, вызванной шестивалентным хромом. Подводя итог, данные, представленные в этом исследовании, свидетельствуют о неспособности самого амигдалина провоцировать события, связанные с начальными этапами опухолегенеза. Кроме того, наблюдаемый антимутагенный/антирекомбиногенный эффект может заключаться в активации безошибочных и подверженных ошибкам событий рекомбинации. Основываясь на высокой селективности по отношению к нормальным или опухолевым линиям клеток, можно предположить, что амигдалин оказывает более высокий цитотоксический эффект в клеточных линиях с более высокой пролиферативной и метаболической активностью, которые составляют большинство быстро развивающихся опухолей.

Дихлорацетат ингибирует рост нейробластомы, специфически действуя против злокачественных недифференцированных клеток

оригинал статьи: https://sci-hub.st/10.1002/ijc.26173

Серена Велла1*, Маттео Конти2*, Роберта Тассо1, Раньери Канседда1,3 и Альдо Пагано1,3

1 Отделение онкологии, биологии и генетики (DOBiG), Университет Генуи, Генуя-Италия
2 Лаборатория клинической фармакологии и токсикологии, Ospedale S. Maria delle Croci, 48100 Равенна-Италия

3 Национальный институт исследования рака (IST) Генуя, Largo R. Benzi, 10, 16132 Генуя-Италия

Небольшая, растворимая в воде молекула дихлорацетата (ДХА) в последнее время вызывает живой интерес в области терапии рака, поскольку было показано, что она способна подавлять рост опухолей человека, действуя специфически на митохондрии раковых клеток без нарушения физиологии не злокачественных клеток. Нейробластома была одним из типов опухолей, в отношении которых DCA считался неэффективным, поскольку она состоит из клеток с небольшим количеством признанных митохондриальных аномалий. Однако нейробластома состоит из различных типов клеток с точки зрения метаболизма, фенотипа и злокачественного потенциала. Несмотря на вышеизложенное предсказание, в данной работе мы показали, что (i) DCA оказывает неожиданный противораковый эффект на опухолевые клетки НБ и (ii) этот эффект избирательно направлен на очень злокачественные клетки НБ, тогда как более дифференцированные/менее злокачественные клетки НБ рефрактерны к лечению DCA. Этот результат подтверждает необходимость детального изучения противораковых свойств DCA против этого типа опухолей с конечной целью его возможного использования в качестве терапевтического средства.

Небольшая молекула/орфанный препарат DCA недавно оказался в центре внимания благодаря своей способности ограничивать рост опухоли glioblastoma multiforme (GBM) в дозах, совместимых с отсутствием побочных эффектов.1-4 Таким образом, учитывая его хорошо переносимую токсичность и низкую стоимость, DCA вызывает живой интерес в связи с его потенциальным использованием в терапии рака и лечении некоторых типов опухолей.5 Действительно, хотя DCA показал свою эффективность в отношении мелкоклеточной карциномылегких6, рака молочнойжелезы7, простаты8, эндометрия9 и клеточных линийглиобластомы2, эффективность этой небольшой молекулы в качестве противоракового лечения пока клинически продемонстрирована только в отношении GBM человека, поэтому доказанную эффективность DCA в отношении других злокачественных опухолей еще предстоитоценить10 Более подробно, в силу своего механизма действия, DCA, как ожидается, будет неэффективен в отношении опухолей, характеризующихся низкой митохондриальной поляризацией, таких как овсяноклеточный рак легких, лимфомы, нейробластома (NB) и саркомы.5 DCA как ингибитор митохондриального фермента киназы пируватдегидрогеназы (PDK) активирует пируватдегидрогеназу (PDH), фермент-привратник, который регулирует поток пирувата в митохондрии, увеличивая соотношение окисления глюкозы и гликолиза.4-6 Bonnet и др. показали, что это усиление окислительного фосфорилирования является избирательно про-апоптотическим в раковых клетках, приводя к снижению их типичной гиперполяризации митохондрий, связанной с устойчивостью к апоптозу.6 Несмотря на то, что НБ изначально считался одним из типов опухолей, в отношении которого DCA, скорее всего, неэффективен, из-за его специфической мелкоклеточной особенности и предполагаемого отсутствия гиперполяризации митохондриальной мембраны,5 пролиферирующие клетки НБ поддерживаются гликолитическим фенотипом.11 Мы изучили возможную эффективность лечения DCA в подавлении роста узелков НБ человека, сформированных у мышей NOD-SCID. Удивительно, но мы заметили, что DCA значительно ограничивает рост опухоли in vivo. В опухолях НБ человека существует три различных типа клеток: I-тип стволовых клеток, N-тип нейробластических/нейроэндокринных предшественников и стволовые S-тип шванновских/меланобластических предшественников. Эти клетки обладают различными морфологическими, биохимическими и опухолегенными свойствами и варьируют по стадиям дифференцировки.12 Интересно, что, используя генетически сконструированные клетки SKNBE2 NB, характеризующиеся выраженной нейроноподобной приверженностью и очень низким злокачественным потенциалом, мы обнаружили, что эффект DCA ограничивается недифференцированными, очень злокачественными, полностью циклическими клетками, тогда как он не влияет на скорость пролиферации более дифференцированных, слабо злокачественных клеток. Представленные здесь эксперименты позволяют расширить возможную эффективность DCA как противоракового препарата до NB, действующего дифференцированно на сильно и/или слабо злокачественные клетки.

Ключевые слова: дихлорацетат, нейробластома, митохондрии *С.В. и М.К. внесли равный вклад в эту работу.

Спонсор гранта: Министерство университетов и исследований Италии — MIUR (2007 PRIN Program prot.); номер гранта: 2007945BZN; спонсор гранта: Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (2009 AIRC Program); номер гранта: IG9378; спонсор гранта: Министерство университетов и исследований Италии — MIUR (2007 Международная программа FIRB), Ассоциация итальянского общества по борьбе с нейробластомой (Генуя, Италия)

DOI: 10.1002/ijc.26173

История: Получено 25 февраля 2011 г.; Принято 20 апреля 2011 г.; Онлайн 9
мая 2011 г

Переписка по адресу: Альдо Пагано, отделение онкологии, биологии и генетики (DOBiG), Университет Генуи, Генуя, Италия, тел.: þ/39/ 010-5737241, факс: þ/39/010-5737257, e-mail: aldo.pagano@unige.it

Int. J. Cancer: 130, 1484-1493 (2012) VC 2011 UICC

Материал и методы

Мыши
Гомозиготные мыши NOD-SCID (NOD.CB17-Prkdcscid) были приобретены в Джексоновской лаборатории (Бар-Харбор, штат Массачусетс). Мышей использовали в возрасте от 5 до 8 недель. Все животные были выращены и содержались в питомнике Национального института исследования рака, Генуя, Италия. Уход и использование животных осуществлялись в соответствии с законами Министерства здравоохранения Италии и руководящими принципами Европейского сообщества.

Анализ опухолеродности in vivo
Суспензию клеток SKNBE2 в PBS (107 клеток) подкожно вводили 37 мышам NOD/SCID. Мыши были разделены на четыре группы: — контрольная группа (n ¼ 13 мышей): стерилизованная вода; — группа, обработанная DCA (25 мг/кг/доза) (n ¼ 14 мышей); — группа, обработанная DCA (2,5 мг/кг/доза) (n ¼ 5 мышей); — группа без обработки (n ¼ 5 мышей): мышам подкожно вводили суспензию клеток, но они были принесены в жертву перед любым видом обработки. DCA, как и стерилизованную воду, вводили внутрижелудочно, один раз в день/5 дней в неделю/в течение 4 недель. Лечение начинали, когда неоплазия достигала порогового диаметра 5 мм. Мышей еженедельно наблюдали за появлением опухолей в местах инъекций; размер опухолей измеряли каждую неделю штангенциркулем во всех группах. Изображения каждой мыши собирали в каждой рассматриваемой временной точке.

Клеточные культуры
Клетки SKNBE2 wt, Mock и S1 поддерживали на среде RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Милан, Италия), 10% FBS (GIBCO, S.Giuliano Milanese, Милан, Италия), L-глутамин (2 мМ; EuroClone, Девон, Великобритания), пенициллин-стрептомицин (100 U/мл/ 100 lg/мл; EuroClone) (стандартная среда). Клетки U2-OS поддерживали на среде Дульбекко, модифицированной Иглсом (DMEM) (Sigma-Aldrich), 10% FBS (GIBCO), L-глутамин (2 мМ; EuroClone) и пенициллин-стрептомицин (100 U/ml/ 100 lg/ml; EuroClone). Дихлорацетат готовили в виде водного раствора и добавляли в среду. Порции каждой рассматриваемой опухоли промывали в PBS и переваривали с 12,5 Ед/мл коллагеназы I типа (Biochrom AG, Берлин, Германия) и 12 Ед/мл диспазы (Roche, Германия) в PBS в течение 20 мин при 37oC. Свежевыделенные клетки использовали как для флоуцитометрического анализа, так и для экспансии in vitro в стандартной среде. Все клеточные культуры поддерживались при 37oCв атмосфере 95% воздуха/5% CO2 при 100% влажности.

Гистологический анализ и иммуногистохимия
Для гистологического исследования опухоли, полученные из каждой экспериментальной группы, были хирургически удалены, зафиксированы в 10% нейтрально-буферном формалине, обезвожены и помещены в парафин с использованием стандартных гистологических методов. Серийные 4-лм срезы вырезали и окрашивали гематоксилином и эозином (H/E) для изучения морфологических особенностей или обрабатывали для иммуногистохимии. После гидратации, извлечение антигена вызывали нагреванием в цитратном буфере pH 6.0, а эндогенные пероксидазы блокировали 3% H2O2 в воде. Неспецифическое связывание ингибировалось путем инкубации предметных стекол в 10% нормальной козьей сыворотке (Sigma-Aldrich, Милан, Италия). Использовали следующее первичное антитело: моноклональное античеловеческое Ki-67 (клон K-3; Oncogene, San Diego, CA). Отрицательные контроли с преиммунной сывороткой проводились параллельно. После тщательной промывки в Трис забуференном физиологическом растворе, слайды инкубировали с антимышиным вторичным антителом (BioSpa, Милан, Италия). После промывки добавляли стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (BioSpa), и инкубировали в течение 30 минут. Затем предметные стекла окрашивали хромогеном диаминобензидином (Lab Vision, Фримонт, Калифорния). Окрашивание проводилось гематоксилином. Изображения получали методом микроскопии в проходящем свете с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 200M, оснащенного цветной охлаждаемой 3CCD-камерой Zeiss Axio-Cam MRc (Zeiss, Wetzlar, Германия). Окрашенные H/E слайды наблюдались под тем же микроскопом в проходящем свете. Размер клеток анализировали с помощью общедоступного программного обеспечения ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ ij/). Порог был установлен для того, чтобы отличить контур каждой клетки от фона, и каждое изображение было преобразовано в двоичное (черно-белое). Для отделения одиночных клеток от скоплений использовалось разделение »Watershed». Площади рассчитывались с помощью «анализа частиц» с порогом отсечения размера частиц в 100 пикселей. Изменения в объеме клеток определялись путем деления количества пикселей с лекарственной обработкой на количество пикселей без лекарственной обработки.

Анализ апоптоза
Апоптоз анализировали методом проточной цитометрии, используя Annexin V в соответствии с инструкциями производителя (Annexin VFITC Apoptosis Kit, Immunological Sciences, Рим, Италия; Annexin V-APC Apoptosis Detection Kit I; BD Biosciences, Оксфорд, Великобритания; DAPI, Sigma-Aldrich, Милан, Италия). Вкратце, клетки, выделенные из опухолевых масс, промывали в PBS и ресуспендировали в бессывороточной среде. Аннексин V-FITC и йодистый пропидий (PI) добавляли к препаратам клеток (105 клеток) и инкубировали в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. Клетки Mock и S1 трипсинизировали, промывали в PBS и ресуспендировали в бессывороточной среде. Аннексин V-APC и DAPI добавляли к препаратам клеток (105 клеток) и инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Образцы анализировали с помощью цитофлуориметра Cyan ADP (Beckman-Coulter, Brea CA). Для каждого образца было получено 20 000 событий. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Summit 4.3.1 (DakoCytomation, Великобритания).

Анализы пролиферации клеток
(i) Для подсчета клеток, клетки Mock и S1 высевали в количестве 5 ×105 клеток в 10-см чашки для культуры ткани, инкубировали в стандартной среде с добавлением DCA (5 и 50 мМ) или без него и подсчитывали с помощью гемоцитометра после 48 ч обработки. (ii) Пролиферацию клеток также оценивали с помощью системы xCELLigence RTCA MP System (Roche, Германия), которая позволяет отслеживать клеточные события в режиме реального времени путем измерения электрического импеданса на пересекающихся золотых микроэлектродах, встроенных в дно планшетов с тканевыми культурами. Измерение импеданса дает количественную информацию о биологическом статусе клеток, включая их количество, жизнеспособность и морфологию.13 Импеданс клеточного сенсора выражается в произвольной единице, называемой клеточным индексом (КИ). Для определения клеточного индекса клетки, выделенные из каждой опухолевой массы, высевали в 100 мл стандартной среды в 96 микротитровальных планшетах (EPlate-Roche, Германия). Фоновый импеданс определялся с использованием 100 мл стандартной среды. Прикрепление, распространение и пролиферация клеток отслеживались каждые 30 минут с помощью системы xCELLigence. Пролиферацию клеток отслеживали в течение 72 ч. Результаты экспериментов проводились с использованием программного обеспечения RTCA Software 1.2, которое рассчитывало удвоение популяции путем подгонки кривой под экспоненциальное уравнение.

Количественный анализ РТ-ПЦР в реальном времени
Общую РНК из образцов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с протоколом производителя и подвергали обратной транскрипции с помощью Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Германия), следуя инструкциям производителя. Суммарную РНК из образцов определяли методом количественной РТПЦР в реальном времени с использованием PE ABI PRISM@ 7700 Sequence Detection System (Perkin Elmer Corp./Applied Biosystems, Foster City, CA) и метода Sybr Green в соответствии с инструкциями производителя. Последовательности прямого и обратного праймеров были следующими:

NF-68: для 5′ -CAAGGACGACGAGGTGTCCGAG-3′, rev 5′ — CCCGGCATGCTTCGA-3′;
NDM

29

: для 5′ -GGCAGGCAGGCGGGTTCGTTT-3′ , rev 5′ — CCACGCCTGGCTAAGTTTTTG-3′ ;
c-Kit: для 5′ -GCAAGTCAGTGCTGTCGGAA-3′ , rev 5′ — AAGATAGCTTGCTTTGGACACAGA-3′ . Для эндогенного контроля была исследована экспрессия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), поскольку было показано, что DCA не влияет на клеточную активность GAPDH.14 Последовательности праймеров для GAPDH человека были 5′ — GAAGGTGAAGGTGTCGGAGTC-3′ и 5′ — GAAGATGGTGATGGATGATTTC-3′ . Относительные уровни транскриптов определяли по относительной стандартной кривой, построенной из разведений исходной кДНК, и делили на целевое количество калибратора в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ митохондриального мембранного потенциала (∆Ψm)
Митохондриальный мембранный потенциал (∆Ψm) исследовали в живых клетках с помощью JC-1 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI). Для анализа потенциала, SKNBE2 wt, Mock, S1 и U2-OS wt высевали при плотности106 клеток/лунку с или без DCA (50 мМ). Через 72 часа после обработки клетки обрабатывали раствором JC-1 и инкубировали при 37oCв течение 15-30 минут. Клетки наблюдали с помощью микроскопа Axiophot Zeiss (Zeiss, Jena, Германия) [(Texas Red: возбуждение/эмиссия 590/610 нм) (FITC: возбуждение/эмиссия 485/ 535 нм)]. Количественную оценку флуоресценции определяли с помощью программного обеспечения ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Статистический анализ
Статистическая значимость наблюдаемых различий между разными экспериментальными группами рассчитывалась с помощью двуххвостового t-теста. p-значения < 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

DCA действует на клетки нейробластомы человека
Сначала, чтобы проверить, влияет ли DCA на рост узлов НБ, как это наблюдается в GBM, мы проверили его способность ограничивать рост опухолевой массы НБ in vivo. Мы ввели 37 мышам NOD-SCID клетки SKNBE2, человеческую N-myc амплифицированную клеточную линию НБ, характеризующуюся высоким злокачественнымпотенциалом17, для создания опухолевых узелков, которые обрабатывались DCA. Когда опухолевые узелки достигли порогового диаметра 5 мм, пять мышей были принесены в жертву до начала лечения, пять мышей были обработаны 2,5 мг/кг/дозу DCA, 14 мышей были обработаны 25 мг/кг/дозу DCA, а остальные 13 животных были обработаны водой в качестве контроля. Мы выбрали внутрижелудочное введение DCA, поскольку в некоторых литературных данных сообщалось, что парентеральное введение неэффективно для снижения роста опухоли.16 Каждую неделю измерялась масса опухоли, что показало, что объем опухоли, полученной от мышей, получавших 2,5 мг/кг/дозу DCA, уменьшился на 30% по сравнению с контрольной группой. Это торможение роста стало статистически значимым (p ¼ 0,0008), когда мышей лечили 25 мг/кг/дозу DCA (55% снижения по сравнению с контрольной группой) (рис. 1a и 1b). Для оценки переносимости лечения DCA мы еженедельно оценивали вес мышей. Животные, получавшие DCA (2,5 и 25 мг/кг/доза), не имели статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой, хотя вес нелеченной контрольной группы был немного увеличен, скорее всего, из-за больших опухолевых масс (рис. 1в). Кроме того, потребление воды не оказывало влияния на леченных животных (данные не показаны).
В целом, приведенные выше данные свидетельствуют о мощном, дозозависимом эффекте DCA на рост опухоли НБ.

Рисунок 1. Лечение DCA опухолей НБ in vivo. (a) На графиках представлены объемы опухолей нелеченных мышей (H2O) в сравнении с мышами, получавшими DCA 2,5 мг/кг (левая панель) и объемы опухолей нелеченных мышей (H2O) в сравнении с мышами, получавшими DCA 25 мг/кг (правая панель). (b) Репрезентативные изображения опухолей, полученных от мышей, получавших и не получавших DCA, после 4 недель лечения. (c) На графике представлен вес мышей, получавших и не получавших DCA, в течение 4 недель лечения. [Цветной рисунок можно посмотреть в онлайновом выпуске, который доступен на сайте wileyonlinelibrary.com]

DCA снижает пролиферацию раковых клеток
Чтобы определить возможные механизмы действия DCA, мы проанализировали, может ли наблюдаемое снижение роста опухоли быть связано с потерей объема клеток. Для этого мы проанализировали морфологию и/или размер клеток в опухолевых узелках, обработанных или не обработанных ДКА. Были рассмотрены 12 срезов из контрольной группы и 12 срезов из групп, получавших DCA (2,5 и 25 мг/кг). Статистически значимых различий в группах, обработанных DCA, по сравнению с контрольной группой не наблюдалось (рис. 2а).
Поскольку опубликованные сообщения о проапоптотическом эффекте ДКА противоречивы, а также учитывая недавние наблюдения о возможной клеточной специфичности проапоптотического эффекта ДКА,15 мы исследовали это явление в наших экспериментальных условиях с помощью флоуцитометрического анализа клеток из опухолей, обработанных ДКА и/или не обработанных. Результаты показали, что процент аннексин V-позитивных клеток одинаков в рассматриваемых группах, что указывает на то, что лечение ДКА не провоцирует увеличение скорости апоптоза в основной массе клеток опухолевых узлов (рис. 2б).

Рисунок 2. Морфология и уровень апоптоза клеток, составляющих опухолевые узелки НБ. (a) Окрашивание гематоксилином/эозином обработанных и необработанных опухолей (левая панель) (увеличение 40). Усредненный объем клеток обработанных и необработанных образцов представлен на правой панели. (b) Диаграммы проточной цитометрии FITC-аннексина V/PI свежевыделенных клеток из обработанных и необработанных опухолей. В левом нижнем квадранте каждой панели показаны жизнеспособные клетки, которые исключают PI и являются отрицательными для связывания FITC-аннексина V. В правом верхнем квадранте (R3) находятся нежизнеспособные, некротические клетки, положительные для связывания FITC-аннексина V и для поглощения PI. В правом нижнем квадранте (R5) представлены апоптотические клетки, положительные по FITC-аннексину V и отрицательные по PI. Показан один репрезентативный эксперимент для каждого экспериментального условия. Усредненный процент жизнеспособных и апоптотических клеток в трех рассматриваемых группах мышей представлен в правой части панели. [Цветной рисунок можно посмотреть в онлайновом выпуске, который доступен на сайте wileyonlinelibrary.com]

Поскольку опухоли, образовавшиеся в нашей экспериментальной модели, были получены в результате инъекции однородной клеточной линии, и учитывая, что мы продемонстрировали, что лечение DCA не повлияло ни на уменьшение объема опухолевых клеток, ни на увеличение апоптоза, мы предположили возможное влияние DCA на пролиферативную способность клеток. Для проверки этой гипотезы мы проанализировали клетки из обработанных и необработанных узлов с помощью иммуногистохимии, используя специфическое моноклональное антитело анти-Ki67. Результаты не выявили существенных различий по доле пролиферирующих/циклирующих клеток между группами. Таким образом, этот результат указывает на то, что лечение DCA не снижает количество циклирующих клеток, что согласуется с отсутствием полной эрадикации опухоли после лечения DCA (рис. 3а). Далее мы использовали систему xCELLigence (Roche, Германия) для выявления возможного дозозависимого увеличения удвоения популяции, вызванного лечением DCA. Мы обнаружили, что опухолевые клетки, полученные от обработанных мышей (25 мг/кг), дублируются через 23,3 часа, клетки от животных, обработанных 2,5 мг/кг, дублируются через 17,1 часа, тогда как клетки, полученные от контрольных мышей, демонстрируют время удвоения популяции 14,9 часа (рис. 3б). Поскольку различия были статистически значимыми (DCA 25 мг/кг против контрольной группы; p ¼ 0,0476), эти результаты показывают, что лечение DCA вызывает дозозависимую задержку клеточного цикла. Далее мы исследовали, связана ли задержка клеточного цикла клеток из обработанных опухолей с увеличением дифференцировки/привязанности. Для этого мы измерили в режиме реального времени методом RT-PCR маркеры дифференцировки клеток NB [Neuroblastoma Differentiation Marker 29 (NDM29), Neurofilament 68 (NF68)] и c-Kit, белок, специфически экспрессируемый стволоподобными/инициирующими опухоль клетками, в опухолевых тканях, обработанных DCA и не обработанных. Как показано на рисунке 3c, общее увеличение синтеза маркеров дифференцировки клеток НБ наблюдалось в клетках из опухолей, обработанных ДКА. Действительно, DCA, использованный в более высокой концентрации, вызывал увеличение экспрессии NF68 (75%, p < 0,001), тогда как более низкая доза вызывала скромное увеличение (17%, не является статистически значимым). Аналогично, увеличение экспрессии NDM29 было статистически значимым в опухолях, обработанных DCA 25 мг/кг (51% увеличение, по сравнению с контрольной группой; p < 0,001), тогда как лишь незначительная разница наблюдалась между клетками из опухолей, обработанных 2,5 мг/кг, и клетками из необработанных опухолей. Интересно, что образцы, обработанные DCA, также характеризовались снижением экспрессии c-Kit (11% снижение при сравнении DCA 2,5 мг/кг с контрольными образцами и 19% снижение при сравнении DCA 25 мг/кг с контрольными образцами, p < 0,001), что указывает на то, что DCA индуцирует снижение стволоподобного/инициирующего опухоль потенциала в пролиферирующих опухолевых клетках. Опять же, эти результаты подтверждают замедление скорости пролиферации и, возможно, снижение злокачественного потенциала клеток, обработанных DCA.
Далее, чтобы оценить, может ли DCA влиять на фракцию недифференцированных пролиферирующих клеток, мы измерили экспрессию c-Kit в опухолевых тканях мышей, принесенных в жертву до лечения DCA, и в узлах обработанных опухолей. Мы обнаружили, что, хотя экспрессия c-Kit (и, предположительно, злокачественный потенциал) прогрессивно увеличивается в процессе роста узелков (см. H2Oпротив до лечения), доставка препарата DCA имеет тенденцию ограничивать это явление, подтверждая в тканях опухолевых образований то, что уже наблюдалось в клетках, и давая обоснование отсутствию эрадикации опухоли у мышей, леченных DCA (рис. 3д).

Рисунок 3. Анализ пролиферативного потенциала и стадии дифференцировки клеток, составляющих опухолевые узлы НБ. (a) Репрезентативные изображения опухолей, полученных от леченных и нелеченных мышей, иммуногистохимически окрашенных антителом анти-Ki67 (увеличение 40). Также показаны преиммунные контроли. (б) Определение влияния DCA на время удвоения клеточной пролиферации клеток, выделенных из обработанных и необработанных опухолей. (в) Количественная оценка экспрессии NF68, NDM29 и c-Kit в опухолевых узлах НБ с помощью RT-PCR в реальном времени. (d) Количественная оценка экспрессии c-Kit в режиме реального времени RT-PCR в опухолевых узелках НБ, полученных от мышей, принесенных в жертву до лечения ДКА (BT), нелеченных мышей (H2O) и мышей, леченных ДКА (2,5 и 25 мг/кг). [Цветной рисунок можно посмотреть в онлайновом выпуске, который доступен на сайте wileyonlinelibrary.com]

DCA действует специфически на злокачественные клетки НБ и неэффективен на дифференцированные, слабо злокачественные клетки НБ
Все больше экспериментальных данных свидетельствует о том, что прогноз НБ и его ответ на противораковое лечение зависят от стадии дифференцировки узлов НБ. Действительно, особенностью НБ является замечательная гетерогенность клеток, которые могут происходить из различных линий нервного гребня на разных стадиях.12,17 В этом контексте разумно предположить возможную различную восприимчивость к ДКА различных типов клеток. Для проверки этой гипотезы мы использовали модель дифференцировки клеток НБ in vitro, основанную на экспрессии транскрибируемой pol III нкРНК. Действительно, недавно мы выделили новую РНК-полимеразу (pol) III-транскрибируемую некодирующую (nc) РНК (а именно NDM29), экспрессия которой вызывает нейроноподобную дифференцировку клеток НБ (NB), сильно снижая их злокачественный потенциал и экспрессию маркеров опухолевых инициаторов/стволоподобных клеток. Встраивая дополнительные копии транскрипционной единицы NDM29 в опухолевые клетки SKNBE2, мы создали линию клеток SKNBE2, сверхэкспрессирующую NDM29 (далее S1), и соответствующую Mock negative, экспрессирующую NDM29 на эндогенном уровне. Клетки S1 демонстрируют частично дифференцированный/нейроноподобный фенотип, слабо злокачественны и характеризуются выраженной задержкой клеточного цикла.18,19
Чтобы исключить, что обработка DCA может индуцировать апоптоз in vitro, как это продемонстрировано в экспериментах in vivo, мы измерили процент апоптотических клеток в клеточных линиях Mock и S1, обработанных и/или не обработанных препаратом в течение 48 ч. Никаких различий между клеточными линиями (необработанными или обработанными разными дозами DCA) не наблюдалось, что подтверждает, что DCA не провоцирует апоптоз в клетках NB (рис. 4a).
Чтобы определить влияние на пролиферацию клеток Mock и S1, мы обработали клетки 5 мМ и 50 мМ DCA и измерили время удвоения клеточной популяции (PD) в четырех независимых экспериментах. Концентрация 50 мМ была выбрана в качестве максимальной дозы, поскольку в различных предыдущих исследованиях сообщалось, что DCA, по-видимому, относительно неактивен в различных клеточных линиях при использовании более низких доз.16,20 Как показано на рисунке 4b, время PD значительно увеличивается при обработке DCA в дозозависимой манере в клетках Mock. Действительно, в отсутствие лечения, Mock дуплицировались через 30 ч, тогда как доставка 5 мМ DCA индуцировала задержку клеточного цикла на 10 ч, а более высокая доза 50 мМ DCA привела к увеличению на 14 ч (p < 0,001). Эти результаты показывают, что DCA индуцирует задержку клеточного цикла в недифференцированных/полностью пролиферирующих клетках NB. Напротив, ПД для клеток S1 оставался приблизительно неизменным, смещаясь от 47 ч для необработанных клеток к 50 ч для клеток, обработанных 5 мМ ДКА, и к 49 ч для клеток, обработанных 50 мМ ДКА (рис. 4б). Этот результат показывает, что ответ на лечение DCA напрямую зависит от стадии дифференцировки/пролиферации клеток НБ, поскольку дифференцированные клетки с очень низким злокачественным потенциалом слабо реагируют на лечение, в то время как их полностью пролиферирующие/очень злокачественные аналоги сильно страдают от лечения DCA.
Чтобы лучше понять этот феномен и учитывая, что эффекты DCA связаны с ингибированием PDK, активацией окислительного фосфорилирования митохондрий и специфическим снижением гиперполяризации митохондрий,6 мы протестировали клетки Mock и S1 на предмет возможных изменений в гиперполяризации митохондрий как основы дифференциальной восприимчивости этих клеток к DCA. Для этого мы обработали клетки JC-1 (5,5′,6,6′-тетрахлор-1,1′,3,3′-тетраэтилбензимидазолокарбоцианин йодид), флуоресцентным красителем, поглощение которого пропорционально потенциалу митохондрий. JC-1 может избирательно проникать в митохондрии и обратимо меняет цвет с зеленого на красный при увеличении митохондриального потенциала, так что уменьшение соотношения красной и зеленой флуоресценции указывает на реактивацию митохондрий. Мы сравнили поляризацию митохондриальных мембран клеток остеосаркомы U2-OS (гиперполяризованные контрольные клетки21), клеток SKNBE2 wt, Mock и S1. Мы обнаружили, что клетки Mock демонстрируют сходную степень поляризации по сравнению с клетками SKNBE2 wt, тогда как клетки S1 характеризуются сниженной степенью поляризации митохондрий (p ¼ 0,0184) (рис. 4c). Результаты, полученные в трех повторах, показали, что в клетках Mock происходит реактивация митохондрий под действием ДКА (снижение отношения красной/зеленой флуоресценции на 25%; p ¼ 0,0077), тогда как в клетках S1 митохондриальная активность не изменяется в присутствии ДКА (рис. 4c). Таким образом, эти результаты показывают, что восприимчивость злокачественных/полностью циклических клеток связана с митохондриальным статусом, чувствительным к действию DCA, тогда как коммитированные/дифференцированные, плохо циклические клетки рефрактерны к действию этого препарата.
Далее, чтобы выявить возможное влияние ДКА на потенциал дифференцировки, мы измерили методом RT-PCR в реальном времени уровень экспрессии NDM29, NF68 и c-Kit в обработанных ДКА и необработанных клетках Mock. Мы провели этот анализ именно на клетках Mock, поскольку клетки S1 были рефрактерны к снижению пролиферации, вызванному DCA. Как показано на рисунке 4d, обработка DCA привела к увеличению экспрессии маркера дифференцировки NF68 (клетки Mock, обработанные 5 мМ или 50 мМ DCA по сравнению с необработанными клетками, p < 0,0001). Аналогично, экспрессия NDM29 была значительно увеличена в обработанных клетках-макетах по сравнению с контролем (p < 0,001). Напротив, экспрессия c-Kit была снижена дозозависимым образом в обработанных клетках (p < 0,0001). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что в клетках НБ противоопухолевый эффект DCA обусловлен в основном антипролиферативным/дифференцирующим действием и не приводит к увеличению уровня апоптоза.

Рисунок 4. Лечение ДКА клеток НБ in vitro. (a) Диаграммы флоуцитометрии APC-Annexin V/DAPI обработанных ДКА и необработанных клеток Mock и S1. Показан один репрезентативный эксперимент для каждого экспериментального условия. Усредненный процент жизнеспособных и апоптотических клеток в двух рассматриваемых клеточных линиях представлен в правой части панели. (b) Определение влияния DCA на время удвоения клеточной пролиферации клеток Mock и S1. (в) Измерение флуоресценции JC-1 в клетках U2-OS wt, SKNBE wt, Mock и S1, обработанных или не обработанных DCA. U2-OS wt используются в качестве гиперполяризованных контрольных клеток. (d) Определение количества NF68, NDM29 и c-KitmRNA в режиме реального времени в клетках Mock, обработанных или не обработанных DCA.

Обсуждение

DCA — это небольшая молекула, которая уже более 30 лет используется для лечения врожденного и приобретенного молочнокислого ацидоза.22 Действительно, хорошо описано, что лечение DCA снижает уровень лактата в циркуляции путем смещения клеточного метаболизма с гликолиза на окисление глюкозы, без какого-либо пагубного влияния на нормальные клетки.6 Благодаря своей способности благоприятствовать метаболизму глюкозы путем аэробного гликолиза, DCA успешно используется в клинических испытаниях при заболеваниях сердца, включая застойную сердечную недостаточность и ишемическую болезнь сердца, поскольку постишемическая дисфункция гипертрофированного сердца связана с низкой скоростью окисления глюкозы и высокой скоростью гликолиза.23
Очень привлекательным свойством DCA является его переносимость и безопасность. Действительно, более чем в 40 клинических исследованиях ДКА сообщается, что наиболее значительным побочным эффектом длительного приема ДКА является обратимая периферическая нейропатия.24,25
В последние годы на моделях in vitro и in vivo получены убедительные доказательства того, что ДКА может быть полезен для лечения некоторых видов рака у человека.6 Действительно, ДКА способен обращать эффект Варбурга, ингибируя PDK, восстанавливая мембранный потенциал митохондрий и увеличивая продукцию ROS. По этой причине DCA прославился как волшебная пуля против рака,1 даже если в настоящее время он еще не одобрен для лечения рака.26 Несмотря на то, что нейробластома до сих пор считалась типом рака, для которого лечение ДКА, скорее всего, неэффективно, из-за предполагаемого отсутствия гиперполяризации митохондриальной мембраны в клетках, составляющих узелки НБ,27 было описано, что пролиферирующие клетки НБ поддерживают гликолитический фенотип,11 и что даже в аэробных условиях клетки НБ превращают значительное количество глюкозы в лактат вместо того, чтобы использовать окисление глюкозы.28 Исходя из этого, целью данного исследования было определить, может ли DCA оказывать благоприятное воздействие на этот тип опухоли. Наши результаты выявили непредсказуемое положительное влияние ДКА на рост опухоли НБ как в моделях in vivo, так и in vitro. Действительно, DCA был эффективен в установленных опухолях НБ, не вызывая никаких явных побочных эффектов у леченных животных.
Более подробный анализ, проведенный на клетках, полученных из обработанных опухолей, показал, что DCA приводит к задержке пролиферации без признаков усиления апоптоза или гибели клеток. Это согласуется с наблюдаемым уменьшением объема опухолевых масс, не сопровождающимся полным уничтожением рака. Механизмы действия DCA до сих пор остаются спорными. В этом контексте наши результаты контрастируют с предыдущими исследованиями, в которых клетки рака эндометрия, простаты, толстой кишки и легких обрабатывались DCA.6,9,20 В этих случаях отмечалось усиление апоптоза без влияния на распределение клеточного

цикла9

,21 или усиление апоптоза, сопровождаемое снижением пролиферации8. С другой стороны, по другим данным, DCA подавляет пролиферацию раковых клеток, но не увеличивает апоптоз или гибель клеток.7 Этот последний механизм подтверждается протеомным анализом, в котором лечение DCA вызывает изменения маркеров клеточной пролиферации, а не количество белков, связанных с апоптозом.16 Такое двойственное поведение DCA может зависеть от типа клеток, возможно, из-за различий в экспрессии изоферментов PDK в исследуемых раковых клетках. В настоящее время ведутся исследования по соотнесению экспрессии PDK с чувствительностью к DCA.
Интересно, что мы показали, что увеличение экспрессии некоторых маркеров дифференцировки, таких как NF68 и NDM29, сопровождающееся снижением экспрессии c-kit, маркера стволовых/опухолеобразующих клеток, коррелирует с наблюдаемым снижением пролиферации раковых клеток. Таким образом, DCA-зависимая индукция задержки клеточного цикла, сопровождающаяся усилением дифференцировки клеток, представляет собой новый, еще не описанный механизм действия этого препарата, который связывает эффекты DCA со стадией дифференцировки раковых клеток.
Документально подтверждено, что опухоли НБ человека характеризуются различными типами клеток, которые имеют различные морфологические, биохимические и туморигенные свойства и различные стадии дифференцировки.12 Чтобы углубить возможную корреляцию восприимчивости к DCA с уровнем дифференцировки клеток, мы использовали модель дифференцировки клеток НБ in vitro, основанную на сверхэкспрессии pol III-транскрибируемой нцРНК (NDM29). Мы создали линию клеток SKNBE2, сверхэкспрессирующую NDM29 (здесь и далее обозначается как S1), и соответствующий отрицательный контроль Mock.19 Эти линии клеток обрабатывали 5 мМ и 50 мМ DCA. Концентрация 50 мМ была выбрана в качестве максимальной дозы, поскольку в различных предыдущих исследованиях сообщалось, что DCA относительно неактивен в различных клеточных линиях при использовании более низких доз,16,20 хотя эта концентрация не может быть достигнута in vivo. Тем не менее, в наших экспериментальных условиях действие DCA проявляется при более низкой дозе (5 мМ), что является подходящей концентрацией для использования in vivo.
Как и ожидалось, мы обнаружили, что и в клетках Mock и S1 обработка DCA не вызвала признаков апоптоза, что подтверждает наши результаты in vivo. Интересно, что эффект DCA ограничивается недифференцированными, очень злокачественными, полностью циклическими клетками (клетки Mock), тогда как он не влияет на скорость пролиферации более дифференцированных, слабо злокачественных клеток (клетки S1). Этот эффект может быть связан с различной степенью поляризации митохондрий в этих типах клеток. Действительно, мы продемонстрировали, что клетки Mock имеют более высокую степень митохондриальной поляризации, чем их более дифференцированный аналог S1.
Таким образом, мы продемонстрировали, что различные клетки, составляющие опухолевые массы НБ, по-разному восприимчивы к DCA, который избирательно действует на очень злокачественные и полностью пролиферирующие клетки, тогда как на слабо злокачественные, более дифференцированные клетки он оказывает очень слабое воздействие. Подобное дифференцированное действие DCA было также отмечено в исследовании, посвященном глиобластоме (GBM)2, где авторы показали, что раковые стволовые клетки, по сравнению с более дифференцированными аналогами, составляющими GBM, демонстрируют те же метаболические и митохондриальные перестройки, но в более высокой степени, поскольку они имеют большинство гиперполяризованных митохондрий.2
В заключение, описанные здесь эксперименты поддерживают мнение о DCA как об очень избирательном препарате, который может помочь в противораковом лечении NB без значительных побочных эффектов на здоровые клетки. Таким образом, это предварительное исследование расширяет возможности использования DCA для лечения рака НБ, подтверждая необходимость детального изучения его противораковых свойств против этого типа опухолей.

Благодарности

R.C. была поддержана Министерством университетов и исследований ИталииMIUR (2007 Международная программа FIRB). А.П. был поддержан Министерством университетов и исследований Италии (2007 PRIN Program prot. 2007945BZN), Итальянской ассоциацией по изучению рака (2009 AIRC Program no. IG9378) и Итальянской ассоциацией по борьбе с нейробластомой (Генуя, Италия).

Генотоксический и антигенотоксический потенциал амигдалина на изолированных человеческих лимфоцитах с помощью кометного анализа

оригинал статьи: https://wellesu.com/10.1111/jfbc.13436

Эрикель Э. , ЮЗБАШИОГЛУ Д. , ЮНАЛ Ф.

ЖУРНАЛ ПИЩЕВОЙ БИОХИМИИ, том 44, № 10, 2020 (SCI-расширенный)

Краткое содержание

Амигдалин — это цианогенный гликозид, в основном присутствующий в семенах семейства розоцветных, таких как абрикосы, персики и горький миндаль. В этом исследовании генотоксические и антигенотоксические эффекты амигдалина in vitro были изучены на лимфоцитах периферической крови человека с использованием кометного анализа. Антигенотоксическое действие амигдалина оценивали в отношении перекиси водорода (H2O2) с использованием трех различных типов лечения (до, одновременно и после лечения). Выделенные лимфоциты инкубировали с различными концентрациями амигдалина (0,86-13,75 мкг/мл) отдельно и в сочетании с H2O2 (100 мкМ). Результаты показали, что амигдалин проявлял антигенотоксическое действие в отношении H2O2, но он не вызывал генотоксический эффект сам по себе в тестируемых концентрациях in vitro на лимфоцитах человека. Практическое применение Амигдалин – это природное соединение, используемое в альтернативной медицине в качестве противоракового, жаропонижающего и противокашлевого средства. Кометный анализ, который является относительно простым, быстрым, чувствительным и экономически эффективным, измеряет изменения в стабильности генома. Оценка амигдалина в отдельности не оказывает генотоксического действия на лимфоциты человека. Более того, антигенотоксичное применение амигдалина (до, одновременно и после лечения) значительно уменьшало повреждение ДНК, вызванное H(2)O(2) на изолированных лимфоцитах человека. В заключение следует отметить, что амигдалин не является генотоксичным, а также проявляет антигенотоксическую активность в отношении окислительно-поврежденной ДНК благодаря своим антиоксидантным свойствам на лимфоцитах человека.

Активация митохондриального окисления путем ингибирования

PDK2 обращает вспять устойчивость к цисплатину при раке головы и шеи

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1016/j.canlet.2015.11.023

Чон Лиел Рох a, *, Джин Янг Парк a, Ын Хе Ким a, Хе Джин Чан a, Минсу Квон b

a Отделение отоларингологии, Медицинский центр Асан, Медицинский колледж Университета Ульсан, Сеул, Республика Корея
b Отделение отоларингологии, Медицинская школа при больнице Национального университета Кёнсан, Чинджу, Республика Корея

Автор переписки: Тел: +82 2 3010 3965; факс: +82 2 489 2773. Адрес электронной почты: rohjl@amc.seoul.kr (J.-L. Roh).

Получено: 9 сентября 2015 г.
Пересмотрено: исправленная форма 13 ноября 2015 г.
Принято: 14 ноября 2015 г

Аннотация

Дихлорацетат (ДХА), сиротский препарат, способствующий переходу от гликолиза к окислительному фосфорилированию, был повторно использован для лечения рака. В настоящем исследовании изучалось, может ли DCA преодолеть резистентность к цисплатину при раке головы и шеи (РГШ). Были использованы две устойчивые к цисплатину линии клеток РГШ (AMC-HN4R и -HN9R), их родительские линии и другие линии клеток РГШ человека. Эффект DCA, отдельно и в комбинации с цисплатином, оценивали путем измерения клеточного цикла, жизнеспособности, гибели, продукции реактивных форм кислорода (ROS), мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) и экспрессии белков в доклинических моделях опухолевых ксенотрансплантатов мыши. Увеличение гликолиза коррелировало со снижением чувствительности к цисплатину и уменьшалось под действием DCA. Устойчивые к цисплатину клетки сверхэкспрессировали киназу пируватдегидрогеназы 2 (PDK2). DCA индуцировал гибель клеток HNC путем снижения ΔΨm и стимулирования производства митохондриальной ROS. Этот эффект снижался антиоксидантом N-ацетил-л-цистеином или ингибированием апоптоза, опосредованного каспазой. Активация митохондриального окисления глюкозы под действием DCA в конечном итоге активировала нижележащие митохондриальные апоптотические сигналы, что привело к гибели химиорезистентных раковых клеток. Таким образом, DCA значительно сенсибилизировал устойчивые клетки HNC к цисплатину in vitro и in vivo. Высокий гликолиз и сверхэкспрессия PDK2 тесно связаны с устойчивостью клеток НЯК к цисплатину; последняя может быть преодолена с помощью DCA.

Ключевые слова: Рак головы и шеи, устойчивость к цисплатину, PDK2, дихлорацетат, ремоделирование митохондрий
Сокращения: РГШ, рак головы и шеи; ДХА, дихлорацетат; CDDP, цисплатин; OXPHOS, окислительное фосфорилирование; PDK2, киназа 2 пируватдегидрогеназы; PDHE1α, изоформа E1α пируватдегидрогеназы; ROS, реактивные виды кислорода; ΔΨm, мембранный потенциал митохондрий; NAC, N-ацетил-цистеин; DCF-DA, 2′,7′- дихлорфлуоресцеин диацетат; PARP, поли(АДФ-рибоза) полимераза; siRNA, короткая интерферирующая РНК; 18F-FDG, 18F-фтордезоксиглюкоза; PET, позитронно-эмиссионная томография; SUV, стандартизированное значение поглощения; MTV, метаболический объем опухоли; TUNEL, терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованное мечение ник-конца ДУТФ.

© 2015 Elsevier Ireland Ltd. Все права защищены.

ВВЕДЕНИЕ

Рак головы и шеи (РГШ) является восьмым по распространенности раком во всем мире, ежегодно диагностируется более полумиллиона новых случаев [1]. Опухоли возникают в верхних отделах пищеварительного тракта, включая ротовую или носовую полость, глотку и гортань, и метастазируют в регионарные лимфатические узлы и отдаленные участки. Современный стандарт лечения ГНК включает мультимодальный подход, включающий хирургию, химиотерапию и радиотерапию, особенно при распространенном ГНК. Наряду с недавним интересом к стратегиям сохранения органов, нехирургические методы, такие как радиотерапия в сочетании с химиотерапией, все чаще используются в качестве первой линии терапии при НЯК [2]. В настоящее время системная химиотерапия является центральным компонентом нескольких лечебных подходов, включая комбинацию с окончательной лучевой терапией или индукционным лечением, превышающим резервирование только для паллиации [3]. Цисплатин, платиновое производное цис-диамминдихлорплатина (II) (CDDP), остается химиотерапевтическим препаратом первой линии в нехирургических методах лечения НЯК, несмотря на последние достижения в области таргетной терапии [4]. Однако за последние три десятилетия, несмотря на диагностические и терапевтические достижения, общая выживаемость при НЯК существенно не изменилась, что является результатом стойкой резистентности раковых клеток к терапии, включая цисплатин и облучение [2].

Метаболические изменения являются общей чертой раковых клеток: сдвиг в генерации клеточной энергии от митохондриального окислительного фосфорилирования к аэробному гликолизу обеспечивает биосинтетическое преимущество раковых клеток [5]. Увеличение гликолиза в раковых клетках, называемое эффектом Варбурга, обычно связано с фенотипическими изменениями, включая адаптацию к гипоксии и недостатку питательных веществ, устойчивость к окислительному стрессу и апоптотическим стимулам, а также повышенный синтез биомассы [6]. Дерегулированный метаболизм связан с устойчивостью к лечению при терапии рака [7]. В гликолитическом пути повышение уровня транспортера глюкозы (GLUT), гексокиназы (HK), пируваткиназы M2 (PKM2), киназы пируватдегидрогеназы (PDK), лактатдегидрогеназы-A (LDHA), синтеза жирных кислот (FASN) и глутаминазы, среди прочих, связано с устойчивостью к противораковым препаратам [7]. Имеются данные о том, что регулирование метаболизма раковых клеток может улучшить терапию и преодолеть устойчивость к химиотерапии или радиотерапии [8,9].

Дихлорацетат (ДХА), сиротский препарат для лечения молочнокислого ацидоза, сдвигает метаболизм раковых клеток с гликолиза на окислительное фосфорилирование [10]. DCA избирательно ингибирует PDK, который активируется во многих видах рака, что приводит к активации пируватдегидрогеназы (PDH), комплекса ферментов, которые превращают цитозольный пируват в митохондриальный ацетил-КоА. Ингибирование PDK с помощью малой интерферирующей РНК (siRNA) или лечение DCA изменяет биоэнергетику рака и восстанавливает митохондрий-зависимый апоптоз в раковых клетках [11]. DCA эффективен в лечении рака с агрессивным фенотипом in vitro и in vivo[12,13], а также преодолевает резистентность к сорафенибу в гепатоцеллюлярной карциноме путем активации митохондриального окислительного фосфорилирования [14]. Таким образом, DCA может быть подходящим противораковым препаратом для повышения эффективности химиотерапии и преодоления резистентности к химиотерапевтическим средствам при раке человека; однако, хотя DCA широко изучался при раке, он редко тестировался на клетках НЯК [15], особенно в условиях резистентности к химиотерапевтическим средствам. Необходимо дальнейшее изучение механизмов действия DCA и синергизма с традиционными химиотерапевтическими препаратами. Здесь мы показываем, что DCA смещает биоэнергетику НЯК в сторону митохондриального окисления глюкозы и приводит к накоплению в клетках митохондриальных реактивных форм кислорода (mROS), тем самым сенсибилизируя химиорезистентные клетки НЯК к цисплатину in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Культура клеток и создание цисплатин-устойчивых клеток НГШ
Клетки рака головы и шеи человека (РГШ) AMC-HN2, -HN3, -HN4, -HN5, -HN9 и -HN10 выращивали в минимальной основной среде Орла (Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA); Клетки SNU-1041, -1066 и -1076 выращивали в среде Roswell Park Memorial Institute (Life TechnologiesTM ); а клетки UMSCC1 выращивали в модифицированной среде Дульбекко Eagle (Life TechnologiesTM ). Среда была дополнена 10% фетальной бычьей сывороткой. Все линии раковых клеток были подтверждены путем профилирования ДНК (короткие тандемные повторы, STR), предоставленной Корейским банком клеточных линий. Клетки инкубировали при 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2.

Устойчивые к цисплатину клетки AMC-HN4 и HN9 (HN4R и HN9R) были получены из родительских чувствительных к цисплатину клеток AMC-HN4 и HN9, соответственно, путем воздействия возрастающих концентраций цисплатина (цис-платина (II) диамин дихлорид [CDDP]; Sigma-Aldrich, Луис, МО, США) [16]. Устойчивость к цисплатину в созданных клеточных линиях оценивали с помощью анализа жизнеспособности клеток и сравнивали с родительскими клетками.

Анализ клеточного цикла и гибели клеток
Для анализа клеточного цикла клетки подвергали воздействию ДКА в течение 72 ч. Затем клетки трипсинизировали, фиксировали на ночь в ледяном этаноле и окрашивали в течение 30 мин йодистым пропидием (Sigma-Aldrich) при температуре 37 °С. Содержание клеточной ДНК измеряли с помощью проточного цитометра FACScalibur (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США). Для анализа клеточной гибели клетки культивировали с цисплатином и DCA, отдельно или в комбинации, или эквивалентным количеством ДМСО (транспортный контроль). Через 72 часа клетки собирали, промывали ледяным PBS и ресуспендировали в буфере для связывания. Клетки окрашивали аннексином V-FITC (флуоресцеин изотиоцианат) и йодистым пропидием с использованием набора для выявления апоптоза аннексином V-FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), а затем анализировали методом проточной цитометрии. Все данные анализировали с помощью программного обеспечения Cell Quest (BD Biosciences). Статистическую значимость между различными группами лечения оценивали с помощью двуххвостового U-теста Манна-Уитни или t-теста Стьюдента.

Для анализа активности каспазы клетки HN4R и HN9R, посеянные в 96-луночный планшет, подвергали воздействию 100 мкл среды, содержащей цисплатин и DCA отдельно или в комбинации, в течение 72 ч, с или без 3 мМ NAC или 50 мкМ Z-VAD-fmk (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) перед воздействием 30 мМ DCA. Анализы проводили в трех лунках с использованием флуориметрического Homogeneous Caspase Assay (Roche Life Science, Базель, Швейцария). Добавляли рабочий раствор субстрата, и планшет инкубировали в темноте при 37 °C в течение 2-8 ч или при комнатной температуре в течение ночи. Поглощение в каждой лунке измеряли при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны эмиссии 520 нм с помощью микропланшетного ридера SpectraMax M2.

Для измерения мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) клетки HN4R и HN9R, посеянные в 96-луночный планшет, подвергались воздействию 100 мкл среды, содержащей цисплатин и DCA отдельно или в комбинации в течение 36 ч. Клетки окрашивались 200 нМ тетраметилродамин этилового эфира (TMRE, Life Technologies TM ) в течение 20 мин и затем анализировались методом проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) каждой группы лечения была нормализована по отношению к контрольной группе.

Доклинические исследования
Все процедуры исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных нашего учреждения. Шестинедельные атимичные самцы мышей BALB/c (nu/nu) были приобретены у Central Lab Animal Inc. (Сеул, Республика Корея). Клетки AMC-HN4R или HN9R (5 x 10 6 ) вводили подкожно во фланг. Объем опухоли и вес тела измеряли каждые 3 дня. Опухоли измеряли с помощью штангенциркуля, а объем рассчитывали как (длина х ширина2 )/2. Лечение начиналось, когда клеточные имплантаты становились пальпируемыми узелками (= день 0). Мыши были рандомизированы на четыре группы лечения: транспортное средство, DCA, цисплатин и DCA плюс цисплатин.

Мышей лечили питьевой водой с добавлением 0,5 г/л DCA, или внутривенным введением 5 мг/кг цисплатина один раз в неделю, или комбинацией DCA и цисплатина по одинаковым графикам. Мышей приносили в жертву на 24-й день, опухоли выделяли и анализировали с помощью иммуноблотинга и in situ терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы-опосредованного мечения никкеля ДУТФ (TUNEL) (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Количество апоптотических телец подсчитывали вслепую в десяти случайно выбранных полях высокой мощности. Статистическую значимость между различными группами лечения оценивали с помощью двуххвостового U-теста Манна-Уитни или t-теста Стьюдента.

Результаты

Увеличение гликолиза в клетках HNC связано с резистентностью к цисплатину и обратимо под действием DCA
Все клеточные линии, использованные в нашем исследовании, были человеческими HNC. Цитотоксический эффект DCA оценивался в клетках HNC с помощью исключения трипанового синего, окрашивания кристаллическим фиолетовым и МТТ. DCA, протестированный в концентрации до 30 мМ в течение 72 ч, заметно подавлял рост клеток HNC (МТТ-тест, рис. 1А). Биоэнергетика клеток НЯК изменялась под действием ДКА: клеточный гликолиз значительно уменьшался, а окислительное фосфорилирование увеличивалось (рис. 1В). Изменение биоэнергетики варьировалось между линиями клеток НЯК и было значительно связано с чувствительностью к цисплатину: клетки НЯК с высоким гликолизом демонстрировали устойчивость к цисплатину (R2 = 0,859, P < 0,001; рис. 1С ). Кроме того, при воздействии DCA раковые клетки с наибольшим изменением биоэнергетики, скорее всего, становились более апоптотичными (R2 = 0,769, P = 0,002; рис. 1D ). Это позволяет предположить, что DCA вызывает специфический для раковых клеток апоптоз путем снижения гликолиза в клетках HNC.

Рис. 1. Повышенный гликолиз в клетках HNC коррелирует со снижением чувствительности к цисплатину и уменьшается под действием дихлорацетата (DCA). (А) DCA индуцировал гибель клеток в клетках HNC. Цитотоксичность оценивалась с помощью МТТ-анализа после воздействия различных концентраций ДХА в течение 72 ч. (B) Изменение биоэнергетики под воздействием ДХА в клетках HNC. Измерения гликолиза и OXPHOS (%) были описаны в разделе «Материалы и методы». (C) Корреляция между гликолизом и IC50 цисплатина в группе клеточных линий HNC. IC50 рассчитывали с помощью МТТ-анализа в трех независимых экспериментах, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. Корреляция оценивалась с помощью линейной регрессии. (D) Корреляция между биоэнергетическими изменениями и апоптозом в клетках HNC. В анализе апоптоза измеряли аннексин V-положительные апоптотические фракции после воздействия 20 мМ DCA в течение 72 часов.

Экспрессия PDK2 связана с устойчивостью к цисплатину в HNC
Цитотоксическое действие цисплатина было проверено на культивируемых клеточных линиях HN4-cisR и HN9-cisR и родительских раковых клетках (рис. 2А). Устойчивые к цисплатину клетки HN4-cisR и HN9-cisR показали 12-кратное и 18-кратное увеличение IC50, соответственно, по сравнению с соответствующими родительскими линиями. Вестерн-блот анализ показал, что HK2 и PDK2 были высоко экспрессированы в клетках HN4-cisR и HN9-cisR по сравнению с соответствующими родительскими клетками, в то время как экспрессия PDHE1α была низкой в клетках, устойчивых к цисплатину (рис. 2B). Уровень экспрессии мРНК PDK2 также был выше в резистентных клетках, чем в чувствительных (P < 0,01) (рис. 2C). DCA подавлял рост цисплатин-резистентных клеток HNC в той же степени, что и цисплатин-чувствительных клеток HNC (рис. 2D). Вестерн-блот анализ показал, что DCA значительно снизил уровень PDK2 и фосфо-PDHE1α (pPDHE1α), но повысил уровень проапоптотических белков, включая расщепленный PARP (cPARP) и PUMA, а также p21 в HN4-cisR и HN9-cisR (рис. 2E). Это говорит о том, что DCA может эффективно подавлять рост цисплатин-резистентных клеток HNC, а также чувствительных к цисплатину клеток HNC.

Рис. 2. Экспрессия PDK2 связана с устойчивостью к цисплатину в НЯК. (А) Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью МТТ-анализа после воздействия цисплатина в течение 72 ч. (B) Вестерн-блот анализ показывает различные уровни белков гексокиназы 2 (HK2), киназы пируватдегидрогеназы 2 (PDK2), пируватдегидрогеназы (PDH) E1α (PDHE1α) и лактатдегидрогеназы-A (LDHA) в необработанных клетках HN4 (HN4R) и HN9 (HN9R), устойчивых к цисплатину, и в их родительских клетках. (C) Изменение уровня экспрессии гена PDK2 между клетками, устойчивыми к цисплатину (cis-R), и их родительскими клетками. * обозначает P <0,01 относительно родительских клеток HNC. (D) Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-анализа после воздействия 15 и 30 мМ DCA в течение 72 ч. Столбики ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. (E) Вестерн-блот анализ выявляет изменения в уровнях расщепленного PARP, PUMA, p21, PDK2, phosho-PDHE1α (pPDHE1α) и PDHE1α в цисплатин-устойчивых клетках HN4R и HN9R, подвергнутых воздействию ДКА в течение 24 ч. Уровень β-актина оценивался в качестве контроля загрузки.

DCA индуцирует накопление ROS в клетках HNC
Изменение клеточной ROS под воздействием DCA оценивалось методом проточной цитометрии с использованием редокс-чувствительного флуоресцентного зонда DCF-DA. Воздействие DCA вызвало значительное повышение уровня ROS в клетках HNC (P < 0,01), которое блокировалось совместным воздействием NAC или ингибитором SOD диэтил-дитиокарбаматом (рис. 3A). Гликолиз значительно увеличился в цисплатин-устойчивых клетках HNC по сравнению с родительскими клетками (P < 0,01), но DCA вызвал значительное снижение гликолиза и увеличение окислительного фосфорилирования как в чувствительных к цисплатину, так и в цисплатин-устойчивых клетках HNC (P < 0,01) (рис. 3B). Мембранный потенциал митохондрий (ΔΨm) измеряли с помощью TMRM, чувствительного к напряжению митохондрий красителя на основе родамина, а митохондриальную ROS (mROS, супероксид митохондрий) измеряли с помощью MitoSOX red. В клетках HNC, обработанных DCA, наблюдалось снижение ΔΨm и увеличение mROS (P < 0,01) (рис. 3C). Изменение ΔΨm в цисплатин-устойчивых клетках HNC при воздействии DCA блокировалось предварительной обработкой NAC (рис. 3Д). Это говорит о том, что DCA может вызывать накопление ROS в клетках HNC путем активации окислительного фосфорилирования.

Рис. 3. DCA индуцирует внутриклеточное накопление ROS в клетках HNC. (A) Повышение уровня ROS под действием DCA. Устойчивые к цисплатину клетки HN4R и HN9R подвергали воздействию 15 или 30 мМ DCA в течение 24 ч. Клетки также предварительно обрабатывали ингибитором ROS N-ацетил-цистеином(NAC, 3 мМ) или ингибитором супероксиддисмутазы (iSOD) диэтил-дитиокарбаматом (10 мкМ). Уровни ROS измерялись методом проточной цитометрии с использованием DCF-DA и показаны как изменения в разах по сравнению с контрольным (базальным) уровнем. Все значения являются средними ± S.E. трех независимых экспериментов. * обозначает P <0,01 относительно контроля, и ** обозначает P <0,01 относительно 30 мМ DCA. (B) Изменение биоэнергетики под действием ДКА в клетках HNC. * обозначает P <0,05 по сравнению с контролем, и ** обозначает P <0,01 по сравнению с родительскими клетками, чувствительными к цисплатину. (C) Изменение реактивных форм кислорода (ROS, т.е. супероксид), измеренных с помощью mitoSOX, и мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm, красное окрашивание) при воздействии 20 мМ DCA по сравнению с необработанным контролем (ctr). Произвольные единицы флуоресценции (AFU) в контрольных и обработанных ДКА клетках. (D) Изменения ΔΨm в клетках HN4R и HN9R после 36 ч воздействия ДКА. ΔΨm измеряли с помощью тетраметилродамин этилового эфира и анализировали методом проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции в каждой группе лечения была нормализована по отношению к контрольной группе. Планки ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. * обозначает P <0,01 по сравнению с контролем. ** обозначает P <0,01 по сравнению с DCA или DCA плюс NAC.

ДКА способствует остановке клеточного цикла и апоптозу в клетках HNC
Клоногенный анализ привел к заметному снижению числа колоний HN4-cisR и HN9-cisR при воздействии ДКА (P < 0,01) (рис. 4A ). Проточная цитометрия с окрашиванием йодистым пропидием показала значительное изменение клеточного цикла в клетках HNC: вогонин увеличил популяцию апоптотических клеток sub-G1 (P < 0,05), и этот эффект блокировался при совместном воздействии с NAC (рис. 4B ). Вестерн-блот анализ показал, что DCA снижал pPDHE1α, но увеличивал cPARP, p21, фосфо-p53 и расщепленную каспазу-3 (cCasp3) в зависимости от времени (рис. 4C ). Активация PDHE1α путем нокдауна PDK2 в клетках AMC-HN4-cisR не привела к значительному увеличению проапоптотических белков cPARP и cCasp3 (рис. 4D ); однако нокдаун PDHE1α снизил экспрессию p21 и фосфорилирование p53. Проточная цитометрия с использованием йодистого пропидия и окрашивания аннексином-V показала эффективную индукцию апоптоза и гибели клеток в цисплатин-устойчивых клетках HNC под действием DCA; эффект снижался при совместном воздействии DCA и антиоксиданта NAC или пан-каспазного ингибитора Z-VAD-fmk (рис. 4E). Это было подтверждено измерением активности каспазы, которая значительно увеличивалась под действием ДКА в зависимости от концентрации (рис. 4F).

Рис. 4. DCA индуцирует гибель клеток и изменения клеточного цикла в клетках HNC. (A) Клоногенный анализ устойчивых к цисплатину раковых клеточных линий, подвергнутых воздействию DCA. Раковые клетки AMC-HN4R и HN9R подвергались воздействию DCA в течение 72 ч. Столбики ошибок представляют собой средние квадратичные значения трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился в трех экземплярах. * обозначает P <0,01. (B) Анализ клеточного цикла при воздействии ДКА. Клетки AMC-HN4R, подвергнутые воздействию DCA в течение 72 ч, окрашивали йодистым пропидием и подвергали проточному цитометрическому анализу. * обозначает P <0,05. (C) Вестерн-блот анализ выявил изменения в уровнях расщепленного PARP (cPARP), p21WAF1, фосфо-p53-ser 15 (pp53), расщепленной каспазы 3 (cCasp3), pPDHE1α и PDHE1α. Клеточные экстракты были получены после воздействия на клетки AMC-HN4R 30 мМ DCA. (D) Влияние DCA и генетического ингибирования PDK2 и PDHE1α на проапоптотические белки, расщепленный PARP и расщепленную каспазу 3, а также на p21WAF1. Белки были измерены с помощью Вестерн-блот анализа в клетках AMC-HN4R, подвергнутых воздействию 30 мМ DCA. Раковые клетки были трансфицированы скремблированной siRNA (scr), PDK2 siRNA или PDHE1α siRNA в течение 48 ч до воздействия 30 мМ DCA. (E) Анализ апоптоза в клетках AMC-HN4R и HN9R, подвергнутых воздействию ДКА. Клетки подвергали воздействию ДКА в течение 72 ч, после чего измеряли апоптотические фракции, позитивные по аннексину V. (F) Повышение активности каспазы при обработке ДКА. Столбики ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех повторов. * и ** обозначают P <0,01 относительно контроля и 30 мМ DCA, соответственно. Перед воздействием 30 мМ ДКА клетки также предварительно обрабатывали 3 мМ NAC или 50 мкМ пан-каспазного ингибитора Z-VAD-fmk.

DCA сенсибилизирует цисплатин-устойчивые клетки HNC к цисплатину in vitro и in vivo
Цисплатин (10 мкМ) не вызывал значительной цитотоксичности или экспрессии апоптотических белков в цисплатин-устойчивых линиях HNC HN4-cisR и HN9-cisR по сравнению с родительскими чувствительными к цисплатину линиями HN4 и HN9 (рис.

5А).

5A); однако DCA вызывал заметное снижение выживаемости в цисплатин-устойчивых клетках HNC (P < 0,05), которое блокировалось предварительной обработкой NAC. DCA индуцировал экспрессию апоптотических белков и увеличивал цисплатин-индуцированную цитотоксичность и экспрессию апоптотических белков в клетках HN4-cisR (рис.

B

). В комбинации DCA увеличивал цитотоксичность цисплатина в клетках HN4-cisR за счет повышения активности каспаз до степени, превышающей сумму эффектов каждого из агентов в отдельности (CI < 1, P < 0,01), которые ослаблялись при глушении гена PDHE1α (рис. 5C). Уровень ΔΨm был выше в клетках HN4-cisR, устойчивых к цисплатину, чем в чувствительных к цисплатину родительских клетках HN4 (ΔΨm, средняя интенсивность флуоресценции [MFI]: 1 ± 0 против 0,54 ± 0,09, P < 0,001) и снижался под действием DCA или комбинации цисплатина и DCA, что ослаблялось глушением гена PDHE1α (рис. 5D).

Рис. 5. DCA сенсибилизировал цисплатин-резистентные клетки HNC к цисплатину. (А) Жизнеспособность клеток оценивали по исключению трипанового синего после воздействия цисплатина (CDDP), DCA или их комбинации. Цитотоксический эффект DCA блокировался антиоксидантом N-ацетил-цистеином(NAC, 3 мМ). Планки ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. * обозначает P <0,01 по сравнению с контролем, и ** обозначает P <0,01 по сравнению с предварительной обработкой NAC. (B) Вестерн-блоттинг, показывающий увеличение чувствительности к цисплатину (CDDP) под действием DCA. Устойчивые к цисплатину клетки AMC-HN4R обрабатывали DCA, цисплатином или обоими препаратами в течение 72 ч. (C) Повышение уровня каспаз после 72-часового воздействия DCA, цисплатина и PDHE1α siRNA. Клетки HN4R подвергались воздействию DCA, цисплатина или комбинации обоих препаратов, после чего измерялась активность каспазы.(D) Изменения ΔΨm в клетках HN4R после 36-часового воздействия DCA, цисплатина или комбинации обоих препаратов. ΔΨm измеряли с помощью этилового эфира тетраметилродамина и анализировали методом проточной цитометрии. Медиана интенсивности флуоресценции в каждой группе лечения была нормализована по отношению к контрольной группе. Планки ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. * и ** означают P <0,01 по сравнению с контролем и скремблированной (scr) siRNA, соответственно. *** обозначает P <0,01 по сравнению с DCA или цисплатином.

Эти результаты были далее изучены на мышиных моделях опухолевых ксенотрансплантатов in vivo. Атимичные мыши BALB/c, несущие опухоли AMC-HN4-cisR или HN9-cisR, получали DCA, цисплатин, DCA плюс цисплатин или транспортное средство. Комбинация цисплатина и DCA синергетически подавляла рост опухоли (рис. 6A). Визуализация роста опухоли in vivo проводилась с помощью ПЭТ с 18 F-ФДГ на 21 день лечения. Очаговые поглощения 18 F-ФДГ наблюдались в местах имплантации опухоли, где измерялось максимальное стандартизированное поглощение (SUVmax) и метаболический объем опухоли при SUV 2.0 (MTV2.0). SUVmax не отличался между группами лечения (P > 0,1), но MTV2.0 был значительно ниже в группах, получавших DCA и комбинацию, чем в других группах (P < 0,05) (рис. 6B). Анализ апоптоза in situ показал, что TUNEL-положительные апоптотические тельца чаще встречались в опухолях, получавших DCA и цисплатин плюс DCA, чем в опухолях, получавших транспортное средство (P < 0,01) (рис. 6C). Вестерн-блот анализ опухолевых тканей показал, что уровень апоптотических белков увеличился в большей степени в клетках HN4-cisR, обработанных комбинацией цисплатина и DCA, чем в опухолях, обработанных одним агентом (рис. 6D).

Рис. 6. DCA сенсибилизирует цисплатин-резистентные клетки HNC к цисплатину in vivo. (A) Противоопухолевый эффект DCA и цисплатина в модели опухолевого ксенотрансплантата на мышах. Голым мышам вводили 5 ×106 клеток AMC-HN4R и HN9R во фланг. Лечение транспортным средством, цисплатином (CDDP), DCA или комбинацией цисплатина и вогонина начиналось после того, как имплантированные опухолевые клетки образовывали пальпируемые узелки. Каждая группа включала десять мышей. Столбики ошибок представляют S.E. * и ** обозначают P <0,05 и P <0,01 по сравнению с контролем (ctr), соответственно. (B) Визуализация опухоли in vivo с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) с 18F-фтордезоксиглюкозой. ПЭТ-сканирование проводилось через 3 недели после начала лечения. Максимальный стандартизированный объем поглощения (SUVmax) и метаболический объем опухоли (MTV2.0) были получены в опухолях (стрелки), и средние значения сравнивались между различными группами лечения. * и ** обозначают P <0,05 и P <0,01 по сравнению с контролем, соответственно. (C) Количественная оценка по результатам анализа TUNEL in situ в срезах опухолей из каждой группы. TUNEL-позитивные апоптотические тельца подсчитывали вслепую в десяти случайно выбранных мощных полях. Столбики ошибок представляют S.E. Двухсторонний t-тест Стьюдента, * обозначает P <0,01. (D) Вестерн-блот анализ расщепленного PARP, фосфо-p53-ser15, расщепленной каспазы 3 и белков PDHE1α, полученных из опухолей, обработанных транспортным средством, DCA, цисплатином или комбинацией обоих препаратов. β-актин служил в качестве внутреннего контроля нагрузки.

Обсуждение

Повышенный гликолиз, который часто встречается при раке, тесно связан с нарушением митохондрий или дефектным окислительным фосфорилированием и способствует терапевтической резистентности [18,19]. Аэробный гликолиз был связан с устойчивостью к химиотерапии [20] или радиотерапии [21]. В настоящем исследовании клеточные линии, устойчивые к цисплатину, показали повышенный гликолиз, что указывает на биохимическую связь между гликолизом и химиорезистентностью. Устойчивые к лекарствам клетки испытывают большую потребность в АТФ, чем нормальные клетки, для поддержания клеточного гомеостаза и активации путей выживания, которые позволяют избежать гибели клеток при генотоксическом стрессе [20]. Устойчивые раковые клетки увеличивают гликолиз для быстрой выработки АТФ, чтобы удовлетворить внутриклеточные потребности. Это было четко обнаружено в наших клетках, устойчивых к цисплатину, по сравнению с родительскими чувствительными клетками, что указывает на то, что лекарственная устойчивость в HNC напрямую связана с увеличением гликолиза. Это означает, что изменение биоэнергетики раковых клеток в сторону увеличения гликолиза связано с химиорезистентностью [14,22]. Таким образом, уровень гликолиза в раковых клетках человека может быть биомаркером химиорезистентности и требует клинического подтверждения в раковых тканях человека.

В настоящем исследовании показано, что DCA смещает генерацию энергии с гликолиза на митохондриальное окисление глюкозы в HNC. Это вызванное DCA изменение метаболического сдвига в сторону гликолиза устраняет пролиферативное преимущество раковых клеток и в конечном итоге приводит к их гибели [23]. DCA, являясь структурным аналогом пирувата, ингибирует PDK и реактивирует PDH, фермент, входящий в комплекс, который преобразует пируват в ацетил-КоА, основной субстрат цикла Кребса [10,23]. Поскольку большинство типов рака создают гипоксическую среду, раковые клетки полагаются на анаэробный гликолиз в качестве основного источника энергии. Активация гипоксия-индуцибельного фактора (HIF) индуцирует митохондриальную PDK [24]. Митохондриальная активность PDH в раке блокируется PDK, что приводит к снижению доступности ацетил-КоА для митохондриального окисления глюкозы [24]. Повышенная экспрессия PDK связана с лекарственной устойчивостью при раке [25,26]. Регуляция PDK2 в результате митохондриальных мутаций и стабилизации HIF1α также наблюдается в клетках HNC [27]. В настоящем исследовании также была подтверждена связь между сверхэкспрессией PDK2 и устойчивостью к цисплатину в клетках HNC. Эти данные указывают на важность PDK как новой молекулярной мишени в терапии рака [10]. Предыдущие данные показали, что генетическое или фармакологическое ингибирование PDK изменяет биоэнергетику рака и восстанавливает митохондрий-зависимый апоптоз в раковых клетках [11,13]. Поэтому ДКК эффективен для преодоления резистентности к лечению в раковых опухолях с агрессивным фенотипом in vitro и in vivo[12-14].

Активация PDH под действием DCA вызывает накопление mROS в раковых клетках. В раковых клетках снижен митохондриальный метаболизм глюкозы, что приводит к снижению активности электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) и уменьшению mROS [10], [28]. Митохондриальное ремоделирование ΔΨm гиперполяризации и снижение выработки mROS в раковых клетках приводит к устойчивости к апоптозу при генотоксическом стрессе. В устойчивых раковых клетках с более гликолитическим фенотипом HK2 приводит к транслокации на внешнюю митохондриальную мембрану и увеличению ΔΨm [29]. Ингибирование гликолиза и транслокации HK2 снижает ΔΨm рака и отменяет устойчивость к апоптозу [29]. В настоящем исследовании повышенная экспрессия HK2 и PDK2 и мембранный потенциал митохондрий также были обнаружены в устойчивых к цисплатину раковых клетках. DCA заставляет пируват поступать в митохондрии через активацию PDH, регулятора митохондриального окисления глюкозы, снижает ΔΨm и увеличивает mROS [13]. В настоящем исследовании DCA просто отменил повышенное митохондриальное ремоделирование в клетках HNC, устойчивых к цисплатину, что способствовало гибели раковых клеток. Активация митохондриального окисления глюкозы под действием DCA вызвала mROS и активацию митохондриальной сигнализации, что привело к активации p53 и связанных с ним проапоптотических путей и к гибели устойчивых к химиотерапии раковых клеток. В нашем исследовании фармакологическое ингибирование выработки mROS или каспаза-опосредованного апоптоза ослабляло цитотоксический эффект DCA в клетках HNC, что подтверждает известные механизмы действия препарата.

Доклинические и клинические исследования поддерживают применение ДКА у онкологических больных и у пациентов с молочнокислым ацидозом, связанным с митохондриальными заболеваниями [10,23]. В ряде исследований продемонстрировано цитотоксическое действие DCA, отдельно или в комбинации с другими препаратами, на различные опухоли, полученные из всех трех зародышевых слоев [23]. Предыдущее исследование показало, что глиобластома, один из самых агрессивных видов рака человека, сверхэкспрессирует PDK2 в раковых тканях, взятых у 49 пациентов, и регрессирует у пяти пациентов после лечения ДКА, что доказывает клиническую пользу ДКА в резистентных раковых опухолях [13]. В недавнем исследовании, посвященном HNC, сравнивался эффект DCA на трех клеточных линиях плоскоклеточной карциномы полости рта (OSCC) [15]. Клетки OSCC с дефицитом митохондриального окислительного фосфорилирования (т.е. высоким гликолизом) были более чувствительны к DCA, чем другие [15,30]. Настоящее исследование подтвердило, что клетки HNC с высокими биоэнергетическими изменениями были более чувствительны к DCA. Фактически, поскольку химиорезистентные раковые клетки имеют тенденцию к высокому гликолизу, эти клетки могут быть мишенью для ингибиторов метаболизма [31]. Таким образом, DCA является хорошим кандидатом для лечения раковых клеток с агрессивным фенотипом, включая химиорезистентные клетки HNC. Однако, поскольку потенциальные противораковые эффекты DCA все еще спорны, особенно в опухолях в условиях гипоксии, необходимы дальнейшие доклинические и клинические исследования DCA и рака [32]. Недавний систематический обзор показал, что DCA синергирует со многими стандартными противораковыми препаратами, а клинические испытания на ранней стадии свидетельствуют о том, что хронический DCA безопасен и хорошо переносится при пероральном приеме 12,5 мг/кг дважды в день [23].

 заключение, наши данные свидетельствуют о том, что высокий уровень гликолиза и сверхэкспрессия PDK тесно связаны с устойчивостью к цисплатину в клетках HNC. DCA переключает биоэнергетику клеток НЯК на митохондриальное окислительное фосфорилирование. Это приводит к снижению ΔΨm и увеличению mROS, тем самым сенсибилизируя химиорезистентные клетки НЯК к цисплатину in vitro и in vivo. Эти данные дают основания для дальнейших доклинических и клинических исследований DCA, перспективного противоракового препарата, при НЯК с агрессивным фенотипом. Однако наше заключение следует принимать во внимание с осторожностью при противоположном сценарии. Дефектное митохондриальное окислительное фосфорилирование было связано с чувствительностью раковых клеток к состоянию низкой глюкозы, что может быть использовано в качестве биомаркера для терапии рака [37]. Раковая клетка также приспособлена для обеспечения пролиферации путем поглощения и включения питательных веществ в биомассу, а не для эффективного производства АТФ [38]. Поэтому доклинические и клинические эффекты DCA на HNC и другие виды рака должны быть изучены далее.

DCA усиливает противоопухолевое действие капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 мыши и ксенотрансплантате немелкоклеточного рака легкого A549 человека

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1007/s00280-013-2281-z

Кафедрабиохимии, факультет наук о жизни, Фуданьский университет, Хандан Роуд 220, Шанхай, 200433, Китай.
Электронная почта: e-mail: whuang@fudan.edu.cn


Получено: 16 мая 2013 г.
Принято: 27 августа 2013 г.
Опубликовано: 17 сентября 2013 г

Аннотация

Цель: Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью. Недавно дихлорацетат натрия (ДХА) показал большой потенциал в качестве противоракового агента. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином при раке со скромной экспрессией TP.

Методы: Для оценки эффекта комбинированного лечения DCA и капецитабином использовали аллотрансплантат меланомы мыши B16 и ксенотрансплантат немелкоклеточного рака легкого человека A549. Гистология и иммуногистохимия использовались для выявления апоптоза и пролиферации раковых клеток. ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот проводились для определения экспрессии TP и каспаз, соответственно.

Результаты: Впервые мы сообщаем, что DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в мышином аллотрансплантате B16 и человеческом ксенотрансплантате A549, способствуя апоптозу опухолевых клеток. DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP.

Выводы: Наши результаты свидетельствуют о том, что DCA в комбинации с капецитабином может стать потенциально новым терапевтическим режимом против некоторых видов рака.

Ключевые слова: DCA, капецитабин, комбинация, противоопухолевый эффект

ВВЕДЕНИЕ

Дихлорацетат натрия (ДХА) — это маленькая молекулярная соль дихлоруксусной кислоты с молекулярной массой 150 Да. DCA ингибирует активность киназы пируватдегидрогеназы, тем самым активируя митохондриальный ферментный комплекс пируватдегидрогеназы [1] и переводя гликолитический путь метаболизма на окислительное фосфорилирование. В течение последних 40 лет DCA использовался в качестве сиротского препарата для лечения врожденного молочнокислого ацидоза у детей и молочнокислого ацидоза, осложненного другими заболеваниями [2], и показал высокую эффективность и низкую токсичность как в доклинических, так и в клинических испытаниях [3]. Недавно DCA продемонстрировал большой потенциал в качестве противоракового средства из-за сходства метаболического ремоделирования некоторых опухолевых клеток с процессами, происходящими при молочнокислом ацидозе [4]. Раковые клетки, особенно раковые стволовые клетки (РСК), сопротивляются апоптозу, производя энергию путем гликолиза и молочнокислого брожения, а не окислительного фосфорилирования, из-за гипоксической природы опухолевой микросреды — явления, известного как эффект Варбурга [5,6]. Было показано, что после перорального приема DCA восстанавливает функцию митохондрий и избирательно способствует апоптозу опухолевых клеток по митохондриально-зависимому пути [7,8]. Терапевтическая активность DCA против глиобластомы была проверена в клинических испытаниях (NCT00540176) и показала некоторые положительные результаты [9]. Однако исследование II фазы NCT01029925 по определению частоты ответа на пероральный прием дихлорацетата у пациентов с рецидивирующим и/или метастатическим и предварительно леченным раком молочной железы и немелкоклеточным раком легкого было прекращено из-за более высокого, чем ожидалось, риска и проблем с безопасностью. Таким образом, клиническая польза DCA для борьбы с раком нуждается в более тщательной оценке.

Как сенсибилизатор апоптоза, DCA также использовался в комбинации с другими методами лечения рака. Cao и другие [10] сообщили, что DCA сенсибилизировал клетки рака простаты к радиации in vitro. Сяо и др. [11] установили, что DCA усиливает гибель опухолевых клеток в сочетании с онколитическим аденовирусом, экспрессирующим опухолевый супрессор MDA-7/IL-24. Недавно метаболическая таргетная терапия с использованием DCA была продемонстрирована как новая стратегия лечения для улучшения результатов фотодинамической терапии [12]. Тонг и др. [13] обнаружили, что DCA и 5-фторурацил проявляют синергетический противоопухолевый эффект в клетках колоректального рака in vitro. Однако до сих пор существуют противоречивые результаты и сомнения относительно применения DCA отдельно или в комбинации с другими препаратами. Шахрзад и др. [14] показали, что DCA снижает апоптоз раковых клеток в гипоксических условиях как in vitro, так и in vivo. Хеше и др. [15] предупредили, что DCA снижает цитотоксичность некоторых стандартных противораковых препаратов, таких как цисплатин и доксорубицин, но не влияет на активность темозоломида в 7 из 10 клеточных линий в их исследовании. Эти противоречивые результаты означают, что применение DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения может зависеть от типа рака и конкретного агента.

Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью и лицензирован в качестве первой линии лечения метастатического рака прямой кишки или альтернативного лечения метастатического рака молочной железы в сочетании с доцетакселом [16,17]. Капецитабин является пролекарством 5-фторурацила (5-ФУ) и требует 3 ферментативных реакций для окончательного превращения в 5-ФУ в опухолевых клетках. Последняя реакция катализируется тимидинфосфорилазой (TP), которая в некоторых опухолях выражена в большей степени, чем в нормальных тканях [18]. Поэтому цитотоксический 5-ФУ образуется в большей степени в опухолевых клетках, чем в тканях вне опухоли, что делает капецитабин малотоксичным химиотерапевтическим препаратом [18]. Уровни экспрессии TP различны в разных типах опухолей [18]; это ограничивает применение капецитабина только несколькими типами рака. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином для раковых опухолей со скромной экспрессией TP. Мы предположили, что DCA усиливает противораковый эффект и снижает эффективную дозу капецитабина. Комбинация DCA с капецитабином может дать хорошую схему лечения, поскольку оба агента можно принимать перорально при хорошей приверженности пациентов. Кроме того, генерические формы DCA могут снизить эффективную дозу капецитабина, тем самым уменьшая побочные эффекты и стоимость лечения рака.

Материалы и методы

Материалы
Дихлорацетат натрия (ДХА, CSA:2156-56-1), чистота 99 %, был получен от компании Shanghai Jieshi Chemical Co. (Китай). 5-фторурацил (5-FU) и 5′-дезокси-фторуридин (5DFUR) были получены от Sigma-Aldrich (США). МТТ был получен от Shanghai Biological Engineering Co. (Китай). Таблетки капецитабина (Xeloda) были получены от Roche (США). Мышиная меланома B16 и человеческая немелкоклеточная линия клеток рака легкого A549 были получены из Американской коллекции клеточных культур (ATCC, США).

Исследования на животных моделях

Модель аллотрансплантата

Мыши C57BL/6, самки, возраст 6-8 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Один миллион одиночных клеток B16 был подкожно (s.c.) инокулирован в правый фланг мышей C57BL/6. Мышей разбили на случайные группы, по 6 мышей на группу в клетке. Было две группы мышей. DCA и капецитабин вводили этим двум группам мышей через 3 и 10 дней после инокуляции, соответственно. DCA добавляли в стерильную питьевую воду до конечной концентрации 1,4 г/л. Измерение объема потребленной воды показало, что количество ДКА, введенного каждой мыши, было приблизительно равно 100 мг/кг/день. Таблетки капецитабина измельчали и суспендировали в стерильной воде с 4 % карбоксиметилцеллюлозы для получения различных концентраций. Двести микролитров суспензии капецитабина вводили внутрижелудочно каждой мыши. Каждые 2 дня длинный (a) и короткий (b) диаметры опухолей измеряли с помощью штангенциркуля, а также регистрировали массу тела. Объем опухоли рассчитывали по формуле V = 0,5ab2. Через 22 дня после инокуляции мышей умертвили, опухоли удалили и взвесили.

Модель ксенотрансплантата

Мыши BALB/c-nu, самцы, возраст 5-6 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Приблизительно 2 × 2 мм срезы только что измельченных опухолевых тканей A549, полученных от мышей BALB/c-nu, ранее инокулированных клетками A549, были введены внутривенно в область правого фланга самцов мышей BALB/c-nu. DCA и капецитабин вводили мышам, когда объем опухоли достигал ~0,2 см3. Через тридцать-тридцать пять дней после лечения мышей умерщвляли, опухоли удаляли и взвешивали. Другие методы были такими же, как описанные в эксперименте с аллотрансплантацией.

Исследования на животных были одобрены группой по благополучию животных и этике факультета лабораторных животных Фуданьского университета.

Гистология и иммуногистохимия
Гистологическое исследование опухолевых узлов проводили с использованием дополнительных животных (по 3 мыши в каждой группе), которые не рассматривались для мониторинга роста опухоли. Ткани фиксировали в 4 % (w/v) параформальдегиде, после фиксации в течение ночи при комнатной температуре образцы обезвоживали в градуированном этаноле и встраивали в парафин. После этого различные части опухоли произвольно вырезали для получения 4-мкм срезов на микротоме Leica. После депарафинизации и регидратации три среза из разных частей каждого образца были отобраны для последующих операций. Терминальное дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованное никелирование концевого участка ДУТФ (TUNEL) и окрашивание 4′6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) проводили в соответствии с инструкциями производителей наборов TUNEL и DAPI (Beyotime, Китай). Срезы анализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Olympus, Япония). Выявление ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) проводили после депарафинизации срезов и инкубации при 96-100 °C в течение 20 мин. Активность эндогенной пероксидазы гасили 0,3 % (v/v) перекисью водорода в 60 % (v/v) метаноле в течение 30 мин. Неспецифическую адсорбцию минимизировали путем инкубации срезов в 2 % (v/v) нормальной козьей сыворотке в PBS в течение 20 мин. Участки тканей инкубировали в течение ночи с кроличьим поликлональным антителом анти-PCNA (Abcam; 1:100 в PBS), промывали PBS 3 раза, по 30 мин каждый раз, и инкубировали с биотин-конъюгированным козьим антирабическим IgG в течение 2 ч при 37 °C и авидин-биотин-пероксидазным комплексом в течение 1 ч при 37 °C. Срезы контрастировали гематоксилином (Sigma-Aldrich) и анализировали с помощью световой микроскопии (Olympus, Япония). Для анализа иммуногистохимии использовали по три опухоли на группу. Один или два среза на опухоль были слепо отобраны для измерения PCNA- или TUNEL-позитивных клеток. Пять случайных полей на слайде при увеличении 400× измеряли вслепую (n = 250 клеток на группу). При проведении количественного анализа TUNEL-позитивных клеток, возможные некротические клетки исключались путем наблюдения за ядерной морфологией с помощью окрашивания DAPI. Для обеспечения точности результатов проводили как положительный, так и отрицательный контроль.

Выделение белка и вестерн-блоттинг
Опухолевые ткани из каждой группы (3 дополнительные мыши в каждой группе) были объединены вместе и измельчены под жидким азотом, а затем лизированы в 150

мкл

буфера для лизиса тканей (Beyotime, Китай). Пробирки энергично встряхивали в течение 1 мин, помещали на лед на 20 мин и центрифугировали при 5 000g в течение 5 мин при 4 °C. Концентрацию общего белка определяли с помощью набора для определения белка BCA (BioRad). Тридцать микрограммов общего белка из каждого образца разделяли методом SDS-PAGE на 10 % геле, переносили на PVDF мембрану, блокировали, инкубировали в течение ночи с первичным антителом, инкубировали в течение 1 ч с вторичным антителом и окрашивали хромогенным субстратом NBT/BCIP. Мышиное моноклональное антитело против антикаспазы 3 (1:500), антитело против антикаспазы 9 (1:1 000), анти-β-актин (1:2 000) и кроличье поликлональное антитело против антикаспазы 8 (1:1 000) были получены от Beyotime (Нанкин, Китай). Мышиное моноклональное антитело анти-ТФ (1:2,000) было получено от Abcam (Великобритания). в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Плотность полос вестерн-блота анализировали с помощью программы Clinx Gel Analysis V2.02 (Clinx Science, Китай).

ПЦР в реальном времени
Опухоли B16 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши C57BL/6, ранее инокулированной клетками B16 (использовали 3 мышей, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Colo205/A549 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши BALB/c-nu, ранее инокулированной клетками Colo205/A549 (3 мыши были использованы, соответственно, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Для анализа экспрессии TP после лечения образцы опухолей объединяли из 3 опухолевых тканей одинакового веса в каждой группе. Тотальную РНК выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США) и подвергали обратной транскрипции с помощью набора реагентов PrimeScript® RT (Takara, Япония). кДНК нормировали на β-актин. ПЦР в реальном времени проводили трехэтапным методом с использованием набора SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takata, Япония) с температурой отжига 55 °C и 40 циклами амплификации. Отдельный тест проводили в трех экземплярах. в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Относительное количество каждой кДНК анализировали с помощью2-△△Ct. Праймеры для ПЦР в реальном времени: β-актин F: 5′-TCAAGATCATTGCTC CTCCTG-3′ и β-актин R: 5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′, hTP F: 5′-TGGCTCAGTCGGGACAGCAG-3′ и hTP R: 5′-TCCGCTGATCATTG GCACCT-3′, mTP F: 5′-GCCTAGCTAAAGCATTGTGCTC-3′ и mTP R: 5′-AAGGGTGCT CGATCTGATAGCA-3′.

Статистика
Мы использовали множественные сравнения ANOVA с post hoc анализом (тест Тьюки), используя программное обеспечение SPSS 16.0 (SPSS Inc., США). Данные представлены как среднее ± SEM, значимым считалось P < 0,05.

Результаты

Экспрессия TP в меланоме мыши B16 и опухолях человека A549 NSCLC
Экспрессия TP в опухолях B16 и A549, удаленных у мышей, была проанализирована методом ПЦР в реальном времени. Печень человека экспрессирует относительно больше TP, чем другие нормальные ткани [18]. В типичных типах рака, подходящих для лечения капецитабином, экспрессия TP в опухоли близка или выше, чем в печени, например, в колоректальном раке и раке молочной железы [18,19]. В ксенотрансплантатах рака человека раковые опухоли с высокой активностью TP были более восприимчивы к лечению капецитабином, чем раковые опухоли с низкой активностью TP [20]. Клеточная линия колоректального рака Colo205 была выбрана в качестве эталона на основании ее умеренной экспрессии TP и умеренной чувствительности к капецитабину [21]. Как показано на рис. 1a, уровень транскрипции TP в Colo205 был немного выше, чем в печени мыши BALB/c-nu. Как показано на рис. 1б, в, уровни транскрипции TP в опухолях B16 и A549 были близки к таковым в печени мышей. Таким образом, B16 и A549 также являются умеренно экспрессирующими TP клеточными линиями. Мы можем сделать вывод, что B16 и A549 будут в определенной степени реагировать на лечение капецитабином, не перекрывая эффект DCA. Таким образом, модели аллотрансплантата B16 и ксенотрансплантата A549 были пригодны для изучения противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина в комбинации.

Рисунок 1. По сравнению с печенью мыши, опухоли B16 и A549 скромно экспрессируют TP ПЦР в реальном времени Анализ уровня транскрипции TP. Использовались праймеры, специфически нацеленные на ТП мыши и человека. Праймер на β-актин подходит как для мышей, так и для человека. a Уровень транскрипции TP в опухоли Colo205 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. b Уровень транскрипции TP в опухоли A549 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. c Уровень транскрипции TP в опухоли B16 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей C57BL/6. В каждой группе использовались образцы от 3 мышей

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате мышиной меланомы B16 без дополнительной токсичности
Поскольку гипоксическая природа опухолевой микросреды является критической для оптимальной активности DCA, противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин был протестирован на животных моделях вместо клеточных линий. Тридцать шесть мышей C57BL/6 были инокулированы 1 ×106 клетками меланомы B16 и случайным образом разделены на 6 групп (n = 6): контрольная группа, не получавшая лекарств, группа, получавшая только DCA, группа, получавшая только капецитабин 10 мг/день, и три группы, получавшие DCA плюс капецитабин 5, 10 или 20 мг/день. Через три дня после инокуляции опухолевых клеток мышам вводили DCA в питьевой воде и перорально (p.o.) капецитабин в качестве отдельных агентов или в комбинации с возрастающими концентрациями капецитабина. Как показано на верхней панели рис. 2a, как DCA, так и капецитабин в дозе 10 мг/день в одиночку незначительно подавляли рост опухолей меланомы B16 по сравнению с контрольной группой. Напротив, DCA плюс 10 мг/день капецитабина значительно усиливали ингибирование роста опухоли (P < 0,05). Противоопухолевый эффект DCA плюс 20 мг/день капецитабина был аналогичен тому, который наблюдался при использовании DCA плюс 10 мг/день капецитабина; рост опухоли был почти полностью подавлен. Примечательно, что у мышей, получавших DCA плюс 20 мг/день капецитабина, наблюдалось резкое снижение массы тела (рис. 2а, нижняя панель), в то время как DCA плюс 10 мг/день капецитабина практически не влиял на массу тела по сравнению с контролем.

Рисунок 2. DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 у мышей без дополнительной токсичности. a Через три дня после инокуляции мышам вводили DCA и капецитабин (CAP) по отдельности или в комбинации. Вводили эскалированные дозы [5, 10 и 20 мг/день (мг/день)] капецитабина в комбинации с постоянной дозой DCA. Показаны кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель). b Через 10 дней после прививки мышам вводили DCA и 7,5 мг/день капецитабина отдельно или в комбинации. Представлены кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель)

Для оценки противоопухолевого эффекта DCA плюс капецитабин против пальпируемых, обнаруживаемых опухолей, через 10 дней после инокуляции опухолевых клеток, DCA и капецитабин отдельно или в комбинации вводили второй группе из 36 мышей C57BL/6, инокулированных 1 ×106 клетками меланомы B16. Мыши с пальпируемыми опухолями были случайным образом разделены на 4 группы (n = 9, 3 мыши использовались для анализа иммуногистохимии): контроль, только DCA, только капецитабин в дозе 7,5 мг/день и DCA плюс капецитабин в дозе 7,5 мг/день. Как показано на верхней панели рис. 2б, DCA плюс капецитабин 7,5 мг/день значительно подавляли рост опухоли по сравнению с DCA или капецитабином (P < 0,05). Через 22 дня после инокуляции DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина подавляли рост опухоли на 75 % (P < 0,05), в то время как только DCA и капецитабин подавляли рост только на 25 % и 35 %, соответственно (P < 0,05). DCA не вызывал резкой потери массы тела по сравнению с лечением только капецитабином (рис. 2b, нижняя панель). Эти результаты показывают, что DCA и капецитабин могут оказывать синергетический противоопухолевый эффект в опухолях меланомы B16.

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели НСКЛ человека A549 без дополнительной токсичности
Ранее сообщалось, что НСКЛ человека можно лечить либо DCA [7], либо капецитабином [22-24]. В настоящем исследовании мы изучили противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин в модели ксенотрансплантата НСКЛ A549 человека. Шестьдесят шесть самцов мышей BALB/c-nu с опухолями человека NSCLC A549 (~2 × 2 мм), привитыми внутривенно в правый фланг, были случайным образом разделены на 9 групп: контроль; только DCA; 2,5, 5, 7,5 или 10 мг/день только капецитабина; или DCA плюс 2,5, 5 или 7.5 мг/день капецитабина (n = 6, кроме контроля, только DCA, 7,5 мг/день капецитабина и DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина; в этих группах n = 9, 3 мыши были использованы для иммуногистохимического анализа и анализа Вестерн-блот или ПЦР в реальном времени). Капецитабин в дозе 10 мг/день был установлен в качестве контроля высокой дозы. Когда объем опухоли достигал 0,15-0,2 см3, мышам вводили препараты. Капецитабин вводили внутривенно по схеме 14 дней в день/7 дней в день. Как показано на левой панели рис. 3a, b и c, только DCA оказывал незначительное ингибирующее действие на опухоли A549; этот результат не согласуется с данными предыдущих отчетов [7], в которых только DCA проявлял больший противоопухолевый эффект. Только капецитабин в дозе 10 мг/день значительно подавлял рост опухолей A549, но при этом отмечалось резкое снижение массы тела, что указывает на сильную токсичность (рис. 3a, b, c, правые панели). Как показано на левой панели рис. 3а, 2,5 мг/день только капецитабина значительно уменьшали рост опухолей A549; комбинация DCA плюс 2,5 мг/день капецитабина усиливала ингибирование роста. Кривая увеличения объема опухоли при лечении только DCA предполагает, что капецитабин оказывает доминирующее противоопухолевое действие при комбинированном лечении. Эффект DCA плюс 5 мг/сут капецитабина был немного лучше, чем DCA плюс 2,5 мг/сут капецитабина, хотя и хуже, чем 10 мг/сут капецитабина, и не наблюдалось значительного снижения массы тела (рис. 3б, правая панель). Примечательно, что DCA плюс 5 мг/сут капецитабина значительно усилили ингибирование роста опухоли по сравнению с 5 мг/сут только капецитабина (рис. 3б, левая панель). Противоопухолевый эффект комбинации был близок к лечению капецитабином 10 мг/день, но без значительной потери массы тела (рис. 3б, правая панель). Эффект только капецитабина 7,5 мг/сут (рис. 3c) был немного лучше, чем капецитабина 5 мг/сут; однако при сочетании с ДКА не было значительной разницы между ДКА плюс капецитабин 7,5 мг/сут и ДКА плюс капецитабин 5 мг/сут. Эти результаты означают, что DCA может снизить дозу капецитабина без потери противоопухолевого эффекта или увеличения токсичности.

Рисунок 3. DCA увеличивает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели NSCLC A549 человека без дополнительной токсичности. a DCA плюс 2,5 мг/день (мг/день) капецитабина. b DCA плюс 5 мг/день капецитабина. c DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. Группа лечения капецитабином 10 мг/день использовалась в качестве контроля больших доз. Показаны кривые роста опухоли(левые панели) и кривые массы тела(правые панели). Объем опухоли представлен на логарифмической оси

DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина на клетки B16 и A549 in vivo
Гистологическое исследование опухолей меланомы B16 проводилось через 7 дней после начала лечения. Окрашивание TUNEL показало, что лечение опухолей меланомы B16 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало клеточный апоптоз на 8 и 17 %, соответственно. В комбинации DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина индуцировали апоптоз примерно на 30 %, что больше, чем сумма отдельных препаратов вместе взятых (рис. 4a, c, левая панель). Окрашивание PCNA в опухолях меланомы B16 показало, что только DCA оказывал незначительное влияние на пролиферацию, в то время как капецитабин 7,5 мг/день значительно снижал пролиферацию. DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина не усиливали ингибирование пролиферации только капецитабином в опухолевых клетках B16 (рис. 4b, c, правая панель).

Рисунок 4. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях меланомы B16. a Иммунофлуоресцентное окрашивание TUNEL образцов опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Иммуногистохимический анализ антигена пролиферации PCNA в образцах опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. c Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток(слева) и PCNA-позитивных клеток(справа). *P < 0.05

Подобно опухолям меланомы B16, лечение опухолей NSCLC A549 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало апоптоз на 15 и 30 %, соответственно. При совместном применении DCA плюс 7,5 мг/сут капецитабина индуцировали апоптоз на 50 %, что больше, чем сумма лечения одним агентом вместе взятым (рис. 5a, b). Эти результаты позволяют предположить, что DCA и капецитабин оказывают синергетическое действие на апоптоз опухолевых клеток NSCLC A549. DCA не усиливал ингибирование пролиферации капецитабином в опухолевых клетках NSCLC A549 (данные не показаны).

Рисунок 3. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях NSCLC A549. a Иммуногистохимический анализ TUNEL образцов опухолей NSCLC A549 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток. c Вестерн-блот активации каспаз в опухолях NSCLC A549. Активация инициаторных каспаз (каспазы 8 и каспазы 9) и эффекторных каспаз (каспазы 3) была обнаружена в опухолях NSCLC A549, инокулированных мышам BALB/c-nu, получавшим DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. d Плотный анализ расщепленных каспаз (C. caspase). Нормализовано по β-актину. *P < 0.05

Вестерн-блот показал, что DCA не оказывает значительного влияния на экспрессию и активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3 в опухолях NSCLC A549 по сравнению с контролем на 7-й день после лечения (рис. 5c, d). Только капецитабин в дозе 7,5 мг/день увеличивал активацию всех трех прокаспаз (рис. 5c, d). Интересно, что хотя DCA сам по себе не оказывал значительного влияния на экспрессию и активацию трех прокаспаз, DCA плюс капецитабин повышали экспрессию прокаспазы 8 и прокаспазы 3 по сравнению с лечением только капецитабином и усиливали активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3.

DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP в опухоли
Мы проанализировали экспрессию TP в образцах опухоли из ксенотрансплантата A549 на 7-й день после лечения. ПЦР в реальном времени (рис. 6a) и Вестерн-блот (рис. 6b) показали, что DCA как отдельный агент или в комбинации с капецитабином мало влияет на экспрессию TP, что означает, что механизм действия DCA и капецитабина в комбинации отличается от других синергистов капецитабина, о которых сообщалось ранее [19,25-27]. ПЦР в реальном времени также показала, что DCA не влияет на экспрессию других ферментов метаболизма капецитабина (тимидилат синтазы, оротат фосфорибозилтрансферазы, дигидропиримидин дегидрогеназы, тимидин киназы 1 и цитидин деаминазы, данные не показаны). Полученные результаты позволяют предположить, что DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не приведет к повышению токсичности капецитабина.

Рисунок 6. Транскрипция и экспрессия TP в опухоли A549 после лечения. a Анализ транскрипции TP методом ПЦР в реальном времени. Нормализовано по β-актину. b Вестерн-блот анализ экспрессии TP. в качестве внутреннего контроля использовался β-актин. Опухоли A549 резецировали у мышей BALB/c-nu через 7 дней после лечения DCA, 7,5 мг/день капецитабина, DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина или контрольной группы. Образцы из трех опухолей каждой группы были объединены вместе

Обсуждение

DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения был протестирован в клинических испытаниях; однако нет сообщений о противоопухолевом действии DCA в комбинации с капецитабином. Мы предположили, что стимулирующее апоптоз действие DCA на клетки солидных опухолей сделает их более чувствительными к капецитабину. В настоящем исследовании только 1,4 г/л DCA не оказывал значительного влияния на рост опухоли NSCLC A549 у мышей. Однако совместное введение DCA и капецитабина позволило снизить эффективную дозу капецитабина на 50 %. DCA усиливал противоопухолевый эффект капецитабина in vivo через сенсибилизацию апоптоза. DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не увеличивает токсичность капецитабина.

Поскольку были получены как положительные, так и отрицательные результаты (как показано в разделе «Введение»), до сих пор существуют разногласия по поводу использования DCA в качестве противоракового агента. Это расхождение может быть связано с различными экспериментальными условиями, особенно между результатами in vivo и in vitro. Клеточные анализы, использованные в настоящем исследовании, показали, что опухолевые клетки нечувствительны к DCA при культивировании in vitro, IC50 превышает 50 мМ. (данные не показаны). Действие DCA на раковые клетки не связано с прямой цитотоксичностью, а зависит от метаболического паттерна раковых клеток [7, 28]. Клеточные линии, культивируемые in vitro, не могут воспроизвести микроокружение опухоли и могут утратить «эффект Варбурга». Поэтому клеточные анализы in vitro могут быть не самыми подходящими модельными системами для определения применения DCA. Поэтому в настоящем исследовании комбинированный противоопухолевый эффект DCA и капецитабина был оценен на мышиных моделях опухолей in vivo. Мы также обнаружили, что эффект DCA на ксенотрансплантат NSCLC A549 в настоящем исследовании был меньше, чем в работе Bonnet et al. [7], даже несмотря на использование большей дозы DCA. Это может быть связано с разницей в метаболической способности ДКА у мышей и крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что на эффект ДКА может влиять состояние раковых клеток и состояние пациентов, что требует тщательного изучения при клиническом использовании ДКА в лечении рака.

В настоящем исследовании на животных моделях было показано, что DCA сам по себе проявляет слабый противоопухолевый эффект против установленных опухолей. Но в сочетании с капецитабином DCA резко усиливал противоопухолевый эффект капецитабина, что видно как из исследований на животных моделях, так и из результатов иммуногистохимии апоптоза. В соответствии с этим, анализ вестерн-блотов показал, что DCA сам по себе оказывает незначительное влияние на экспрессию и расщепление прокаспаз. Но в сочетании с капецитабином DCA значительно увеличивает экспрессию и расщепление прокаспаз 8, 9 и 3. Сообщается, что цитотоксический агент, такой как 5-Fu, может привести к увеличению экспрессии и активации каспазы 8 [29,30]. Причина, по которой капецитабин приводит к увеличению экспрессии и активации каспазы 9, до сих пор не ясна. Возможно, это связано с антиангиогенетическим действием капецитабина. Сообщается, что DCA может нормализовать ось митохондрий-K+ каналов и действовать как сенсибилизатор апоптоза [7]. Мы предполагаем, что DCA может деполяризовать митохондриальный потенциал раковых клеток, нормализуя эту ось, и тем самым усиливать активацию каспазы 8 и каспазы 9 капецитабином. Повышенная активация каспазы 8 и каспазы 9 приводит к повышенной активации каспазы 3.

Недавно был подчеркнут критический вклад CSCs с их повышенной опухолеродной способностью и устойчивостью к радио- и химиотерапии в злокачественное поведение [31]. Сообщается, что CSCs в солидных опухолях играют важную роль в антихимиотерапевтических и антирадиотерапевтических характеристиках опухолей [32, 33]. Обсуждается множество методов лечения, направленных на CSCs [34, 35], а комбинированные методы лечения, направленные как на CSCs, так и на «нормальные» раковые клетки, вызывают большой интерес [36-38]. Сообщается, что DCA индуцирует апоптоз в предполагаемых стволовых клетках глиобластомы как in vitro, так и in vivo [9]. В нашем исследовании после 7 дней лечения DCA количество CD133-положительных клеток в опухолевых срезах A549, определенных с помощью иммуногистохимии, уменьшилось до 0,5 % по сравнению с 6 % в контрольной группе (данные не показаны), что позволяет предположить, что DCA может также влиять на индуцирование апоптоза в КСК рака легких. Мы предполагаем, что DCA может сенсибилизировать опухолевые клетки, особенно КСК, к капецитабину. Комбинация DCA и капецитабина действует против опухолевых клеток двумя способами: капецитабин нацелен на «нормальные» раковые клетки, щадя CSCs, а DCA нацелен на CSCs и способствует апоптозу капецитабина. Другой вероятный сценарий объяснения эффекта комбинации заключается в том, что DCA подавляет ангиогенез рака in vivo [9], при котором DCA не проявляет прямого действия на раковые клетки. В дополнение к своей классической противоопухолевой активности, капецитабин может действовать как антиангиогенетическая молекула, согласно последним исследованиям [39]. DCA может усиливать антиангиогенный эффект капецитабина, что объясняет противоопухолевый эффект комбинации. Для определения подробного механизма будут проведены углубленные исследования.

В заключение, мы использовали модели опухолей, привитых сингенетически, и ксенотрансплантированных опухолей для изучения комбинированного противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина и обнаружили, что DCA впервые потенцировал противоопухолевый эффект капецитабина. Мы определили, что DCA обладает способностью сенсибилизировать раковые клетки и усиливать апоптотическое действие капецитабина. При комбинированном применении DCA позволял снизить эффективную дозу капецитабина без увеличения токсичности. Недорогой, непатентованный и пероральный DCA в сочетании с пероральным капецитабином может стать хорошей терапевтической схемой против рака.

Благодарности

Мы очень благодарны Венлонг Рену из Шанхайского института фармацевтической промышленности за помощь в подготовке мышиных опухолевых моделей.

Конфликт интересов

Нет.

Амигдалин задерживает прогрессирование клеточного цикла и блокирует рост клеток рака простаты in vitro

оригинал статьи: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S002432051630039X

Ясмина Макаревич а 1,Игорь Цаур а 1,Ева Юнгель а,Хендрик Боргманн а,Карен Нельсон б,Кристиан Томас а,Георг Барч а,Аксель Хаферкамп а 2,Роман А. Блахета а 2

Кафедра урологии, Университет Гёте, Франкфурт-на-Майне, ГерманиябКафедра сосудистой и эндоваскулярной хирургии, Университет Гёте, Франкфурт-на-Майне, Германия

Получено 10 августа 2015 г., пересмотрено 22 января 2016 г., принято 26 января 2016 г., доступно онлайн 29 января 2016 г., версия записи 10 февраля 2016 г.

Цели

Несмотря на впечатляющие преимущества в выживании от новых препаратов для лечения метастазирующего рака простаты (РПЖ), прогрессирующая лекарственная устойчивость препятствует долгосрочному ответу и ограничивает эффективность последующей терапии. В связи с зарегистрированной противоопухолевой активностью амигдалина и растущей популярностью комплементарной и альтернативной медицины был оценен потенциал этого природного, широко используемого вещества для оказания противоопухолевого воздействия на клетки рака простаты.

Основные методы

Клетки LNCaP (чувствительные к кастрации), DU-145 и PC3 (устойчивые к кастрации) подвергались воздействию различных концентраций амигдалина в течение 24  ч или 2 недель. Рост клеток измерялся с помощью теста МТТ, клонирование — с помощью клоногенного анализа . Проточная цитометрия служила для исследования апоптоза и фаз клеточного цикла . Белки, регулирующие клеточный цикл, и сигнальная ось mTOR–akt анализировались с помощью вестерн-блоттинга . 

Основные выводы

Амигдалин дозозависимо уменьшал рост опухолевых клеток с максимальным эффектом при 10 Белки клеточного цикла cdk 1, cdk 2 и cdk 4, а также циклин A , циклин B и циклин D3 модулировались амигдалином как через 24 часа, так и через 2 недели. Отчетливое влияние на экспрессию p19 и p27, а также на активацию Akt, Rictor и Raptor стало очевидным только через 2 недели. мг/мл. Апоптоз клеток PC3 и LNCaP , но не DU-145, был снижен, тогда как образование колоний было подавлено во всех клеточных линиях. Было зарегистрировано снижение числа клеток G2/M- и S-фазы наряду с повышенным числом клеток G0/G1-фазы.   

Значение

Амигдалин проявляет значительную противоопухолевую активность как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-резистентных линиях клеток РПЖ и заслуживает дальнейшей оценки в терапевтических целях.

Введение

 В 2015 году в США было зарегистрировано 220 800 новых случаев рака предстательной железы (РПЖ), в то время как 27  540 мужчин умрут, что делает РПЖ, помимо рака кожи, наиболее часто диагностируемой злокачественной опухолью и второй по значимости причиной смерти от рака у мужчин [1]. Исключительная клиническая и экономическая значимость РПЖ способствовала проведению множества исследований, способствуя быстрому расширению возможностей лечения метастатического РПЖ [2]. Таким образом, значительное улучшение выживаемости на кастрационно-резистентной стадии было достигнуто за счет клинического применения новых препаратов для биосинтеза андрогенов и рецепторного таргетирования, радиофармацевтических препаратов, циторедуктивных и иммунотерапевтических агентов [3]. Предварительные данные также указывают на многообещающий результат ранней химиотерапии доцетакселом при кастрационно-чувствительном РПЖ, хотя для этой терапевтической концепции необходимы дальнейшие исследования [4]. Несмотря на обнадеживающие результаты новых протоколов, первичная или приобретенная лекарственная резистентность исключает долгосрочный ответ. Перекрестная резистентность часто ограничивает эффективность последующей терапии [5]. Кроме того, побочные эффекты, требующие тщательного наблюдения за пациентами и даже прерывания лечения, могут ограничивать клиническое применение [6].Чтобы избежать токсичности, укрепить иммунную систему и, возможно, предотвратить рецидив РПЖ [7], наблюдается рост популярности комплементарной и альтернативной медицины (КАМ), несмотря на скудную доказательную эффективность [8]. Около трети пациентов с РПЖ, и даже больше с запущенным заболеванием, используют КАМ в форме натуральных продуктов для здоровья, таких как витамин Е, пальма сереноа, селен и ликопин [9], [10]. Из-за зарегистрированной противоопухолевой активности цианогенное вещество, диглюкозид амигдалин ( d -манделонитрил-β-гентиобиозид), использовалось в качестве синергического партнера с известными средствами для лечения РПЖ. Предполагается, что это вещество, в изобилии встречающееся в косточках плодов видов Rosaceae, поможет предотвратить негативные эффекты химиотерапии [11]. Однако воздействие амигдалина на РПЖ и его молекулярный механизм активности еще предстоит выяснить.Целью настоящего исследования было изучение влияния амигдалина на способность к росту и молекулярные механизмы в трех линиях клеток РПЖ.

Культура клеток

Клеточные линии рака простаты человека PC3, DU-145 (устойчивые к кастрации) и LNCaP (чувствительные к кастрации) были получены из DSMZ (Брауншвейг, Германия). Опухолевые клетки выращивали и субкультивировали в RPMI 1640 (Gibco/Invitrogen; Карлсруэ, Германия). Среда содержала 10% сыворотки плода теленка (FCS), 2% буфера HEPES (1  М, pH  7,4), 2% глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина.

Лечение амигдалином

Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток (1–10  мг/мл) и

Анализ зависимости реакции от дозы

Воздействие амигдалина на опухолевые клетки PC3, DU-145 и LNCaP в течение 24  ч привело к зависимому от концентрации снижению числа опухолевых клеток, причем наиболее выраженные эффекты были очевидны в присутствии 10  мг/мл (рис. 1А, 24  -часовая инкубация). Тот же ответ наблюдался, когда опухолевые клетки хронически обрабатывались амигдалином в течение 2  недель (рис. 1А, 2-недельная инкубация). Тест исключения трипанового синего не выявил токсических эффектов на линии опухолевых клеток после воздействия  амигдалина в концентрации 10 мг/мл (данные не показаны). Поскольку

Обсуждение

Это исследование показывает, что лечение амигдалином значительно снижает скорость роста как кастрационно-чувствительных (LNCaP), так и кастрационно-устойчивых (PC3, DU-145) клеточных линий и ослабляет образование клонов во всех трех клеточных линиях без токсических эффектов. Эти результаты согласуются с отчетами, показывающими ингибирующее рост, антипролиферативное и проапоптотическое действие амигдалина на промиелоцитарный лейкоз [12], рак толстой кишки [13], рак шейки матки [14] и клетки рака мочевого пузыря [15]. В настоящее время

Заключение

Эти результаты указывают на заслуживающую внимания противоопухолевую активность природного соединения, амигдалина, как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-устойчивых клетках РПЖ. Дальнейшая проверка этих предварительных данных необходима in vitro и in vivo, чтобы выяснить, заслуживает ли амигдалин оценки в надлежащим образом спланированных будущих клинических испытаниях.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана « Фондом Бригитты и Норберта Мут » и « Vereinigung von Freunden und Förderern der Goethe-Universität ».

Амигдалин как химиопротекторное средство при совместном лечении с цисплатином

оригинал статьи: https://www.frontiersin.org/journals/pharmacology/articles/10.3389/fphar.2022.1013692/full

ОРИГИНАЛЬНАЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ статья

Фронт. Фармакол. , 20 сентября 2022 г.Секция Экспериментальная фармакология и открытие лекарствТом 13 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fphar.2022.1013692

Панайота Христодулу1,2 *Панайотис Буцикос1Кристиана М. Неофиту3Теодора-Кристина Кириаку1,3Мария-Иоанна Христодулу2Панайотис Папагеоргис3Анастасис Стефану1Иоаннис Патрикиос1

• 1 Медицинский факультет Европейского университета Кипра, Никосия, Кипр
• 2 Лаборатория иммунологии опухолей и биомаркеров, Центр фундаментальных и трансляционных исследований рака, Факультет наук о жизни, Европейский университет Кипра, Никосия, Кипр
• 3 Лаборатория микроокружения опухоли, метастазирования и экспериментальной терапии, Центр фундаментальных и трансляционных исследований рака, Факультет наук о жизни, Европейский университет Кипра, Никосия, Кипр

Амигдалин — это природный гликозид, используемый в традиционной китайской медицине, который, как известно, обладает противораковыми свойствами. Несмотря на то, что противораковые свойства амигдалина хорошо известны, его воздействие на нормальные клетки не было тщательно изучено. Целью настоящего исследования было изучение возможной химиопротекторной роли амигдалина против цитотоксических эффектов химиотерапии для нормальных клеток человека. В частности, он был протестирован в сочетании с сильным химиотерапевтическим препаратом цисплатином. Человеческая неканцерогенная эпителиальная клеточная линия MCF12F, клетки человеческих фибробластов, клетки человеческого рака молочной железы MCF7 и MDA-MB-231 были обработаны цисплатином в зависимости от дозы и времени в отсутствие или в присутствии амигдалина. Когда клетки MCF12F и фибробласты подвергались предварительной обработке амигдалином с последующей обработкой цисплатином (24 ч амигдалин + 24 ч цисплатин), жизнеспособность клеток увеличивалась (22%, p < 0,001), как показано с помощью анализа МТТ. Как подтверждается проточной цитометрией, комбинированное лечение было связано с уменьшением процента поздних апоптотических клеток по сравнению с монотерапией (кратность изменения снижения = 1,6 и 4,5 для 15 и 20 мкМ соответственно). Кроме того, экспрессия белков PUMA, p53, фосфо-p53 и Bax снижалась, когда использовалась комбинированная обработка по сравнению с одним цисплатином, в то время как проапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL демонстрировали повышенную тенденцию в присутствии амигдалина. Более того, уровни проапоптотических генов PUMA , p53 и мРНК BAX были значительно снижены (∼83%, ∼66% и ∼44% соответственно) по сравнению с одним цисплатином, в то время как уровни мРНК антиапоптотических генов BCl-2 и Bcl-XL были повышены (∼44,5% и ∼51% соответственно) по сравнению с одним цисплатином после 24 ч комбинированного лечения. Исследование анализа индекса комбинации (CI) показало, что амигдалин, возможно, можно рассматривать как антагонист цисплатина (2,2 и 2,3) для клеток MCF12F и фибробластов соответственно. Напротив, для клеток рака молочной железы MCF7 и MDA-MB-231 амигдалин и цисплатин показали синергический эффект (0,8 и 0,65) соответственно. Наши текущие результаты показывают, что амигдалин оказывает химиомодулирующее действие при совместном лечении с цисплатином и способен защищать нормальные клетки молочной железы, а также фибробласты во время химиотерапии, что указывает на сильную селективную химиопротекторную способность и может способствовать улучшению качества жизни онкологических больных.

Введение

Рак является второй по значимости причиной смерти в мире, после сердечно-сосудистых заболеваний ( Nagai and Kim, 2017 ). Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным видом рака среди женщин во всем мире и представляет собой серьезную проблему для общественного здравоохранения [Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), 2021]. Химиотерапия является наиболее эффективным и часто используемым методом лечения большинства злокачественных новообразований ( Huang et al., 2017 ). Несмотря на многочисленные достижения за последнее десятилетие в области адъювантной терапии РМЖ, остаются нерешенными многочисленные проблемы, включая неблагоприятные побочные эффекты, вызываемые химиотерапевтическими препаратами, такие как тошнота, выпадение волос, рвота, усталость и в тяжелых случаях даже смерть ( Waris and Ahsan, 2006 ; Ye et al., 2017 ). Управление по контролю за продуктами и лекарствами США одобрило в общей сложности 132 химиотерапевтических препарата, из которых 56, как сообщается, вызывают окислительный стресс ( Chen et al., 2018 ). Многие классы химиотерапевтических препаратов, такие как таксаны и производные платины, могут вызывать окислительный стресс ( Cauli, 2021 ).

Цис-диаммининдихлорплатина (II) (цисплатин) — неорганическое соединение, «алкилирующий агент», используемый в качестве основного лечебного препарата, способного уменьшать рост раковых клеток, против различных видов рака человека, включая рак молочной железы, яичек, яичников и легких ( Dasari and Tchounwou, 2014 ). Цисплатин образует внутри- и межцепочечные аддукты с ДНК и, таким образом, является мощным индуктором остановки клеточного цикла, приводящей к апоптозу для большинства типов раковых клеток. Сшивающие взаимодействия цисплатина с ДНК способствуют ингибированию репликации, транскрипции и других ядерных функций, которые могут останавливать пролиферацию раковых клеток и рост опухоли ( Zwelling et al., 1979 ; Dasari and Tchounwou, 2014 ). Эффективность цисплатина зависит от способности клеток либо восстанавливать повреждения ДНК, либо приступать к гибели ( Mirmalek et al., 2016 ). Таким образом, сигнальные пути, регулирующие апоптоз, играют ключевую роль в том, как клетки будут реагировать на цисплатин ( Истман, 1990 ).

Амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид) — это цианогенный диглюкозид, который естественным образом содержится в косточках многочисленных фруктов и растений семейства розоцветных, таких как Prunus armeniaca (абрикос) и Prunus persica (персик). Все больше доказательств подтверждают, что амигдалин (также известный как «лаэтрил») может действовать как противораковый агент, вызывая остановку клеточного цикла и апоптоз ( Guo et al., 2013 ; Makarevic et al., 2014 ; Lee and Moon, 2016 ; Saleem et al., 2018 ). Амигдалин проявляет синергический эффект в сочетании с другими соединениями, такими как синильная кислота (противоопухолевое вещество) и бензальдегид (обезболивающее соединение); вызывая гибель раковых клеток ( Song and Xu, 2014 ). Кроме того, in vitro сообщалось, что амигдалин связан с противораковой активностью в отношении клеток рака молочной железы, главным образом, посредством окислительного стресса; он способствует дифференциальному ингибированию пролиферации клеток MCF7 и T470 ( Abboud et al., 2019 ).

Амигдалин может быть расщеплен ферментом, известным как β -глюкозидаза, высвобождающим цианистый водород, бензальдегид и глюкозу. Бензальдегид является обезболивающим, который может быть преобразован в бензойную кислоту кислородом в нормальных/здоровых тканях. Цианистый водород может вызывать токсичность цианида и, следовательно, убивать раковые клетки ( Blaheta et al., 2016 ). С другой стороны, другой фермент, роданеза, который присутствует только в нормальных тканях, а не в раковых, по-видимому, обладает способностью детоксифицировать цианид и, следовательно, защищать нормальные ткани ( Newmark et al., 1981 ). Эти два вышеупомянутых фермента, вероятно, могут способствовать избирательной токсичности амигдалина, контролируя рост и метастазирование раковых клеток.

Теперь мы намерены изучить влияние амигдалина, цисплатина и их комбинированной терапии на жизнеспособность клеток с использованием как нормальных, так и раковых клеточных линий, а также оценить потенциальную химиопротекторную роль амигдалина.

Материалы и методы

Культура клеток

Амигдалин был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США) и растворен в воде (концентрат 1М). Концентрат цисплатина 1 мг/мл для приготовления раствора для инфузий был приобретен у Accord. Клеточные линии MCF12F, MCF7 и MDA-MB-231 были приобретены у American Type Culture Collection (ATCC, Роквилл, Мэриленд). Фибробласты, извлеченные из ткани поджелудочной железы, были любезно предоставлены Университетом Кипра. Клетки MCF12F и фибробласты культивировались в модифицированной среде Дульбекко с питательной смесью Ham's F-12 (DMEM/F12), содержащей 5% лошадиной сыворотки, обработанной Chelex, приобретенной Sigma-Aldrich, эпидермальный фактор роста (EGF, 10 мкг/500 мл), холерный токсин (50 мкг/500 мл), инсулин (5 мг/500 мл) и гидрокортизон (250 мкг/500 мл) вместе с 1% антибиотиков и антимикотиков. Клетки MCF7 и MDA-MB-231 культивировались в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотика, приобретенного Sigma-Aldrich. Клетки инкубировались при 37°C в увлажненной камере при 95% O2 / 5% CO2 . Bcl-2, фосфо-p53, p53, Bax, GAPDH, каспаза-9, антитела были приобретены в Cell Signalling Technology (Дэнверс, Массачусетс, США). β -Актин и каспаза-8 были приобретены в Santa Cruz Biotechnology Inc. Реагенты для культивирования клеток (DMEM, FBS, HS, антибиотик/противогрибковый препарат и трипсин) были приобретены в Gibco, Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США).

Анализ комбинированного индекса

Анализ индекса комбинации (CI) является самым простым способом оценки фармакологических взаимодействий препаратов и в нашем случае использовался для количественной оценки синергизма или антагонизма. Синергизм используется для описания улучшения ответа опухоли, тогда как антагонизм используется, когда эффект комбинации менее токсичен, чем результат индивидуальных эффектов.

Результаты анализа индекса комбинации основаны на теории Chou-Talalay ( Chou, 2010 ). CompuSyn — это компьютерная программа для количественной оценки синергизма и антагонизма в комбинациях лекарственных средств и определения значений IC50 и ED50. Когда этот конкретный анализ дает CI = 1, это означает, что реагирующие вещества имеют аддитивный эффект, CI < 1 означает, что реагирующие вещества имеют синергический эффект, а CI > 1 означает, что реагирующие вещества имеют антагонистический эффект ( таблица 1 и дополнительный материал 2 ) ( Chou, 2010 ).

ТАБЛИЦА 1

ТАБЛИЦА 1. Значения IC50 различных линий клеток.

МТТ-тест

Для оценки жизнеспособности клеток был проведен анализ пролиферации клеток с использованием МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромида, M2128 от Sigma-Aldrich] ( Gasparini et al., 2017 ). После трипсинизации и подсчета с помощью гемоцитометра клетки MCF12F и MCF7 были высеяны в 96-луночный планшет ( Green and Sambrook, 2019 ). После проверки адгезии (примерно через 18 ч после высевания) клетки инкубировали с 10 мМ амигдалина и через 24 ч добавляли 15 мкМ цисплатина еще на 24 ч. После обработки клеток 20 мкл красителя МТТ в течение 4 ч, а затем инкубации с 150 мкл ДМСО (диметилсульфоксид, D8418 от Sigma-Aldrich) в течение 15 мин. Поглощение при 595 нм измеряли с помощью микропланшетного ридера (ThermoFisher Scientific).

синтез кДНК

Общая РНК из каждой популяции клеток была выделена с помощью набора RNeasy Micro Kit (50), а концентрация, а также чистота были измерены с помощью поглощения в λ = 280 и 260 нм/280 нм соответственно. кДНК каждого образца синтезирована с помощью набора primeScript first strand cDNA Synthesis kit (Takara) для смеси 1 и 2. Смесь 1 инкубировали при 65°C в течение 10 мин, а затем во льду в течение 3 мин перед добавлением смеси 2 до конечного объема 20 мкл. Последним шагом была инкубация смесей при определенных температурах в машине RT-qPCR (Bio-Rad) ( Neophytou et al., 2019 ).

ОТ-ПЦР в реальном времени

Для измерения экспрессии мРНК была проведена ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) с использованием набора KAPA SYBR FAST qPCR (KK4610). Были использованы следующие праймеры: Bax, прямой: 5′-ACA​TGG​AGC​TGC​AGA​GGA​TG-3′, обратный: 5′-CCA​GTT​GAA​GTT​GCC​GTC​AG-3′; p53, прямой: 5′-CCT​CAG​CAT​CTT​ATC​CGA​GTG​G-3′, обратный: 5′-TGG​ATG​GTG​GTA​CAG​TCA​GAG​C-3′; PUMA, прямой: 5′-ACG​ACC​TCA​ACG​CAC​AGT​ACG​A-3′, обратный: 5′-GTA​AGG​GCA​GGA​GTC​CCA​TGA​T-3′; Bcl-2, прямой: 5′-GGA​TAA​CGG​AGG​CTG​GGA​TG-3′, обратный: 5′-GGC​CAA​ACT​GAG​CAG​AGT​CT-3′; Bcl-xL, прямой: 5′-AGA​GCC​TTG​GAT​CCA​GGA​GA-3′, обратный: 5′-TCA​GGA​ACC​AGC​GGT​TGA​AG-3′; GADPH, прямой: 5′-GTC​TCC​TCT​GAC​TTC​AAC​AGC​G-3′, обратный: 5′-ACC​ACC​CTG​TTG​CTG​TAG​CCA​A-3′. GADPH использовали в качестве гена домашнего хозяйства. В конце реакции регистрировали значения Ct, и среднее значение трехкратных повторов использовали для расчета кратности изменения экспрессии гена с использованием метода 2[-Delta Delta C(T)] ( Livak and Schmittgen, 2001 ), как описано ранее ( Papageorgis et al., 2010 ). Для оценки эффекта лечения использовали данные по крайней мере трех независимых биологических повторов.

Извлечение белка

Среду удаляли из 6-луночного планшета и добавляли 1 мл PBS для промывки лунок, а затем аспирировали. После этого добавляли 150 мкл RIPA для лизиса клеток. Гомогенизированные образцы переносили в пробирки Eppendorf на льду на 30 мин с частым встряхиванием. Образцы центрифугировали при 10 000 об/мин/10 мин/4°C ( Ngoka, 2008 ). Образцы хранили при температуре –80 до дальнейшего использования ( Дополнительные материалы 1 и 3).

вестерн-блоттинг

Для определения уровня белка мы провели анализ вестерн-блоттинга. Смеси белков инкубировали при 98°C в течение 5 минут, а затем переносили на мембрану PVDF и блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в первичном антителе в течение ночи при 4°C, а затем добавляли вторичное антитело в течение 60 минут при комнатной температуре. MCF12F обрабатывали цисплатином и амигдалином по отдельности или в комбинации в течение 48 часов. Белки экстрагировали и разделяли с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и зондировали с помощью антител против Bcl-2, фосфо-p53, p53, Bax, PUMA, PARP-1 и каспазы-9. Bcl-2 (CST 15071, 1:1000), PARP-1 (CST 9542, 1:1000), Bax (CST 2772, 1:1000), каспаза-9 (CTS 9502, 1:1000), фосфо-p53 (CST 9286 (Ser15), 1:1000), p53 (CST 9282, 1:1000), PUMA (CST 12450, 1:1000) были приобретены для Cell Signalling Technology (Дэнверс, Массачусетс, США), а Bcl-2 (sc-783, 1:1000), GAPDH (sc-25778, 1:1000) были приобретены у Santa Cruz Biotechnology Inc. Мы визуализировали полосы белков с использованием субстрата вестерн-блоттинга с улучшенной хемилюминесценцией (ECL) (Thermo Fisher Scientific) и машины Chemidoc от Biorad. Значения интенсивности из денситометрического анализа вестерн-блотов были нормализованы относительно GAPDH или β -актина с использованием программного обеспечения для анализа ImageJ. Значения интенсивности были выражены как кратное изменение по сравнению с контролем ( Ngoka, 2008 ).

Оценка апоптоза/некроза методом проточной цитометрии

Исследование индукции апоптоза/некроза оценивалось с помощью проточного цитометрического анализа при двойном окрашивании Annexin-V-FITC/пропидиум йодидом (PI). Клетки высевали в концентрации 1 × 10 5 клеток на лунку в 6-луночные планшеты для культивирования тканей и обрабатывали цисплатином (15 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ) и/или амигдалином (10 мМ), как указано. Клетки, обработанные только цисплатином, использовали в качестве положительного контроля, а необработанные клетки — в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали и окрашивали с помощью набора Annexin V/Dead Cell Apoptosis (Life Technologies, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Апоптоз и некроз клеток анализировали с помощью проточного цитометра Attune NxT (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) и программного обеспечения FlowJo v10 (BD Biosciences, США) ( Steensma et al., 2003 ).

Статистический анализ

Все результаты были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка между самой низкой и самой высокой точками измерения. Непарные t -тесты были применены для исследования возможных различий в непрерывных переменных для двух групп. p -значения представлены как двусторонние с доверительными интервалами 95%. Статистический тест и анализ были проведены с использованием программного обеспечения Prism версии 5.0 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США). Для взаимодействия лекарств использовался метод Chou-Talalay (индекс комбинации) для оценки эффекта комбинированного лечения на основе данных о концентрации-эффекте ( Chou, 2010 ). Этот метод для комбинации лекарств основан на уравнении медианы-эффекта, которое исходит из принципа закона действия масс, который связывает один объект и несколько объектов, а также динамику первого и более высокого порядка ( Chou, 2011 ). Для результатов программного обеспечения уравнения индекса комбинации используется программа CompuSyn ( Chou, 2010 ).

Результаты

Оценка жизнеспособности нормальных и раковых клеток молочной железы после однократного лечения цисплатином или амигдалином

Чтобы определить влияние лечения амигдалином и цисплатином на нормальные (MCF12F) и раковые (MCF7, MDA-MB-231) клетки молочной железы, а также на фибробласты (FBS), мы использовали анализ MTT для оценки жизнеспособности клеток в зависимости от дозы в различные моменты времени. Во-первых, влияние амигдалина и цисплатина оценивалось по отдельности. Когда была указана идеальная концентрация (цисплатин 15 мкМ, амигдалин 10 мМ) для обоих видов лечения, была проведена комбинированная терапия с использованием цисплатина и амигдалина вместе для оценки разницы в количестве клеток.

Клетки MCF12F, MCF7, MDA-MB-231 и FBS обрабатывали 1, 10, 15, 20 и 30 мкМ цисплатина, а жизнеспособность клеток оценивали через 24, 48 и 72 ч ( рисунок 1A ). Цисплатин повлиял на все клеточные линии, уменьшив количество жизнеспособных клеток. Клетки рака молочной железы были поражены цисплатином больше, чем нормальные клетки молочной железы, а также фибробласты. Однако обе клеточные линии были значительно затронуты цисплатином.

РИСУНОК 1

РИСУНОК 1. Эффект цисплатина и амигдалина в линиях клеток молочной железы, а также в фибробластах. (A) Анализ МТТ использовался для оценки цитотоксичности (% жизнеспособности клеток) возрастающих концентраций цисплатина (1, 10, 15, 20 и 30 мкМ) в i) MCF-12F, ii) FBS, iii) MCF-7 и iv) MDA-MB-231 в течение 24, 48, 72 ч и (B) возрастающих концентраций амигдалина (10, 25, 50, 75 и 100 мМ) в i) MCF-12F, ii) FBS, iii) MCF-7 и iv) MDA-MB-231 в течение 24, 48, 72 ч лечения. Звездочки указывают на силу статистической значимости между столбцами [* (0,05) < ** (0,01) < ***(0,001)].

Кроме того, клетки MCF12F, MCF7, MDA-MB-231 и FBS обрабатывали 10, 25, 50, 75 и 100 мМ амигдалина в течение 24, 48 и 72 ч ( Рисунок 1B ). Во всех клеточных линиях количество жизнеспособных клеток уменьшалось с увеличением концентрации амигдалина. Однако при использовании 10 мМ обработки амигдалином существенных различий не наблюдалось, поскольку уровень жизнеспособности клеток составлял >90% во всех временных точках. IC 50 цисплатина был определен равным 23,8 мкМ в MCF12F и 21,7 мкМ в MCF7, тогда как IC 50 амигдалина был равен 85,4 мМ в MCF12F и 64,5 мМ в MCF7 после 24, 48 и 72 ч обработки соответственно ( таблица 1 ).

Комбинированное лечение демонстрирует химиопротекторный эффект в нормальных клетках молочной железы

Комбинированное лечение применялось к клеткам MCF12F с использованием 10 мМ амигдалина и 1, 10, 15, 20 и 30 мкМ цисплатина. Сначала клетки обрабатывали амигдалином в течение 24 ч, а затем добавляли цисплатин на 24, 48 и 72 ч ( рисунки 2Ai–iii ). Затем мы предварительно обработали клетки 10 мМ амигдалином в течение 24 ч и наиболее подходящей концентрацией цисплатина, 15 мкМ в течение 24, 48 и 72 ч. Концентрация цисплатина основывалась на жизнеспособности клеток, которая составляла >50% при лечении одним агентом. Результаты показывают, что комбинированное лечение повышает жизнеспособность клеток во всех временных точках по сравнению с лечением одним цисплатином ( рисунок 2B ). Наиболее значительное увеличение жизнеспособности клеток ( ∼ 22%) наблюдалось через 48 ч при комбинированном лечении (24 ч амигдалин + 24 ч цисплатин). Анализ индекса комбинации, указывающий на синергизм или антагонизм амигдалина с цисплатином, представлен в таблице 1 .

РИСУНОК 2

РИСУНОК 2. Эффект цисплатина отдельно и в сочетании с амигдалином в нормальных клетках молочной железы, MCF12F. Клетки были предварительно обработаны 10 мМ амигдалином, а затем цисплатин (1, 10, 15, 20 и 30 мкМ) был добавлен в течение (A) i) 24 ч, ii) 48 ч и iii) 72 ч. Анализ МТТ был применен для измерения жизнеспособности клеток в этих условиях. (B) Амигдалин (10 мМ) снижает цитотоксичность цисплатина (15 мкМ) и увеличивает выживаемость во всех временных точках с пиком на 48 ч общей обработки. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM трех различных повторов и являются репрезентативными по крайней мере для трех различных экспериментов [* (0,05) < ** (0,01) < ***(0,001)].

Оценка апоптоза, опосредованного комбинированным лечением

Окрашивание аннексином V/PI использовалось для оценки апоптотического эффекта возрастающих концентраций цисплатина 15 и 20 мкМ с 10 мМ амигдалином или без него в течение 48 часов лечения.

Как показано на рисунке 3 , в клетках MCF12F процент поздних апоптотических клеток (двойной положительный результат по аннексину-V/PI) после 48-часовой комбинированной обработки (% среднего ± SE; цисплатин 15 мкМ + 10 мМ амигдалин: 5,8 ± 1,2 или цисплатин 20 мкМ + 10 мМ амигдалин: 4,3 ± 0,6) был значительно ниже по сравнению с обработкой цисплатином (15 мкМ: 9,5 ± 1,8; кратность изменения снижения = 1,6 или 20 мкМ: 19,3 ± 2,4; кратность изменения снижения = 4,5). Более того, % живых клеток при комбинированном лечении был увеличен (цисплатин 15 мкМ + 10 мМ амигдалин: 90,1 ± 1,2 или цисплатин 20 мкМ + 10 мМ амигдалин: 90,2 ± 0,5) по сравнению с применением только цисплатина (15 мкМ: 86,8 ± 0,5; p = 0,05 или 20 мкМ: 74,4 ± 1,9; p = 0,03 соответственно). Процент живых, ранних, поздних апоптотических и некротических клеток для всех условий лечения представлен на рисунке 3B . Была использована концентрация 30 мкМ, поскольку было обнаружено, что это самая высокая концентрация, способная убить более 50% обработанных клеток. Кроме того, 30 мкМ использовали в качестве положительного контроля для остальных экспериментов.

РИСУНОК 3

РИСУНОК 3. Влияние амигдалина на апоптоз, вызванный цисплатином в клетках MCF-12F. (A) Окрашивание аннексином V/PI использовалось для оценки апоптотического эффекта (% по сравнению с контролем) 15 и 20 мкМ цисплатина с 10 мМ амигдалином или без него в течение 48 ч. Приведены диаграммы зебра % живых (Q4), ранних (Q3), поздних апоптотических (Q2) и некротических клеток (Q1) при каждой стимуляции. (B) Сложенные столбчатые диаграммы, изображающие изменения в вышеупомянутых популяциях. Показаны данные трех независимых экспериментов.

Амигдалин и цисплатин регулируют белки, связанные с апоптозом

Комбинация цисплатина и амигдалина снизила уровни проапоптотических BAX, фосфо-p53, p53 и PUMA, медиаторов апоптотических ответов ( Рисунок 4 ). Напротив, уровни антиапоптотического BCl-2, известного ингибитора процесса проницаемости митохондриальной наружной мембраны (MOMP), были повышены ( Рисунок 4A ). PARP-1, фермент репарации ДНК, который расщепляется во время апоптоза, не представил свою расщепленную форму во время комбинированного лечения ( Рисунок 4B ). Расщепленная каспаза-9, мишень проапоптотических белков, высвобождаемых из митохондрий, была обнаружена в клетках, обработанных цисплатином, но не в группе комбинированного лечения ( Рисунок 4C ). Расщепленная каспаза-9 является активной формой, которая расщепляется от прокаспазы-9 (полной длины), показывая инициацию апоптотического пути. Эти результаты показывают, что комбинированное лечение с амигдалином подавляло апоптоз по сравнению с лечением только цисплатином.

РИСУНОК 4

РИСУНОК 4. Влияние амигдалина и цисплатина на уровни и локализацию апоптотических белков в нормальных клетках. (A) Сочетание 10 мМ амигдалина и 15 мкМ цисплатина снизило уровни белков Bax, phosho-p53, p53, PUMA и увеличило уровни белков Bcl-2 после 48 ч обработки в MCF12F. (B) Показана экспрессия расщепленного PARP при обработке цисплатином. Цисплатин сам по себе вызывал расщепление каспазы-9, тогда как (C) амигдалин (10 мМ) снижал этот эффект. Значения интенсивности из денситометрического анализа вестерн-блотов показаны в верхней части каждого блота и были нормализованы по GAPDH с помощью программного обеспечения ImageJ. Результаты являются репрезентативными по крайней мере для трех независимых экспериментов.

Влияние амигдалина и цисплатина на экспрессию мРНК про- и антиапоптотических генов

После комбинированной обработки в течение 48 ч на клетках MCF12F уровни мРНК PUMA , p53 и Bax были значительно снижены на ∼83%, ∼66% и ∼44% соответственно по сравнению с обработкой только цисплатином. Напротив, уровни мРНК Bcl-2 и Bcl-xL были повышены на ∼44,5% и ∼51% соответственно при комбинированной обработке по сравнению с обработкой только цисплатином. Кроме того, уровни мРНК соотношения BAX/Bcl-2 были снижены на ∼81% при комбинированной обработке по сравнению с обработкой только цисплатином ( Рисунок 5 ). Более того, комбинированная обработка не показала никакого химиопротекторного эффекта на основе уровней экспрессии мРНК про- и антиапоптотических генов в клетках MCF7 и MDA-MB-231. ( Рисунок 5 ). Амигдалин сам по себе показал увеличение мРНК p53 в клетках MCF12F ( Рисунок 5 ), однако на уровне белка p53 ( Рисунок 4 ) он остался неизменным, и это может означать, что уровень мРНК не всегда коррелирует с уровнем белка. Аналогично, амигдалин не способствовал гибели клеток, как было оценено с помощью проточной цитометрии в клетках MCF12F ( Рисунок 3 ).

РИСУНОК 5

РИСУНОК 5. Влияние амигдалина и цисплатина на экспрессию мРНК проапоптотических и антиапоптотических генов. В MCF12F экспрессия мРНК проапоптотических генов PUMA, p53 и Bax , а также соотношение BAX/Bcl-2 были снижены при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), тогда как экспрессия мРНК антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-xL была повышена при комбинированном лечении. В MCF7 экспрессия мРНК проапоптотических генов PUMA, p53 и Bax , а также соотношение BAX/Bcl-2 были увеличены при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), в то время как экспрессия мРНК антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-xL была снижена при комбинированном лечении. В MDA-MB-231 экспрессия мРНК проапоптотического гена p 53 была увеличена при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), в то время как экспрессия мРНК антиапоптотического гена Bcl-2 была снижена. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM трех различных повторов и являются репрезентативными по крайней мере для трех различных экспериментов, ∗ значение p < 0,05, ∗∗ значение p < 0,01, ∗∗∗ значение p < 0,001.

Обсуждение

Наиболее широко используемыми методами лечения рака являются хирургия, радиотерапия и химиотерапия, однако их эффективный терапевтический результат остается ограниченным из-за их неблагоприятных побочных эффектов, которые часто могут быть серьезными, что подчеркивает необходимость альтернативных или адъювантных методов лечения. Следовательно, стратегии, включающие фитохимические вещества, могут помочь в снижении этих побочных эффектов и улучшении качества жизни. Химиопротекторное лечение является многообещающим подходом, направленным на смягчение химиотерапевтических побочных эффектов в организме ( Maier et al., 2010 ). Фитохимические вещества, по-видимому, участвуют в профилактике и лечении рака из-за их относительно безопасного профиля цитотоксичности ( Duthie, 2007 ; Jagtap et al., 2009 ). В последнее десятилетие исследования направлены на выявление потенциала комбинированных стратегий с использованием одного или нескольких натуральных продуктов вместе с эффективным химиотерапевтическим средством для улучшения традиционной терапии рака ( Krzyzanowska et al., 2010 ; Kaminski et al., 2011 ; Saldanha and Tollefsbol, 2012 ).

В этом исследовании мы исследовали химиопротекторное и терапевтическое действие амигдалина в сочетании с обычным химиотерапевтическим средством цисплатином. Чтобы определить дифференциальную цитотоксичность по отношению к нормальным и раковым клеткам молочной железы, а также к фибробластам, эффект различных концентраций цисплатина и амигдалина, по отдельности, оценивался на клеточных линиях MCF12F, MCF7, MDA-MB-231, а также на фибробластах. Цисплатин и амигдалин снижали жизнеспособность клеток всех клеточных линий в зависимости от дозы и времени. Важно отметить, что обработка амигдалином в концентрации 10 мМ как нормальных, так и раковых клеток не показала статистически значимой разницы в жизнеспособности клеток, и этот показатель составлял более 90% во всех временных точках. Это подтверждает предыдущие выводы, указывающие на то, что многие фитохимические вещества, включая амигдалин, куркумин и сульфорафан, малотоксичны для нераковых, нормальных клеток ( Ravindran et al., 2009 ; Sharma et al., 2011 ).

На основании результатов IC50 концентрация амигдалина была установлена ​​на уровне 10 мМ (не повлияла на жизнеспособность клеток ни в одной из клеточных линий в течение 24 ч). Концентрация цисплатина была установлена ​​на уровне 15 мкМ для всех клеточных линий, чтобы иметь более 50% жизнеспособности клеток (для лучшей оценки эффекта комбинированного лечения в нормальных клетках).

Цисплатин является хорошо известным химиотерапевтическим препаратом для лечения широкого спектра злокачественных новообразований человека, но он связан с серьезными побочными эффектами и неспецифической цитотоксичностью, которая приводит к повреждению нормальных клеток и развитию лекарственной устойчивости ( McWhinney et al., 2009 ; Gopal et al., 2012 ). Предыдущие исследования продемонстрировали цитотоксический синергизм цисплатина и других агентов, таких как пчелиный яд, производное тиазоло[5,4-b] хинолина D3CLP и препарат AT-101 по отношению к различным линиям раковых клеток ( Alizadehnohi et al., 2012 ; Gonzalez-Sanchez et al., 2012 ; Mazumder et al., 2012 ; Karaca et al., 2013 ). Другое исследование продемонстрировало синергетическую активность фитохимического эпигаллокатехин галлата (EGCG) в сочетании с цисплатином и опухолеактивными соединениями палладия при раке яичников, что позволяет предположить, что комбинации платиновых препаратов, включая цисплатин и разработанные транс-палладии вместе с выбранными фитохимическими веществами, могут опосредовать преодоление лекарственной устойчивости в будущем. В нашем исследовании мы использовали комбинированную обработку 15 мкМ цисплатина и 10 мМ амигдалина как в нормальных клетках MCF12F, так и в FBS, чтобы дополнительно оценить безопасность амигдалина на нормальных клетках, а также его цитопротекторные способности в присутствии противораковых методов лечения. Также изучалась способность амигдалина сенсибилизировать эффекты, вызывающие смерть, в раковых клетках.

Проточная цитометрия подтвердила химиопротекторный эффект амигдалина, снижающий процент поздних апоптотических клеток до 4,5 раз ( рисунок 3 ). Как показано, амигдалин способен снижать цитотоксическое действие цисплатина на нормальные клетки молочной железы. Это подтверждается индексом комбинации (CI), который показал антагонизм между амигдалином и цисплатином при использовании в нормальных клетках и синергизм против раковых клеток.

Амигдалин приобрел широкую популярность благодаря своей противораковой активности и другим полезным эффектам на различные системы организма, таким как подавление фиброза почек, противоастматическое действие и улучшение иммунной функции ( Syrigos et al., 1998 ). Однако химиопротекторный потенциал амигдалина на нормальных эпителиальных клетках молочной железы ранее не исследовался.

Как показали наши результаты ( Рисунок 5 ), уровень мРНК проапоптотических PUMA, p53, BAX был значительно снижен, в то время как мРНК антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-xL были повышены после комбинированного лечения по сравнению с лечением только цисплатином в нормальных клетках. Это конкретное наблюдение и открытие подтверждают основное обоснование механизма действия через апоптотический путь. Напротив, уровень мРНК проапоптотических PUMA, p53, BAX был повышен, в то время как мРНК антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-xL были снижены после комбинированного лечения по сравнению с лечением только цисплатином в раковых клетках. Результаты ОТ-ПЦР в клетках рака молочной железы (MCF7 и MDA-MB-231) предполагают возможный синергический эффект амигдалина с цисплатином и подчеркивают его противораковую активность. Из предварительных отчетов известно, что возможным механизмом этого токсического эффекта является наличие β -глюкозидазы в раковых клетках, но не в нормальных клетках, которая способна расщеплять и высвобождать цианит из основной молекулы амигдалина. С другой стороны, нормальные клетки содержат фермент роданезу, который не может приводить к расщеплению и высвобождению цианида ( Newmark et al., 1981 ).

Похожая картина про- и антиапоптотической экспрессии также наблюдалась на уровнях белков. Экспрессия белков PUMA, p53, фосфо-p53 и Bax ( Рисунок 4 ) также снижалась при использовании комбинированного лечения по сравнению с одним цисплатином. С другой стороны, проапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL демонстрировали повышенную тенденцию в присутствии амигдалина. Кроме того, при использовании комбинированного лечения были получены сниженные уровни расщепленной формы каспазы 9 и PARP, что указывает на ингибирование апоптотического пути. Мы поясняем, что даже несмотря на то, что можно наблюдать некоторую непоследовательность в отношении результата уровня GAPDH, учитывая полученный результат во всех других белках, запущенных для эксперимента по сравнению с GAPDH, непоследовательность нельзя считать проблемной. Более того, разница в расщеплении каспазы-9 между дорожкой 1 (контроль) и дорожкой 3 (15 мкМ цисплатин) очень слабая, но это обычное явление в ситуациях, когда наблюдается повышенный апоптотический результат.

Эти результаты могут указывать на то, что комбинированное лечение способно подавлять апоптоз по сравнению с лечением цисплатином.

Учитывая предыдущие изменения как в экспрессии мРНК, так и в экспрессии белка, мы можем сделать вывод, что комбинированное лечение цисплатином и амигдалином, возможно, может способствовать нормальному выживанию клеток выборочно, ингибируя апоптоз только в нормальных клетках. Эти наблюдения и выводы подтверждают нашу первичную и основную гипотезу и совместимы с другими исследованиями, которые указали на аналогичный механизм действия амигдалина в различных клеточных линиях или в моделях животных ( Kwon et al., 2003 ; Chang et al., 2006 ; Chen et al., 2013 ; Makarevic et al., 2014 ; Su et al., 2014 ).

В раковых клетках мы показали, что цисплатин способствует активации p53, что приводит к апоптозу посредством снижения уровня антиапоптотического белка Bcl-2 и повышения уровня проапоптотического белка Bax. Про- и антиапоптотические белки семейства Bcl-2 активируют процесс MOMP, который, в свою очередь, активирует апоптоз. MOMP приводит к высвобождению цитохрома c из митохондрий в цитозоль, вызывая активацию каспазы и последующий апоптоз ( Рисунок 6 ). С другой стороны, амигдалин оказывает цитопротекторное действие на нераковые клетки, способствуя эффективной экспрессии антиапоптотического гена.

РИСУНОК 6

РИСУНОК 6. Потенциальный механизм действия амигдалина и цисплатина в нормальных клетках молочной железы против рака молочной железы. При лечении цисплатином индуцируется повреждение ДНК с последующей активацией фосфо-p53, приводящей к апоптозу. Фосфо-p53 может индуцировать апоптоз посредством снижения регуляции Bcl-2 и повышения регуляции Bax, что приводит к MOMP и активации каспазы-9.

Рак груди известен как одно из самых смертельных злокачественных новообразований среди женщин во всем мире и является серьезной проблемой общественного здравоохранения. Более того, известно, что существующие методы химиотерапии рака связаны с серьезными побочными эффектами, влияющими на качество жизни пациентов и продолжительность жизни. Таким образом, существует острая необходимость в новых терапевтических подходах. Это делает наши нынешние результаты важными для открытия новых горизонтов и направлений в области лечения рака.

Это исследование может быть расширено в будущем за счет использования экспериментов in vivo с использованием животных для оценки эффективности амигдалина при лечении рака. Предыдущие исследования показали, что они лечили мышей амигдалином с использованием 200, 100 и 50 мг/кг веса тела ( Albogami et al., 2020 ). Это правда, что используемые дозы концентрации (10–100 мМ) можно считать очень высокими для будущих исследований на животных. Тем не менее, тот факт, что они не были токсичными, дает нам уверенность в том, что они не будут способствовать возникновению побочных или токсических эффектов при использовании на животных. Кроме того, мы уточняем, что будут проведены новые исследования по оптимизации дозы, включая исследования ФК для обнаружения амигдалина в плазме перед использованием на животных.

Понимание цитопротекторного действия амигдалина во время химиотерапии может позволить разработать новые методы лечения, позволяющие снизить неблагоприятные побочные эффекты и, следовательно, улучшить качество и продолжительность жизни онкологических больных.

Заявление о доступности данных

Исходные данные, подтверждающие выводы настоящей статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

Вклад автора

Задумал, разработал, контролировал и предоставил финансирование для исследования, IP, AS и PC; Обзор литературы и эксперименты, PC и PB; Проанализировал данные, PC, M-IC и CN; Сгенерировал и предоставил реагенты/материалы/инструменты анализа, CN и PP; Статистический анализ, PC и CN; Составил черновик рукописи: PC и IP; Отредактировал рукопись: AS и PP. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить благодарность доценту Панайотису Политису за его любезную поддержку и предоставление использованных учебников.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все заявления, высказанные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют заявления их аффилированных организаций или заявления издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не гарантируется и не одобряется издателем.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.1013692/full#supplementary-material

Совместное введение амигдалина и дезоксиниваленола нарушило регуляторные белки, связанные с пролиферацией клеток свиных яичников in vitro

Оригинал статьи: https://www.researchgate.net/publication/318430770_Co-administration_of_amygdalin_and_deoxynivalenol_disrupted_regulatory_proteins_linked_to_proliferation_of_porcine_ovarian_cells_in_vitro

Дезоксиниваленол (ДОН) представляет собой один из наиболее распространенных трихотеценовых микотоксинов, вырабатываемых видами Fusarium, вызывая экономические и медицинские последствия. С другой стороны, было показано, что амигдалин обладает как профилактическими, так и лечебными свойствами, поэтому он использовался в качестве традиционного лекарства из-за его широкого спектра медицинских преимуществ, включая лечение или профилактику рака, снятие лихорадки, подавление кашля и утоление жажды. Целью этого исследования in vitro была оценка потенциального воздействия натурального продукта амигдалина в сочетании с микотоксином дезоксиниваленолом (ДОН) на ключевые регуляторы пролиферации клеток и апоптоза в гранулезных клетках яичников свиней. Клетки гранулезы яичников инкубировали в течение 24 ч с амигдалином (1, 10, 100, 1000, 10 000 мкг.мл⁻¹) в сочетании с дезоксиниваленолом (1 мкг.мл⁻¹), в то время как контрольная группа оставалась необработанной. Наличие пролиферативных (циклин B1, PCNA) и апоптотических маркеров (каспаза-3) в клетках гранулезы яичников свиней после обработки амигдалином (1, 10, 100, 1000, 10 000 мкг.мл⁻¹) в сочетании с дезоксиниваленолом (1 мкг.мл⁻¹) было обнаружено с помощью иммуноцитохимии. Присутствие пролиферативных (циклин B1, PCNA) и апоптотических маркеров (каспаза-3) в гранулезных клетках яичников свиней было обнаружено с помощью иммуноцитохимии. Совместное введение амигдалина и ДОН значительно (p < 0,05) увеличило количество гранулезных клеток, содержащих циклин B1 и PCNA во всех протестированных концентрациях по сравнению с контролем. Однако процент гранулезных клеток, содержащих основной апоптотический маркер каспазу-3, не отличался после совместного введения амигдалина и ДОН. Подводя итог, результаты этого исследования in vitro указывают на то, что совместное воздействие амигдалина и дезоксиниваленола может стимулировать пептиды, связанные с пролиферацией, в гранулезных клетках яичников свиней и, таким образом, изменять пролиферацию клеток и нормальное развитие фолликулов.

Амигдалин блокирует рост клеток рака мочевого пузыря in vitro, уменьшая циклин А и cdk2

Оригинал статьи:

https://neue-krebstherapie.com/wp-content/uploads/2015/03/Amygdalin_PlosOne_Wachstum_Blase.pdf

Аннотация

Амигдалин, природное соединение, использовалось многими онкологическими больными в качестве альтернативного подхода к лечению их болезни. Однако, действительно ли это вещество оказывает противоопухолевое действие, так и не было установлено. Было начато исследование in vitro для изучения влияния амигдалина (1,25-10 мг/мл) на рост панели линий клеток рака мочевого пузыря (UMUC-3, RT112 и TCCSUP). Были исследованы рост опухоли, пролиферация, клональный рост и прогрессирование клеточного цикла. Были исследованы белки, регулирующие клеточный цикл cdk1, cdk2, cdk4, циклин A, циклин B, циклин D1, p19, p27, а также сигналы, связанные с мишенью рапамицина млекопитающих (mTOR), phosphoAkt, phosphoRaptor и phosphoRictor. Амигдалин дозозависимо снижал рост и пролиферацию во всех трех линиях клеток рака мочевого пузыря, что отражалось в значительной задержке прогрессирования клеточного цикла и остановке G0/G1. Молекулярная оценка выявила снижение phosphoAkt, phosphoRictor и потерю компонентов Cdk и циклина. Поскольку наиболее выдающиеся эффекты амигдалина наблюдались на оси cdk2-циклин A, были проведены исследования по снижению siRNA, выявившие положительную корреляцию между уровнем экспрессии cdk2/циклин A и ростом опухоли. Таким образом, амигдалин может блокировать рост опухоли путем снижения модуляции cdk2 и циклина A. Для оценки практической ценности амигдалина как противоопухолевого препарата необходимо провести исследование in vivo.

Долгосрочная стабилизация метастатической меланомы с помощью дихлорацетата натрия

Акбар Хан, Дуг Эндрюс, Джилл Шейнхаус, Аннеке С. Блэкберн

Акбар Хан, Дуглас Эндрюс, Medicor Cancer Centres Inc., Торонто, Онтарио M2N 6N4, Канада

Джилл Шейнхаус, Insight Naturopathic Clinic, Торонто, ON M4P 1N9, Канада

Аннеке С. Блэкберн, Школа медицинских исследований Джона Кертина, Австралийский национальный университет, Канберра, ACT 2601, Австралия 

Вклад авторов: Хан А. лечил пациента и написал большую часть отчета о случае; Эндрюс Д. помогал в разработке протокола натурального лечения для снижения побочных эффектов DCA и написал часть отчета о случае; Шейнхаус Дж. лечил пациента с помощью натуральной терапии; Блэкберн А.С. интерпретировал отчет о случае в контексте литературы по исследованиям DCA in vitro и in vivo, написал части введения и обсуждения, а также просмотрел рукопись в целом.

Заявление об информированном согласии: Пациентка, описанная в данной рукописи, дала согласие на публикацию своего случая анонимно. 

Заявление о конфликте интересов: Один из авторов (Хан) проводит терапию дихлорацетатом для онкологических больных через онкологические центры Medicor Cancer Centres за плату и без получения прибыли. Клиника принадлежит члену семьи этого автора. Другим авторам нечего раскрывать.

Открытый доступ: эта статья является статьей открытого доступа, которая была выбрана внутренним редактором и полностью проверена внешними рецензентами. Она распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), которая позволяет другим распространять, перерабатывать, адаптировать, строить на основе этой работы некоммерческие работы и лицензировать свои производные работы на других условиях, при условии, что оригинальная работа должным образом цитируется и использование является некоммерческим. См.: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Источник рукописи: приглашенная рукопись

Адрес для корреспонденции: Акбар Хан, доктор медицины, медицинский директор, 
Medicor Cancer Centres Inc., 4576 Yonge St., Suite 301, Toronto, 
ON M2N 6N4, Canada. akhan@medicorcancer.com
Телефон: +1-416-2270037
Факс: +1-416-2271915

  Получено:  30 января 2017 г.
  Начало рецензирования:  12 февраля 2017 г.
  Первое решение:  28 марта 2017 г.
  Исправлено:  5 мая 2017 г.
  Принято:  30 мая 2017 г.
  Статья в печати:  31 мая 2017 г.
  Опубликовано онлайн:  10 августа 2017 г.

Абстрактный

Дихлорацетат натрия (DCA) изучается как метаболическая терапия рака с 2007 года на основе публикации Bonnet et al, демонстрирующей, что DCA может вызывать апоптоз (запрограммированную гибель клеток) в клетках рака молочной железы, легких и мозга человека. Классически реакция рака на медикаментозную терапию в исследованиях на людях измеряется с помощью определений Критериев оценки ответа для солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации, однако стабилизация заболевания также является полезным клиническим результатом. Было показано, что DCA может функционировать как цитостатический агент in vitro и in vivo, не вызывая апоптоза. Представлен случай 32-летнего мужчины, у которого терапия DCA без сопутствующей традиционной терапии привела к регрессии и стабилизации рецидивирующей метастатической меланомы в течение более 4 лет с незначительными побочными эффектами. Этот случай демонстрирует, что DCA можно использовать для уменьшения объема заболевания и поддержания долгосрочной стабильности у пациентов с запущенной меланомой.

Ключевые слова: Дихлорацетат; Рак; BRAF; Меланома; Цитостатики

© Автор(ы) 2017. Опубликовано Baishideng Publishing Group Inc. Все права защищены.

Основная подсказка: Дихлорацетат натрия (DCA) изучается как метаболическая терапия рака с 2007 года. Было показано, что терапия DCA может привести к классическому ответу, который измеряется уменьшением или исчезновением опухолей при визуализации. Однако DCA может также остановить рост раковых клеток, не вызывая апоптоза (цитостатический эффект). Это может привести к долгосрочной стабилизации метастатического рака. Мы представляем случай пероральной терапии DCA, которая привела к уменьшению и стабилизации метастатической меланомы у 32-летнего мужчины в течение более 4 лет, с небольшими побочными эффектами.

Хан А., Эндрюс Д., Шейнхаус Дж., Блэкберн А.К. Долгосрочная стабилизация метастатической меланомы с помощью дихлорацетата натрия.
World J Clin Oncol 2017; 8(4): 371-377

Доступно по адресу: URL: http://www.wjgnet.com/2218-4333/full/v8/i4/371.htm
DOI: http://dx.doi.org/10.5306/wjco.v8.i4.371

ВВЕДЕНИЕ

Дихлорацетат натрия (DCA) привлек внимание медицинского сообщества в 2007 году, когда Боннет и др.  опубликовали первое исследование in vitro и in vivo, иллюстрирующее ценность DCA как метаболической терапии рака посредством его ингибирующего действия на митохондриальный фермент пируватдегидрогеназу киназу. Ранее Стакпул и др. опубликовали несколько исследований DCA для лечения врожденного лактатацидоза при митохондриальных заболеваниях. Эти исследования показали, что пероральный DCA является безопасным препаратом для использования человеком. Было отмечено, что DCA не оказывает почечной, легочной, костномозговой и сердечной токсичности . Большинство побочных эффектов DCA были умеренными, причем наиболее серьезным из них была обратимая периферическая невропатия . Также сообщалось об обратимом делирии. Повышение уровня печеночных ферментов (бессимптомное и обратимое) было отмечено у небольшого процента пациентов. Предшествующие исследования митохондриальных расстройств на людях позволили быстро перевести DCA на использование человеком в качестве не по назначению терапии рака. В настоящее время опубликовано несколько отчетов о клинических испытаниях с использованием DCA в качестве терапии рака, подтверждающих его профиль безопасности и указывающих на растущее признание потенциальной полезности DCA в онкологической клинике . Одним из ограничений этих исследований с участием пациентов на поздней стадии является то, что они сообщали только о лечении в течение коротких периодов времени.

В публикации Бонне 2007 года  было показано, что лечение DCA снижает потенциал митохондриальной мембраны, что селективно способствует апоптозу в раковых клетках человека. Ингибирование аэробного гликолиза (эффект Варбурга) и активация митохондриальных калиевых ионных каналов были идентифицированы как механизмы действия DCA. Дальнейшие исследования DCA in vitro подтвердили противораковую активность против широкого спектра типов рака, которые были недавно рассмотрены Канкотией и Стэкпулом . Кроме того, DCA также способен усиливать апоптоз в сочетании с другими агентами . Также были предложены другие противораковые действия DCA, включая ингибирование ангиогенеза  , изменение экспрессии HIF1-α , изменение регуляторов pH клеток V-АТФазы и MCT1, а также других регуляторов выживания клеток, таких как p53 и PUMA . Однако во многих исследованиях in vitro используются неоправданно высокие концентрации DCA, которые клинически недостижимы, в попытке продемонстрировать цитотоксическую активность.. В других исследованиях использовались более скромные концентрации DCA, что показало, что DCA может быть цитостатическим. Во втором отчете 2010 года о его противораковой активности in vivo было обнаружено, что DCA сам по себе является цитостатическим в метастатической модели рака молочной железы , ингибируя пролиферацию, не вызывая апоптоз. Это предполагает роль DCA как стабилизатора рака, аналогичного ингибиторам ангиогенеза.

В ответ на отчет 2007 года о противораковом действии DCA Хан начал использовать DCA для лечения онкологических больных с коротким прогнозом или тех, кто перестал реагировать на традиционные методы лечения рака. В сотрудничестве с врачом-натуропатом (Эндрюс) был разработан протокол натурального лечения для решения проблемы ограничивающей дозу неврологической токсичности DCA. Он состоял из 3 лекарств: ацетил L-карнитин , R-альфа-липоевая кислота и бенфотиамин для профилактики нейропатии и энцефалопатии. У более чем 300 пациентов с поздней стадией рака наблюдательные данные показали, что терапия DCA принесла пользу в 60% -70% случаев. Риск нейропатии при сочетании натуральных нейропротекторных лекарств с DCA составлял приблизительно 20% при дозировке 20-25 мг/кг в день в течение 2 недель приема/1 недели перерыва (клинические наблюдательные данные опубликованы онлайн на сайте www.medicorcancer.com). Здесь представлен отчет о случае пациента, иллюстрирующий как апоптотический, так и антипролиферативный эффект хронического лечения DCA в течение более четырех лет.

ОТЧЕТ О ДЕЛЕ

32-летний ранее здоровый светлокожий мужчина изначально заметил, что родинка на его левой икре начала меняться в 2006 году. Он обратился к врачу, и родинка была удалена. Был поставлен патологический диагноз меланомы. Была проведена диссекция сторожевого узла, которая оказалась отрицательной на метастатическое заболевание. В 2007 году пациент отметил увеличение левых паховых лимфатических узлов и небольшие меланоцитарные поражения на коже левой ноги. Он прошел лечение интерфероном альфа в рамках клинического испытания в региональной онкологической больнице, что привело к уменьшению узлов и разрешению кожных метастазов. Интерферон был отменен через 9 месяцев из-за побочных эффектов.
Пациент оставался в хорошем состоянии до 2010 года, когда появился новый кожный метастаз левой ноги. Он был хирургически удален. В конце 2011 года был обнаружен еще один новый кожный метастаз на левой ноге в рубце от первоначальной операции по удалению меланомы. Была проведена биопсия, и был подтвержден диагноз рецидивирующей меланомы. Затем ему сделали широкое иссечение и пересадку кожи.
В марте 2012 года у пациента диагностировали рецидив в кожном лоскуте левой ноги. Он был иссечен, и была проведена новая процедура пересадки кожи. Патология выявила положительные края иссеченного метастаза, поэтому была проведена повторная резекция, снова с положительными краями. В то же время игольчатая биопсия левого пахового лимфатического узла подтвердила наличие BRAF-положительной метастатической меланомы. Компьютерная томография (КТ), проведенная в марте 2012 года, не выявила никаких признаков отдаленных метастазов. Самый большой левый паховый узел имел диаметр 8 мм, что было сообщено как «незначительный по критериям размера» (рисунок 1).
В апреле 2012 года пациент обратился к врачу-натуропату (Shainhouse) и начал терапию следующими пероральными натуральными противораковыми средствами: активное гексозо-коррелированное соединение или AHCC (экстракт гриба) , корень одуванчика  , куркумин и корень астрагала  . Также была начата парентеральная терапия, которая состояла из внутривенного витамина С два раза в неделю и подкожного экстракта омелы европейской. Пациент также перешел на веганскую диету.
В мае 2012 года пациент посетил клинику автора (Khan), желая получить дополнительные нетрадиционные методы лечения. Обсуждалась терапия DCA, но пациент решил сначала провести адекватную пробу натуральных противораковых методов лечения (прописанных Shainhouse). В мае 2012 года была проведена повторная КТ (всего через 1 месяц естественной терапии), которая выявила умеренное увеличение множественных паховых и наружных подвздошных узлов размерами от 10 мм × 11 мм до 14 мм × 15 мм.
В июле 2012 года КТ-сканирование было повторено для оценки естественной противораковой терапии пациента. В то время левые паховые и наружные подвздошные узлы снова увеличились и имели размер от 13 мм × 16 мм до 22 мм × 20 мм (рисунок 2). ПЭТ-сканирование также было проведено в рамках подготовки к участию в клиническом исследовании в Бостоне, штат Массачусетс (США), и подтвердило повышенное поглощение глюкозы в левых паховых узлах. Появилась новая слабая (2/10) ноющая боль в левой паховой области. Обследование выявило 20-миллиметровый безболезненный левый паховый лимфатический узел и два небольших кожные метастаза в пределах кожного трансплантата левой голени.

Рисунок 1. Компьютерная томография от марта 2012 г. до естественной терапии и до терапии дихлорацетатом. Самый большой узел имел диаметр 8 мм.Рисунок 2. Компьютерная томография от июля 2012 г. после 3 месяцев только естественной терапии, непосредственно перед началом терапии дихлорацетатом. Самый большой узел имел размеры 22 мм × 20 мм.

Таким образом, у пациента диагностировали прогрессирование заболевания. В этот момент он решил начать терапию DCA. Он начал принимать DCA перорально по 500 мг 3 раза в день, что было эквивалентно 17 мг/кг в день (производитель: Tokyo Chemical Industry, США) в дополнение к поддержанию других натуральных методов лечения. Цикл лечения DCA составлял 2 недели приема и 1 неделю перерыва. Чтобы свести к минимуму возникновение побочных эффектов DCA, были назначены 3 дополнительных натуральных препарата: пероральный ацетил L-карнитин по 500 мг 3 раза в день, пероральный бенфотиамин по 80 мг два раза в день и пероральная R-альфа-липоевая кислота по 150 мг 3 раза в день. Эти добавки принимались ежедневно (без цикла). Были проведены рутинные базовые анализы крови (таблица 1). Все они были в норме, за исключением низкого уровня креатинина, который считался незначительным.
В ноябре 2012 года, через 4 месяца после добавления DCA к его первоначальной естественной противораковой терапии, пациент прошел повторную оценку. Он чувствовал себя в целом хорошо. Было сообщено, что два новых симптома начались только после начала терапии DCA: слегка сниженная чувствительность кончиков пальцев рук и ног и слегка сниженная способность концентрироваться в течение 2 недель, в течение которых он принимал DCA. Легкая потеря чувствительности не ухудшалась и ощущалась как легкая невропатия, связанная с DCA. Сообщалось, что как онемение, так и снижение концентрации прошли в течение недель, когда пациент не принимал DCA. Анализ крови от октября 2012 года не показал существенных изменений (таблица 1). КТ в августе 2012 года и ноябре 2012 года выявили значительную регрессию всех ранее увеличенных лимфатических узлов. Самый большой узел был 10 мм, и не было никаких признаков внутригрудного или внутрибрюшного заболевания, а также никаких метастазов в кости (рисунок 3).
Пациент продолжал чувствовать себя хорошо на терапии DCA и не заметил никаких новых метастазов в коже или нового увеличения паховых узлов. Он продолжал проходить частый клинический мониторинг у своего врача-натуропата (Шейнхаус) и ежегодное последующее наблюдение у своего лечащего врача (Хан). Перечисленные натуральные противораковые терапии (назначенные Шейнхаусом) и терапия DCA продолжались до 2016 года. Результаты анализа крови в июне 2016 года продолжали быть нормальными (таблица 1). КТ была повторена в августе 2016 года, не показав никаких признаков метастатической меланомы, после полных 4 лет непрерывной терапии DCA в сочетании с натуральной противораковой терапией (рисунок 4). К декабрю 2016 года пациент сообщил об увеличении стресса, связанного с работой, и снижении соблюдения режима приема лекарств. В то время он заметил новую паховую массу слева. Была получена ультразвуковая визуализация, которая выявила новый конгломерат увеличенных лимфатических узлов размером 40 мм × 25 мм × 23 мм, с цветным допплером, показывающим кровоток внутри массы. Это было интерпретировано как повторный рост меланомы, примерно после четырех с половиной лет непрерывной терапии DCA. Было проведено дальнейшее обследование, включая ПЭТ/КТ, которое подтвердило рецидив заболевания в 3 левых паховых узлах (SUV max в диапазоне от 13 до 17,8).

Рисунок 3. Компьютерная томография от ноября 2012 г. после 4 месяцев терапии дихлорацетатом. Самый большой узел размером 10 мм.Рисунок 4. Компьютерная томография после 4 лет терапии дихлорацетатом без сопутствующих традиционных методов лечения рака. Сканирование показывает отсутствие повторного роста рака. Все узлы имеют размер менее 10 мм.

Вкратце, пациент получал традиционную терапию рецидивирующей меланомы 3 стадии в течение 6 лет, состоящую из первичной хирургической резекции с лимфодиссекцией, интерферона альфа и хирургической резекции рецидивирующих кожных метастазов 5 раз. Затем пациент получал только естественную противораковую терапию (назначенную Шейнхаусом) в течение 3 месяцев без ответа, о чем свидетельствовало устойчивое прогрессирование заболевания на серийных КТ-сканированиях. Наконец, пациент добавил пероральную терапию DCA к естественной противораковой терапии с 3 сопутствующими нейропротекторными препаратами (липоевая кислота, ацетил L-карнитин и бенфотиамин) и без сопутствующих традиционных методов лечения рака. Результатом стала полная радиологическая ремиссия, продолжавшаяся более 4 лет, за которой последовал рецидив. Во время курса терапии DCA у пациента наблюдались незначительные побочные эффекты, состоящие из легкой невропатии и небольшого снижения концентрации. У пациента сохранялась функция ECOG уровня 0, и он мог работать полный рабочий день.

Таблица 1 Анализ крови до терапии дихлорацетатом натрия

1 Указывает на аномальное значение. DCA: Дихлорацетат; LDH: Лактатдегидрогеназа; GGT: Гамма-глутамилтрансфераза; AST: Аспартатаминотрансфераза; ALT: Аланинаминотрансфераза.

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование перорального DCA у пациента с метастатической меланомой, описанное здесь, демонстрирует уменьшение опухоли и долгосрочную стабильность заболевания в соответствии с клиническим статусом и КТ-визуализацией. Стабильность заболевания сохранялась более 4 лет при приеме DCA в отсутствие какой-либо сопутствующей традиционной терапии, с выживаемостью с момента первоначальной постановки диагноза 10 лет. Согласно статистике рака SEER Национального института рака, выживаемость этого пациента, у которого не было признаков отдаленных метастазов, не является примечательной (62,9% 5-летняя выживаемость при меланоме с распространением на региональные лимфатические узлы, https://seer.cancer.gov/statfacts/html/melan.html). Примечательно то, что в ситуации, когда вовлеченные лимфатические узлы явно увеличивались, добавление пероральной терапии DCA было эффективным для уменьшения увеличивающихся узлов (рисунки 2 и 3) и достижения ремиссии, продолжавшейся более 4 лет. Возможно, что естественные противораковые терапии, которые получал пациент, синергизировались с DCA, но также очевидно, что эти естественные терапии сами по себе не могут объяснить регрессию заболевания. Сообщалось, что DCA оказывает как апоптотический, так и цитостатический эффект, что согласуется с клиническим течением регрессии (апоптотический) и длительной ремиссией (цитостатический) у этого пациента. Рецидив через 4 года совпал с уменьшением соблюдения режима лечения, что предполагает, что этот метод лечения рака с помощью DCA требует постоянного поддержания метаболического давления. Несмотря на рецидив, пациент оставался клинически здоровым и планировал начать прием новых иммунотерапевтических препаратов. Еще предстоит выяснить, сможет ли изменение терапии снова достичь регрессии или стабильности заболевания.
Помимо поддержания ремиссии в течение более 4 лет, этот случай иллюстрирует, что DCA может хорошо переноситься онкологическим пациентом в течение длительного периода времени по сравнению со всеми опубликованными клиническими испытаниями DCA по раку. Примечательно, что этот пациент смог переносить 17 мг/кг в день в режиме 2 недели приема/1 неделя перерыва в течение 4 лет с минимальными побочными эффектами. Это похоже на наш предыдущий отчет о случае хронического использования DCA при раке толстой кишки , где пациент смог переносить 16 мг/кг в день (но не 25 мг/кг в день) в том же режиме, но контрастирует с клиническими испытаниями DCA, которые рекомендуют более низкую дозу 10-12,5 мг/кг в день, вводимую непрерывно. Перерыв в 1 неделю или нейропротекторные добавки могут способствовать способности пациентов в отчетах о случаях переносить более высокую дозу. Генетические полиморфизмы в GSTZ1, ферменте печени, который метаболизирует DCA, также могут способствовать дозе DCA, которая может быть переносима. В испытаниях сообщалось о различных уровнях препарата, но не все из них рассматривали этот фармакогенетический аспект терапии DCA , и необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, является ли это существенным фактором переносимости DCA. На момент написания этой статьи продолжается исследование DCA с множественной миеломой у людей, в котором изучаются как генотипы GSTZ1, так и уровни препарата, чтобы внести свой вклад в наше понимание этих проблем (Реестр клинических испытаний Австралии и Новой Зеландии #ACTRN12615000226505, http://www.anzctr.org.au).
Этот отчет о случае показывает, что хроническая терапия DCA может использоваться без снижения качества жизни по сравнению с традиционными методами лечения меланомы, такими как интерферон. Чтобы определить оптимальный протокол для максимально переносимого острого или хронического лечения с помощью DCA, необходимы испытания на людях. Но что еще важнее, все еще остается выяснить, какая доза требуется для целевых эффектов, которые будут эффективны против рака. Эта информация необходима перед инвестированием в более крупные долгосрочные исследования результатов для пациентов. DCA заслуживает дальнейшего изучения в клинических испытаниях как нетоксичная терапия рака из-за своей скромной стоимости и низкой токсичности, а также заслуживает рассмотрения в качестве терапии рака не по назначению.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентку за ее поддержку и согласие опубликовать ее случай.

КОММЕНТАРИИ 

Характеристика случая
У 32-летнего мужчины на ноге обнаружилось пигментное пятно.

Клинический диагноз
У пациентки диагностирована меланома.

Лабораторный диагноз:
Меланома подтверждена эксцизионной биопсией.

Диагностика с помощью визуализации:
подтверждено наличие увеличенного пахового узла в меланоме (биопсия иглой).

Патологический диагноз:
Меланома, BRAF-положительный.

Лечение
Иссечение первичного очага с пересадкой кожи, иссечение сторожевого узла, множественные иссечение рецидивирующих кожных метастазов. Традиционная терапия прекращена и начаты натуральные противораковые терапии (AHCC, корень одуванчика, куркумин, корень астрагала, внутривенно витамин С, подкожно европейская омела). Прогрессирование через 3 месяца, добавлен дихлорацетат (DCA). Регресс и ремиссия после добавления DCA, продолжающиеся более 4 лет.

Сопутствующие отчеты
Отчеты компьютерной томографии демонстрируют течение заболевания и реакцию на терапию.

Объяснение термина 
DCA: Дихлорацетат натрия; RECIST: Критерии оценки ответа на солидные опухоли; ECOG: Восточная кооперативная онкологическая группа; SEER: Наблюдение, эпидемиология и конечные результаты.

Опыт и уроки
DCA может действовать как проапоптотический и цитостатический препарат и, таким образом, может достигать регрессии, а также долгосрочной стабилизации метастатического рака без серьезных побочных эффектов, как показано на примере этого случая меланомы.

Рецензирование
Доктор Хан описал 32-летнего мужчину, который получал терапию DCA с другими препаратами от натуропатов и поддерживался в состоянии стабилизации (метастатическая меланома) более 4 лет. Это интересный случай.

ССЫЛКИ

1 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED. Ось митохондриального канала K+ подавляется при раке, а ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака. Cancer Cell 2007; 11: 37-51 [PMID: 17222789 DOI: 10.1016/ j.ccr.2006.10.020]
2 Stacpoole PW, Kurtz TL, Han Z, Langaee T. Роль дихлорацетата в лечении генетических митохондриальных заболеваний. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60: 1478-1487 [PMID: 18647626 DOI: 10.1016/ j.addr.2008.02.014]
3 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE, Carney PR, Valenstein E, Theriaque DW, Shuster JJ. Оценка длительного лечения детей с врожденным лактоацидозом дихлорацетатом. Педиатрия 2008; 121: e1223-e1228 [PMID: 18411236 DOI: 10.1542/ peds.2007-2062]
4 Stacpoole PW, Kerr DS, Barnes C, Bunch ST, Carney PR, Fennell EM, Felitsyn NM, Gilmore RL, Greer M, Henderson GN, Hutson AD, Neiberger RE, O'Brien RG, Perkins LA, Quisling RG, Shroads AL, Shuster JJ, Silverstein JH, Theriaque DW, Valenstein E. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактоацидоза у детей. Педиатрия 2006; 117: 1519-1531 [PMID: 16651305 DOI: 10.1542/peds.2005-1226]
5 Berendzen K, Theriaque DW, Shuster J, Stacpoole PW. Терапевтический потенциал дихлорацетата при дефиците пируватдегидрогеназного комплекса. Mitochondrion 2006; 6: 126-135 [PMID: 16725381 DOI: 10.1016/j.mito.2006.04.001]
6 Kaufmann P, Engelstad K, Wei Y, Jhung S, Sano MC, Shungu DC, Millar WS, Hong X, Gooch CL, Mao X, Pascual JM, Hirano M, Stacpoole PW, DiMauro S, De Vivo DC. Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование. Neurology 2006; 66: 324-330 [PMID: 16476929 DOI: 10.1212/01. wnl.0000196641.05913.27]
7 Brandsma D, Dorlo TP, Haanen JH, Beijnen JH, Boogerd W. Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом. J Neurol 2010; 257: 2099-2100 [PMID: 20632025 DOI: 10.1007/ s00415-010-5654-9]
8 Микелакис Э.Д., Сутендра Г., Дромпарис П., Вебстер Л., Хароми А., Нивен Э., Магуайр К., Гаммер Т.Л., Макки Дж.Р., Фултон Д., Абдулкарим Б., Макмертри М.С., Петрук К.С. Метаболическая модуляция глиобластомы дихлорацетатом. Sci Transl Med 2010; 2: 31ra34 [PMID: 20463368 DOI: 10.1126/scitranslmed.3000677]
9 Данбар EM, Коутс BS, Шроудс AL, Лангаи T, Лью A, Фордер JR, Шустер JJ, Вагнер DA, Стэкпул PW. Фаза 1 испытания дихлорацетата (DCA) у взрослых с рецидивирующими злокачественными опухолями мозга. Invest New Drugs2014; 32: 452-464 [PMID: 24297161 DOI: 10.1007/ s10637-013-0047-4]
10Garon EB, Christofk HR, Hosmer W, Britten CD, Bahng A, Crabtree MJ, Hong CS, Kamranpour N, Pitts S, Kabbinavar F, Patel C, von Euw E, Black A, Michelakis ED, Dubinett SM, Slamon DJ. Дихлорацетат следует рассматривать с химиотерапией на основе платины при гипоксических опухолях, а не как единственный агент при распространенном немелкоклеточном раке легких. J Cancer Res Clin Oncol 2014; 140: 443-452 [PMID: 24442098 DOI: 10.1007/s00432-014-1583-9]
11 Chu QS, Sangha R, Spratlin J, Vos LJ, Mackey JR, McEwan AJ, Venner P, Michelakis ED. Открытое исследование фазы I с однокомпонентным методом и повышением дозы дихлорацетата (DCA) у пациентов с запущенными солидными опухолями. Invest New Drugs 2015; 33: 603-610 [PMID: 25762000 DOI: 10.1007/s10637-015-0221-y]
12 Канкотия С., Стэкпул П. У. Дихлорацетат и рак: новый дом для орфанного препарата? Biochim Biophys Acta 2014; 1846: 617-629 [PMID: 25157892 DOI: 10.1016/j.bbcan.2014.08.005]
13 Сан Р. К., Борд П. Г., Блэкберн А. К. Нацеливание метаболизма с помощью триоксида мышьяка и дихлорацетата в клетках рака молочной железы. Mol Cancer 2011; 10: 142 [PMID: 22093145 DOI: 10.1186/1476-4598-10-142]
14 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, Phillips LR, Hollingshead MG, Newton DL. Дихлорацетат натрия селективно воздействует на клетки с дефектами в митохондриальной ЭТЦ. Int J Cancer 2010; 127: 2510-2519 [PMID: 20533281 DOI: 10.1002/ijc.25499]
15 Gang BP, Dilda PJ, Hogg PJ, Blackburn AC. Нацеливание на два аспекта метаболизма при лечении рака молочной железы. Cancer Biol Ther 2014; 15: 1533-1541 [PMID: 25482950 DOI: 10.4161/15384047.2014.955992]
16 Sutendra G, Dromparis P, Kinnaird A, Stenson TH, Haromy A, Parker JM, McMurtry MS, Michelakis ED. Активация митохондрий путем ингибирования PDKII подавляет сигнализацию HIF1a и ангиогенез при раке. Oncogene 2013; 32: 1638-1650 [PMID: 22614004 DOI: 10.1038/onc.2012.198]
17 Cairns RA, Bennewith KL, Graves EE, Giaccia AJ, Chang DT, Denko NC. Фармакологически повышенная гипоксия опухоли может быть измерена с помощью позитронно-эмиссионной томографии с 18F-фторазомицин арабинозидом и усиливает реакцию опухоли на гипоксический цитотоксин PR-104. Clin Cancer Res 2009; 15: 7170-7174 [PMID: 19920111 DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-09-1676]
18 Anderson KM, Jajeh J, Guinan P, Rubenstein M. In vitro эффекты дихлорацетата и CO2 на гипоксические клетки HeLa. Anticancer Res 2009; 29: 4579-4588 [PMID: 20032407]
19 Sun RC, Fadia M, Dahlstrom JE, Parish CR, Board PG, Blackburn AC. Изменение гликолитического фенотипа дихлорацетатом подавляет рост метастатических клеток рака молочной железы in vitro и in vivo. Breast Cancer Res Treat 2010; 120: 253-260 [PMID: 19543830 DOI: 10.1007/ s10549-009-0435-9]
20De Grandis D. Ацетил-L-карнитин для лечения периферической нейропатии, вызванной химиотерапией: краткий обзор. CNS Drugs 2007; 21 Suppl 1: 39-43; обсуждение 45-46 [PMID: 17696592]
21 Maestri A, De Pasquale Ceratti A, Cundari S, Zanna C, Cortesi E, Crinò L. Пилотное исследование эффекта ацетил-L-карнитина при периферической нейропатии, вызванной паклитакселом и цисплатином. Tumori 2005; 91: 135-138 [PMID: 15948540]
22 Evans JD, Jacobs TF, Evans EW. Роль ацетил-L-карнитина в лечении диабетической периферической нейропатии. Ann Pharmacother 2008; 42: 1686-1691 [PMID: 18940920 DOI: 10.1345/aph.1L201]
23 Mijnhout GS, Kollen BJ, Alkhalaf A, Kleefstra N, Bilo HJ. Альфа-липоевая кислота при симптоматической периферической нейропатии у пациентов с диабетом: метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. Int J Endocrinol 2012; 2012: 456279 [PMID: 22331979 DOI: 10.1155/2012/456279]
24 Liu F, Zhang Y, Yang M, Liu B, Shen YD, Jia WP, Xiang KS. [Лечебный эффект альфа-липоевой кислоты на периферическую нейропатию при диабете 2 типа: клиническое исследование]. Zhonghua Yixue Zazhi 2007; 87: 2706-2709 [PMID: 18167250]
25 Ziegler D, Hanefeld M, Ruhnau KJ, Meissner HP, Lobisch M, Schütte K, Gries FA. Лечение симптоматической диабетической периферической нейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой. 3-недельное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN). Diabetologia 1995; 38: 1425-1433 [PMID: 8786016]
26 Winkler G, Kempler P. [Патомеханизм диабетической нейропатии: предпосылки патогенез-ориентированной терапии]. Orv Hetil 2010; 151: 971-981 [PMID: 20519180 DOI: 10.1556/OH.2010.28898]
27 Ang CD, Alviar MJ, Dans AL, Bautista-Velez GG, Villaruz-Sulit MV, Tan JJ, Co HU, Bautista MR, Roxas AA. Витамин B для лечения периферической нейропатии. Cochrane Database Syst Rev 2008; (3): CD004573 [PMID: 18646107 DOI: 10.1002/14651858.CD004573. pub3]
28 Winkler G, Pál B, Nagybéganyi E, Ory I, Porochnavec M, Kempler P. Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии. Arzneimittelforschung 1999; 49: 220-224 [PMID: 10219465 DOI: 10.1055/s-0031-1300405]
29 Ignacio RM, Kim CS, Kim YD, Lee HM, Qi XF, Kim SK. Терапевтический эффект активного гексозо-коррелированного соединения (AHCC) в сочетании с CpG-ODN (олигодезоксинуклеотидом) в мышиной модели меланомы B16. Cytokine 2015; 76: 131-137 [PMID: 26082022 DOI: 10.1016/j.cyto.2015.06.002]
30 Chatterjee SJ, Ovadje P, Mousa M, Hamm C, Pandey S. Эффективность экстракта корня одуванчика в индукции апоптоза в клетках меланомы человека, устойчивых к лекарственным препаратам. Evid Based Complement Alternat Med 2011; 2011: 129045 [PMID: 21234313 DOI: 10.1155/2011/129045]
31Mirzaei H, Naseri G, Rezaee R, Mohammadi M, Banikazemi Z, Mirzaei HR, Salehi H, Peyvandi M, Pawelek JM, Sahebkar A. Куркумин: новый кандидат для терапии меланомы? Int J Cancer 2016; 139: 1683-1695 [PMID: 27280688 DOI: 10.1002/ijc.30224]
32 Huang XY, Zhang SZ, Wang WX. Повышение противоопухолевой эффективности при комбинированном применении астрагала и птеростильбена при меланоме. Asian Pac J Cancer Prev 2014; 15: 1163-1169 [PMID: 24606435]
33 Wagner SC, Markosian B, Ajili N, Dolan BR, Kim AJ, Alexandrescu DT, Dasanu CA, Minev B, Koropatnick J, Marincola FM, Riordan NH. Внутривенная аскорбиновая кислота как адъювант иммунотерапии интерлейкином-2. J Transl Med 2014; 12: 127 [PMID: 24884532 DOI:10.1186/1479-5876-12-127]
34 Horneber MA, Bueschel G, Huber R, Linde K, Rostock M. Терапия омелой в онкологии. Cochrane Database Syst Rev 2008; (2): CD003297 [PMID: 18425885 DOI: 10.1002/14651858.CD003297.pub2]
35 Delaney LM, Ho N, Morrison J, Farias NR, Mosser DD, Coomber BL. Дихлорацетат влияет на пролиферацию, но не на выживаемость клеток колоректального рака человека. Apoptosis 2015; 20: 63-74 [PMID: 25344893 DOI: 10.1007/s10495-014-1046-4]
36 Abildgaard C, Dahl C, Basse AL, Ma T, Guldberg P. Биоэнергетическая модуляция с помощью дихлорацетата снижает рост клеток меланомы и усиливает их ответ на ингибирование BRAFV600E. J Transl Med 2014; 12: 247 [PMID: 25182332 DOI: 10.1186/s12967-014-0247-5]
37 Хан А., Эндрюс Д., Блэкберн А. С. Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии дихлорацетатом натрия. World J Clin Cases 2016; 4: 336-343 [PMID: 27803917]
38 Ценг Х. Ф., Блэкберн А. С., Борд П. Г., Андерс М. В. Полиморфизм и зависящая от вида инактивация дзета-глутатионтрансферазы дихлорацетатом. Chem Res Toxicol 2000; 13: 231-236 [PMID: 10775321]