Тэг: Дихлорацетат

Гликолитический фенотип опухоли (эффект Варбурга): метаболические особенности и подходы к терапии
Введение

Современная онкология рассматривает опухоль не только как генетическое нарушение, но и как метаболическую систему с изменённым типом энергетического обмена. Одним из наиболее изученных и характерных вариантов является гликолитический фенотип, известный также как эффект Варбурга. Этот феномен был описан ещё в 1920-х годах немецким биохимиком Отто Варбургом, который впервые обратил внимание на то, что злокачественные клетки активно расщепляют глюкозу до лактата, даже при наличии достаточного количества кислорода.

Такой тип обмена энергии называется аэробным гликолизом, и именно он лежит в основе повышенной выживаемости, агрессивности и устойчивости опухолевых клеток.

Метаболические особенности гликолитического фенотипа

Опухоли с гликолитическим фенотипом отличаются рядом ключевых характеристик:

Аэробный гликолиз — глюкоза превращается в лактат даже в присутствии кислорода, что позволяет клетке получать энергию быстро, хотя и менее эффективно по количеству вырабатываемого АТФ.

Повышенная экспрессия LDHA (лактатдегидрогеназы-А) — фермента, который катализирует превращение пирувата в лактат, обеспечивая поддержание гликолитического потока.

Активность пируват-дегидрогеназной киназы (PDK) — фермента, который ингибирует пируват-дегидрогеназу и блокирует превращение пирувата в ацетил-КоА, препятствуя входу углерода в цикл Кребса.

Высокий уровень лактата и ацидоз микроокружения — результат накопления молочной кислоты, что создаёт условия для инвазии и подавления иммунного ответа.

Гиперактивация сигнальных путей HIF-1α, PI3K/AKT/mTOR и MYC — факторов, стимулирующих гликолитическую активность.

В результате клетка переходит на «быстрый» способ получения энергии, что обеспечивает ей преимущество при гипоксии, низком питании и стрессовых условиях.

Диагностика гликолитического фенотипа

Диагностировать гликолитический фенотип можно с помощью комплекса лабораторных и инструментальных методов:

Иммуногистохимия (ИГХ) — определение экспрессии ферментов LDHA, PDK, GLUT1, HK2 (гексокиназа 2).

Измерение уровня лактата в опухолевых тканях или крови — отражает активность гликолиза.

ПЭТ-КТ с 18F-ФДГ (фтордезоксиглюкозой) — позволяет визуализировать зоны повышенного поглощения глюкозы, характерные для гликолитических опухолей.

МР-спектроскопия — помогает оценить уровень метаболитов (пируват, лактат, глутамин).

Комбинация этих методов даёт возможность не только подтвердить тип метаболизма опухоли, но и выбрать наиболее рациональную терапевтическую стратегию.

Основные принципы терапии гликолитического фенотипа

Главная задача метаболической терапии при гликолитическом фенотипе — нарушить гликолитический поток, создать окислительный стресс и снизить адаптацию опухоли к гипоксии.

Такой подход включает несколько взаимосвязанных направлений:

Блокировка гликолиза — уменьшение потребления глюкозы и выработки лактата.

Активация митохондриального дыхания — переключение клеточного метаболизма с гликолиза на окислительное фосфорилирование.

Создание прооксидантного стресса — усиление образования активных форм кислорода (АФК) для индукции апоптоза.

Нормализация микроокружения опухоли — снижение ацидоза и подавление ангиогенеза.

Таким образом, лечение направлено не на прямое уничтожение клетки, а на изменение её энергетической логики, что делает опухоль более уязвимой к химиотерапии и лучевому воздействию.

Препараты с доказанной эффективностью
1. 2-дезоксиглюкоза (2-DG)

2-DG — структурный аналог глюкозы, который проникает в клетку через транспортеры GLUT1 и фосфорилируется гексокиназой, но не может быть далее утилизирован. Это приводит к блокаде гликолиза и энергетическому дефициту.

Механизм действия:

конкурентное ингибирование гексокиназы;

подавление синтеза АТФ;

усиление чувствительности опухоли к облучению и химиотерапии.

Результаты исследований:
2-DG показал эффективность в экспериментальных моделях глиобластомы, карциномы лёгких, молочной железы и сарком. В клинических испытаниях комбинированное применение с доксорубицином и лучевой терапией приводило к снижению объёма опухоли и задержке её роста.

2. Метформин

Метформин — противодиабетический препарат, который проявил мощные антипролиферативные и метаболические свойства.

Механизм действия:

ингибирование комплекса I дыхательной цепи митохондрий;

активация AMPK (фермента энергетического контроля клетки);

снижение продукции АТФ и торможение гликолиза через ингибирование mTOR.

Эффекты в онкологии:

уменьшение роста опухоли;

усиление действия химиопрепаратов;

снижение риска рецидивов при раке молочной железы, простаты и яичников.

3. Дихлорацетат натрия (DCA)

DCA — один из ключевых препаратов метаболической терапии. Он воздействует на фермент пируват-дегидрогеназную киназу (PDK), которая блокирует превращение пирувата в ацетил-КоА.

Механизм действия:

ингибирование PDK1;

активация пируват-дегидрогеназы (PDH);

восстановление потока углерода в митохондрии;

снижение лактата и ацидоза.

Результаты:
DCA восстанавливает митохондриальные функции и стимулирует апоптоз. В ряде клинических наблюдений отмечено замедление роста опухоли при глиомах, карциномах лёгких и молочной железы.

Препараты со средней доказанностью
1. Амигдалин

Амигдалин — природный цианогенный гликозид, содержащийся в косточках абрикоса. В ряде стран используется в составе метаболической терапии, включая внутривенные формы.

Механизм действия:

высвобождение цианидных радикалов под действием β-глюкозидаз, присутствующих в опухолевых тканях;

усиление окислительного стресса и повреждение мембран раковых клеток;

синергия с аскорбатом и DCA.

Амигдалин рассматривается как средство, усиливающее прооксидантное направление метаболической терапии, особенно при гликолитическом фенотипе, где высокий уровень лактата сопровождается снижением антиоксидантной защиты.

2. Оксамат

Оксамат — структурный аналог пирувата и конкурентный ингибитор лактатдегидрогеназы-А (LDHA).

Механизм действия:

блокада превращения пирувата в лактат;

уменьшение выработки молочной кислоты;

снижение внутриклеточного NADH/NAD+ соотношения, что препятствует продолжению гликолиза.

Терапевтическое значение:
Применение оксамата в экспериментальных моделях рака молочной железы, лёгких и печени приводило к уменьшению уровня лактата и повышению чувствительности опухоли к дихлорацетату.

Перспективы комбинированных подходов

Гликолитический фенотип требует многоуровневого терапевтического подхода, поскольку гликолиз — не изолированный процесс, а часть сложной сети взаимодействий между митохондриальным дыханием, аминокислотным и липидным обменом.

Перспективными считаются комбинации:

DCA + метформин — одновременное восстановление митохондриального дыхания и подавление синтеза АТФ;

2-DG + аскорбат или амигдалин — усиление прооксидантного стресса;

Оксамат + DCA — блокада LDHA и активация PDH.

Такой подход позволяет атаковать опухоль сразу по нескольким метаболическим осям, снижая риск адаптации.
2-Дезоксиглюкоза (2-DG) — это структурный аналог глюкозы, который проникает в опухолевые клетки через транспортеры GLUT1 и фосфорилируется гексокиназой, но не может далее участвовать в гликолизе. В результате происходит энергетический дефицит, накопление неутилизируемых метаболитов и блокада синтеза АТФ. Применение 2-DG особенно эффективно при гликолитическом фенотипе опухоли (эффект Варбурга), где клетки зависят от быстрого гликолитического потока. В сочетании с оксаматом (ингибитором лактатдегидрогеназы-А) препарат усиливает торможение образования лактата и снижает уровень ацидоза в опухолевом микроокружении. Комбинация с дихлорацетатом натрия (DCA) обеспечивает двойное воздействие: 2-DG подавляет гликолиз на раннем этапе, а DCA восстанавливает активность пируват-дегидрогеназы и активирует митохондриальное дыхание. Такое сочетание позволяет эффективно подавлять энергетические пути опухоли, снижая выработку лактата.

Заключение

Гликолитический фенотип опухоли — это не просто метаболическая особенность, а фундаментальный механизм её выживания. Воздействие на этот фенотип с помощью метаболических препаратов открывает реальную возможность контролировать рост опухоли, уменьшать метастатическую активность и повышать эффективность классических методов лечения.

Наиболее перспективными средствами остаются дихлорацетат, метформин и 2-дезоксиглюкоза, дополняемые препаратами со средней доказанностью — амигдалином и оксаматом. Все они направлены на одну цель: лишить опухоль её главного источника энергии — гликолиза.

Метаболическая терапия в контексте эффекта Варбурга становится важным направлением современной онкологии, где энергия опухоли превращается в её слабое место.

Примеры статей с данными по сочетаниям и отдельным препаратам

1. “Dichloroacetate and metformin synergistically suppress the growth and enhance the apoptosis of ovarian cancer cells”

   • Авторы исследовали SKOV3 и OVCAR3 клетки (яичниковый рак). PMC

   • Они показали, что сочетание 40 мМ DCA + 10 мМ метформин снижает жизнеспособность клеток сильнее, чем любой препарат сам по себе. PMC

   • В in vivo модели (ксенотрансплантаты в иммунодефицитных мышах) сочетание DCA + метформин значимо подавляло рост опухолей по сравнению с контролем или одиночным применением. PMC

2. “Metformin and sodium dichloroacetate effects on proliferation …” / PLOS ONE

   • В этой работе рассмотрено воздействие DCA и метформина по отдельности и в комбинации на человеческие опухолевые и фибробластные культуры. PMC+1

   • Сочетание (например, 3 мМ DCA + 1–5 мМ метформин) приводило к более выраженному снижению клеточной пролиферации и метаболической активности, чем каждый препарат отдельно. PMC

   • Анализ «Bliss» показал позитивные значения (то есть синергия) для многих сочетаний в исследованных линиях. PMC+1

3. “Metformin and Dichloroacetate Suppress Proliferation of Liver Cancer Cells”

   • Исследование in vitro и in vivo на клетках гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2, PLC/PRF5) и модели мышей. PubMed+1

   • Они применяли 10 мМ метформин + 8 мМ DCA для оценок. Сочетание подавляло выработку лактата и внутриклеточные уровни АТФ сильнее, чем каждый компонент по отдельности. MDPI+1

   • Индекс комбинации (CI) получился ~0,63 и 0,58 для двух линий (HepG2 и PLC/PRF5), что указывает на синергию (CI < 1). MDPI

   • В животной модели сочетание значимо подавляло рост опухолей без токсичности к нормальным гепатоцитам. MDPI

4. “Inhibition of LDH-A by oxamate induces G2/M arrest, apoptosis … non-small cell lung cancer cells”

   • Исследование, в котором оксамат (ингибитор LDHA) вызывал арест клеточного цикла, апоптоз и усиливал чувствительность клетки к цисплатину. spandidos-publications.com

   • Это подтверждает, что оксамат имеет антипрофилеративный эффект при гликолитическом фенотипе. spandidos-publications.com

5. “Lactate Dehydrogenase Inhibition With Oxamate Exerts Anticancer Effects”

   • В данном исследовании использовали панель ингибиторов гликолиза: 2-ДГ, DCA, 3-бромопируват и натриевый оксамат (OXA). PMC+1

   • В клетках костных тканей (osteoprogenitors) оценивали токсичность и сдвиг биоэнергетики (уменьшение гликолиза, увеличение окислительного фосфорилирования). PMC

   • Упоминается, что оксамат (OXA) в исследуемых концентрациях не проявлял существенной токсичности в сравнении с другими ингибиторами. PMC

6. “Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics” (обзор)

   • Обзор, описывающий использование 2-DG, а также сочетания 2-DG с таргетной терапией (например, trastuzumab) для усиления эффекта через ингибирование гликолиза. Nature

   • Авторы показывают, что комбинации, включающие 2-DG, могут усиливать чувствительность устойчивых к терапии линий. Nature

7. “Review Oxamate targeting aggressive cancers …”

   • В обзоре рассматриваются данные применения оксамата в агрессивных опухолях (например, глиобластома, клетки U87, T98) с акцентом на блокаду LDHA. ScienceDirect

   • Указывается, что оксамат и 2-DG приводят к снижению лактатного обмена и торможению пролиферации в таких клетках. ScienceDirect

8. “Positive feedback regulation between glycolysis and histone lactylation”

   • В работе показано, что обработка клеток панкреатической карциномы (линии MIA PaCa-2, AsPC-1) ингибиторами DCA, оксамат и 2-DG существенно снижает миграцию клеток в тестах wound healing и транзитных миграций. molecular-cancer.biomedcentral.com

   • Это демонстрирует, что гликолитические ингибиторы влияют не только на пролиферацию, но и на подвижность клеток. molecular-cancer.biomedcentral.com

     DCA + метформин

     • Dichloroacetate and metformin synergistically suppress the growth and enhance the apoptosis of ovarian cancer cells.
       In vitro (SKOV3/OVCAR3) и in vivo: метформин ослабляет защитную аутофагию, индуцируемую DCA, а DCA уменьшает метформин-индуцированное накопление лактата; итог — синергичное подавление роста и усиление апоптоза. PMC

     • Metformin and Dichloroacetate Suppress Proliferation of Liver Cancer Cells (HCC).
       Механизмы: подавление mTORC1, рост ROS и апоптоз; в ксенографтах комбинирование существенно тормозит опухолевый рост (синергия по CI<1). MDPI+1

     • DCA + метформин в глиоме/ДИПГ и лейкемии (доп. данные).
       Для глиомы/ДИПГ отмечено синергичное повышение оксидативного стресса и остановка пролиферации; для B-CLL — усиление антипролиферативного эффекта в первичных клетках. PMC+1

     • Обзор/кросс-ссылки на разные опухоли.
       Подтверждается синергизм метформина с DCA в ряде моделей (молочная железа, яичник, лёгкое); полезно как «зонтичная» ссылка. Nature

     2-DG + аскорбат (витамин C) / амигдалин

     • Cytotoxic activity of high-dose ascorbic acid is enhanced by 2-DG in glycolytic melanoma cells.
       В меланоме 2-DG усиливает прооксидантную цитотоксичность высокодозного аскорбата, снижая энергетическую компенсацию — больше ROS, меньше выживаемость. PubMed+1

     • Высокодозный аскорбат + метаболические модификаторы (смежные механистические данные).
       Работы по аскорбату показывают усиление эффектов при подавлении систем утилизации H₂O₂/гликолиза — полезно как механистическая опора для стратегий с 2-DG. PMC

     • Амигдалин: современный обзор.
       Сводка по механизмам (β-глюкозидазы, прооксидантный стресс, подходы к доставке) и перспективам — как база для обоснования сочетаний с гликолитическими ингибиторами (клинических данных по паре 2-DG+амигдалин мало, но механистическая логика подтверждается). PMC

     • 2-DG — обзор по комбинированным стратегиям.
       Современный обзор: перечисляет препараты и опухоли, где 2-DG усиливает эффект в комбинациях (в т.ч. с прооксидантами/митохондриальными ингибиторами). PMC

     Оксамат + DCA (LDHA-блокада + активация PDH)

     • Оксамат (ингибитор LDHA) — антипрофилеративные эффекты и сенсибилизация.
       Показаны G2/M-арест, апоптоз и повышение чувствительности (напр., к цисплатину), что логично сочетается с DCA, «проталкивающим» пируват в митохондрии. spandidos-publications.com

     • Обзор по оксамату в агрессивных опухолях (глиобластома и др.).
       Подтверждает снижение LDH-активности, миграции и ростовые эффекты — полезный источник по дозам/моделям для обоснования комбинации с DCA. ScienceDirect

     • Оксамат + DCA: патентные и доклинические данные.
       Комбинированное ингибирование PDK и LDH (в т.ч. через конъюгаты) усиливает противоопухолевый ответ; концептуально подтверждает вашу схему «LDHA-блокада + PDH-активация». Патенты Google

     • Метаболическая гибкость: одновременное ингибирование гликолиза/дыхания.
       Обсуждается усиливающее подавление пролиферации при совместном воздействии на LDH/PDK/ETC; подходит как механизм-ориентированная ссылка под «оксамат + DCA». PMC

Метаболическая терапия рака: мировая практика, мишени и перспективы

Введение

Современная онкология стремительно развивается. За последние два десятилетия внедрение молекулярно-таргетных препаратов, иммунных ингибиторов контрольных точек и персонализированного подбора терапии изменили представления о возможностях лечения злокачественных опухолей. Однако даже самые современные подходы сталкиваются с ограничениями: лекарственная резистентность, токсичность, высокая стоимость.

На этом фоне всё большую известность получает метаболическая терапия рака — направление, которое рассматривает опухоль не только как генетически изменённую ткань, но и как структуру с нарушенным энергетическим обменом. Воздействие на эти особенности открывает новые возможности для замедления прогрессирования болезни и повышения эффективности стандартного лечения.

Почему метаболическая терапия актуальна

Опухолевые клетки обладают метаболическими отличиями от здоровых. Наиболее известное из них — так называемый эффект Варбурга: предпочтение гликолиза как основного источника энергии даже при нормальном поступлении кислорода. Дополнительные особенности включают:

• глутаминовую зависимость — многие опухоли используют глутамин как источник азота и углерода;

• переключение на липидный обмен — некоторые опухоли активно окисляют жирные кислоты;

• повышенное образование активных форм кислорода — опухолевые клетки балансируют на грани прооксидантного стресса;

• сниженную гибкость метаболизма — в отличие от нормальных клеток, опухоль часто «заперта» в одном энергетическом пути.

Эти особенности создают «ахиллесову пяту», на которую можно воздействовать фармакологическими и нутритивными методами.

География применения метаболической терапии

Метаболические подходы активно изучаются и применяются в различных странах:

• Европа — Германия, Австрия и Чехия известны клиническими программами с применением дихлорацетата (DCA), кетогенной диеты, внутривенных высоких доз витамина С и амигдалина для инъекций.

• Северная Америка — в США и Канаде исследуются комбинации метформина, 2-дезоксиглюкозы и кетогенного питания; в онкологических центрах также применяются высокодозные аскорбатные инфузии.

• Южная Америка — в Бразилии и Аргентине используют внутривенный витамин С и амигдалин, а также диетологические программы для контроля уровня глюкозы.

• Азия — Япония, Южная Корея и Китай сосредоточены на растительных метаболических модуляторах (куркумин, ресвератрол, экстракты зелёного чая), а также на митохондриально-направленных препаратах.

Основные направления и их мишени

1. Ингибирование гликолиза

• Препараты: 2-дезоксиглюкоза, дихлорацетат.

• Мишени: ферменты гликолиза, пируват-дегидрогеназная киназа.

• Эффект: снижение потребления глюкозы опухолью, истощение энергетических запасов, повышение чувствительности к радиации и химиотерапии.

2. Влияние на митохондрии и окислительный стресс

• Препараты: метформин, фенформин, высокие дозы аскорбата, амигдалин для внутривенного введения.

• Мишени: дыхательная цепь митохондрий, прооксидантный баланс.

• Эффект: запуск апоптоза, накопление активных форм кислорода, ослабление опухолевых клеток при сохранении жизнеспособности нормальных тканей.

3. Регуляция аминокислотного обмена

• Препараты: ингибиторы глутаминазы (BPTES, CB-839), ограничение глутамина в диете.

• Мишени: зависимость опухоли от глутамина.

• Эффект: блокировка роста глутамин-зависимых опухолей, усиление эффективности иммунотерапии.

4. Модификация липидного метаболизма

• Препараты: этомоксир (ингибитор β-окисления жирных кислот), диетические программы с низким содержанием жиров.

• Мишени: использование жиров в качестве источника энергии.

• Эффект: энергетическое «обеднение» опухолей с липидной зависимостью.

5. Нутритивные стратегии

• Кетогенная диета — перевод организма в состояние кетоза, снижение уровня глюкозы, использование кетоновых тел.

• Ограничение метионина и глутамина — создание неблагоприятных условий для синтеза нуклеотидов и белков опухолевыми клетками.

• Эффект: ослабление роста опухоли при сохранении питания нормальных клеток.

Роль амигдалина

Амигдалин — природный цианогенный гликозид, содержащийся в семенах некоторых растений (например, абрикоса). В ряде стран он применяется в виде внутривенных инъекций как дополнительное средство метаболической терапии.

Предполагаемые механизмы действия включают:

• локальное образование цианидных радикалов в опухолевых тканях, где активны определённые β-глюкозидазы;

• усиление прооксидантного стресса в раковых клетках;

• возможное повышение чувствительности опухоли к классическим видам лечения.

Хотя данные остаются противоречивыми и требуют строгих клинических исследований, амигдалин продолжает использоваться в ряде протоколов как дополнительный метаболический агент.

Перспективы и вызовы

Несмотря на растущий интерес, у метаболической терапии есть свои трудности:

• неравномерность доказательной базы: одни подходы (метформин, кетогенная диета) имеют больше подтверждений, другие (амигдалин, 2-дезоксиглюкоза) требуют дополнительных исследований;

• различия в законодательстве: препараты, разрешённые в одной стране, могут быть под запретом в другой;

• необходимость персонализации: разные опухоли используют разные метаболические пути, поэтому универсального метода не существует;

• вопросы безопасности: избыточное вмешательство в обмен веществ может повлиять и на здоровые клетки.

В то же время возможности огромны. Метаболическая терапия способна усиливать стандартные методы, снижать токсичность лечения, повышать качество жизни пациентов и открывать новые пути для персонализированной медицины.

Заключение

Метаболическая терапия — это не альтернатива классической онкологии, а её дополнение. Она объединяет фармакологию, нутрициологию и молекулярную биологию, создавая условия, в которых опухолевые клетки становятся более уязвимыми.

Применение препаратов вроде дихлорацетата, метформина, высоких доз витамина С, а также амигдалина для внутривенных инъекций демонстрирует, что воздействие на энергетические пути опухоли способно усиливать результаты хирургического, химиотерапевтического и иммунного лечения.

Метаболическая терапия уже сегодня становится важным подспорьем современной онкологии, а в будущем, по мере развития персонализированных подходов, её роль будет только возрастать.

Совместное лечение дихлорацетатом и омепразолом оказываетсинергическоеантипролиферативноедействиена злокачественные опухоли

TATSUAKIISHIGURO1,2,MIYUISHIGURO1,RYUMEIISHIGURO1иSAYURIIWAI1

1Отделениеэкспериментальнойтерапии,KamuiMedicalCo.,Ltd.,Токио 1120002;

2КлиникаХибияУчисайвайчо,Токио1050004,ЯпонияПоступила 14 ноября 2011 г.; принята 28 декабря 2011 г. DOI: 10.3892/ol.2012.552

Аннотация. Сообщалось, что обработка раковых клеток дихлорацетатом (ДХА), одобренным для лечения врожденного молочнокислого ацидоза, обращает эффект Варбурга и подавляет рост опухоли). Кроме того, омепразол (OMP) - хорошо известный агент, усиливающий действие противораковых препаратов. Целью данного исследования было найти клинически используемые препараты, усиливающие действие DCA. Комбинация DCA и OMP проявляла более мощную противоопухолевую активность, чем только DCA, в отношении клеток фибросаркомы HT1080 и рака толстой кишки RKO, при этом препараты не влияли на пролиферацию фибробластов человека WI-38. Ингибирующий эффект DCA в сочетании с OMP был отменен витамином Е и Z- VAD-FMK, поэтому в качестве механизма ингибирования было предложено традиционное каспазозависимое ингибирование клеточного роста через производство супероксида. Комбинация этих препаратов также оказывала действие на клеткифибросаркомыHT1080,инокулированныемышам.ПосколькуOMP и DCA могут применяться перорально и уже несколько лет используются в клинической практике без серьезных побочных эффектов, мы считаем, что эта комбинированная терапия может быть легко применена для лечения злокачественных опухолей.

Введение

Варбург впервые заметил, что даже в присутствии достаточного количества кислорода раковые клетки предпочитают метаболизировать глюкозу и вырабатывать молочную кислоту (1- 4). Сопутствующее увеличение поглощения глюкозы может быть использовано в клинических условиях для выявления большинства солидных злокачественных опухолей с помощью позитронно- эмиссионной томографии с фтордезоксиглюкозой (ФДГ-ПЭТ).Одна из возможных причин того, что раковые опухоли используют этот менее эффективный путь производства аденозинтрифосфата (АТФ) по сравнению с окислительным фосфорилированием

Запись по адресу: Д-р Тацуаки Исигуро, Kamui Medical Co., Ltd., 2-20-13 Koishikawa Bunkyo-ku, Tokyo 1120002, Japan.

E-mail:ti227241@ka3.so-net.ne.jp

Сокращения: DCA - дихлорацетат; PPI - ингибитор протонной помпы;OMP - омепразол; SOD - супероксид; ROS - реактивные видыкислорода.

Ключевыеслова:фибросаркома,рактолстойкишки,дихлорацетат,омепразол

являетсяегопреимуществомдлявыживанияипролиферациив уникальной гипоксической среде опухоли (5). Предпочтение анаэробного дыхания также считается причиной устойчивости раковых клеток к противораковым препаратам, вызывающим апоптоз по митохондриальному пути. Bonnet et al. сообщили, что обработкараковыхклетокдихлорацетатом(ДХА),одобреннымдля лечения врожденного молочнокислого ацидоза, обращает эффект Варбурга и подавляет рост опухоли (3,4,6-8). ДКА увеличивает приток пирувата в митохондрии за счет ингибирования киназы пируватдегидрогеназы и способствует преобладанию окисления глюкозы над гликолизом. В результате DCA снижает выработку молочной кислоты опухолью и повышает внутриклеточный pH. ДКА вызывает апоптоз по двум путям: в митохондриях, где деполяризация и выработка супероксида (SOD) активируют митохондрий-зависимый апоптоз, ина уровне плазмалеммы, где активация/регуляция каналов Kv1.5 снижает (K+)i, активируя каспазы (6). DCA является перспективным противораковым препаратом благодаря удобству перорального применения, низкой стоимости, малому количеству побочных эффектов и большому опыту клинического использования (7,8). Несмотря на то что он представляется перспективным средством для лечения злокачественных опухолей, его действие ограничено в продолжающихся отчетах о клинических испытаниях. Поэтому мы задались целью найти клинически используемые препараты,

усиливающиедействие DCA.

Омепразол (ОМП) является ингибитором протонной помпы (ИПП) и, как известно, усиливает действие противораковых препаратов (9). ОМП ингибирует активность V-АТФазы, а также воздействует на кислотный насос желудка. Сообщалось, что он подавляет пролиферацию опухолевых клеток, возможно, за счет подщелачивания лизосом и пермеабилизации мембран лизосом с последующим образованием реактивных форм кислорода (ROS) (10,11).

Как уже говорилось, считается, что DCA и OMP ингибируют ростопухолевыхклетокчерезобщийпутьпроизводстваROSпутем влияния на внутриклеточный уровень pH. Поскольку эти два препарата используются в клинической практике с незначительными побочными эффектами, мы считаем, что их комбинацияявляетсяперспективным протоколомдлялечения рака.

Материалы иметоды

Химические вещества. DCA и витамин Е (токоферола ацетат) были приобретены у компании Wako Chemical Industries, Ltd. (Токио, Япония). (Токио, Япония). OMP был приобретен у Astra Zeneca Japan (Осака, Япония). Z-VAD-FMK был приобретен у Peptide Institute, Inc. (Осака, Япония).

Культура клеток. Клетки фибросаркомы человека HT1080, клетки фибробластов человека WI-38 и клетки рака толстой кишки RKO высевали и выращивали в модифицированной среде Дульбекко Орла, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и выдерживали в инкубаторе.

при37˚Cи5%CO2.Дляэкспериментовпопролиферацииклетоких высевали в 12-луночные планшеты и инкубировали в тех же условиях. Через 7 дней клетки обрабатывали трипсином-ЭДТА и подсчитывали под микроскопом.

Эксперименты на животных. Клетки HT1080 (5x106) подкожно прививали мышам nude (самки 8w). Препараты добавляли в питьевую воду для достижения суточной дозы, аналогичной той, которая используется в клинических условиях (DCA 50 мг/кг, OMP 2 мг/кг). Размер каждой опухоли измеряли штангенциркулем, а объем опухоли рассчитывали путем умножения трех диаметров.

Результаты

Комбинированное лечение DCA и OMP подавляло пролиферацию клеток. Клетки фибросаркомы человека HT1080 культивировали с возрастающимиконцентрациямиDCAиOMPвтечение7дней,что приводило к дозозависимому ингибированию пролиферации (рис. 1). Как показано на рис. 2А, комбинация DCA и OMP заметно блокировала пролиферацию HT1080.

фибросаркомы, в то время как эта же комбинация не влияла на пролиферацию нормальных клеток фибробластов человека WI-38.

Витамин Е подавлял действие DCA и OMP. Хотя механизм каспазозависимого ингибирования роста клеток под действием OMP вызывает споры (10,11), сообщалось, что DCA и OMP подавляют рост опухолевых клеток за счет выработки СОД (6,10). Чтобы выяснить, действует ли тот же механизм в клетках фибросаркомы HT1080, мы использовали витамин Е в качестве ингибитора СОД. Витамин Е успешно ингибировал действие DCAи OMP, что позволило предположить участие СОД в торможении роста опухолевых клеток (рис. 2В). Пан-каспазный ингибитор Z- VAD-FMK также подавлял действие этих препаратов, поэтому можно предположить, что в этих процессах, по крайней мере частично, задействован каспазозависимый противоопухолевый механизм (рис. 2В). В целом, DCA и OMP подавляют рост клеток фибросаркомы HT1080, возможно, через каспазозависимый путь посредством выработки SOD. В результате при совместном применении препараты могут проявлять синергетический эффект. ЭтотсинергетическийэффектиингибирующийэффектвитаминаЕ также наблюдался в клетках рака толстой кишки RKO (рис. 3).

Мыпровелиэкспериментынаживотных,чтобыизучитьдействие DCA и OMP in vivo. Как показано на рис. 4, противоопухолевый эффект комбинации DCA и OMP также был выше, чем у одного из препаратов.

Обсуждение

Мы показали, что комбинированное лечение DCA и OMP более эффективно, чем лечение одним из препаратов в клетках фибросаркомы человека HT1080 и клетках рака толстой кишки RKO. Комбинированная терапия была также эффективна в экспериментах на животных.

DCAиOMPбезопасноиспользуютсявтечениенесколькихлет, нонеотносятсякпротивораковымпрепаратам.DCAиспользовался для лечения врожденного метаболического ацидоза, а OMP - для лечения кислотозависимых заболеваний, причем оба препарата не вызывали серьезных побочных эффектов (7,8,12,13). Ожидается,что комбинация DCA и OMP позволит снизить необходимую дозу каждого препарата и сопутствующие риски.

Сообщалось, что пероральный прием 20 мг ОМП один раз в день приводит к максимальной концентрации в плазме крови у пациентов

~2,5 мкг/мл (7 мкМ) через 2 часа после приема (14). Доза 120 мг ОМП три раза в день использовалась для лечения синдрома Золлингера-Эллисона, при этом даже при длительном применении наблюдалисьлишьредкиеи слабыепобочныеэффекты(15,16).Эта доза соответствует гипотетической пиковой концентрации in vivo

~15 мкг/мл (42 мкМ). Передозировка до 2400 мг [гипотетическая пиковаяконцентрациявплазме300мкг/мл(840мкМ)]переносится с незначительными побочными эффектами (17). ДКА уже зарекомендовал себя в клинической практике. Значение Cmax DCA у взрослых после 6 месяцев непрерывного лечения (пероральные дозы 25 мг/кг/день) составило 53±18 мкг/мл (0,35±0,12 мМ) (18). Пациенты благополучно переносили хроническое лечение ДКА в максимальной дозе 50 мг/кг/сут (19). Ряд детей с молочнокислым ацидозом получали ДКА в дозе >100 мг/кг в сутки в течение длительного периода времени (8). Исходя из этих данных, мы считаем, что необходимая доза этих двух препаратов является переносимой. Более того, кандидаты в аналоги ДКА, обладающие меньшей токсичностью и лучшим связывающим сродством, были

(20). Таким образом, комбинация DCA и OMP рассматривается как потенциальный вариант терапии злокачественных опухолей и может привести к разработке новой терапевтической стратегии.

Ссылки

1. Warburg O: Ueber den Stoffwechsel der Tumoren, Constable, London,
2. WarburgO: Onthe origin ofcancer cells. Science123: 309-314,
3. Hsu PP и Sabatini DM: Метаболизм раковых клеток: Варбург и нетолько. Cell 134: 703-707, 2008.
4. MichelakisED,WebsterLandMackeyLR:Dichloroacetate(DCA)asapotential metabolic-targeting therapy for cancer. Br J Cancer 99: 989-994,2008.
5. Plas DR и Thompson CB: Клеточный метаболизм в регуляциизапрограммированной клеточной смерти. Trends Endocrinol Metab13: 75-78, 2002.
6. Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C,Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, et al: Amitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and itsnormalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. CancerCell 11: 37-51, 2007.
7. Stacpoole PW: The pharmacology of dichloroacetate. Метаболизм 38:1124-1144,2006.
8. Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE, Carney PR, Valenstein E,Theriaque DW and Shuster JJ: Evaluation of long-term treatment ofchildrenwithcongenitallacticacidosiswithdichloroacetate.Педиатрия121: 1223-1228, 2008.
9. Luciani F, Spada M, Milito AD, Molinari A, Rivoltini L, Montinaro A,Marra M, Lugini L, Logozzi M, Lozupone F, et al: Effect of protonpump inhibitor prereatment on resistance of solid tumors to cytotoxicdrugs. J Natl Cancer Inst 96: 1702-1713, 2004.
10. Milito AD, Iessi E, Logozzi M, Lozupone F, Spada M, Marino ML,Federici C, Perdicchio M, Matarrese P, Lugini L, et al: Proton pumpinhibitors induce apoptosis of human B-cell tumors through a caspase-independent mechanism involving reactive oxygen species. Cancer Res67: 5408-5417, 2007.
11. DeMilitoA,CaneseR,MarinoML,BorghiM,IeroM,VillaA,VenturiG, Lozupone F, Iessi E, Logozzi M, et al: pH-зависимаяпротивоопухолевая активность ингибиторов протонной помпыпротив меланомы человека опосредована ингибированиемкислотности опухоли. Int J Cancer 27: 207-219, 2010.
12. Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, Webster L, Haromy A, NivenE, Maguire C, Gammer TL, Mackey JR, Fulton D, et al: Metabolicmodulation of glioblastoma with dichloroacetate. Sci Trasl Med 2: 31-34,2010.
13. Shi S and Klotz U: Ингибиторы протонной помпы: обновленнаяинформация об их клиническом применении и фармакокинетике.Eur J Clin Pharmacol 64: 935-951, 2008.
14. Katagiri F, Inoue S, Itoh H и Takayema M: Омепразол повышаетуровень соматостатина и мотилина в плазме крови человека. BiolPharm Bull 28: 370-372, 2005.
15. FruchtH,MatonPNиJensenRT:Применениеомепразолаупациентовс синдромом Золлингера-Эллисона. Dig Dis Sci 36: 394-404, 1991.
16. Thomson ABR, Sauve MD, Kassam N и Kamitakahara H:Безопасность длительного применения ингибиторов протоннойпомпы. World J Gastroenterol 16: 2323-2330, 2010.
17. Udelnow A, Kreyes A, Ellinger S, Landfester K, Walther P,Klapperstueck T, Wohlrab J, Henne-Bruns D, Knippschild U and WürlP: Omeprazole inhibits proliferation and modulates autophagy inpancreatic cancer cells. PLoS One 6: e20143, 2011.
18. ShroadsAL,GuoX,DixitV,LiuHP,JamesMOиStacpoolePW:Age-dependent kinetics and metabolism of dichloroacetate: possiblerelevance to toxicity. J Pharmacol Exp Ther 324: 1163-1171, 2008.
19. Stacpoole PW, Henderson GN, Yan Z, Cornett R и James MO:Фармакокинетика,метаболизмитоксикологиядихлорацетата.DrugMetab Rev 30: 499-539, 1998.
20. Subramanian K и Ramaian AS: Разработка менее токсичного аналогадихлорацетата с помощью докинга и дескрипторного анализа.Биоинформация 5: 73-76, 2010.

Дихлорацетат подавляет рост нейробластомы, действуя специфически против злокачественных недифференцированных клеток

Авторы:
Серена Велла¹*, Маттео Конти²*, Роберта Тассо¹, Раньери Канчедда¹,³, Альдо Пагано¹,³

¹ Департамент онкологии, биологии и генетики (DOBiG), Университет Генуи, Генуя, Италия
² Лаборатория клинической фармакологии и токсикологии, Госпиталь Святой Марии делле Крочи, Равенна, Италия
³ Национальный институт онкологических исследований (IST), Генуя, Италия
* S.V. и M.C. внесли равный вклад в работу

Аннотация:

Маленькая, водорастворимая молекула дихлорацетат (DCA) вызывает все больший интерес в онкотерапии, так как продемонстрировала способность ингибировать рост опухолей человека, воздействуя специфически на митохондрии раковых клеток, не нарушая при этом физиологию нормальных клеток. Ранее нейробластома считалась нечувствительной к DCA, поскольку клетки этой опухоли не демонстрируют выраженных митохондриальных аномалий. Однако нейробластома состоит из различных типов клеток, отличающихся по метаболизму, фенотипу и злокачественности. В настоящей работе мы показали, что:

1. DCA оказывает неожиданный противоопухолевый эффект на клетки нейробластомы;
2. этот эффект селективно направлен против высокозлокачественных, недифференцированных клеток, тогда как более дифференцированные, менее злокачественные клетки устойчивы к лечению DCA.

Эти данные указывают на необходимость более глубокого изучения противораковых свойств DCA в отношении нейробластомы с целью возможного клинического применения.

Ключевые слова:

дихлорацетат, нейробластома, митохондрии

Введение (перевод):

DCA — это небольшая молекула/препарат-сирота, которая недавно привлекла внимание благодаря способности ограничивать рост глиобластомы (GBM) в дозах, не вызывающих побочных эффектов. Благодаря хорошей переносимости и низкой стоимости DCA активно изучается как потенциальное средство лечения различных опухолей.

Хотя его эффективность была продемонстрирована для рака лёгкого, груди, предстательной железы, эндометрия и клеточных линий глиобластомы, в клинике она пока подтверждена лишь для GBM. Ввиду механизма действия предполагается, что DCA неэффективен в опухолях с низкой митохондриальной поляризацией, таких как мелкоклеточный рак лёгкого, лимфомы, нейробластома и саркомы.

DCA ингибирует пируватдегидрогеназукиназу (PDK), активируя пируватдегидрогеназу (PDH), и тем самым усиливает окисление глюкозы и снижает гликолиз. Ранее было показано, что эта стимуляция окислительного фосфорилирования избирательно запускает апоптоз в раковых клетках. Несмотря на ранние предположения об устойчивости нейробластомы к DCA, мы обнаружили, что пролиферирующие клетки нейробластомы поддерживают гликолитический фенотип. Мы проверили эффективность DCA в подавлении роста опухолей у мышей NOD-SCID и обнаружили значительное замедление роста опухоли in vivo.

Дихлорацетат подавляет рост нейробластомы, действуя специфически против злокачественных недифференцированных клеток

Авторы:
Серена Велла¹*, Маттео Конти²*, Роберта Тассо¹, Раньери Канчедда¹,³, Альдо Пагано¹,³

¹ Департамент онкологии, биологии и генетики (DOBiG), Университет Генуи, Генуя, Италия
² Лаборатория клинической фармакологии и токсикологии, Госпиталь Святой Марии делле Крочи, Равенна, Италия
³ Национальный институт онкологических исследований (IST), Генуя, Италия
* S.V. и M.C. внесли равный вклад в работу

Аннотация:

Маленькая, водорастворимая молекула дихлорацетат (DCA) вызывает все больший интерес в онкотерапии, так как продемонстрировала способность ингибировать рост опухолей человека, воздействуя специфически на митохондрии раковых клеток, не нарушая при этом физиологию нормальных клеток. Ранее нейробластома считалась нечувствительной к DCA, поскольку клетки этой опухоли не демонстрируют выраженных митохондриальных аномалий. Однако нейробластома состоит из различных типов клеток, отличающихся по метаболизму, фенотипу и злокачественности. В настоящей работе мы показали, что:

1. DCA оказывает неожиданный противоопухолевый эффект на клетки нейробластомы;
2. этот эффект селективно направлен против высокозлокачественных, недифференцированных клеток, тогда как более дифференцированные, менее злокачественные клетки устойчивы к лечению DCA.

Эти данные указывают на необходимость более глубокого изучения противораковых свойств DCA в отношении нейробластомы с целью возможного клинического применения.

Ключевые слова:

дихлорацетат, нейробластома, митохондрии

Введение (перевод):

DCA — это небольшая молекула/препарат-сирота, которая недавно привлекла внимание благодаря способности ограничивать рост глиобластомы (GBM) в дозах, не вызывающих побочных эффектов. Благодаря хорошей переносимости и низкой стоимости DCA активно изучается как потенциальное средство лечения различных опухолей.

Хотя его эффективность была продемонстрирована для рака лёгкого, груди, предстательной железы, эндометрия и клеточных линий глиобластомы, в клинике она пока подтверждена лишь для GBM. Ввиду механизма действия предполагается, что DCA неэффективен в опухолях с низкой митохондриальной поляризацией, таких как мелкоклеточный рак лёгкого, лимфомы, нейробластома и саркомы.

DCA ингибирует пируватдегидрогеназукиназу (PDK), активируя пируватдегидрогеназу (PDH), и тем самым усиливает окисление глюкозы и снижает гликолиз. Ранее было показано, что эта стимуляция окислительного фосфорилирования избирательно запускает апоптоз в раковых клетках. Несмотря на ранние предположения об устойчивости нейробластомы к DCA, мы обнаружили, что пролиферирующие клетки нейробластомы поддерживают гликолитический фенотип. Мы проверили эффективность DCA в подавлении роста опухолей у мышей NOD-SCID и обнаружили значительное замедление роста опухоли in vivo.

Рисунок 1a. Рост опухоли при лечении DCA (в миллиметрах кубических)

• Контрольная группа (вода): непрерывный рост опухоли до ~480 мм³ за 4 недели.
• DCA 2.5 мг/кг: рост замедлен, объем ~330 мм³.
• DCA 25 мг/кг: значительно ингибирует рост — до ~210 мм³.

Это подтверждает дозозависимый эффект подавления роста опухоли.

Рисунок 1c. Масса тела мышей

• В течение 4 недель масса тела в обеих группах оставалась стабильной.
• Легкое повышение в контрольной группе, возможно, связано с увеличением массы опухоли.
• Лечение DCA переносится без значительных побочных эффектов, включая потерю массы тела.

Результаты

DCA эффективен против клеток нейробластомы человека

Чтобы проверить, влияет ли DCA на рост узлов нейробластомы (НБ) так же, как на глиобластому, мы протестировали его способность ограничивать рост опухолевой массы НБ in vivo.

В 37 мышей NOD-SCID были введены клетки SKNBE2 — линия клеток нейробластомы человека с амплификацией гена N-myc и высокой злокачественностью. Когда диаметр опухолей достигал 5 мм, часть животных получала DCA:

• 5 мышей — 2.5 мг/кг,
• 14 мышей — 25 мг/кг,
• 13 — контрольная группа (вода),
• 5 — умерщвлены до начала лечения (группа до лечения).

DCA вводили интрагастрально. Литературные данные указывали, что парентеральное введение менее эффективно для ингибирования роста опухолей.

Разработка пероральной формы DCA и Тиамина

Заголовок:
Development of an Oral Drug Formulation for Dichloroacetate and Thiamine
Авторы: George N. Henderson, Patrick O. Wraicn, Rebecca A. Darr, Stephen H. Curry, Hartmut Derendorf, Thomas G. Baumgarmer, Peter W. Stacpoole
Организации: University of Florida и другие
Журнал: Drug Development and Industrial Pharmacy, 1994

Аннотация (перевод):
Дихлорацетат (DCA) — это исследуемый препарат для лечения ряда метаболических и сердечно-сосудистых нарушений. До сих пор он использовался преимущественно в виде внутривенных краткосрочных схем терапии. Хроническое применение препарата может быть токсичным, частично из-за истощения запасов тиамина в тканях. Мы разработали стабильную жидкую форму натриевой соли DCA и тиамина гидрохлорида, подходящую для хронического перорального применения. Смесь DCA-тиамин представлена в виде приятного на вкус раствора, содержащего глицерин, бензоат натрия и аспартам в фосфатном буфере с pH 3.5. Ускоренное термическое исследование разложения препарата показало срок годности около 5 лет при 4°C и около 156 дней при 25°C. Стабильность также контролировалась в течение 1 года при температуре хранения 4°C.

Исследования стабильности в фосфатных буферах (с аспартамом):

Были приготовлены следующие стандартные растворы:

• 1 М раствор монобазового фосфата (1 л),
• 1% раствор бензоата натрия (100 мл),
• 10% раствор тиамина (10 мл),
• 1% раствор аспартама (100 мл),
• 10% раствор красителя (10 мл).

Были приготовлены пять различных тестовых растворов (A–E) путём смешивания различных компонентов:

• A–E: 2,5 мл фосфатного буфера, 5 мл бензоата натрия, 10 мл глицерина, 5 мл аспартама;
• C–E: 1 мл тиамина;
• B, D и E: 2,5 г DCA;
• E: 100 мкл ароматизатора, 50 мкл красителя.

Затем pH доводили до 3,5 с использованием фосфорной кислоты, а объём – до 50 мл. Раствор E представляет собой финальную пероральную формулу, а растворы A–D – варианты с отсутствием одного или нескольких компонентов.

Четыре пробы по 10 мл каждого раствора (A–E) нагревались при 100, 95, 80 и 60°C. Объёмы по 500 мкл отбирались в различные моменты времени (от 0 до 48 часов) и замораживались при –20°C для последующего анализа методом ВЭЖХ (HPLC). Дополнительные исследования при 25°C и 4°C не показали изменений в концентрациях DCA, тиамина и аспартама в течение 30 дней.

Рисунок 2:

Влияние pH на разложение тиамина при 110°C:

• В отсутствие (A) и
• В присутствии (B) 10% DCA в 0,1 M фосфатном буфере.

Обозначения pH:

• 9.0 (пустой круг),
• 7.4 (закрашенный круг),
• 6.0 (пустой треугольник),
• 5.5 (закрашенный треугольник),
• 5.0 (пустой квадрат),
• 2.5 (закрашенный квадрат).

Устойчивость DCA и тиамина:

DCA оказался стабильным в исследованном диапазоне pH, и добавление тиамина не влияло на его стабильность. Интересно, что на всех уровнях pH разложение тиамина замедлялось в присутствии DCA (см. рисунок 2B). Разложение витамина было заметным только при pH 6 и 9. Из вида графиков (логарифм концентрации против времени) можно заключить, что разложение тиамина подчиняется кинетике первого порядка.

Пероральные формы DCA:

Начальные препараты перорального DCA/тиамина были приготовлены на основе коммерческих сиропов с вишнёвым вкусом и нейтральных сиропов (10% DCA). Предварительные дегустационные тесты показали недостаточное маскирование горько-солёного вкуса формулы DCA/тиамин. Исследования стабильности при повышенных температурах показали, что DCA оставался стабильным. Однако компоненты сиропов мешали анализу тиамина методом ВЭЖХ, после чего было принято решение использовать аспартам как безопасный и сладкий компонент.

Таблица 2:

Значения констант скорости (k) разложения аспартама
в растворе фосфатного буфера и в составе пероральной формулы DCA:

Таблица 3:

Прогнозируемый срок хранения пероральной формы DCA:

Выводы:

На рисунках 3A и 3B представлены графики log k против 1/T (1000/T) для аспартама в буфере и в растворе DCA соответственно. Линейность графиков позволяет с уверенностью оценить сроки хранения, приведённые в таблице 3.

Дополнительные исследования при рекомендуемом условии хранения (4°C в течение 1 года) не выявили признаков разложения компонентов препарата и отсутствия бактериального или грибкового роста. Следовательно, формулу можно хранить в холодильнике как минимум 1 год.

Список литературы (основные источники):

1. Stacpoole P.W. Metabolism, 38, 1124 (1989).
2. Wargovich T.J. et al. Am. J. Cardiol., 61, 65 (1988).
3. Stacpoole P.W. et al. N. Engl. J. Med., 309, 390 (1983).
4. DeVivo D.C. et al. Ann. Neurol., 28, 437 (1990).
5. Stacpoole P.W. et al. N. Engl. J. Med., 298, 526 (1978).
6. Stacpoole P.W. et al. Fund. Appl. Toxicol., 14, 327 (1990).
7. Levhuk J.W. et al. Am. J. Hosp. Pharm., 45, 1311 (1988).
8. Bronson M.H. et al. J. Parenter. Enteral Nutr., 12, 25 (1988).
9. Curry S.H. et al. Clin. Pharmacol. Ther., 37, 89 (1985).
10. Wells P.G. et al. Diabetologia, 19, 109 (1980).
11. Somogyi I.C. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 22 (Suppl), 29 (1976).
12. Hilker D.L. & Clifford A.J. J. Chromatogr., 231, 433 (1982).
13. Gaines S.M. & Bada J.L. J. Chromatogr., 389, 219 (1987).
14. Maeda Y. et al. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 72, 244 (1989).
15. Chu P.I. Pharmacokinetics of sodium dichloroacetate, Ph.D. диссертация, University of Florida, Gainesville, FL (1987).
16. Farrer K.L.H. Biochem. J.

Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии

дихлорацетатом натрия (отчет о клиническом случае)

Акбар Хан 1, Дуглас Эндрюс 1, Аннеке С. Блэкберн 1

• PMID: 27803917

• PMCID: PMC5067498

• DOI: 10.12998/wjcc.v4.i10.336

Аннеке С. Блэкберн, Школа медицинских исследований Джона Кертина, Австралийский национальный университет, Канберра, ACT 2601, Австралия 

Вклад авторов: Хан А. лечил пациента и написал большую часть отчета о случае; Эндрюс Д. лечил пациента, разработал протоколы естественной терапии и был соавтором отчета о случае; Блэкберн А.С. выполнил работу in vitro и in vivo, продемонстрировав эффекты DCA как цитостатического средства, и написал части отчета о случае, посвященные исследованию DCA in vitro и in vivo.

Заявление институционального наблюдательного совета: Неприменимо. 

Заявление об информированном согласии: Пациентка, описанная в данной рукописи, дала согласие на публикацию своего случая анонимно. 

Заявление о конфликте интересов: Один из авторов (Хан) проводит терапию дихлорацетатом для онкологических больных через онкологические центры Medicor Cancer Centres за плату и без получения прибыли. Клиника принадлежит члену семьи этого автора. Другим авторам нечего раскрывать.

Открытый доступ: эта статья является статьей открытого доступа, которая была выбрана внутренним редактором и полностью проверена внешними рецензентами. Она распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), которая позволяет другим распространять, перерабатывать, адаптировать, строить на основе этой работы некоммерческие работы и лицензировать свои производные работы на других условиях, при условии, что оригинальная работа должным образом цитируется и использование является некоммерческим. См.: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Адрес для корреспонденции: Акбар Хан, доктор медицины, медицинский директор, 
Medicor Cancer Centres Inc., 4576 Yonge St., Suite 301, Toronto, 
ON M2N 6N4, Canada. akhan@medicorcancer.com
Телефон: +1-416-2270037
Факс: +1-416-2271915

 Получено:  30 апреля 2016 г.
  Начало рецензирования:  3 мая 2016 г.
  Первое решение:  17 июня 2016 г.
  Исправлено:  23 июля 2016 г.
  Принято:  6 августа 2016 г.
  Статья в печати:  8 августа 2016 г.
  Опубликовано онлайн:  16 октября 2016 г.

Абстрактный

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) исследовался как новая метаболическая терапия для различных видов рака с 2007 года на основе данных Боннета и др. о том, что DCA может вызывать апоптоз клеток рака легких, молочной железы и мозга человека. Ответ на терапию в исследованиях на людях измеряется стандартными критериями оценки ответа для определений солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации.

Однако Блэкберн и др. продемонстрировали, что DCA также может действовать как цитостатический агент in vitro и in vivo, не вызывая апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Представлен случай, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины в течение почти 4 лет без серьезной токсичности. Поскольку естественное течение рака толстой кишки 4 стадии представляет собой неуклонное прогрессирование, приводящее к инвалидности и смерти, этот случай демонстрирует новое применение DCA в качестве цитостатического средства с потенциалом поддержания долгосрочной стабильности рака на поздней стадии.

Ключевые слова: Дихлорацетат; Рак; Толстая кишка; Колоректальный; Цитостатик; Стабилизация; Ингибирование роста; Внутривенный

© Автор(ы) 2016. Опубликовано Baishideng Publishing Group Inc. Все права защищены.

Основной совет: Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) был исследован как новая метаболическая терапия для различных видов рака. Ответ на терапию в исследованиях на людях измеряется стандартными критериями оценки ответа для определений солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации.

Однако DCA может также действовать как цитостатический агент, не вызывая апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Представлен случай, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации опухоли рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины на период почти 4 года без серьезной токсичности.

Хан А., Эндрюс Д., Блэкберн А.К. Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии дихлорацетатом натрия. World J Clin Cases 2016; 4(10): 336-343

Доступно по адресу: URL: http://www.wjgnet.com/2307-8960/full/v4/i10/336.htm  
DOI: http://dx.doi.org/10.12998/wjcc.v4.i10.336

ВВЕДЕНИЕ

Препарат дихлорацетат натрия (DCA) исследовался как новая метаболическая терапия для различных видов рака с 2007 года, когда Боннет и др. [1] опубликовали комбинированное исследование in vitro/in vivo на крысах, демонстрирующее эффективность DCA в лечении рака легких, молочной железы и мозга человека путем ингибирования киназы митохондриальной пируватдегидрогеназы. Stacpoole и др . [2-4] ранее опубликовали несколько исследований с использованием DCA для лечения врожденного лактоацидоза, который состоит из набора наследственных митохондриальных заболеваний [5] .

Эти исследования установили профиль безопасности перорального DCA у людей. Было обнаружено, что DCA является безопасным препаратом, не оказывающим токсического воздействия на сердце, легкие, почки или костный мозг [4] . Наиболее серьезным распространенным побочным эффектом является периферическая невропатия, которая является обратимой [6] . Сообщалось о делирии, который является обратимым после прекращения приема DCA [7] . У небольшого процента пациентов было зарегистрировано бессимптомное и обратимое повышение уровня печеночных ферментов [3] .

Предшествующие работы по врожденному лактатацидозу способствовали быстрому прогрессированию DCA в онкологической клинике. В настоящее время опубликовано четыре отчета о клинических испытаниях рака с использованием DCA, что указывает на растущее признание потенциальной полезности DCA [8-11] . Однако эти испытания, в которых лечили пациентов на поздней стадии, смогли сообщить только о лечении в течение относительно коротких периодов времени.

В первоначальной статье 2007 года Боннета и др . [1] сообщалось, что DCA снижает потенциал митохондриальной мембраны, что приводит к избирательному апоптозу в раковых клетках. Выявленный механизм заключается в ингибировании аэробного гликолиза (эффект Варбурга) и активации митохондриальных калиевых ионных каналов [1] .

Дальнейшие исследования DCA подтвердили противораковую активность при нескольких типах рака, включая рак толстой кишки [12] , предстательной железы [13] , яичников [14] , нейробластому [15] , карциноид легких [16] , шейки матки [17] , эндометрия [18] , холангиокарциному [19] , саркому [20] и Т-клеточную лимфому [21] .

Также были предложены другие противоопухолевые действия DCA. Они включают блокаду ангиогенеза [22] , изменения в экспрессии HIF1-α [23] , изменение регуляторов pH V-АТФазы и MCT1, а также других регуляторов выживания клеток, таких как PUMA, GLUT1, Bcl2 и p53 [24] .

Однако в поисках цитотоксической активности многие отчеты in vitro используют концентрации DCA, которые вряд ли будут достигнуты клинически [25] . В некоторых исследованиях использовались ограниченные концентрации и было обнаружено, что DCA является цитостатическим, а не цитотоксическим, но способным усиливать апоптоз с другими агентами [26-28] .

В отчете об успешном лечении рака молочной железы in vivo с помощью DCA Сан и др . [26] обнаружили, что DCA является цитостатическим средством, ингибирующим пролиферацию без увеличения апоптоза. DCA смог значительно снизить метастатическую нагрузку в легких крыс в высокометастатической модели рака молочной железы in vivo. Это предполагает новую роль DCA как стабилизирующего рак агента, аналогичного антиангиогенной терапии.

Однако, насколько известно авторам, пока не опубликовано никаких данных по человеку, подтверждающих использование DCA для долгосрочного поддержания стабильного заболевания. В результате новаторской публикации Боннета о DCA в начале 2007 года Хан начал клиническое использование DCA для лечения онкологических больных с плохим прогнозом или тех, кто не отреагировал на одобренные методы лечения рака.

Протокол натуральных лекарств был разработан для решения проблемы ограничивающей дозу неврологической токсичности в сотрудничестве с врачом-натуропатом (Эндрюс). Разработанный пероральный режим DCA включал три натуральных лекарства: ацетил L-карнитин [29-31] , R-альфа-липоевую кислоту [32-34] и бенфотиамин [35-37] , для основной цели профилактики невропатии.

Данные наблюдений, собранные у более чем 300 онкологических больных с запущенным заболеванием, показали измеримые преимущества терапии DCA в 60%-70% случаев. Риск нейропатии при включении натуральных нейропротекторов составил примерно 20% при дозировке 20-25 мг/кг в день в течение 2 недель приема/1 неделя перерыва. Обратимое повышение уровня печеночных ферментов было отмечено примерно у 2% в этой группе пациентов (данные клинических наблюдений опубликованы онлайн на www.medicorcancer.com).

Представлен случай пациента, иллюстрирующий цитостатические эффекты перорального лечения DCA, поддерживаемые в течение нескольких лет. У этого пациента был плохой прогноз (медианная выживаемость 9-12 месяцев при колоректальном раке 4 стадии с использованием агрессивной традиционной паллиативной химиотерапии) [38] . Пациента лечил Хан в сотрудничестве с врачом-натуропатом Эндрюсом, который разработал протокол, состоящий из натуральных нейропротекторов.

ОТЧЕТ О ДЕЛЕ

Женщина 57 лет обратилась в клинику автора (Khan) в марте 2012 года в поисках терапии метастатического колоректального рака. Первоначально рак прямой кишки был диагностирован у пациентки в середине 2010 года, когда она обратилась к врачу по поводу нового запора и боли в пояснице. Была предпринята попытка провести колоноскопию, но колоноскоп не удалось провести из-за наличия частично перекрывающей ректальную опухоль. Биопсия подтвердила умеренно дифференцированную колоректальную аденокарциному.

Компьютерная томография (КТ) того времени выявила заболевание 4 стадии с множественными метастазами в печени диаметром до 3 см, возможными мелкими метастазами в легких и кольцевидной карциномой прямой кишки, которую было трудно измерить (края рака было трудно отличить от окружающих тканей при КТ).

Пациенту была проведена петлевая илеостомия для обхода обструкции, а опухоль прямой кишки не была удалена. После операции была проведена химиотерапия, состоящая из 5-фторурацила, иринотекана, лейковорина и бевацизумаба (FOLFIRI + бевацизумаб). Первоначально пациент отреагировал на химиотерапию уменьшением метастазов в печени, уменьшением первичного поражения прямой кишки и уменьшением маркера карциноэмбрионального антигена крови (CEA) с 260,9 нг/мл до химиотерапии до 3,5 нг/мл непосредственно перед началом терапии DCA. Затем реакция на химиотерапию начала выходить на плато. К тому времени, как пациент обратился в клинику автора, химиотерапия вызывала минимальное уменьшение заболевания и по сути просто поддерживала стабильность.

Пациентка ранее была здорова и курила в течение 20 лет. Алкоголь употребляла время от времени. В семейном анамнезе был положительный анамнез рака толстой кишки и рака желудка. Лекарства включали текущую химиотерапию, как описано, клизмы с перекисью водорода, пероральный витамин С, иногда пероральный витамин D, гидроморфон замедленного высвобождения 32 мг два раза в день и гидроморфон короткого действия 2-4 мг перорально по мере необходимости при «прорывной» боли. Аллергий не было.

Функциональное обследование выявило несколько легких язв во рту, связанных с продолжающейся химиотерапией, легкую диарею (ожидаемую при илеостомии) и легкое прерывистое ректальное кровотечение. Была ноющая/жгучая боль в пояснице и крестце интенсивностью до 6 из 10, а также легкая боль в правом плече, усугубленная химиотерапией (по ощущениям, это была отраженная боль, связанная с метастазами в печени).

Поскольку химиотерапия все еще была эффективна, и у пациента не наблюдалось серьезных побочных эффектов, первоначальный подход заключался в поддержке существующей терапии пациента, а не в ее замене. Интегративный план был разработан совместно с врачом-натуропатом (Эндрюс).

План состоял из добавления высокой дозы перорального витамина D в размере 10 000 международных единиц в день, замены перорального витамина C на витамин C 50 г внутривенно (iv) еженедельно и добавления дихлорацетата натрия (DCA) 3000 мг внутривенно (49 мг/кг) еженедельно (производитель: Tokyo Chemical Industry, США). Для снижения риска побочных эффектов DCA были назначены 3 натуральные добавки: альфа-липоевая кислота (рацемическая) 500 мг внутривенно с каждой дозой DCA, пероральная R-альфа-липоевая кислота 150 мг 3 раза в день, пероральный ацетил L-карнитин 500 мг 3 раза в день и пероральный бенфотиамин 80 мг два раза в день.

Инфузии планировались вокруг инфузий химиотерапии (отделенных как минимум на 2 дня от химиотерапии), чтобы избежать любых потенциальных помех или лекарственных взаимодействий. Липоевая кислота не вводилась в дни химиотерапии или в течение 1 дня до или после химиотерапии, поскольку она является мощным антиоксидантом и может снижать эффективность химиотерапии. Интегративная терапия началась в марте 2012 года. Побочных эффектов не было отмечено, поэтому DCA была увеличена до 4000 мг внутривенно (66 мг/кг) в неделю. Единственным побочным эффектом, отмеченным при более высокой дозе DCA, была легкая постинфузионная седация.

Таблица 1 Анализ крови до терапии дихлорацетатом натрия

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

Пероральный метформин был добавлен, чтобы помочь сенсибилизировать рак к химиотерапии, начиная с 500 мг перорально один раз в день с титрованием до 500 мг 3 раза в день [39] . Прегабалин был добавлен, чтобы помочь контролировать невропатическую крестцовую боль (начало с 50 мг в день, титрование до 50 мг 3 раза в день). Побочные эффекты химиотерапии включали тошноту и рвоту (до начала приема метформина), и метформин пропускали в дни, когда пациент чувствовал себя плохо, чтобы предотвратить потенциальную токсичность, если у пациента возникнет обезвоживание.

Были получены стандартные базовые анализы крови, включая полный подсчет клеток, стандартную метаболическую панель, ферменты печени и билирубин (таблица 1). Была доступна базовая КТ, которая была выполнена за 2 месяца до начала интегративной терапии с DCA. 

После 4 месяцев интегративной терапии, как описано, было проведено новое КТ-сканирование (рисунок 1), которое было сообщено как «стабильное и неизмененное», но никаких измерений предоставлено не было. Было отмечено случайное обнаружение желчного камня (также стабильного с предыдущего сканирования). Пациент был расстроен тем, что не было отмечено никакого улучшения, и в отчете КТ не было указано никаких подробных измерений. Была предпринята попытка получить позитронно-эмиссионную томографию, чтобы прояснить живые или некротические опухоли, но государственное финансирование получить не удалось, и пациент отказался платить за сканирование в частном порядке.

После некоторого обсуждения пациент решил продолжить терапию и пройти будущие КТ-сканирования в другой больнице. К сентябрю 2012 года были отмечены усиливающиеся побочные эффекты химиотерапии, включая усталость, тошноту и рвоту. Новое КТ-сканирование показало, что все поражения печени были «либо меньше, либо больше не определялись». Однако наибольшее уменьшение опухоли составило всего 2 мм (маркерное поражение 2,5 см в сегменте печени 4a уменьшилось до 2,3 см). Новых поражений не было выявлено.

Рисунок 1. Абдоминальная компьютерная томография через 4 месяца интегративной терапии дихлорацетатом натрия, 5-фторурацилом и натуральными препаратами.  Показаны три среза с различными измеримыми метастазами печени. A: метастаз печени 23 мм × 33 мм; B: метастаз печени диаметром 15 мм; C: метастаз печени 11,2 мм × 25 мм 
.

Таблица 2 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, январь 2013 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

После обзора КТ пациент решил прекратить всю химиотерапию, а также бевацизумаб и метформин. Введение DCA внутривенно было продолжено, и доза была увеличена до 4500 мг внутривенно в неделю. Тошнота и рвота прекратились. Боль оставалась под контролем.

Новое КТ-сканирование было получено через 3 месяца, которое показало остаточную опухоль прямой кишки со стриктурой и проксимальной фекальной нагрузкой (без изменений), а также «метастазы в печени, без существенных изменений». Пациент сообщил о легком онемении пальцев рук и ног. Было отмечено дальнейшее увеличение бессимптомных повышений печеночных ферментов (таблица 2). Оба эти явления были диагностированы как побочные эффекты DCA. Во время терапии до этого момента CEA показывал легкие колебания, но в целом считался стабильным (рисунок 2).
Терапия DCA была прервана на 3 месяца, чтобы разрешить побочные эффекты DCA.

В это время применялись только натуральные методы лечения (прописанные Эндрюсом). Ацетил L-карнитин, бенфотиамин и альфа-липоевая кислота были продолжены для ускорения восстановления нейропатии DCA. Пероральный куркумин [40] и хонокиол (экстракт магнолии) были добавлены в попытке поддерживать контроль над раком [41] . В период, когда DCA был остановлен, CEA увеличился с 4,1 до 5,1 нг/мл (рисунок 2). Легкая нейропатия DCA разрешилась, и печеночные ферменты начали улучшаться.

К марту 2013 года из-за беспокойства о стоимости инфузионной терапии было решено начать оральную терапию DCA. Новое базовое КТ показало увеличение на 1 мм маркерного поражения сегмента печени 7 и увеличение на 1 мм маркерного аортокавального лимфатического узла, но было сообщено как «стабильный вид толстой кишки» и «стабильные метастазы в печени».

Пероральный DCA был начат в дозе 500 мг (8,2 мг/кг) два раза в день, и нейропротекторные добавки, состоящие из перорального ацетил L-карнитина, бенфотиамина и R-альфа-липоевой кислоты, были продолжены. Добавки давались непрерывно, а DCA давался по циклу 2 недели приема/1 неделя отдыха.

В декабре 2013 года в качестве обезболивающего средства был произведен переход с гидроморфона на метадон по 10 мг 3 раза в день для простоты, улучшения контроля боли и экономии средств.

Пациентка продолжила этот режим с регулярными КТ-сканированиями каждые 3–6 месяцев. Пациентка стала менее приверженной регулярным анализам крови из-за плотного рабочего графика. Она оставалась высокофункциональной (уровень ECOG 1) с легкой хронической нейропатией DCA, которая была контролируемой и не влияла на ее повседневную деятельность.

Была сделана попытка увеличить дозу DCA до 500 мг 3 раза в день, но это привело к значительному бессимптомному повышению уровня печеночных ферментов и усилению невропатии. В результате доза DCA 500 мг два раза в день была возобновлена ​​после кратковременного перерыва в терапии.

Продолжающиеся КТ-сканирования продолжали выявлять стабильное заболевание (рисунок 3), без появления новых очагов. Общий CEA существенно не изменился с начала терапии DCA (CEA 3,5 в начале терапии DCA до CEA 3,7 после почти 4 лет терапии). Общий анализ крови также был благоприятным на отметке 3 года (таблица 3) и после отметки 4 года (таблица 4).

Вкратце, после получения обычной химиотерапии в течение приблизительно 18 месяцев пациентка получала внутривенную терапию DCA с сопутствующей химиотерапией в течение приблизительно 6 месяцев, после чего последовала внутривенная и пероральная терапия DCA без сопутствующей обычной терапии рака в течение почти 4 лет. Во время лечения пероральным DCA у пациентки наблюдалась стабильная болезнь по данным КТ и стабильная болезнь по данным измерения опухолевого маркера CEA. Она также была клинически стабильна без эскалации дозы метадона, сохраняла функцию ECOG уровня 1, стабильную легкую нейропатию DCA, и она смогла успешно вести свой собственный бизнес.

Рисунок 2. График карциноэмбрионального антигена в ходе терапии. РЭА: карциноэмбриональный антиген.Рисунок 3. Абдоминальное компьютерное томографическое сканирование после 3 дополнительных месяцев интегративной терапии (дихлорацетат натрия + 5-фторурацил + натуральные лекарства), за которыми последовали почти 4 года дихлорацетата натрия без какой-либо сопутствующей традиционной терапии рака. Сканирование демонстрирует отсутствие повторного роста рака и отсутствие новых метастазов в печени. Показаны те же срезы, что и на рисунке 1. A: метастаз в печени 11,3 мм × 27,5 мм; B: метастазы не видны; C: метастазы не видны.

Таблица 3 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, май 2015 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

Таблица 4 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, апрель 2016 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.ОБСУЖДЕНИЕ

В данном случае применения DCA-терапии у пациента с раком толстой кишки четвертой стадии по клиническим, биохимическим и рентгенологическим критериям продемонстрирована долгосрочная стабильность заболевания.

Продолжительность стабильности при использовании DCA без другой активной химиотерапии в настоящее время составляет 46 месяцев (почти 4 года), а продолжительность жизни с момента первоначальной диагностики колоректального рака 4 стадии составляет 6 лет.

Согласно обзору статистики рака SEER Национального института рака за 1975-2011 гг., 5-летняя относительная выживаемость женщин с диагнозом рак толстой кишки/прямой кишки IV стадии составила 14,4% (http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/). Хотя нельзя сделать окончательный вывод об эффективности DCA, выживаемость в течение этого периода времени при отсутствии постоянной химиотерапии была бы относительно маловероятной.

Было отмечено, что DCA оказывает цитостатическое, а не цитотоксическое действие на колоректальные и другие раковые клетки, что подтверждает этот клинический вывод [ 23 , 27 , 42-44 ] . На сегодняшний день состояние пациентки остается клинически хорошим, и она продолжает получать терапию DCA.

Помимо поддержания стабильного течения заболевания, этот случай демонстрирует переносимость перорального DCA у онкологического пациента в течение гораздо более длительных периодов времени, чем те, о которых в настоящее время сообщают из опубликованных клинических испытаний у онкологических пациентов. Чу и др. [11] сообщили о 24 пациентах, получавших лечение в течение медианного времени 2 месяца в дозе 6,25 или 12,5 мг/кг два раза в день, на непрерывном пероральном DCA без нейропротекторных добавок.

Они пришли к выводу, что рекомендуемая доза для фазы 2 составляет 6,25 мг/кг два раза в день (12,5 мг/кг в день), при этом необходим тщательный мониторинг невропатии. Данбар и др. [9] рекомендовали 5 мг/кг два раза в день в качестве начальной дозы для большинства пациентов, при этом в их исследовании вводили 4, 8 или 12,5 мг/кг два раза в день непрерывно (медианное время на DCA 34 дня), также без нейропротекторных добавок.

Пациент в этом отчете принимал 500 мг два раза в день, что эквивалентно 8,2 мг/кг два раза в день, 2 недели приема/1 неделя перерыва, но не мог переносить эту дозу три раза в день (всего 25 мг/кг в день). Данбар и др. [9] предполагают, что генотипирование полиморфизмов в GSTZ1, ферменте метаболизма DCA в печени, который инактивируется при продолжающемся использовании DCA [45] , следует учитывать при определении начальной дозы для пациентов.

Однако необходима дальнейшая работа для сбора убедительных данных о генотипах и переносимости дозы. В настоящее время проводится клиническое исследование DCA у пациентов с множественной миеломой, чтобы внести вклад в этот пул данных (Реестр клинических испытаний Австралии и Новой Зеландии #ACTRN12615000226505, http://www.anzctr.org.au).

Необходимы дальнейшие исследования для определения оптимального режима дозировки для максимально переносимого острого или хронического лечения с помощью DCA, а также для определения дозы, необходимой для обеспечения эффективности.

Представленный случай показывает, что DCA имеет большие перспективы в качестве терапии рака. Пациентка получила значительную пользу от своей терапии, с легкими побочными эффектами и без гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичности. Наблюдалась некоторая гепатотоксичность (таблица 2), которая легко купировалась прерыванием терапии DCA с последующей корректировкой дозы.

Сообщалось о легкой обратимой периферической нейротоксичности. Натуральные методы лечения, которые сочетались с DCA (ацетил L-карнитин, альфа-липоевая кислота и бенфотиамин), помогли пациенту уменьшить побочные эффекты, но, как известно, не действуют как методы лечения рака.

На момент написания статьи не проводилось активных клинических испытаний, изучающих использование DCA в качестве цитостатического средства у людей. Поскольку DCA не имеет патента, сбор достаточных средств для поддержки крупномасштабных испытаний на людях является серьезной проблемой. Надеемся, что этот случай, иллюстрирующий преимущества перорального DCA, послужит стимулом для дальнейших клинических исследований.

На основании нашего клинического опыта в сочетании с существующими публикациями можно сделать вывод, что терапия DCA не по назначению является вариантом для пациентов с ограниченными возможностями традиционного лечения, если они понимают и принимают риски и преимущества терапии.

Этот отчет о случае показывает, что даже на поздней стадии заболевания DCA имеет потенциал для продления жизни без ущерба для качества жизни пациента по сравнению с химиотерапией с ее частыми изнурительными побочными эффектами или нарушением физиологических функций. Учитывая его разумную стоимость и умеренную токсичность, DCA заслуживает дальнейшего изучения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентку за ее поддержку и согласие опубликовать ее случай.

КОММЕНТАРИИ 

Характеристика случая
Пациентка 57 лет обратилась с жалобами на запор и боли в пояснице.

Клинический диагноз
У пациента диагностирован рак прямой кишки с частичной обструкцией. 

Лабораторная диагностика.
Повышенный уровень раково-эмбрионального антигена, онкомаркера.

Диагностика с помощью визуализации:
опухоль прямой кишки, обнаруженная при колоноскопии толстой кишки.

Патологический диагноз:
Умеренно дифференцированная колоректальная аденокарцинома. 

Лечение
Петлевая илеостомия с последующей химиотерапией, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, лейковорина и бевацизумаба, затем добавление дихлорацетата натрия (ДХА), затем ДХА без химиотерапии в течение почти 4 лет.

Сопутствующие отчеты
Отчеты компьютерной томографии демонстрируют снижение заболеваемости раком при комбинированной химиотерапии + DCA, а затем стабилизацию заболевания в течение почти 4 лет при DCA и отсутствии химиотерапии.

Объяснение термина 
DCA: Дихлорацетат натрия; RECIST: Критерии оценки ответа на солидные опухоли; ECOG: Восточная кооперативная онкологическая группа; SEER: Наблюдение, эпидемиология и конечные результаты.

Опыт и уроки
DCA не только является проапоптотическим препаратом, но и может действовать как цитостатический агент, и, таким образом, может обеспечить долгосрочную стабилизацию запущенного рака без серьезных побочных эффектов, как показано на примере этого случая рака прямой кишки. 

Рецензируемый
DCA, натриевая соль дихлорацетата, является дешевым химическим соединением, которое показало некоторый явный потенциал в качестве альтернативного лечения рака, которое использовалось в ряде испытаний с людьми, страдающими раком мозга или глиобластомой. Это хорошо написанный отчет о случае, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации опухоли рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины на период более 3 лет, без серьезной токсичности. Этот отчет охватывает то, что он обещает.

Авторы проделали солидную работу по объяснению основ терапии DCA и ее роли в различных типах опухолей. Наряду с добавлением механизмов действия против раковых клеток и терапевтического потенциала DCA, авторы предоставляют хороший ресурс для читателей, которые не знакомы с терапией DCA, но также предоставляют детали.

Влияние дихлорацетата натрия как отдельного препарата, так и в составе комбинированной терапии на рост и метастазирование опухолей легких

оригинал статьи: https://www.academia.edu/65113034/Impact_of_Sodium_Dichloroacetate_Alone_and_in_Combination_Therapies_on_Lung_Tumor_Growth_and_Metastasis?email_work_card=title

Айя Аль-Азави

1, Шахразада Сулейман

1, Холуд Арафат

1, Джавед Ясин 2

, Абдеррахим Неммар 3,4

и Самир Аттуб 1,4,5,*

• Кафедра фармакологии и терапии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных

Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; 201870001@uaeu.ac.ae (AA-A.); sharazadjeffy@uaeu.ac.ae (SS); kholoud.arafat@uaeu.ac.ae (KA)

• Кафедра медицины, Колледж медицины и медицинских наук, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; yasin@uaeu.ac.ae Кафедра
• физиологии, Колледж медицины и медицинских наук, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; anemmar@uaeu.ac.ae Центр
• медицинских наук имени Заида, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские
• Эмираты Национальный институт здравоохранения и медицинских исследований (INSERM), 75013 Париж,

Франция * Адрес для корреспонденции: samir.attoub@uaeu.ac.ae

Комбинированная терапия легких Рост опухоли и метастазы. Int. J. Молекулярные науки 2021, 22, 12553. https:// doi.org/10.3390/ijms222212553

Получено: 24 октября 2021 г.

Принято: 17 ноября 2021 г.

Опубликовано: 21 ноября 2021 г.

Аннотация: Метаболическое перепрограммирование признано важнейшим признаком нового рака. Сообщалось, что дихлорацетат (DCA), ингибитор киназы пируватдегидрогеназы (PDK), обладает противораковыми эффектами, обращая вспять гликолиз, связанный с опухолью. Это исследование было проведено с целью изучения противоракового потенциала DCA при раке легких как отдельно, так и в сочетании с химиотерапией и таргетной терапией с использованием двух клеточных линий немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), а именно A549 и LNM35.

DCA заметно вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности и роста колоний клеток A549 и LNM35 in vitro. DCA также снижал рост опухолевых ксенотрансплантатов как в хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, так и в моделях голых мышей in vivo. Кроме того, DCA снижал ангиогенную способность эндотелиальных клеток пупочной вены человека in vitro. С другой стороны, DCA не ингибировал клеточную миграцию и инвазию in vitro , а также заболеваемость и рост метастазов подмышечных лимфатических узлов in vivo у голых мышей. Лечение DCA не показало никакой токсичности у куриных эмбрионов и голых мышей. Наконец, мы продемонстрировали, что DCA значительно усиливал противораковый эффект цисплатина в LNM35. Кроме того, сочетание DCA с гефитинибом или эрлотинибом приводит к аддитивным эффектам на ингибирование роста колоний LNM35 после семи дней лечения и к синергетическим эффектам на ингибирование роста колоний A549 после 14 дней лечения. В совокупности это исследование демонстрирует, что DCA является безопасным и перспективным терапевтическим средством для лечения рака легких.

Рак легких является вторым по частоте встречаемости видом рака с самым высоким уровнем смертности в мире, составив 2,2 миллиона случаев и 1,8 миллиона смертей в 2020 году. Прогнозируется, что заболеваемость и смертность продолжат расти примерно на 60%, до предполагаемых 3,6 миллиона и 3 миллионов соответственно в 2040 году [1]. Большинство случаев рака легких — это НМРЛ, на которые приходится 80–85% всех случаев рака легких [2]. Развитие таргетной и иммунотерапии произвело революцию в лечении НМРЛ. Однако побочные эффекты, резистентность и эффективность в небольшой терапевтически чувствительной группе пациентов создают неравенство в доступе к таким агентам [3–5]. Таким образом, это подчеркивает необходимость более безопасных и эффективных агентов. Метаболическое перепрограммирование является одним из признаков рака, который является многообещающей целью для разработки эффективных терапевтических подходов [6]. По сравнению с

Нормальные клетки, которые в основном полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) в аэробных условиях, раковые клетки отклоняются от этого нормального метаболического фенотипа, полагаясь в основном на цитозольный гликолиз и молочную ферментацию, даже в присутствии кислорода, чтобы удовлетворить потребности высокой пролиферации [7]. Это явление известно как эффект Варбурга, который использовался в качестве терапевтической мишени для подавления роста опухоли PDK входит в число основных ферментов, контролирующих гликолиз и OXPHOS [9]. Он отключает митохондриальный OXPHOS, фосфорилируя и ингибируя пируватдегидрогеназу (PDH), ключевой фермент, катализирующий окислительное превращение пирувата в ацетилкофермент А в митохондриях [10]. DCA — это препарат с небольшой молекулярной массой, который использовался при лактоацидозе, врожденных митохондриальных дефектах и диабете [11]. Интересно, что DCA продемонстрировал способность переключать метаболизм опухоли с цитозольного аэробного гликолиза на митохондриальный OXPHOS путем ингибирования PDK и повышения активности PDH [12]. Следовательно, сообщалось, что DCA оказывает противораковое действие за счет увеличения оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, а также повышения уровня ROS с последующей гибелью раковых клеток [11,13 15]. Однако в клинических исследованиях профиль безопасности DCA вызывал беспокойство. Тем не менее, Гарон и др. (2014), которые провели клиническое исследование с DCA на пациентах с раком легких, пришли к выводу, что: «в отсутствие более крупного контролируемого исследования четкие выводы относительно связи между неблагоприятными событиями у пациента и DCA неясны». Они рекомендовали рассматривать DCA с химиотерапией на основе платины при гипоксических опухолях, а не как единственный агент при распространенном немелкоклеточном раке легких [16]. Считается, что DCA является мощной молекулой , которая требует дальнейшего изучения ее противоракового потенциала при НМРЛ. Целью данного исследования было изучение влияния DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ, рост колоний, миграцию и инвазию клеток in vitro, а также на рост опухоли, метастазирование и токсичность in vivo. Кроме того, непосредственное влияние DCA на ангиогенез оценивалось in vitro. Кроме того, мы исследовали влияние DCA в комбинированной терапии с химиотерапией и первым поколением ингибиторов тирозинкиназы EGFR (EGFR-TKi). 2. Результаты 2.1 Влияние DCA на жизнеспособность клеток и рост колоний линий клеток НМРЛ Эффект увеличения концентрации DCA (3,125–100 мМ) был исследован на двух линиях клеток NSCLC, а именно A549 и LNM35. Как показано на рисунке 1, DCA снижал жизнеспособность A549 (рисунок 1A) и LNM35 (рисунок 1B) в зависимости от концентрации и времени. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC50) DCA через 48 ч составляет приблизительно 25 мМ для обеих линий клеток. Для дальнейшей оценки противоракового эффекта DCA было исследовано его влияние на рост предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. Для этого обе клеточные линии выращивали при определенной плотности в течение 1 недели для формирования колоний, а затем обрабатывали возрастающей концентрацией DCA в течение 1 недели. Как показано на рисунке 1, DCA вызывал зависимое от концентрации сокращение числа колоний для обеих клеточных линий, с более высокой чувствительностью, показанной в колониях LNM35 (рисунок 1D,E) по сравнению с колониями A549 (рисунок 1C,E). Эти результаты подтверждают противораковый эффект DCA in vitro

Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие A549 (A) и LNM35 (B)

Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие раковые клетки A549 (A) и LNM35

(B) инкубировали в отсутствие или в присутствии увеличивающихся концентраций DCA (3,125–100 мМ) в течение 24, 48 и 72 ч. Жизнеспособность клеток оценивали, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее трех раз. Формы представляют средние значения, столбцы представляют SEM. Раковые клетки A549 (C) и LNM35 (D) выращивали в течение 7 дней для формирования колоний, которые обрабатывали различными концентрациями DCA (6,25–50 мМ) в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». (E) Репрезентативные фотографии контрольных и обработанных DCA колоний показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Результаты представлены в виде процента колоний (среднее значение ± SEM) обработанных клеток по сравнению с контролем. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.

• Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухоли НМРЛ в курином эмбрионе CAM и голых мышах in vivo

Для подтверждения фармакологической значимости наших результатов in vitro противораковый эффект DCA оценивали in vivo с использованием анализа CAM куриного эмбриона.

Ксенотрансплантированные опухоли A549 и LNM35 на CAM обрабатывали 50 мМ DCA каждые 48 ч в течение 1 На E17 опухоли были извлечены из верхней части CAM и взвешены. Как показано на рисунке 2, 50 мМ

DCA значительно снизили рост ксенотрансплантатов опухоли A549 примерно на 40% (рисунок 2A), в то время как не показали значительного снижения роста ксенотрансплантатов опухоли LNM35 (рисунок 2B). Поэтому 100 мМ DCA были исследованы на ксенотрансплантатах опухоли LNM35, и они значительно снизили рост примерно на 40% (рисунок 2C). Токсичность также оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах. На E17 DCA не показал цитотоксичности, поскольку процент живых эмбрионов был схож с контрольной и обработанной DCA (рисунок 2D–F).

Рисунок 2. Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухолей A549 и LNM35 в CAM куриного эмбриона in vivo. (A)

Масса опухоли раковых клеток A549, ксенотрансплантированных на CAM с плотностью 1 миллион клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ) в течение 1 недели. (B, C) Масса опухоли раковых клеток LNM35, ксенотрансплантированных на CAM с плотностью 0,3 миллиона клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ и 100 мМ). (D) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах A549. (E, F) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах LNM35. Столбцы — средние значения; полосы — SEM *** Значительно отличается при <0,001. **** Значительно отличается при <0,0001. ns — незначимо.

Влияние DCA на опухолевые ксенотрансплантаты также оценивалось in vivo с использованием бестимусных мышей, инокулированных клетками A549 и LNM35. Сообщалось, что средние летальные дозы (LD50) DCA составляли 4,5 г/кг и 5,5 г/кг у крыс и мышей соответственно [17]. Поэтому мыши с опухолевыми ксенотрансплантатами A549 получали перорально ежедневно (5 дней в неделю) 50 мг/кг и 200 мг/кг DCA в течение 38 последовательных дней. Лечение DCA (50 мг/кг) не вызвало значительного уменьшения объема опухолевых ксенотрансплантатов A549, в то время как DCA (200 мг/кг) значительно

уменьшил объем примерно на 45% (рисунок 3A). Аналогичная разница наблюдалась также в весе опух Не было выявлено никаких явных признаков токсичности или каких-либо проявлений нежелательного воздействия DCA на поведение животных, массу тела (рисунок 3C), компоненты крови, функцию

печени и почек (рисунок 3D).

Рисунок 3. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата A549, привитого голым мышам in vivo. (A) Объем опухоли ксенотрансплантата A549, привитого подкожно голым мышам и леченного DCA (50 и 200 мг/кг) перорально или только контрольным раствором- носителем в течение 38 дней. (B) Вес опухоли, полученный от тех же контрольных и обработанных DCA голых мышей. (C) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. (D) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции

печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. * Значительно отличается при <0,05.

** Значимое различие при <0,01. ns — несущественно.

С другой стороны, наблюдался рост ксенотрансплантатов опухоли LNM35, и мыши получали перорально 200 мг/кг и 500 мг/кг DCA каждый день (5 дней в неделю) в течение 10 и 24 дней соответственно. Лечение DCA (200 мг/кг) вызвало незначительное уменьшение объема ксенотрансплантатов опухоли LNM35 (рисунок 4A), в то время как DCA (500 мг/кг) значительно уменьшил объем опухоли почти на 75% (рисунок 4B). Почти такие же различия были замечены в весе опухоли в конце экспериментов (рисунок 4C). Никаких признаков токсичности не наблюдалось в поведении животных или не было обнаружено по весу мышей (рисунок 4D,E), компонентам крови, печени и функции почек (рисунок 4F)

Рисунок 4. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата LNM35, привитого голым мышам in vivo. (A, B) Объем опухоли ксенотрансплантата LNM35, привитого подкожно голым мышам и обработанного соответственно DCA (200 и 500 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем ежедневно в течение 10 и 24 дней. (C) Вес опухоли, полученный от контрольных и голых мышей, получавших DCA в дозе 500 мг/кг. (D, E) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. (F) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение

± SEM для 9–11 мышей/группу. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при

<0,001. ns — статистически незначимо.

• Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур и прорастание HUVEC in vitro

Ангиогенез является одним из признаков рака, который обеспечивает поставку питательных веществ и кислорода для роста и распространения раковых клеток. Влияние DCA на ангиогенез было исследовано in vitro с использованием HUVEC, которые могут образовывать капилляроподобные структуры при засевании

на Матригель. Как показано на рисунке 5A, HUVEC образовали организованные капилляроподобные структуры

структуры в отсутствие DCA, и эта организация была нарушена после добавления DCA.

Длины трубок измеряли вручную (рисунок 5B) и с помощью анализа изображений Wimasis (рисунок 5C), и было обнаружено, что 25 мМ DCA способны значительно ингибировать способность HUVEC формировать нитевидные структуры примерно на 30–40%. Это ингибирование наблюдалось при концентрациях

Рисунок 5. Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур HUVEC in vitro. (A) Формы ангиогенеза , индуцированные в HUVEC, культивируемых на матрице Matrigel в 96-луночном планшете в отсутствие и в присутствии различных концентраций DCA. Для контрастной фотографии использовался инвертированный микроскоп (4×) , а для уточнения изображений использовалось программное обеспечение Wimasis. (B,C) Количественная оценка тубулярного ангиогенеза, индуцированного в клетках HUVEC, культивируемых в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–

25 мМ) вручную и с использованием программного обеспечения Wimasis соответственно. (D) Жизнеспособность клеток HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы», в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ). Эксперименты повторяли не менее 3 раз.

Столбцы представляют средние значения; полосы представляют SEM *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.

В анализе прорастания сфероиды HUVECs были встроены в 3D коллагеновую матрицу в присутствии и отсутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или комбинации VEGF и DCA. Рисунок 6A показывает в репрезентативном эксперименте, что проростки, образованные в

присутствии VEGF, были ингибированы DCA, 25 мМ. Были измерены общие длины проростков, и было обнаружено, что общая длина была значительно увеличена в присутствии VEGF, а

DCA значительно уменьшил длину проростков, индуцированных VEGF (Рисунок 6B). Это ингибирование наблюдалось при концентрации, которая не показала никакого снижения жизнеспособности HUVECs (Рисунок 6C).

Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование ангиогенеза в опухолях может быть потенциальным механизмом, выходящим за рамки противоракового действия DCA.

Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков встроенными сфероидами HUVECs in vitro. (A) Представитель Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков встроенными сфероидами HUVECs in vitro. (A) Представительные изображения предварительно окрашенных

сфероидов HUVEC через 24 часа после встраивания в коллагеновую матрицу в присутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или VEGF + DCA. Использовался инвертированный микроскоп с 20-кратным увеличением. (B) Среднее значение общей длины ростков различных сфероидов для каждого условия из одного представительного эксперимента. (C) Жизнеспособность HUVECs определялась, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты были повторены 2 раза. Столбцы представляют средние значения 12 сфероидов; столбцы представляют SEM **** Значительно отличается при <0,0001. #### Значимое отличие при <0,0001. ns: незначимо.

• Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro

Метастазирование — многоступенчатый процесс, включающий отделение клеток от первичной опухоли, миграцию клеток в соседние ткани с последующей инвазией клеток в кровь или лимфатическую систему до колонизации этих клеток в отдаленных органах. Влияние DCA на метастазирование у мышей, которым ксенотрансплантировали клетки рака легких с высокой степенью метастазирования, а именно LNM35, оценивали путем проверки веса и частоты подмышечных лимфатических узлов в контрольной и обработанной DCA группах. DCA снижает рост метастазов в лимфатических узлах, не достигая статистической значимости (рисунок 7A).

Кроме того, он не влияет на частоту метастазов в лимфатических узлах (рисунок 7B).

Для оценки способности DCA инвазировать и миграцию клеток A549 и LNM35 in vitro использовались анализ инвазии в камере Бойдена и анализ миграции при заживлении ран. Чтобы убедиться, что потенциальное влияние DCA на миграцию и инвазию не обусловлено гибелью клеток, мы использовали более низкие концентрации DCA. В этих условиях 6,25 мМ и

12,5 мМ DCA не смогли ингибировать клеточную инвазию LNM35 (рисунок 7C) и A549 (рисунок 7D). Аналогичным образом, эти концентрации не смогли ингибировать клеточную миграцию обеих клеточных линий (рисунок 7E–H).

1. Обсуждение

Несмотря на недавние достижения в скрининге, диагностике и лечении рака легких, в дополнение к замечательному прогрессу в понимании его молекулярной биологии, рак легких является вторым наиболее часто диагностируемым видом рака с самым высоким уровнем смертности во всем мире в 2020 году [1].

Поэтому прилагаются различные усилия для разработки эффективных агентов и подходов с хорошими запасами безопасности для воздействия на рак легких в попытке обеспечить излечение или улучшить общую выживаемость пациента. Целью данного исследования было изучение влияния метаболического препарата DCA на рост, миграцию, инвазию и ангиогенез рака легких in vitro и рост опухоли и метастазы in vivo, а также влияние целевого метаболизма DCA на цитотоксический эффект одобренной химиотерапии и таргетной терапии в качестве шага к достижению лучшей эффективности и лучшего профиля безопасности.

Настоящее исследование показало, что DCA (3,125–100 мМ) вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности клеток и роста предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. IC50 DCA через 48 ч составлял приблизительно 25 мМ в обеих

клеточных линиях. Наши результаты согласуются с другими отчетами, в которых DCA (10–90 мМ) ингибировал

жизнеспособность клеток линий колоректального рака (КРР), а именно, SW620, LS174t, LoVo и HT-29, в зависимости от концентрации через 48 ч с диапазоном IC50 30–50 мМ в зависимости от типа клеточной линии [18]. Аналогичным образом, DCA (20 мМ) значительно снизил жизнеспособность клеток КРР, а именно, SW480, LoVo и HT-29 через 48 ч, с большим эффектом на плохо дифференцированные клетки SW480 и метастатические клетки LoVo по сравнению с хорошо дифференцированными клетками HT-29 [19]. С другой стороны, более высокая IC50 была зарегистрирована в клетках рака шейки матки, клетках Hela и SiHa [20], в то время как DCA (20 мМ) не смог ингибировать жизнеспособность клеток линии клеток рака молочной железы MCF-7 [21].

Наши данные in vitro были подтверждены путем тестирования влияния DCA на прогрессирование опухоли in vivo с использованием моделей CAM куриного эмбриона и бестимусных мышей. Во-первых, мы продемонстрировали, что значительное снижение роста было достигнуто в A549 и LNM35, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона, при использовании доз DCA 50 мМ и 100 мМ соответственно. Во время написания этой рукописи было опубликовано исследование, в котором изучалось

влияние натрия DCA на линии клеток глиобластомы U87 MG и PBT24, ксенотрансплантированных на CAM куриного Авторы сообщили об изменении роста опухолей U87 MG и PBT24 в ответ на различные концентрации натрия DCA. Сообщалось, что 10 мМ натрия DCA были эффективны в снижении роста опухоли PBT24,

но не роста опухоли U87, что отражает некоторые различия в биологии двух клеточных линий [22]. Во-вторых, мы продемонстрировали, что лечение DCA в дозах 200 мг/кг ежедневно (5 дней в неделю) вызвало значительное снижение роста ксенотрансплантированной опухоли A549 на 40%, в то время как для значительного снижения роста ксенотрансплантированной опухоли LNM35 требовалась более высокая доза DCA (500 мг/кг) . В этом контексте ранее сообщалось, что DCA (100 мг/кг) увеличил время удвоения опухолей A549 и H1975 NSCLC примерно с 3 до 6,5 дней [15], но не оказал значительного ингибирующего эффекта на мышей с опухолью MDA-MB-231 [23]. С другой стороны, значительная задержка роста также наблюдалась в ксенотрансплантатах HT-29, обработанных пероральным DCA (200 мг/кг) ежедневно в течение четырех дней [24].

Исследование токсичности потенциальных противораковых препаратов так же важно, как и исследование их эффективности, поскольку тяжелая токсичность может помешать их использованию в клинике. DCA не показал цитотоксичности для куриных эмбрионов и бестимусных мышей. Процент живых эмбрионов был одинаковым в группах, получавших DCA, и контрольных группах. Кроме того, DCA не повлиял на поведение мышей, вес, общий анализ крови, параметры функции печени и почек по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с предыдущими доклиническими и клиническими отчетами, которые не показали никаких доказательств тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности при лечении DCA [13,14]. Немногие пациенты, получавшие лечение DCA, жаловались на общие желудочно-кишечные эффекты. Кроме того, наиболее распространенным ограничением для введения DCA является обратимая периферическая невропатия, которую можно свести

к минимуму путем снижения дозы или дополнительного введения антиоксидантов [11]. Включение DCA в системы доставки лекарств (СДЛ), такие как наночастицы, является перспективным подходом для сохранения противораковой активности DCA с минимальными побочными эффектами [25–27].

Сообщалось, что противораковый эффект DCA частично обусловлен индукцией апоптоза, как это наблюдалось в клетках колоректального рака [19] и клетках НМРЛ [15] , или ингибированием ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза, такие как антитело к VEGF бевацизумаб и блокатор рецепторов VEGF рамуцирумаб, были клинически одобрены для лечения рака легких [28]. Несмотря на их подтвержденную эффективность, их скромные общие терапевтические эффекты с сопутствующими побочными эффектами подчеркивают очевидную необходимость в более эффективном подходе, нацеленном на ангиогенез [28]. Наше исследование показало, что DCA (25 мМ) является перспективным антиангиогенным средством, поскольку он способен значительно ингибировать образование и прорастание эндотелиальных клеток in vitro. Кроме того, более низкие концентрации DCA (6,25 и 12,5 мМ) не влияли на образование трубок HUVEC. Эти результаты согласуются с отчетом Шунджанса и его коллег, которые продемонстрировали, что 5 мМ и 10 мМ DCA не повлияли на формирование трубок HUVEC in vitro [29]. В соответствии с нашими данными, DCA вызвал снижение плотности микрососудов опухоли у обработанных крыс, у которых также было отмечено подавление HIF1α в опухолевых клетках [30]. С другой стороны, Чжао и его коллеги

Недавно сообщалось, что DCA стимулирует ангиогенез в модели сосудистой деменции у крыс за счет улучшения функции эндотелиальных клеток-предшественников [31].

Примерно у 30–40% пациентов с НМРЛ на момент постановки диагноза наблюдалось метастатическое заболевание . Отдаленные метастазы отрицательно влияют на варианты лечения, ответ и выживаемость

[32] и являются основной причиной смерти от рака легких [33]. Метастазирование — это многоступенчатый процесс, включающий отсоединение раковых клеток, миграцию, инвазию и колонизацию в отдаленных участках. Поэтому терапевтические агенты и схемы, уменьшающие такой отличительный признак рака, имеют большое значение в терапии рака. Несмотря на продемонстрированную антиангиогенную активность DCA, это исследование не показало влияния DCA на метастазирование клеток LNM35, ксенотрансплантированных бестимусным мышам, получавшим перорально эффективную дозу. В этом исследовании клетки LNM35, ксенотрансплантированные путем подкожной инокуляции бестимусным мышам, вызвали 90% случаев метастазов в подмышечных лимфатических узлах, и DCA не смог снизить частоту и рост этих метастазов в лимфатических узлах. Линия клеток LNM35 была создана в 2000 году как первая линия клеток рака легких человека, имеющая лимфогенные метастатические свойства со 100% частотой после подкожной инъекции в боковой бок голых мышей [34]. Кроме того, DCA не показал никаких ингибирующих эффектов на миграционные и инвазивные свойства клеток LNM35 и A549 in vitro. Аналогичным образом сообщалось, что монотерапия DCA не была эффективна в снижении метастазов в легких из метастатических клеток рака молочной железы, ксенотрансплантированных голым мышам [23].

Комбинированная терапия является фундаментальным подходом в лечении рака. Объединение различных противораковых препаратов позволяет воздействовать на различные основные сигнальные пути для усиления терапевтических преимуществ, избегания приобретенной резистентности и снижения тяжести побочных эффектов [35]. Химиотерапия играет неотъемлемую роль в лечении пациентов с НМРЛ. Обычно используется схема с платиной (цисплатин или карбоплатин) плюс паклитаксел, гемцитабин , доцетаксел, винорелбин, иринотекан или пеметрексед [36]. Неселективные характеристики химиотерапевтических агентов приводят к скромному увеличению выживаемости при значительной токсичности для пациента [37]. Это подчеркивает необходимость в более эффективных стратегиях для улучшения результатов лечения пациентов с минимальными побочными эффектами. В настоящем

исследовании DCA не удалось усилить противораковый эффект камптотецина и гемцитабина в обеих линиях клеток Н Кроме того, DCA не смог значительно усилить противораковые эффекты цисплатина в клеточной линии

A549 in vitro, но он усилил цитотоксический эффект цисплатина в клеточной линии LNM35, что отражает роль генетического фона раковых клеток в определении пути гибели клеток, вызванного препаратами. Ким и др. сообщили, что клетки A549 имеют более низкую скорость аэробного гликолиза по сравнению с клетками H460 из-за дифференциальной экспрессии некоторых метаболических ферментов [38]. Аэробный

гликолиз при раке был связан с химиорезистентностью, и ингибирование связанных путей было предложено в качестве механизма преодоления такой резистентности. Например, сверхэкспрессия PDK4 при раке мочевого пузыря высокой степени злокачественности заставляет совместное введение DCA с цисплатином вызывать резкое снижение роста опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [39].

Аналогичным образом, введение DCA с паклитакселом было описано как успешный подход к преодолению резистентных к паклитакселу клеток НМРЛ из-за сверхэкспрессии PDK2 [40]. Кроме того, Галгамува и др. заявили, что предварительное лечение DCA значительно ослабило нефротоксичность, вызванную цисплатином у мышей, сохранив противораковые эффекты цисплатина [41].

Открытие таргетной терапии помогло врачам адаптировать варианты лечения для пациентов с НМРЛ. Было разработано много таргетных препаратов, которые стали частью первой линии лечения НМРЛ, например, гефитиниб и эрлотиниб, которые считаются первым поколением EGFR-TKi [42]. Гефитиниб и эрлотиниб были одобрены более 10 лет назад для лечения пациентов с прогрессирующим мутантным EGFR НМРЛ, не получавших химиотерапию, в качестве первой линии лечения. Они также используются в качестве второй линии терапии после неудачи химиотерапии [43]. Некоторые отчеты показали, что эрлотиниб имеет хорошую эффективность у пациентов с EGFR - диким типом НМРЛ [44]. Поддерживающая доза может принести пользу этим пациентам после химиотерапии на основе платины, которая считается основной терапией при диком типе EGFR НМРЛ [45]. Несмотря на замечательные преимущества, многие пациенты приобрели терапевтическую резистентность через 10–14 месяцев лечения из-за вторичной мутации в гене EGFR [46].

В этом исследовании мы стремились изучить способность DCA сенсибилизировать линии клеток NSCLC дикого типа EGFR при сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. DCA значительно усилил ингибирующий эффект гефитиниба и эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35. Это исследование также показало аддитивные эффекты на рост колоний LNM35 при сочетании DCA с гефитинибом или эрлотинибом в течение семи дней лечения. Более того, эта комбинация оказала синергическое действие на рост колоний A549 после четырнадцати дней лечения. Кроме того, все эти протоколы комбинирования привели к существенному снижению клеточной плотности отдельных колоний как A549, так и LNM35. В этом контексте сообщалось, что DCA с гефитинибом или эрлотинибом синергически подавляет жизнеспособность и способность к образованию колоний мутантных клеток EGFR (NCI-H1975 и NCI-H1650) из-за синергического эффекта в продвижении апоптоза. В клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI- H460) они показали, по сравнению с индивидуальными обработками, что комбинация вызывала повышенное значение фракции, затронутой (Fa), в жизнеспособности клеток, не достигая уровня синергизма в клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460), и эта комбинация не подавляла значительно образование колоний этих линий клеток [47]. Различия в экспериментальных условиях между вышеупомянутым отчетом и нашим исследованием могут объяснить такие переменные результаты. В своем клоногенном анализе исследователи обрабатывали отдельные клетки в течение трех последовательных дней, а затем инкубировали в среде без лекарственных средств в течение 15 дней для формирования колоний; Однако в наших экспериментах клетки сначала инкубировали в течение десяти дней для формирования колоний, а затем подвергали обработке в течение семи и четырнадцати дней.

Подводя итог, можно сказать, что это исследование продемонстрировало, что DCA является перспективным противораковым средством для лечения НМРЛ, подавляя жизнеспособность клеток и рост колоний клеток НМРЛ in vitro , а также рост опухолей у эмбрионов цыплят CAM и голых мышей, в которых также оценивалась безопасность этого средства. DCA подавляет способность эндотелиальных клеток образовывать капилляроподобные структуры и прорастать in vitro, что позволяет предположить ингибирование ангиогенеза как потенциальный механизм противоракового эффекта. Это исследование также выявило потенциальную ценность DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro.

Результаты этого исследования прокладывают путь для подтверждения влияния комбинации DCA с гефитинибом или эрлотинибом на рост опухоли in vivo, в дополнение к исследованию влияния DCA в сочетании с EGFR-TKi второго и третьего поколения.

1. Материалы и методы 4.1.Клеточная культура и реагенты

Клетки NSCLC, A549 и LNM35, поддерживались в среде RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) в увлажненном инкубаторе при температуре 37  C и 5% CO2. Среда была дополнена 1% раствора пенициллина- стрептомицина (Hyclone, Cramlington, UK) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Cramlington, UK). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) поддерживались в полном наборе сред EndoGROTM-VEGF (Merck Millipore, Massachusetts, USA) в увлажненном инкубаторе при температуре 37 C и 5% CO2 в колбах , покрытых 0,2% желатином. Культуральную среду всех клеток меняли каждые 3 дня, а клетки пересевали один раз в неделю, когда культура достигала 95% конфлюэнтности для раковых клеток и 80% для HUVEC.

Натрий DCA, цисплатин, камптотецин, гемцитабин HCl, эрлотиниб HCl и гефитиниб были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). DCA был свежерастворен в воде HyPure (Hyclone, Крамлингтон, Великобритания) перед началом любого эксперимента для приготовления исходного раствора 1 М, который затем был разбавлен до требуемых концентраций для лечения.

4.2. Жизнеспособность

клеток Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночный планшет.

Через 24 часа клетки обрабатывали возрастающей концентрацией DCA (3,125–100 мМ) в двух повторностях в течение 24, 48 и 72 часов, тогда как контрольные клетки обрабатывали лекарственным средством ( вода Hypure), смешанным со средой. В указанные временные точки использовали анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) для определения

влияния DCA на жизнеспособность клеток путем количественной оценки АТФ, которая будет пропорциональна

к числу метаболически активных клеток. Люминесцентный сигнал измеряли с помощью люминометра GloMax® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность клеток представляли в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности клеток, обработанных DCA, с контрольными клетками, жизнеспособность которых предполагалась равной 100%.

Во втором наборе экспериментов клетки обрабатывали в течение 48 ч возрастающей концентрацией гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ). Кроме того, клетки обрабатывали в течение 48 ч комбинацией DCA и других противораковых агентов, а именно цисплатина, камптотецина,

гемцитабина , гефитиниба и эрлотиниба. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo® Анализ люминесцентной жизнеспособности клеток и люминометр GloMax® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность была представлена в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности обработанных лекарством клеток с контрольными клетками.

4.3. Клоногенный анализ

В 6-луночный планшет высевали клетки A549 и LNM35, соответственно, по 50 и 100 клеток на лунку. Клетки выдерживали для роста в колонии в течение 7–10 дней во влажной атмосфере при 37  C и 5% CO2, при этом среду меняли каждые три дня. Образованные колонии обрабатывали каждые 3 дня в течение 7 дней возрастающими концентрациями DCA (6,25–50 мМ). После этого колонии промывали три раза 1× PBS, фиксировали и окрашивали в течение 2 часов 0,5% кристаллическим фиолетовым, растворенным в 50% метаноле (об./об.). Наконец, колонии промывали 1× PBS и фотографировали, и подсчитывали колонии с более чем 50 клетками . Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных DCA, с контрольными колониями. Плотность клеток колоний оценивали путем фотографирования колоний в каждой группе с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа (4×).

Во втором наборе экспериментов сформированные колонии обрабатывались каждые 3 дня в течение 7 или 14 дней комбинацией DCA и гефитиниба или DCA и эрлотиниба. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных препаратом, с контрольными колониями.

4.4 Анализ роста опухоли in ovo

Оплодотворенные яйца леггорнов инкубировали в инкубаторе для яиц, установленном на температуру 37,5  C и влажность 50% в течение первых 3 дней после оплодотворения. На 3-й день эмбрионального развития (E3) САМ был удален путем просверливания небольшого отверстия в яичной скорлупе напротив круглого, широкого конца с последующей аспирацией ~1,5–2 мл альбумина с помощью шприца объемом 5 мл с иглой 18G. Затем в яичной скорлупе над САМ было вырезано небольшое окно с помощью тонких ножниц, которое было заклеено полупроницаемой клейкой пленкой (Suprasorb® F). Яйца снова содержались в инкубаторе до 9-го дня эмбрионального развития (E9), на котором раковые клетки были трипсинизированы, центрифугированы и суспендированы в 80% матрице Matrigel® (Corning, Bedford, UK) для получения 1 × 106 клеток/100 мкл для A549 и 0,3 ×

106 клеток/100 мкл для LNM35. 100 мкл инокулята добавляли на САМ каждого яйца, в общей сложности 10–13 я

На 11-й день эмбрионального развития (E11) образовавшиеся опухоли обрабатывали местно, капая 100 мкл DCA, приготовленного на 0,9% NaCl для первой группы, или лекарственного носителя для контрольной группы. Обработку повторяли на E13 и E15. Все описанные шаги выполняли в асептических условиях.

Наконец, на 17-й день эмбрионального развития (E17) эмбрионы гуманно умерщвляли путем местного добавления 10–30 мкл пентобарбитона натрия (300 мг/мл, Jurox, Окленд, Новая Зеландия). Опухоли осторожно извлекали из нормальных верхних тканей CAM, промывали 1× PBS и взвешивали для определения влияния DCA на рост опухолей. Данные представлены в виде сравнений среднего веса опухолей в контрольной группе и группе, обработанной DCA. Токсичность препарата оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах в конце эксперимента.

Живость эмбрионов определялась путем проверки их произвольных движений, а также целостности и пульсации кровеносных сосудов.

Этот анализ представляет собой рандомизированный открытый анализ, который был проведен в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных в Университете Объединенных Арабских Эмиратов . Согласно Европейской директиве 2010/63/EU о защите животных, используемых

Для проведения научных экспериментов с использованием куриных эмбрионов на E18 и ранее не требуется одобрения со стороны Комитета по уходу и использованию животных (IACUC).

4.5 Анализ роста опухоли и метастазирования

Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, утвержденным

комитетом по этике работы с животными Университета ОАЭ в марте 2019 года (код протокола ERA_2019_5872).

Шести-восьминедельных бестимусных мышей-самцов линии NMRI nude (nu/nu, Charles River,

Германия) содержали в ламинарных шкафах с фильтруемым воздухом и соблюдали асептические условия.

Клетки A549 (5 × 106 клеток/200 мкл PBS) и клетки LNM35 (0,4 × 106 клеток/200 мкл PBS) вводили

подкожно в боковой бок голых мышей. Спустя десять дней, когда опухоли достигли объема приблизительно 50 мм3, животные с ксенотрансплантатами A,549 были случайным образом

разделены на три группы по 9–10 мышей в каждой. Эти группы получали перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 50 мг/кг или 200 мг/кг или лекарственный носитель в течение 38 дней. С другой стороны, животные с ксенотрансплантатами LNM35 получали перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 200 мг/кг или лекарственный носитель в течение 10 дней и DCA 500 мг/кг или лекарственный носитель в течение 24 дней. Размеры опухолей и вес животных проверяли каждые три или четыре дня. Кроме того, физические признаки и поведение проверялись каждый день. Объем опухоли рассчитывался по формуле V = L × W2 ×

0,5, где L представляет собой длину , а W — ширину опухоли. В конце экспериментов животных анестезировали и умерщвляли путем смещения шейных позвонков, а опухоли удаляли и взвешивали. Влияние DCA на рост опухоли было представлено путем сравнения среднего веса опухоли в конце эксперимента между контрольной группой и группой, получавшей DCA. Его также оценивали путем сравнения объема опухоли между контрольной и группой, получавшей DCA, на протяжении всего эксперимента. Образцы крови собирали у каждой мыши и анализировали с помощью счетчика крови животных SCIL VET ABC™ Animal Blood Counter для полного анализа крови. Кроме того, плазму крови отделяли центрифугированием для биохимического анализа. Для изучения влияния DCA на метастазирование подмышечные

лимфатические узлы были вырезаны и взвешены у животных с ксенотрансплантатами LNM35 в конце

• Анализ формирования

сосудистых трубок Матрикс Matrigel® (Corning, Bedford, UK) размораживали и добавляли 40– 50 мкл в лунки 96-луночного планшета для покрытия. Для того чтобы Матригель затвердел, планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37                                                                                    C и 5% CO2 в течение 1 ч. HUVEC

трипсинизировали и высевали на покрытый планшет с плотностью 2,5 × 104 клеток/100 мкл/ лунку в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA. Через 8 ч инкубации сети

трубок в разных лунках фотографировали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Влияние DCA на способность HUVEC формировать капилляроподобные структуры оценивали путем измерения общей длины сформированных трубок в контрольных и обработанных DCA лунках. Общая длина трубок измерялась вручную и с помощью программного обеспечения для онлайн-анализа изображений, разработанного Wimasis (https://www.wimasis.com/ en/products/13/WimTube - дата доступа 1 марта 2019 г.). Влияние различных концентраций DCA

на жизнеспособность HUVEC определялось с помощью анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), как ранее описано в разделе о жизн

• Анализ прорастания сфероидов HUVEC

Сфероиды HUVEC были приготовлены путем первого окрашивания клеток путем инкубации 190 000 клеток с 2 мкМ раствором красителя CellTrackerTM Green CMFDA (Invitrogen Molecular probes, Paisley, UK) в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе, установленном на 37  C и 5% CO2, с последующим центрифугированием в течение 5 мин и удалением супернатанта. Осадок HUVEC был суспендирован в дополненной среде HUVEC (5 мл), смешанной с раствором метоцела (1,25 мл), который должен быть приготовлен ранее [48]. Затем 25 мкл клеточной суспензии пипеткой наносили на крышку чашки Петри. Примерно 50 капель пипеткой наносили в каждую чашку Петри.

Наконец, капли держали перевернутыми в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе, установленном на 37

Образованные сфероиды в каждой чашке (~50 сфероидов) собирали отдельно с 1× PBS и центрифугировали при 150× g в течение 5 мин. Тем временем рабочий раствор коллагена I готовили на льду путем осторожного смешивания исходного коллагена I из хвоста крысы (1500 мкл) (Millipore, MA, США) с 10× средой 199 (150 мкл) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, США) и ледяным стерильным 1N NaOH (34 мкл), который приобрел красный цвет. Каждый сфероидный осадок покрывали слоем раствора метоцела, содержащего 4% FBS (0,25 мл), рабочего раствора коллагена I (0,25 мл) и 60 мкл базальной среды или VEGF 30 нг/мл или DCA 25 мМ или их комбинации.

Сразу после осторожного перемешивания смесь добавляли в предварительно нагретый 24-луночный планшет и инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37  C и 5% CO2 в течение 24 часов, что позволяло полимеризовать коллаген и прорасти сфероидам. Через 24 часа сфероиды были захвачены с помощью инвертированного микроскопа с 20-кратным увеличением. Длина проростков в 12 сфероидах в каждом состоянии была измерена с помощью ImageJ.

• Анализ подвижности при

заживлении ран Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 1 × 106 клеток/лунку в 6-луночный планшет. Через 24 часа с помощью наконечника объемом 200 мкл делали царапину в сливающемся монослое . После этого клетки дважды промывали 1× PBS с последующим добавлением свежей среды с добавлением лекарственного носителя или DCA. В верхней части планшета были отмечены два места для мониторинга уменьшения размера раны с течением времени с использованием инвертированного микроскопа при объективе 4× (Olympus 1X71, Токио, Япония). Планшеты инкубировали во влажной атмосфере при 37  C и 5% CO2 , а ширину раны измеряли через 0, 2, 6 и 24 часа после инкубации.

Расстояние миграции выражалось как среднее значение разницы между измерениями в нулевой момент времени и в периоды времени 2, 6 и 24 часа.

• Анализ камер инвазии в матригеле

Согласно протоколу производителя (Corning, Bedford, MA, USA), в нижние камеры добавляли 0,5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS. После этого раковые клетки высевали с плотностью 1 × 105 клеток/ 0,5 мл в верхние камеры в среде без FBS в присутствии и отсутствии DCA. Планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37  C и 5% CO2 в течение 24 часов. Инвазивные клетки разрушают матригель и проходят через поры вставки размером 8 мкм. Непроникающие клетки верхних камер удаляли, осторожно протирая область ватным тампоном. Затем полупроницаемую мембрану удаляли с помощью очень тонких ножниц.

Инвазивные клетки были обнаружены с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), ранее описанного в разделе жизнеспособности клеток. Влияние DCA на клеточную инвазию было представлено в процентах (%) путем сравнения инвазирующих клеток в присутствии DCA с контролем.

• Статистический анализ

Помимо анализа in ovo и экспериментов на голых мышах, каждый эксперимент проводился не менее трех раз. Данные выражены как среднее значение ± SEM Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 8.3.1 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния,

США). Для оценки разницы между двумя группами использовался непарный t-тест . Для сравнения 3 или более групп с контрольной группой использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Даннетта . Кроме того, для комбинированных экспериментов

использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного*сравнения Тьюки. p

** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001 указывают на значимые различия.

Вклад авторов: Концептуализация, SA; методология, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; валидация, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; формальный анализ, SA и AA-A.; расследование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; курирование данных, SA; написание — подготовка первоначального черновика, SA и AA-A.; написание — рецензирование и редактирование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; визуализация, SA, AA-A. и AN; руководство, SA; администрирование проекта, SA; получение финансирования, SA Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование: Это исследование частично финансировалось за счет гранта Центра медицинских наук имени Зайеда, Университета Объединенных Арабских Эмиратов, № 31R136.

Заявление институционального наблюдательного совета: Исследование на голых мышах проводилось в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации и протоколом, одобренным Комитетом по этике обращения с животными Университета Объединенных Арабских Эмиратов (код протокола ERA_2019_5872).

Заявление об информированном согласии: Неприменимо.

Заявление о доступности данных: Неприменимо.

Благодарности: Авторы выражают благодарность Такаши Такахаши за предоставление клеток LNM35.

Конфликты интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не принимали участия в разработке исследования, в сборе, анализе или интерпретации данных, в написании рукописи или в решении опубликовать результаты.

Оригинал статьи: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25362214/

Новая форма терапии дихлорацетатом для пациентов с запущенными стадиями рака: описание 3 случаев

Абстрактный

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) в настоящее время исследуется как монотерапия и как вспомогательное средство для лечения различных видов рака. Одним из факторов, ограничивающих его клиническое использование в непрерывном пероральном режиме, является дозозависимая, обратимая нейротоксичность, включая периферическую нейропатию и энцефалопатию. Внутривенный (IV) путь имеет ряд потенциальных преимуществ, включая (1) импульсное дозирование для достижения более высоких концентраций, чем это возможно при пероральном применении, (2) более длительный период вымывания для снижения потенциальной нейротоксичности и (3) обход пищеварительной системы, что особенно важно для пациентов с раком на поздней стадии. Были доступны данные о высоких дозах IV DCA (до 100 мг/кг/доза), которые подтвердили его безопасность как у здоровых добровольцев, так и у пациентов в критическом состоянии, что позволило авторам начать нестандартное лечение онкологических больных. У нескольких своих пациентов, получавших IV DCA, авторы наблюдали клинические, гематологические или радиологические ответы. В этой статье представлены 3 случая пациентов с рецидивирующим раком, у которых все традиционные методы лечения оказались неэффективными: (1) 79-летний мужчина с раком толстой кишки и метастазами в печень, (2) 43-летний мужчина с ангиосаркомой и метастазами в поджелудочную железу и кости, и (3) 10-летний мужчина с нейроэндокринной карциномой поджелудочной железы и метастазами в печень. (Altern Ther Health Med. 2014;20(suppl 2):21-28.)

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) — это препарат, который в настоящее время исследуется как монотерапия и дополнительное лечение рака. 1 На момент написания этой статьи в Университете Альберты проходит текущее исследование фазы I перорального DCA для рецидивирующих или метастатических солидных опухолей, а в Стэнфордском университете проводятся 2 испытания перорального DCA для лечения рака головы и шеи.
DCA был широко изучен Стэкпулом 2-5 для лечения врожденного лактоацидоза, который включает группу наследственных митохондриальных заболеваний. Профиль безопасности использования перорального DCA у людей был установлен в ходе этой работы. Было обнаружено, что препарат относительно безопасен, не имеет гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичности. 6 Основная токсичность — неврологическая, в первую очередь периферическая невропатия, и это состояние обратимо . 7 Наблюдался делирий, вызванный DCA, который быстро обращался после отмены препарата. 8 Бессимптомное, но обратимое повышение уровня печеночных ферментов может наблюдаться у небольшого процента пациентов. 9
В январе 2007 года Боннет и др. 10 опубликовали новаторскую работу, в которой продемонстрировали, что DCA эффективен при лечении рака груди, легких и мозга человека in vitro и in vivo (у крыс) с помощью новых метаболических путей, включающих ингибирование киназы пируватдегидрогеназы митохондрий. Исследователи сообщили, что DCA селективно запускает апоптоз в раковых клетках, снижая потенциал митохондриальной мембраны, блокируя аэробный гликолиз (эффект Варбурга) и активируя митохондриальные калиевые каналы. Впоследствии DCA был дополнительно изучен и обнаружен противораковый эффект в отношении многих типов рака, включая рак толстой кишки11, предстательной железы12, яичников13 , нейробластому14 , карциноид легких15 , рак шейки матки16 , эндометрия17, холангиокарциному18 , саркому19 и Т -клеточную лимфому20. Также были предложены другие механизмы действия DCA против раковых клеток . Эти методы включают (1) ингибирование ангиогенеза21, ( 2) изменение экспрессии фактора 1-α, индуцируемого гипоксией (HIF1-α), 21 и (3) изменение регуляторов pH вакуолярного типа H + -АТФазы (V-АТФазы) и монокарбоксилатного транспортера 1 (MCT1) и других регуляторов выживания клеток, таких как p53-активируемый модулятор апоптоза (PUMA), транспортер глюкозы 1 (GLUT1), белок В-клеточной лимфомы 2 (BCL2) и клеточный опухолевый антиген p53 (p53) .20
Однако некоторые исследования дали иные результаты, показав снижение апоптоза в определенных линиях раковых клеток в условиях гипоксии22,23. Также
было показано, что DCA in vitro увеличивает цитотоксичность выбранных соединений платины, что предполагает потенциал для клинического применения при резистентном к платине мелкоклеточном раке легких; саркоме Юинга; и раке яичников24. Другое исследование in vitro обнаружило значительные, синергические, антипролиферативные эффекты при использовании линий клеток рака шейки матки с комбинацией DCA и цисплатина25. Основная часть литературы ясно показывает потенциал для дальнейших исследований и разработок DCA.
Основываясь на оригинальной работе Бонне и др.10 , один из нынешних авторов начал использовать пероральный DCA в 2007 году в качестве лечения не по назначению для онкологических больных, у которых был плохой прогноз или которые не отреагировали на традиционную терапию рака. Было отмечено, что периферическая невропатия26 является основным фактором, ограничивающим клиническую полезность. Этот автор разработал протокол DCA для лечения невропатии в сотрудничестве с другим автором, врачом-натуропатом. Результатом этой работы стал режим перорального приема DCA, который включал натуральные нейропротекторные препараты ацетил-L-карнитин, 27-30 R-α-липоевую кислоту, 31-34 и бенфотиамин. 35-37 Клиническое наблюдение за более чем 300 пациентами с запущенным раком, лечившимися по этому режиму, показало, что 60–70 % продемонстрировали измеримые преимущества от DCA. Приблизительный риск невропатии составил 20 % при дозе DCA 20–25 мг/кг/день, которая была в цикле 2 недели приема/1 неделя перерыва, в сочетании с 3 натуральными добавками.
Внутривенный (IV) путь имеет ряд терапевтических преимуществ, включая (1) более высокие уровни в крови, поскольку импульсное IV дозирование может достигать более высокой концентрации, чем это возможно при пероральном приеме, (2) более длительный период вымывания для снижения потенциальной нейротоксичности и (3) обход пищеварительной системы, что особенно важно для пациентов с поздней стадией рака. Были доступны данные о высокой дозе IV DCA до 100 мг/кг/доза, которые подтвердили ее безопасность как для здоровых добровольцев38, так и для пациентов в критическом состоянии39. Авторы Элиаз и Хан разработали протокол лечения IV-DCA и внедрили его в клиническую практику. У Хана был предыдущий опыт, начиная с 2007 года, с IV DCA, он использовал его для лечения пациентов с полной непроходимостью кишечника. Однако при более раннем использовании IV DCA Ханом, датируемом 2007 годом, не было возможности оценить долгосрочные ответы, поскольку лечение проводилось у пациентов на конечной стадии с прогнозом продолжительности жизни от 4 до 6 недель.
В этой статье представлены 3 случая, иллюстрирующих эффекты лечения IV-DCA. Все пациенты и/или опекуны пациентов дали согласие на публикацию своих случаев. У этих пациентов был очень плохой прогноз и/или они не отреагировали на традиционную терапию. Все пациенты получили существенные преимущества от терапии DCA с минимальными побочными эффектами, без миелосупрессии и без токсичности для органов. Пациенты в этих исследованиях случаев лечились в сотрудничестве с 3 авторами, которые являются врачами-натуропатами. Они разработали индивидуальные протоколы, которые включали натуральные адъюванты, такие как лечение внутривенной аскорбиновой кислотой/витамином C (IVC) и натуральными нейропротекторами.

СЛУЧАЙ 1: РАК ТОЛСТОЙ КИШКИ

Мужчина 79 лет обратился за лечением метастатического рака толстой кишки с первоначальным диагнозом аденокарциномы сигмовидной кишки T3N1M0, которая была умеренно дифференцированной. Сопутствующие заболевания включали анамнез стенокардии, инфаркта миокарда, четырехкратного коронарного шунтирования, гипертонии, гиперхолестеринемии и дивертикулеза. Первоначально его лечили левой гемиколэктомией и колостомией, затем химиотерапией 5-фторурацилом (5-ФУ) и иринотеканом в течение примерно 6 месяцев и последующей отменой колостомии.
Пациент оставался здоровым в течение примерно 3 лет, после чего начал расти раково-эмбриональный антиген (CEA), а компьютерная томография (КТ) показала новые метастазы в печени и легких. Его снова лечили химиотерапией 5-ФУ и иринотеканом в течение 3 циклов, которые были неэффективны и осложнились крайней усталостью и недомоганием. Химиотерапию прекратили, и пациента направили на паллиативную помощь.
Пациент решил пройти натуропатическое лечение в клинике одного автора, начиная с декабря 2010 года. Терапия включала гомеопатические средства и IVC в дозе 75 г два раза в неделю с последующим повышением уровня энергии и набора веса. Лекарствами и добавками в то время были пантопразол, альфузозин, метопролол, рамиприл, симвастатин, амлодипин, клопидогрель, витамин D, комплекс витаминов группы B, ацидофилус и α-липоевая кислота. Пациент продолжал лечение до 2011 года с хорошим контролем симптомов; однако его CEA продолжал расти. КТ в ноябре 2011 года показало обширное, диффузное, метастатическое заболевание печени и многочисленные увеличивающиеся легочные узелки, соответствующие интервальному прогрессированию заболевания. Затем пациент решил пройти пробный курс IV DCA. Базовые анализы крови, включая CEA и ферменты печени, были получены 19 декабря 2011 года. Первая доза 3000 мг (41 мг/кг) IV DCA была введена 22 декабря 2011 года вместе с 50 г IVC. Тест CEA был запланирован на 4 недели позже, но был ошибочно повторен через 1 день после инфузии вместе с измерением ферментов печени. Было отмечено быстрое снижение ферментов печени и CEA. (См. Рисунок 1 и Рисунок 2.)

Рисунок 1. Раково-эмбриональный антиген
На рисунке показано постепенное увеличение раково-эмбрионального антигена (РЭА) во время натуропатического лечения и его резкое снижение после внутривенного введения дихлорацетата натрия (ДХА).Рисунок 2.
Сокращения ферментов печени: АСТ = аспартатаминотрансфераза; АЛТ = аланинаминотрансфераза; ГГТ = γ-глутамилтранспептидаза; АЛКП = щелочная фосфатаза.
На рисунке показано немедленное резкое падение и продолжающееся снижение ферментов печени при введении внутривенного DCA.

Вторая инфузия DCA была сделана через 6 дней в дозе 3500 мг (48 мг/кг) вместе с 35 г IVC. После инфузии пациент отметил новые симптомы: озноб, потливость и усталость. Третья инфузия DCA в дозе 3700 мг (50 мг/кг) и 50 г IVC была сделана через 8 дней после второй дозы, и последующие анализы крови показали дальнейшее улучшение (рисунок 2).
Однако пациент снова отметил кратковременный период усталости и недомогания после инфузии и, вопреки совету врачей, решил прекратить лечение на основании этих побочных эффектов. Новое УЗИ брюшной полости было сделано через 1 месяц после лечения DCA. В отчете говорилось: «Учитывая различия в методах визуализации, внешний вид метастазов печени существенно не изменился по сравнению с предыдущей КТ брюшной полости от 10 ноября 2011 года». Метастазы в легких не оценивались, поскольку респираторные симптомы не были очевидны.

СЛУЧАЙ 2: АНГИОСАРКОМА

43-летний мужчина обратился за лечением метастатической ангиосаркомы правой бедренной кости. У пациента в анамнезе была остеосаркома правой большеберцовой кости, диагностированная в возрасте 27 лет в 1995 году и пролеченная резекцией и реконструкцией опухоли-протеза, за которой последовала химиотерапия доксорубицином и цисплатином. Этот рак считался излеченным.
В возрасте 39 лет в 2007 году он обратился к врачу с болью и отеком над правым коленом. После магнитно-резонансной томографии (МРТ) и биопсии был поставлен диагноз ангиосаркомы. Этот рак считался потенциальной вторичной злокачественной опухолью, вызванной предыдущей химиотерапией. Пациент получил химиотерапию доксорубицином и ифосфамидом, но предполагаемый курс был сокращен из-за инфекции и последующего повреждения почек, вторичного по отношению к лечению антибиотиком ванкомицином. Затем в 2008 году ему провели резекцию опухоли и реконструкцию.
В 2009 году, через год после этой операции, у него развились метастазы в легких, которые были удалены хирургическим путем с помощью резекции клина легкого. Впоследствии развились дальнейшие метастазы в легких, по поводу которых пациент перенес 2 дополнительные резекции легких в период с 2009 по 2011 год. В августе 2011 года был обнаружен метастаз в левом подвздошном крыле, который был вылечен путем иссечения и лучевой терапии. В октябре 2011 года в результате КТ был диагностирован новый метастаз в хвосте поджелудочной железы размером 6,1 × 5,7 см, который был немедленно вылечен лучевой терапией. На КТ также был обнаружен увеличивающийся метастаз в левой верхней доле легкого размером 12 мм.
В ноябре 2011 года пациент обратился за консультацией к одному из авторов, врачу-натуропату. Пациенту было назначено внутривенное введение Viscum album (экстракт омелы) и IVC. Дозы были увеличены до 300 мг вискума белого и 75 г IVC 3 раза в неделю. Он также получал добавки, включая витамин D, модифицированный цитрусовый пектин, пищеварительные ферменты, омега-3 жирные кислоты, биоперин и артемизинин.
В январе 2012 года еще одно КТ-сканирование выявило новые небольшие метастазы в позвоночнике, несмотря на агрессивную натуропатическую терапию. Масса хвоста поджелудочной железы увеличилась до 7,6 × 5,6 см через 2 месяца после лучевой терапии. Было обнаружено несколько новых небольших узелков в легких. Были обнаружены новые литические метастазы в костях, включающие C3, T9, L2 и рукоятку.
На основании прогрессирования заболевания пациент решил начать терапию IV DCA в феврале 2012 года. Исходные результаты анализа крови были значительными для анемии (гемоглобин 101 г/л), легкой почечной недостаточности (мочевина 12,6 ммоль/л и креатинин 195 мкмоль/л) и легкого повышения γ-глутамилтранспептидазы (ГГТ) (77 ЕД/л). Его щелочная фосфатаза (ALKP) была в норме. Перед началом DCA в качестве исходного уровня была проведена МРТ позвоночника.
IV DCA была начата с дозы 3000 мг (47 мг/кг) еженедельно и увеличена в течение 2 недель до 5000 мг (47 мг/кг) дважды в неделю. Побочных эффектов не наблюдалось. Одновременно с началом DCA пациент также получил стереотаксическую радиотерапию позвоночника. После 2 месяцев IV DCA в сочетании с продолжающимся натуропатическим лечением КТ показала стабильность всех метастазов в легких и уменьшение метастаза поджелудочной железы с 7,6 × 5,6 см до 5,9 × 5,2 см. Была обнаружена едва заметная новая область просветления на уровне T12 с небольшим увеличением просветления всех других метастазов в костях. Сканирование костей с технецием в апреле 2012 года не показало соответствующей активности ни в одной из областей просветления, обнаруженных на КТ. Новая МРТ позвоночника подтвердила смешанный ответ, при этом наибольший рост метастазов в костях составил 1–2 мм.
После 4 месяцев терапии IV DCA МРТ продемонстрировала стабильность почти всех метастазов в позвоночнике, 2 из которых были немного больше, без указания измерений. Новых метастазов в позвоночнике отмечено не было. КТ месяц спустя, после 5 месяцев IV DCA, показало, что все легочные узелки стабильны, а масса поджелудочной железы еще больше уменьшилась в размерах с 5,9 × 5,2 см до 4,4 × 4,4 см. Новых интраторакальных или интраабдоминальных метастазов не было. Многие из существующих костных метастазов продемонстрировали небольшое увеличение прозрачности. ALKP оставался нормальным, и не произошло ухудшения количества клеток или функции почек. Хотя он продолжал терапию IV DCA, пациент начал поиск более агрессивных вариантов лечения с целью достижения полной ремиссии. За исключением спинальной стереотаксической радиотерапии, никакая сопутствующая традиционная терапия не проводилась одновременно с IV DCA.
Пациент оставался клинически стабильным до сентября 2012 года, когда он прервал лечение IV DCA после 8 месяцев терапии, чтобы поехать в частную клинику в Германии для низкодозной химиотерапии с общей гипертермией тела и потенцированием инсулина.

СЛУЧАЙ 3: НЕЙРОЭНДОКРИННАЯ КАРЦИНОМА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Десятилетний мальчик с метастатической нейроэндокринной карциномой поджелудочной железы был привезен из Португалии его родителями в клинику одного автора в Канаде для лечения DCA после неэффективности традиционной химиотерапии. Сначала он обратился к своему врачу в Португалии с жалобами на усталость и анорексию. Диагноз был поставлен с помощью УЗИ и биопсии, которые выявили массу поджелудочной железы с метастазами в брюшные лимфатические узлы и обширные метастазы в печень, занимающие всю паренхиму печени. Сцинтиграфия рецепторов соматостатина показала поражение поджелудочной железы с высоким поглощением, но показала низкое поглощение во всех поражениях печени. На основании многопрофильного обсуждения случая с детской онкологической группой в региональном онкологическом центре в Лиссабоне, Португалия, в качестве первичного лечения были выбраны 6 циклов цисплатина и этопозида. КТ после 2 циклов химиотерапии показала уменьшение метастазов и первичной опухоли. К пятому циклу онколог отметил ухудшение ответа на основе новых КТ-сканов и маркеров крови, и у пациента началось клиническое ухудшение с потерей веса, тошнотой и рвотой. Возможность высокодозной химиотерапии и трансплантации печени были исключены командой трансплантологов. Терапия была прекращена после полного лечения цисплатином в дозе 600 мг/м 2 и этопозидом в дозе 1800 мг/м 2 .
Пациент прибыл в Канаду для оценки относительно терапии DCA через 2 месяца. В то время его лекарства включали метоклопрамид, ондансетрон, флуконазол, лоперамид, эзомепразол, налтрексон (4,5 мг) перед сном и парацетамол (ацетаминофен). DCA в дозе 2500 мг внутривенно (74 мг/кг) и октреотид в дозе 100 мкг внутривенно были начаты дважды в неделю в условиях клиники. Октреотид был добавлен с надеждой на усиление действия только против основной опухоли поджелудочной железы; он показал высокое поглощение при предыдущем сканировании рецепторов соматостатина. Терапия была начата в течение 2 недель после последнего КТ-сканирования. Поддерживающее внутривенное лечение проводилось одновременно и состояло из R-α-липоевой кислоты в дозе 250 мг, аминокислот, IVC, кальция, магния, комплекса витаминов B и многокомпонентных минералов без меди. После 2 инфузий IVC был увеличен с 5 до 20 г после того, как безопасность была подтверждена нормальным уровнем сывороточной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD). Октреотид был увеличен до 100 мкг внутривенно ежедневно.
Пациент испытывал временное усиление боли в животе и новую боль в левом плече через 1 день после инфузий. Он также сообщил об увеличении своего уровня энергии. Он продолжал испытывать временное усиление боли после каждой инфузии, которое хорошо купировалось пероральным морфином после прекращения приема налтрексона. Он проходил лечение дважды в неделю в течение 2 недель в условиях офиса. Новые анализы крови после 4 внутривенных процедур показали снижение аланинаминотрансферазы (АЛТ), стабильной аспартатаминотрансферазы (АСТ) и ГГТ, значительное увеличение дегидрогеназы молочной кислоты (ЛДГ) и падение гемоглобина (таблица 1). Затем он был выписан под наблюдение своих врачей в Португалии, которые продолжили внутривенную терапию DCA вместе с поддерживающей внутривенной терапией и внутривенной α-липоевой кислотой без осложнений.

Таблица 1. Нейроэндокринная карцинома поджелудочной железы, сводка анализа крови
Сокращения: ЛДГ = дегидрогеназа молочной кислоты; ГГТ = γ-глутамилтранспептидаза; АСТ = аспартатаминотрансфераза; АЛТ = аланинаминотрансфераза.

КТ после 6 недель терапии показало уменьшение самого крупного метастаза в печени на 2 см (рисунки 3А и 3Б). Второй по величине метастаз также уменьшился почти на 2 см (рисунки 4А и 4Б).

Рисунки 3А и 3Б. Результаты КТ-сканирования самого большого метастаза печени после 6 недель терапии
Рисунок 3А показывает самый большой метастаз до начала терапии с помощью IV DCA. Рисунок 3Б показывает уменьшение этой опухоли на 2 см после терапииРисунки 4А и 4Б. Результаты КТ второго по величине метастаза после 6 недель терапии
Рисунок 4А показывает второй по величине метастаз до начала терапии с помощью внутривенного введения DCA. Рисунок 4Б показывает уменьшение этой опухоли почти на 2 см.

Новое сканирование соматостатина (позитронно-эмиссионная томография с галлием-68), проведенное через неделю после КТ, не выявило «никаких признаков опухолевых поражений с повышенной экспрессией рецепторов соматостатина 2, 3 или 5». На основании этого открытия внутривенный октреотид был прекращен, а терапия DCA была продолжена. Пациент оставался клинически стабильным без каких-либо изменений в терапии в течение еще 3 месяцев. В этот момент он попросил прекратить терапию, поскольку его личной целью было достижение функционального статуса уровня ECOG 0 (полностью активный без ограничений физических возможностей), и эта цель считалась недостижимой.

ОБСУЖДЕНИЕ

Было представлено три случая терапии IV DCA для пациентов с запущенным раком, в которых авторы наблюдали благоприятные клинические, биохимические или радиологические ответы.
Случай 1 иллюстрирует биохимический ответ метастатического рака толстой кишки на IV DCA в сочетании с высокой дозой IVC. Ранее CEA пациента неуклонно повышался при использовании IVC только в течение 10 месяцев. Таким образом, снижение CEA можно отнести к терапии DCA. Поскольку в литературе сообщается о возможности снижения CEA более чем на 50% в течение 10 часов после метастатэктомии печени, 40 большое падение CEA на 1 день после любой другой терапии является правдоподобным, если рак быстро отреагировал, и не должно считаться ошибочным результатом. Более того, быстрое снижение печеночных ферментов согласуется с уменьшением повреждения печени в результате гибели раковых клеток или ингибирования роста.
Ультразвуковое исследование после лечения DCA не показало никаких изменений в размерах опухоли; Однако непосредственно перед началом лечения DCA не было базового сканирования, а сравнительное КТ было выполнено за 2 месяца до начала терапии. Таким образом, нельзя сделать выводов о том, произошло ли уменьшение размера опухоли. В рамках ограничений времени сканирования и сравнения КТ с УЗИ авторы, по крайней мере, наблюдали стабильность опухоли. Нельзя сделать выводов о длительности ответа, поскольку пациент прекратил терапию очень рано. Авторы пришли к выводу, что IV DCA, по-видимому, обладает активностью у людей против аденокарциномы толстой кишки.
Случай 2 иллюстрирует частичный ответ метастатической ангиосаркомы на IV DCA в сочетании с естественной терапией. Несмотря на уже имеющуюся анемию и хроническую почечную недостаточность, эффективное лечение было возможно, поскольку DCA не является миелосупрессивным или нефротоксичным. У этого пациента наблюдалось уменьшение большого метастаза поджелудочной железы, который не реагировал на предыдущую лучевую терапию. Уменьшение размера более чем на 30% соответствует определению частичного ответа в соответствии с Критериями оценки ответа при солидных опухолях (RECIST). Результатом стала стабильность множественных метастазов в легких и почти полная стабильность существующих метастазов в костях. Ответ метастазов в костях можно было бы отнести к сопутствующей стереотаксической спинальной радиотерапии, но ответ других метастазов нельзя. Крошечные новые метастазы в костях появились во время начального 5-месячного курса терапии DCA. Никаких новых интраторакальных или интраабдоминальных метастазов не появилось во время терапии DCA, тогда как метастазы в легких и поджелудочной железе выросли до этой терапии. У пациента не было никаких существенных побочных эффектов, связанных с лечением.
Смешанные ответы можно ожидать из-за гетерогенности опухоли. Другим возможным объяснением усиленного ответа метастазов поджелудочной железы по сравнению с метастазами легких является то, что DCA может быть более эффективным в предварительно облученных опухолях. Этот результат был зарегистрирован ранее. 41 Частичный ответ обнадеживает, учитывая плохой прогноз для пациента, особенно потому, что лечение хорошо переносилось без гематологической, почечной или неврологической токсичности. При более мягкой, нетоксичной терапии частичный ответ может быть полностью приемлемым и от него не нужно отказываться. Авторы пришли к выводу, что IV DCA, по-видимому, обладает активностью у людей против ангиосаркомы.
Случай 3 иллюстрирует уменьшение опухоли с помощью IV DCA в сочетании с высокой дозой IVC. Этот результат классифицируется как стабильное заболевание в соответствии с определением RECIST, поскольку уменьшение опухоли было ниже 30%. Наблюдались минимальные побочные эффекты. На основании сканирования октреотида до и после лечения, уменьшение крупных метастазов печени не может быть отнесено к терапии октреотидом; Ни одно сканирование не показало рецепторов октреотида в метастазах печени. Кроме того, исчезновение рецепторов октреотида из опухоли поджелудочной железы еще больше подчеркивает отсутствие пользы, связанной с терапией октреотидом. Таким образом, ответ можно отнести к введению DCA в сочетании с натуральными лекарствами. Временное обострение боли, связанной с опухолью, иногда отмечается при внутривенном введении DCA и может быть признаком ответа опухоли с последующим воспалением. Внезапное увеличение сывороточного ЛДГ пациента согласуется с этим эффектом. Из-за короткой продолжительности оценки нельзя сделать вывод о длительности ответа. Авторы пришли к выводу, что внутривенный DCA, по-видимому, обладает активностью у людей против нейроэндокринной карциномы поджелудочной железы. Представленные
случаи указывают на то, что внутривенный DCA является многообещающей терапией рака. Все пациенты получили значимую пользу от своей терапии с минимальными субъективными побочными эффектами и без гематологической, почечной или неврологической токсичности, несмотря на позднюю стадию заболевания во всех случаях. Такие методы лечения, как высокодозный IVC, которые сочетались с DCA, были поддерживающими с точки зрения качества жизни и могли иметь синергетический эффект с IV DCA. Однако было ясно, что эти методы лечения сами по себе не объясняли реакции опухоли. Интересно отметить, что все пациенты в этой серии случаев использовали IVC с IV DCA. Считается, что IVC может оказывать противораковое действие посредством иммуномодуляции 42,43 или посредством индукции аутофагии, опосредованной генерацией H 2 O 2 и истощением АТФ. 44-46 Было показано, что IVC действует как адъювант в других методах лечения рака, таких как гемцитабин при карциноме поджелудочной железы. 47-49Таким образом, IVC может играть важную роль в качестве вспомогательного средства к IV DCA при лечении запущенных форм рака.
На момент написания этой статьи 4 активных клинических испытания изучают роль перорального DCA в качестве терапии рака, но ни одно из испытаний в настоящее время не изучает способ введения IV. Из-за непатентованного статуса DCA исследователям сложно собрать средства в масштабах, необходимых для проведения испытаний на людях. Есть надежда, что эти случаи, иллюстрирующие преимущества IV DCA, побудят к более формальным клиническим исследованиям. Необходимы дальнейшие исследования in vitro и in vivo, чтобы помочь определить механизмы действия DCA и особенности типа опухоли и микросреды, которые благоприятно реагируют на этот препарат. Клинические испытания с участием пациентов, у которых уже известно, что опухоли благоприятно реагируют на DCA, необходимы для лучшей оценки преимуществ препарата и оптимизации схемы лечения. DCA показал себя многообещающим в сочетании с некоторыми традиционными химиотерапевтическими средствами, преимущество, которое также следует изучить подробнее.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании литературы и клинического опыта авторов, не по назначению IV DCA является многообещающим вариантом лечения для пациентов, которые полностью понимают и принимают его риски и преимущества, особенно тех, у кого нет доступных традиционных вариантов лечения. Эти исследования случаев показывают, что DCA имеет потенциал для продления жизни без снижения качества жизни пациентов с изнурительными побочными эффектами или ухудшением физиологических функций, даже при заболевании на очень поздней стадии. В представленных случаях терапия IV DCA была ограниченной продолжительности, что затрудняет оценку степени преимущества для выживания. Однако, основываясь на опыте авторов хронического использования перорального DCA, причем самым долгоживущим на данный момент является 48-летний мужчина с глиобластомой, который был стабилен в течение 6 лет при пероральном DCA без традиционной терапии, авторы полагают, что препарат обладает потенциалом для долгосрочной стабилизации и/или регрессии, а также существенного повышения выживаемости. Учитывая его доступность и низкую токсичность, DCA заслуживает дальнейшего изучения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентов за их поддержку и согласие на публикацию их случаев.

ЗАЯВЛЕНИЕ АВТОРА О РАСКРЫТИИ

В своих клиниках авторы применяли индивидуальные, интегративные, дополнительные протоколы к пациентам с раком за плату, включающую стоимость одного или нескольких лекарств, перечисленных в этой публикации. Клиники принадлежат авторам и/или членам их семей. Авторы не получали никаких других грантов или финансовой поддержки для этого исследования.

ССЫЛКИ

1 1. Результаты поиска «Дихлорацетатный рак». Веб-сайт ClinicalTrials.gov. http:// clinicaltrials.gov/ct2/results?term=dichloroacetate+cancer. Доступ 22 июля 2014 г.
2 Stacpoole PW, Harman EM, Curry SH, Baumgartner TG, Misbin RI. Лечение лактоацидоза дихлорацетатом. N Engl J Med. 1983;309(7):390-396.
3 Stacpoole PW, Lorenz AC, Thomas RG, Harman EM. Дихлорацетат в лечении лактоацидоза. Ann Intern Med. 1988;108(1):58-63.
4 Stacpoole PW, Wright EC, Baumgartner TG и др. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения лактоацидоза у взрослых: группа по изучению дихлорацетата и лактоацидоза. N Engl J Med. 1992;327(22):1564-1569.
5 Stacpoole PW, Kurtz TL, Han Z, Langaee T. Роль дихлорацетата в лечении генетических митохондриальных заболеваний. Adv Drug Deliv Rev. 2008;60(13- 14):1478-1487.
6 Stacpoole PW, Kerr DS, Barnes C и др. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактоацидоза у детей. Pediatrics. 2006;117(5):1519-1531.
7 Kaufmann P, Engelstad K, Wei Y и др. Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование. Neurology. 2006;66(3):324-330.
8 Brandsma D, Dorlo TP, Haanen JH, Beijnen JH, Boogerd W. Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом. J Neurol. 2010;257(12):2099-2100.
9 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE и др. Оценка долгосрочного лечения детей с врожденным лактоацидозом с помощью дихлорацетата. Pediatrics. 2008;121(5):e1223-e1228.
10 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J и др. Ось митохондриального-K+ канала подавляется при раке, и ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака. Cancer Cell. 2007;11(1):37-51.
11 Madhok BM, Yeluri S, Perry SL, Hughes TA, Jayne DG. Дихлорацетат индуцирует апоптоз и остановку клеточного цикла в клетках колоректального рака. Br J Cancer. 2010;102(12):1746-1752.
12 Cao W, Yacoub S, Shiverick KT и др. Дихлорацетат (DCA) сенсибилизирует как дикие, так и сверхэкспрессирующие Bcl-2 клетки рака предстательной железы in vitro к облучению. Prostate. 2008;68(11):1223-1231.
13 Saed GM, Fletcher NM, Jiang ZL, Abu-Soud HM, Diamond MP. Дихлорацетат индуцирует апоптоз эпителиальных клеток рака яичников посредством механизма, включающего модуляцию окислительного стресса. Reprod Sci. 2011;18(12):1253-1261.
14 Vella S, Conti M, Tasso R, Cancedda R, Pagano A. Дихлорацетат ингибирует рост нейробластомы, специфически действуя против злокачественных недифференцированных клеток. Int J Cancer. 2012;130(7):1484-1493.
15Fiebiger W, Olszewski U, Ulsperger E, Geissler K, Hamilton G. In vitro цитотоксичность новых препаратов на основе платины и дихлорацетата против линий клеток карциноида легких. Clin Transl Oncol. 2011;13(1):43-49.
16 Liu D, Liu S, Jing X, Li X, Li W, Huang Y. Некроз карциномы шейки матки дихлорацетатом, выделяемым из электропряденых полилактидных матов. Biomaterials. 2012;33(17):4362-4369.
17 Wong JY, Huggins GS, Debidda M, Munshi NC, De Vivo I. Дихлорацетат индуцирует апоптоз в клетках рака эндометрия. Gynecol Oncol. 2008;109(3):394-402.
18 Ishiguro T, Ishiguro R, Ishiguro M, Iwai S. Co-treatment of dichloroacetate, omeprazole and tamoxifen displayed synergistically antiproliferative effect on malignant tumors: in vivo experimentals and a case report. Гепатогастроэнтерология. 2012;59(116):994-996.
19 Sorokina LV, Pyatchanina TV, Didenko GV, Kaplia AA, Khyzhnyak SV. Влияние дихлорацетата натрия на окислительные процессы при саркоме 37. Exp Oncol. 2011;33(4):216-221.
20 Kumar A, Kant S, Singh SM. Новые молекулярные механизмы противоопухолевого действия дихлорацетата против Т-клеточной лимфомы: влияние измененного метаболизма глюкозы, гомеостаза pH и регуляции выживания клеток. Chem Biol Interact. 2012;199(1):29-37.
21 Sutendra G, Dromparis P, Kinnaird A и др. Активация митохондрий путем ингибирования PDKII подавляет сигнализацию HIF1a и ангиогенез при раке. Oncogene. 2013;32(13):1638-1650.
22 Shahrzad S, Lacombe K, Adamcic U, Minhas K, Coomber BL. Дихлорацетат натрия (DCA) снижает апоптоз при гипоксии колоректальных опухолей. Cancer Lett. 2010;297(1):75-83.
23 Anderson KM, Jajeh J, Guinan P, Rubenstein M. In vitro эффекты дихлорацетата и CO2 на гипоксические клетки HeLa. Anticancer Res. 2009;29(11):4579-4588.
24 Olszewski U, Poulsen TT, Ulsperger E, Poulsen HS, Geissler K, Hamilton G. In vitro цитотоксичность комбинаций дихлорацетата с противораковыми соединениями платины. Clin Pharmacol. 2010;2:177-183.
25 Xie J, Wang BS, Yu DH и др. Дихлорацетат переключает метаболизм с гликолиза на окисление глюкозы и проявляет синергическое ингибирование роста с цисплатином в клетках HeLa. Int J Oncol. 2011;38(2):409-417.
26 Данные наблюдений за лечением DCA онкологическим центром Medicor. Веб-сайт онкологических центров Medicor. http://medicorcancer.com/dca_therapy/dca-therapy-datajuly-2009/. Обновлено 1 июля 2009 г. Доступ 22 июля 2014 г.
27 Де Грандис Д. Ацетил-L-карнитин для лечения периферической нейропатии, вызванной химиотерапией: краткий обзор. Препараты для лечения ЦНС. 2007;21(suppl 1):39-43.
28Maestri A, De Pasquale Ceratti A, Cundari S, Zanna C, Cortesi E, Crino L. Пилотное исследование эффекта ацетил-L-карнитина при периферической нейропатии, вызванной паклитакселом и цисплатином. Tumori. 2005;91(2):135-138.
29 Evans JD, Jacobs TF, Evans EW. Роль ацетил-L-карнитина в лечении диабетической периферической нейропатии. Ann Pharmacother. 2008;42(11):1686-1691.
30 Di Cesare Mannelli L, Ghelardini C, Toscano A, Pacini A, Bartolini A. Защитный агент от нейропатии ацетил-L-карнитин активирует протеинкиназу C-гамма и MAPK в модели нейропатической боли у крыс. Neuroscience. 2010;165(4):1345-1352.
31 Mijnhout GS, Kollen BJ, Alkhalaf A, Kleefstra N, Bilo HJ. Альфа-липоевая кислота при симптоматической периферической нейропатии у пациентов с диабетом: метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. Int J Endocrinol. 2012;2012:456279.
32 Vallianou N, Evangelopoulos A, Koutalas P. Альфа-липоевая кислота и диабетическая нейропатия. Rev Diabet Stud. 2009;6(4):230-236.
33 Liu F, Zhang Y, Yang M и др. Лечебный эффект альфа-липоевой кислоты на периферическую нейропатию при диабете 2 типа: клиническое исследование [на китайском языке]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2007;87(38):2706-2709.
34 Ziegler D, Hanefeld M, Ruhnau KJ и др. Лечение симптоматической диабетической периферической нейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой: 3-недельное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN). Diabetologia. 1995;38(12):1425-1433.
35 Winkler G, Kempler P. Патомеханизм диабетической нейропатии: предпосылки патогенез-ориентированной терапии [на венгерском языке]. Orv Hetil. 2010;151(24):971-981.
36 Ang CD, Alviar MJ, Dans AL и др. Витамин B для лечения периферической нейропатии. Cochrane Database Syst Rev. 2008;(3):CD004573.
37 Winkler G, Pal B, Nagybeganyi E, Ory I, Porochnavec M, Kempler P. Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии. Arzneimittelforschung. 1999;49(3):220-224.
38 Savasi I, Evans MK, Heigenhauser GJ, Spriet LL. Метаболизм скелетных мышц не зависит от инфузии DCA и гипероксии после начала интенсивных аэробных упражнений. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002;283(1):E108-E115.
39 Shangraw RE, Lohan-Mannion D, Hayes A, Moriarty RM, Fu R, Robinson ST. Дихлорацетат стабилизирует интраоперационный кислотно-щелочной баланс во время трансплантации печени. Liver Transpl. 2008;14(7):989-998.
40. Lokich J, Ellenberg S, Gerson B, Knox WE, Zamcheck N. Очищение плазмы от карциноэмбрионального антигена после гепатоцеллюлярной метастатэктомии. J Clin Oncol. 1984;2(5):462-465.
41Khan A. Использование перорального дихлорацетата для облегчения боли в ноге, возникающей при метастатической низкодифференцированной карциноме: отчет о случае. J Palliat Med. 2011;14(8):973-977.
42 См. D, Mason S, Roshan R. Повышение фактора некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и функции естественных клеток-киллеров (NK) с использованием интегративного подхода при поздних стадиях рака. Immunol Invest. 2002;31(2):137-153.
43 Mikirova N, Casciari J, Rogers A, Taylor P. Влияние высоких доз внутривенного витамина C на воспаление у онкологических пациентов. J Transl Med. Сентябрь 2012;10:189.
44 Chen P, Yu J, Chalmers B, et al. Фармакологический аскорбат вызывает цитотоксичность в клетках рака простаты через истощение АТФ и индукцию аутофагии. Противораковые препараты. 2012;23(4):437-444.
45 Чен П., Стоун Дж., Салливан Г., Дриско Дж. А., Чен К. Противораковый эффект фармакологического аскорбата и его взаимодействие с дополнительным парентеральным глутатионом в доклинических моделях рака. Free Radic Biol Med. 2011;51(3):681-687.
46 Дойбзер Б., Майер Ф., Кучи З. и др. Цитотоксичность фармакологических концентраций аскорбата, опосредованная H(2)O(2), по отношению к клеткам нейробластомы: потенциальная роль лактата и ферритина. Cell Physiol Biochem. 2010;25(6):767-774.
47 Welsh JL, Wagner BA, van't Erve TJ и др. Фармакологический аскорбат с гемцитабином для контроля метастатического и лимфоположительного рака поджелудочной железы (PACMAN): результаты клинического исследования фазы I. Cancer Chemother Pharmacol. 2013;71(3):765-775.
48 Monti DA, Mitchell E, Bazzan AJ и др. Фаза I оценки внутривенной аскорбиновой кислоты в сочетании с гемцитабином и эрлотинибом у пациентов с метастатическим раком поджелудочной железы. PloS One. 2012;7(1):e29794.
49 Cullen JJ, Spitz DR, Buettner GR. Комментарий к «Фармакологический аскорбат синергизирует с гемцитабином в доклинических моделях рака поджелудочной железы», т. е. все, что мы говорим, это дать шанс C. Свободные радикалы Биол. Мед. 2011;50(12):1726-1727.

Влияние дихлорацетата натрия как отдельного препарата, так и в составе комбинированной терапии на рост и метастазирование опухолей легких

Кафедра фармакологии и терапии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты2Медицинский факультет, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты3Кафедра физиологии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты4Центр медицинских наук имени Зайеда, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты5Национальный институт здоровья и медицинских исследований (INSERM), 75013 Париж, Франция*Автор, которому следует адресовать корреспонденцию.

Международный журнал молекулярных наук 2021 , 22 (22), 12553; https://doi.org/10.3390/ijms222212553Получено: 24 октября 2021 г. / Пересмотрено: 14 ноября 2021 г. / Принято: 17 ноября 2021 г. / Опубликовано: 21 ноября 2021 г.(Эта статья относится к разделу Биохимия )

Абстрактный

Метаболическое перепрограммирование было признано важнейшим признаком нового рака. Сообщалось, что дихлорацетат (DCA), ингибитор пируватдегидрогеназной киназы (PDK), обладает противораковыми эффектами, обращая вспять гликолиз, связанный с опухолью. Это исследование было проведено для изучения противоракового потенциала DCA при раке легких отдельно и в сочетании с химио- и таргетной терапией с использованием двух линий клеток немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), а именно A549 и LNM35. DCA заметно вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности и роста колоний клеток A549 и LNM35 in vitro. DCA также снижал рост опухолевых ксенотрансплантатов как в хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, так и в моделях голых мышей in vivo. Кроме того, DCA снижал ангиогенную способность эндотелиальных клеток пупочной вены человека in vitro. С другой стороны, DCA не ингибировал in vitro клеточную миграцию и инвазию, а также in vivo заболеваемость и рост метастазов подмышечных лимфатических узлов у голых мышей. Лечение DCA не показало никакой токсичности у куриных эмбрионов и голых мышей. Наконец, мы продемонстрировали, что DCA значительно усилил противораковый эффект цисплатина в LNM35. Кроме того, сочетание DCA с гефитинибом или эрлотинибом приводит к аддитивным эффектам на ингибирование роста колоний LNM35 после семи дней лечения и к синергетическим эффектам на ингибирование роста колоний A549 после 14 дней лечения. В совокупности это исследование демонстрирует, что DCA является безопасным и перспективным терапевтическим средством для лечения рака легких.Ключевые слова:рак легких ; дихлорацетат ; ингибитор киназы пируватдегидрогеназы ; рост опухоли ; ангиогенез ; гефитиниб ; эрлотиниб

1. Введение

Рак легких является вторым по частоте встречаемости видом рака с самым высоким уровнем смертности в мире, составив 2,2 миллиона случаев и 1,8 миллиона смертей в 2020 году. Прогнозируется, что заболеваемость и смертность продолжат расти примерно на 60%, до предполагаемых 3,6 миллиона и 3 миллионов соответственно в 2040 году [ 1 ]. Большинство случаев рака легких — это НМРЛ, на которые приходится 80–85% всех случаев рака легких [ 2 ]. Развитие таргетной и иммунотерапии произвело революцию в лечении НМРЛ. Однако побочные эффекты, резистентность и эффективность в небольшой терапевтически чувствительной группе пациентов создают неравенство в доступе к таким агентам [ 3 , 4 , 5 ]. Таким образом, это подчеркивает необходимость в более безопасных и эффективных агентах.Метаболическое перепрограммирование является одним из отличительных признаков рака, который является многообещающей целью для разработки эффективных терапевтических подходов [ 6 ]. По сравнению с нормальными клетками, которые в основном полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) в аэробных условиях, раковые клетки отклоняются от этого нормального метаболического фенотипа, полагаясь в основном на цитозольный гликолиз и молочнокислое брожение, даже в присутствии кислорода, чтобы удовлетворить потребности высокой пролиферации [ 7 ]. Это явление известно как эффект Варбурга, который использовался в качестве терапевтической цели для ингибирования роста опухоли [ 8 ]. PDK является одним из основных ферментов, контролирующих гликолиз и OXPHOS [ 9 ]. Он отключает митохондриальный OXPHOS путем фосфорилирования и ингибирования пируватдегидрогеназы (PDH), ключевого фермента, катализирующего окислительное превращение пирувата в ацетилкофермент А в митохондриях [ 10 ].DCA — это препарат с небольшой молекулярной массой, который использовался при лактоацидозе, врожденных митохондриальных дефектах и ​​диабете [ 11 ]. Интересно, что DCA продемонстрировал способность переключать метаболизм опухоли с цитозольного аэробного гликолиза на митохондриальный OXPHOS путем ингибирования PDK и повышения активности PDH [ 12 ]. Таким образом, сообщалось, что DCA оказывает противораковое действие за счет увеличения оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, а также повышения уровня ROS с последующей гибелью раковых клеток [ 11 , 13 , 14 , 15 ]. Однако в клинических исследованиях профиль безопасности DCA вызывал беспокойство. 

2. Результаты

2.1 Влияние DCA на жизнеспособность клеток и рост колоний линий клеток НМРЛ

Эффект увеличения концентрации DCA (3,125–100 мМ) был исследован на двух линиях клеток NSCLC, а именно, A549 и LNM35. Как показано на рисунке 1 , DCA снижал жизнеспособность A549 ( рисунок 1 A) и LNM35 ( рисунок 1 B) в зависимости от концентрации и времени. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC 50 ) DCA через 48 ч составляет приблизительно 25 мМ для обеих линий клеток.Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие раковые клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) инкубировали в отсутствие или в присутствии увеличивающихся концентраций DCA (3,125–100 мМ) в течение 24, 48 и 72 ч. Жизнеспособность клеток оценивали, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее трех раз. Формы представляют средние значения, столбцы представляют SEM. Раковые клетки A549 ( C ) и LNM35 ( D ) выращивали в течение 7 дней для формирования колоний, которые обрабатывали различными концентрациями DCA (6,25–50 мМ) в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E ) Репрезентативные фотографии контрольных и обработанных DCA колоний показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Результаты представлены в виде процента колоний (среднее значение ± SEM) обработанных клеток по сравнению с контролем. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Для дальнейшей оценки противоракового эффекта DCA было исследовано его влияние на рост предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. Для этого обе клеточные линии выращивали при определенной плотности в течение 1 недели для формирования колоний, а затем обрабатывали возрастающей концентрацией DCA в течение 1 недели. Как показано на рисунке 1 , DCA вызывал зависимое от концентрации сокращение числа колоний для обеих клеточных линий, с более высокой чувствительностью, показанной в колониях LNM35 ( рисунок 1 D,E) по сравнению с колониями A549 ( рисунок 1 C,E). Эти результаты подтверждают противораковый эффект DCA in vitro.

2.2 Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухоли НМРЛ в курином эмбрионе CAM и голых мышах in vivo

Для подтверждения фармакологической значимости наших результатов in vitro противораковый эффект DCA оценивали in vivo с использованием анализа CAM на курином эмбрионе. Ксенотрансплантированные опухоли A549 и LNM35 на CAM обрабатывали 50 мМ DCA каждые 48 ч в течение 1 недели. На E17 опухоли извлекали из верхней части CAM и взвешивали. Как показано на рисунке 2 , 50 мМ DCA значительно снизили рост ксенотрансплантатов опухоли A549 примерно на 40% ( рисунок 2 A), в то время как не показали значительного снижения роста ксенотрансплантатов опухоли LNM35 ( рисунок 2 B). Поэтому 100 мМ DCA исследовали на ксенотрансплантатах опухоли LNM35, и это значительно снизило рост примерно на 40% ( рисунок 2 C). Токсичность также оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах. На E17 DCA не проявил цитотоксичности, поскольку процент живых эмбрионов был аналогичен контрольной группе и группе DCA ( рисунок 2 D–F).Рисунок 2. Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухолей A549 и LNM35 в CAM куриного эмбриона in vivo. ( A ) Масса опухоли раковых клеток A549, ксенотрансплантированных на CAM при плотности 1 миллион клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ) в течение 1 недели. ( B , C ) Масса опухоли раковых клеток LNM35, ксенотрансплантированных на CAM при плотности 0,3 миллиона клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ и 100 мМ). ( D ) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах A549. ( E , F ) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах LNM35. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Влияние DCA на опухолевые ксенотрансплантаты также оценивалось in vivo с использованием бестимусных мышей, инокулированных клетками A549 и LNM35. Сообщалось, что средние летальные дозы (LD50) DCA составляли 4,5 г/кг и 5,5 г/кг у крыс и мышей соответственно [ 17 ]. Поэтому мыши с опухолевыми ксенотрансплантатами A549 получали перорально ежедневно (5 дней в неделю) 50 мг/кг и 200 мг/кг DCA в течение 38 последовательных дней. Лечение DCA (50 мг/кг) не вызвало значительного уменьшения объема опухолевых ксенотрансплантатов A549, в то время как DCA (200 мг/кг) значительно уменьшил объем примерно на 45% ( Рисунок 3 A). Аналогичная разница также наблюдалась в весе опухоли в конце эксперимента ( Рисунок 3 B). Не было выявлено никаких явных признаков токсичности или каких-либо проявлений нежелательного воздействия DCA на поведение животных, массу тела ( рисунок 3 C), компоненты крови, функцию печени и почек ( рисунок 3 D).Рисунок 3. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата A549, инокулированного голым мышам in vivo. ( A ) Объем опухоли ксенотрансплантата A549, инокулированного подкожно голым мышам и леченного DCA (50 и 200 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем в течение 38 дней. ( B ) Вес опухоли, полученный от тех же контрольных и обработанных DCA голых мышей. ( C ) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. ( D ) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. * Значительно отличается при <0,05. ** Значительно отличается при <0,01. ns — незначимо.С другой стороны, наблюдался рост ксенотрансплантатов опухоли LNM35, и мышам вводили перорально 200 мг/кг и 500 мг/кг DCA каждый день (5 дней в неделю) в течение 10 и 24 дней соответственно. Лечение DCA (200 мг/кг) вызвало незначительное уменьшение объема ксенотрансплантатов опухоли LNM35 ( Рисунок 4 A), в то время как DCA (500 мг/кг) значительно уменьшило объем опухоли почти на 75% ( Рисунок 4 B). Почти такие же различия наблюдались в весе опухоли в конце экспериментов ( Рисунок 4 C). Никаких признаков токсичности не наблюдалось в поведении животных или не было обнаружено по весу мышей ( Рисунок 4 D,E), компонентам крови, печени и функции почек ( Рисунок 4 F).Рисунок 4. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата LNM35, инокулированного голым мышам in vivo. ( A , B ) Объем опухоли ксенотрансплантата LNM35, инокулированного подкожно голым мышам и леченного, соответственно, DCA (200 и 500 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем ежедневно в течение 10 и 24 дней. ( C ) Вес опухоли, полученный от контрольных и голых мышей, получавших 500 мг/кг DCA. ( D , E ) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. ( F ) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–11 мышей/группу. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. ns — недостоверно.

2.3 Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур и прорастание HUVEC in vitro

Ангиогенез является одним из признаков рака, который обеспечивает поставку питательных веществ и кислорода для роста и распространения раковых клеток. Влияние DCA на ангиогенез было исследовано in vitro с использованием HUVEC, которые могут образовывать капилляроподобные структуры при посеве на Матригель. Как показано на рисунке 5 A, HUVEC образовывали организованные капилляроподобные структуры в отсутствие DCA, и эта организация была нарушена после добавления DCA. Длины трубок измеряли вручную ( рисунок 5 B) и с помощью анализа изображений Wimasis ( рисунок 5 C), и было обнаружено, что 25 мМ DCA были способны значительно ингибировать способность HUVEC образовывать нитевидные структуры почти на 30–40%. Это ингибирование наблюдалось при концентрациях, которые не показывали никакого снижения жизнеспособности HUVEC ( рисунок 5 D).Рисунок 5. Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур HUVEC in vitro. ( A ) Формы ангиогенеза, индуцированного в HUVEC, культивируемых на матрице Matrigel в 96-луночном планшете в отсутствие и в присутствии различных концентраций DCA. Для контрастной фотографии использовался инвертированный микроскоп (4×), а для уточнения изображений использовалось программное обеспечение Wimasis. ( B , C ) Количественная оценка канальцевого ангиогенеза, индуцированного в клетках HUVEC, культивируемых в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ) вручную и с помощью программного обеспечения Wimasis соответственно. ( D ) Жизнеспособность клеток HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы», в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ). Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Столбцы представляют средние значения; полосы представляют SEM *** Значительно отличается при <0,001. **** Значимое отличие при <0,0001. ns — незначимо.В анализе прорастания сфероиды HUVECs были встроены в 3D коллагеновую матрицу в присутствии и отсутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или комбинации VEGF и DCA. Рисунок 6A показывает в репрезентативном эксперименте, что проростки, образованные в присутствии VEGF, были ингибированы DCA, 25 мМ. Были измерены общие длины проростков, и было обнаружено, что общая длина была значительно увеличена в присутствии VEGF, а DCA значительно уменьшил длину проростков, индуцированных VEGF ( Рисунок 6B ). Это ингибирование наблюдалось при концентрации, которая не показывала никакого снижения жизнеспособности HUVECs ( Рисунок 6C ).Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков внедренными сфероидами HUVEC in vitro. ( A ) Представительные изображения предварительно окрашенных сфероидов HUVEC через 24 часа внедрения в коллагеновую матрицу в присутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или VEGF + DCA. Использовался инвертированный микроскоп с 20-кратным увеличением. ( B ) Среднее значение общей длины ростков различных сфероидов для каждого условия из одного представительного эксперимента. ( C ) Жизнеспособность HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты были повторены 2 раза. Столбцы представляют средние значения 12 сфероидов; полосы представляют SEM **** Значительно отличается при <0,0001. #### Значительно отличается при <0,0001. ns: незначимо.Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование ангиогенеза в опухолях может быть потенциальным механизмом, выходящим за рамки противоракового действия DCA.

2.4 Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro

Метастазирование — многоступенчатый процесс, включающий отделение клеток от первичной опухоли, миграцию клеток в соседние ткани с последующей инвазией клеток в кровь или лимфатическую систему до колонизации этих клеток в отдаленных органах. Влияние DCA на метастазирование у мышей, которым ксенотрансплантировали клетки рака легких с высокой степенью метастазирования, а именно LNM35, оценивали путем проверки веса и частоты подмышечных лимфатических узлов в контрольной и обработанной DCA группах. DCA снижает рост метастазов в лимфатических узлах, не достигая статистической значимости ( рисунок 7 A). Кроме того, он не влияет на частоту метастазов в лимфатических узлах ( рисунок 7 B).Рисунок 7. Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro. ( A ) Вес подмышечных лимфатических узлов с метастазами LNM35 в контрольной группе и группе, получавшей DCA (500 мг/кг перорально). ( B ) Процент мышей с метастазами в лимфатических узлах LNM35 в контрольной группе и группе, получавшей DCA. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. Используя анализ в камере инвазии Бойдена, клетки LNM35 ( C ) и A549 ( D ) инкубировали в течение 24 ч в отсутствие и в присутствии DCA (6,25, 12,5 мМ). Клетки, которые проникли в Матригель и пересекли поры 8 мкм, определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». Царапины были нанесены на сливающиеся монослои клеток LNM35 ( E ) и A549 ( F ), культивируемых в 6-луночном планшете в отсутствие и в присутствии DCA (6,25, 12,5 мМ). Инвертированный микроскоп с 4-кратным увеличением использовался для измерения среднего расстояния, на которое клетки мигрировали от края соскобленной области в течение 2, 6 и 24 ч. Фотографии индуцированных царапин на сливающихся монослоях клеток LNM35 ( G ) и клеток A549 ( H ) в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA через 0, 2, 6 и 24 ч. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы или формы являются средними значениями; столбцы являются SEM * Значительно отличается при <0,05. ** Значительно отличается при <0,01. ns — незначимо.Для оценки способности DCA инвазии и миграции клеток A549 и LNM35 in vitro использовались анализ инвазии в камере Бойдена и анализ миграции при заживлении ран. Чтобы убедиться, что потенциальное влияние DCA на миграцию и инвазию не обусловлено гибелью клеток, мы использовали более низкие концентрации DCA. В этих условиях 6,25 мМ и 12,5 мМ DCA не смогли ингибировать клеточную инвазию LNM35 ( Рисунок 7 C) и A549 ( Рисунок 7 D). Аналогично, эти концентрации не смогли ингибировать клеточную миграцию обеих клеточных линий ( Рисунок 7 E–H).

2.6 Влияние DCA в сочетании с EGFR-TKi на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний

Влияние 48-часовой инкубации с увеличивающимися концентрациями гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ) было исследовано на раковых клетках A549 и LNM35. Гефитиниб вызывал зависимое от концентрации снижение жизнеспособности раковых клеток A549 и LNM35 ( Рисунок 9 A,B); аналогично, эрлотиниб показал ту же картину снижения в двух клеточных линиях ( Рисунок 9 C,D). Количество 20 мкМ гефитиниба и эрлотиниба обладает способностью в обеих клеточных линиях ингибировать клеточную жизнеспособность A549 и LNM35 примерно на 40%, и эта концентрация использовалась в комбинированных экспериментах с DCA.Рисунок 9. Влияние EGFR-Tki на жизнеспособность клеток НМРЛ. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A , C ) и LNM35 ( B , D ) обрабатывали лекарственным носителем, гефитинибом или эрлотинибом (5–80 мкМ) в течение 48 ч. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Столбцы — средние значения; полосы — SEM * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Обработка клеток в течение 48 ч 25 мМ DCA значительно усилила эффект гефитиниба на жизнеспособность клеток A549 ( Рисунок 10 A) и LNM35 ( Рисунок 10 B). Затем был проведен клоногенный анализ для оценки эффекта комбинации на рост предварительно сформированных колоний обеих клеточных линий после семи дней обработки. Концентрация 20 мкМ гефитиниба вызвала 20–40%-ное снижение количества колоний A549 ( Рисунок 10 C) и LNM35 ( Рисунок 10 D). По сравнению с индивидуальными обработками, комбинация DCA с гефитинибом приводит к значительному снижению количества колоний обеих клеточных линий ( Рисунок 10 C, D), вызывая аддитивный эффект в LNM35 по сравнению с расчетным аддитивным значением отдельных обработок (86% против 90%). Кроме того, эта комбинация показывает значительное снижение плотности клеток отдельных колоний обеих клеточных линий ( рисунок 10 E,F).Рисунок 10. Влияние DCA в сочетании с гефитинибом на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) обрабатывали, соответственно, DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo. ( C , D ) Обработка предварительно сформированных колоний клеток A549 и LNM35, соответственно, DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E , F ) Репрезентативные изображения колоний для контрольной и обработанной групп показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Аналогично, DCA усиливает ингибирующее действие эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35 ( Рисунок 11 A, B). Количество колоний A549 и LNM35 было значительно снижено при применении эрлотиниба на 30–40% ( Рисунок 11 C, D), и это снижение было усилено DCA в LNM35 ( Рисунок 11 D), но не в A549 ( Рисунок 11 C). Комбинация вызвала аддитивные эффекты в LNM35, уменьшив количество колоний на 76 ± 2,8%, что статистически незначимо по сравнению с расчетным аддитивным значением отдельных обработок (91 ± 5,8%). Несмотря на незначительное снижение количества колоний A549 при использовании комбинации по сравнению с обработкой одним препаратом, плотность клеток каждой колонии была значительно снижена по сравнению с отдельными обработками ( Рисунок 11 E). Аналогичным образом, плотность клеток колоний LNM35 была снижена в группе, получавшей комбинированную терапию ( рисунок 11 F).Рисунок 11. Влияние DCA в сочетании с эрлотинибом на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) обрабатывали, соответственно, DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo. ( C , D ) Обработка предварительно сформированных колоний клеток A549 и LNM35, соответственно, DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E , F ) Репрезентативные изображения колоний для контрольной и обработанной групп показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Для изучения различий между двумя клеточными линиями в воздействии комбинированной терапии на рост колоний была исследована более длительная продолжительность лечения DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом на рост колоний A549. Как показано на рисунке 12 , комбинация DCA с гефитинибом приводит к значительному сокращению числа колоний ( рисунок 12 A,B). Эта комбинация вызвала большее ингибирование числа колоний по сравнению с рассчитанными аддитивными эффектами препаратов, используемых по отдельности ( рисунок 12 C). Аналогичное наблюдение было отмечено при комбинации DCA и эрлотиниба ( рисунок 12 D–F). В заключение следует отметить, что увеличение продолжительности лечения с семи до четырнадцати дней приводит к синергетическим эффектам предлагаемых комбинированных протоколов.Рисунок 12. Влияние более длительного лечения DCA в сочетании с гефитинибом и эрлотинибом на рост колоний A549. Обработка предварительно сформированных колоний A549 DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ ( A , B ) и DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ ( D , E ) в течение 14 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( C , F ) Влияние комбинаций DCA и гефитиниба или эрлотиниба на рост колоний по сравнению с рассчитанными аддитивными эффектами двух препаратов по отдельности. Все эксперименты были повторены 3 раза. Столбцы представляют собой средние значения; полосы представляют собой SEM ** Значительно отличается при <0,01. *** Значительно отличается при <0,001. **** Значительно отличается при <0,0001.

3. Обсуждение

Несмотря на недавние достижения в скрининге, диагностике и лечении рака легких, в дополнение к замечательному прогрессу в понимании его молекулярной биологии, рак легких является вторым наиболее часто диагностируемым видом рака с самым высоким уровнем смертности во всем мире в 2020 году [ 1 ]. Поэтому прилагаются различные усилия для разработки эффективных агентов и подходов с хорошими пределами безопасности для воздействия на рак легких в попытке обеспечить излечение или улучшить общую выживаемость пациента. Целью данного исследования было изучение влияния метаболического препарата DCA на рост, миграцию, инвазию и ангиогенез рака легких in vitro и рост опухоли и метастазы in vivo, а также влияние целевого метаболизма DCA на цитотоксический эффект одобренной химиотерапии и таргетной терапии в качестве шага к достижению лучшей эффективности и лучшего профиля безопасности.Настоящее исследование показало, что DCA (3,125–100 мМ) вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности клеток и роста предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. IC50 DCA через 48 ч составлял приблизительно 25 мМ в обеих клеточных линиях. Наши результаты согласуются с другими отчетами, в которых DCA (10–90 мМ) подавлял жизнеспособность клеток линий колоректального рака (КРР), а именно SW620, LS174t, LoVo и HT-29, в зависимости от концентрации через 48 ч с диапазоном IC50 30–50 мМ в соответствии с типом клеточной линии [ 18 ]. Аналогично, DCA (20 мМ) значительно снизил жизнеспособность клеток CRC, а именно SW480, LoVo и HT-29 через 48 ч, с большим эффектом на слабодифференцированные клетки SW480 и метастатические клетки LoVo по сравнению с хорошо дифференцированными клетками HT-29 [ 19 ]. С другой стороны, более высокий IC50 был зарегистрирован в клетках рака шейки матки, клетках Hela и SiHa [ 20 ], в то время как DCA (20 мМ) не смог ингибировать жизнеспособность клеток линии рака молочной железы MCF-7 [ 21 ].Наши данные in vitro были подтверждены путем тестирования влияния DCA на прогрессирование опухоли in vivo с использованием моделей CAM куриного эмбриона и бестимусных мышей. Во-первых, мы продемонстрировали, что значительное снижение роста было достигнуто в A549 и LNM35, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона, при использовании доз DCA 50 мМ и 100 мМ соответственно. Во время написания этой рукописи было опубликовано исследование, в котором изучалось влияние натрия DCA на линии клеток глиобластомы U87 MG и PBT24, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона [ 22 ]. Авторы сообщили об изменении роста опухолей U87 MG и PBT24 в ответ на различные концентрации натрия DCA. Сообщалось, что 10 мМ натрия DCA были эффективны в снижении роста опухоли PBT24, но не опухоли U87, что отражает некоторые различия в биологии двух линий клеток [ 22 ]. Во-вторых, мы продемонстрировали, что лечение DCA в дозах 200 мг/кг ежедневно (5 дней в неделю) вызвало значительное снижение роста ксенотрансплантированной опухоли A549 на 40%, в то время как для значительного снижения роста ксенотрансплантированной опухоли LNM35 потребовалась более высокая доза DCA (500 мг/кг). В этом контексте ранее сообщалось, что DCA (100 мг/кг) увеличил время удвоения опухолей A549 и H1975 NSCLC примерно с 3 до 6,5 дней [ 15 ], но не оказал значительного ингибирующего эффекта у мышей с опухолью MDA-MB-231 [ 23 ]. С другой стороны, значительная задержка роста также наблюдалась у ксенотрансплантатов HT-29, леченных пероральным DCA (200 мг/кг) ежедневно в течение четырех дней [ 24 ].Исследование токсичности потенциальных противораковых препаратов так же важно, как и исследование их эффективности, поскольку тяжелая токсичность может помешать их использованию в клинике. DCA не показал цитотоксичности для куриных эмбрионов и бестимусных мышей. Процент живых эмбрионов был одинаковым в группах, получавших DCA, и контрольных группах. Кроме того, DCA не повлиял на поведение мышей, вес, общий анализ крови, параметры функции печени и почек по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с предыдущими доклиническими и клиническими отчетами, которые не показали никаких доказательств тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности при лечении DCA [ 13 , 14 ]. Немногие пациенты, получавшие лечение DCA, жаловались на общие желудочно-кишечные эффекты. Кроме того, наиболее распространенным ограничением для введения DCA является обратимая периферическая невропатия, которую можно свести к минимуму путем снижения дозы или дополнительного введения антиоксидантов [ 11 ]. Включение DCA в системы доставки лекарств (СДЛ), такие как наночастицы, является многообещающим подходом для сохранения противораковой активности DCA с минимальными побочными эффектами [ 25 , 26 , 27 ].Сообщалось, что противораковый эффект DCA частично обусловлен индукцией апоптоза, как это наблюдалось в клетках колоректального рака [ 19 ] и клетках НМРЛ [ 15 ] или ингибированием ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза, такие как антитело к VEGF бевацизумаб и блокатор рецепторов VEGF рамуцирумаб, были клинически одобрены для лечения рака легких [ 28 ]. Несмотря на их подтвержденную эффективность, их скромные общие терапевтические эффекты с сопутствующими побочными эффектами подчеркивают очевидную необходимость в более эффективном подходе, нацеленном на ангиогенез [ 28 ]. Наше исследование показало, что DCA (25 мМ) является перспективным антиангиогенным средством, поскольку он способен значительно ингибировать образование и прорастание эндотелиальных клеток in vitro. Кроме того, более низкие концентрации DCA (6,25 и 12,5 мМ) не влияли на образование трубок HUVEC. Эти результаты согласуются с отчетом Шунджанса и его коллег, которые продемонстрировали, что 5 мМ и 10 мМ DCA не повлияли на формирование трубок HUVEC in vitro [ 29 ]. В соответствии с нашими данными, DCA вызвал снижение плотности микрососудов опухоли у обработанных крыс, у которых также было отмечено подавление HIF1α в опухолевых клетках [ 30 ]. С другой стороны, Чжао и его коллеги недавно сообщили, что DCA стимулирует ангиогенез в модели сосудистой деменции у крыс за счет улучшения функции эндотелиальных клеток-предшественников [ 31 ].Примерно у 30–40% пациентов с НМРЛ на момент постановки диагноза наблюдалось метастатическое заболевание. Отдаленные метастазы отрицательно влияют на варианты лечения, ответ и выживаемость [ 32 ] и являются основной причиной смерти от рака легких [ 33 ]. Метастазирование — это многоступенчатый процесс, включающий отсоединение раковых клеток, миграцию, инвазию и колонизацию в отдаленных участках. Поэтому терапевтические агенты и схемы, уменьшающие такой отличительный признак рака, имеют большое значение в терапии рака. Несмотря на продемонстрированную антиангиогенную активность DCA, это исследование не показало влияния DCA на метастазирование клеток LNM35, ксенотрансплантированных бестимусным мышам, получавшим перорально эффективную дозу. В этом исследовании клетки LNM35, ксенотрансплантированные путем подкожной инокуляции бестимусным мышам, вызвали 90% случаев метастазов в подмышечных лимфатических узлах, и DCA не смог снизить частоту и рост этих метастазов в лимфатических узлах. Линия клеток LNM35 была создана в 2000 году как первая линия клеток рака легких человека, имеющая лимфогенные метастатические свойства со 100% частотой после подкожной инъекции в боковой бок голых мышей [ 34 ]. Кроме того, DCA не показал никаких ингибирующих эффектов на миграционные и инвазивные свойства клеток LNM35 и A549 in vitro. Аналогичным образом сообщалось, что монотерапия DCA не была эффективна в снижении метастазов в легких из метастатических клеток рака груди, ксенотрансплантированных голым мышам [ 23 ].Комбинированная терапия является фундаментальным подходом в лечении рака. Сочетание различных противораковых препаратов позволяет воздействовать на различные основные сигнальные пути для усиления терапевтических преимуществ, избегания приобретенной резистентности и снижения тяжести побочных эффектов [ 35 ]. Химиотерапия играет неотъемлемую роль в лечении пациентов с НМРЛ. Обычно используется схема с платиной (цисплатин или карбоплатин) плюс паклитаксел, гемцитабин, доцетаксел, винорелбин, иринотекан или пеметрексед [ 36 ]. Неселективные характеристики химиотерапевтических агентов приводят к скромному увеличению выживаемости при значительной токсичности для пациента [ 37 ]. Это подчеркивает необходимость в более эффективных стратегиях для улучшения результатов лечения пациентов с минимальными побочными эффектами. В настоящем исследовании DCA не удалось усилить противораковый эффект камптотецина и гемцитабина в обеих линиях клеток НМРЛ. Кроме того, DCA не смог значительно усилить противораковые эффекты цисплатина в клеточной линии A549 in vitro, но он усилил цитотоксический эффект цисплатина в клеточной линии LNM35, что отражает роль генетического фона раковых клеток в определении пути гибели клеток, вызванного препаратами. Ким и др. сообщили, что клетки A549 имеют более низкую скорость аэробного гликолиза по сравнению с клетками H460 из-за дифференциальной экспрессии некоторых метаболических ферментов [ 38 ]. Аэробный гликолиз при раке был связан с химиорезистентностью, и ингибирование связанных путей было предложено в качестве механизма преодоления такой резистентности. Например, сверхэкспрессия PDK4 при раке мочевого пузыря высокой степени злокачественности заставляет совместное введение DCA с цисплатином вызывать резкое снижение роста опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [ 39 ]. Аналогичным образом, введение DCA с паклитакселом было описано как успешный подход к преодолению резистентных к паклитакселу клеток НМРЛ из-за сверхэкспрессии PDK2 [ 40 ]. Кроме того, Галгамува и др. заявили, что предварительное лечение DCA значительно ослабило нефротоксичность, вызванную цисплатином у мышей, сохранив противораковые эффекты цисплатина [ 41 ].Открытие таргетной терапии помогло врачам адаптировать варианты лечения для пациентов с НМРЛ. Было разработано много таргетных препаратов, которые стали частью первой линии лечения НМРЛ, например, гефитиниб и эрлотиниб, которые считаются первым поколением EGFR-TKi [ 42 ]. Гефитиниб и эрлотиниб были одобрены более 10 лет назад для лечения пациентов с прогрессирующим мутантным EGFR НМРЛ, не получавших химиотерапию, в качестве первой линии лечения. Они также используются в качестве второй линии терапии после неудачи химиотерапии [43]. Некоторые отчеты показали, что эрлотиниб имеет хорошую эффективность у пациентов с НМРЛ с диким типом EGFR [ 44 ]. Поддерживающая доза может принести пользу этим пациентам после химиотерапии на основе платины, которая считается основной терапией при НМРЛ с диким типом EGFR [ 45 ]. Несмотря на значительные преимущества, у многих пациентов после 10–14 месяцев лечения развилась терапевтическая резистентность из-за вторичной мутации в гене EGFR [ 46 ].В этом исследовании мы стремились изучить способность DCA сенсибилизировать линии клеток NSCLC дикого типа EGFR при сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. DCA значительно усилил ингибирующий эффект гефитиниба и эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35. Это исследование также показало аддитивные эффекты на рост колоний LNM35 при сочетании DCA с гефитинибом или эрлотинибом в течение семи дней лечения. Более того, эта комбинация оказала синергическое действие на рост колоний A549 после четырнадцати дней лечения. Кроме того, все эти протоколы комбинирования привели к существенному снижению клеточной плотности отдельных колоний как A549, так и LNM35. В этом контексте сообщалось, что DCA с гефитинибом или эрлотинибом синергически подавляет жизнеспособность и способность к образованию колоний мутантных клеток EGFR (NCI-H1975 и NCI-H1650) из-за синергического эффекта в продвижении апоптоза. В клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460) они показали, по сравнению с индивидуальными обработками, что комбинация вызывала повышенное значение фракции, затронутой (Fa), в жизнеспособности клеток, не достигая уровня синергизма в клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460), и эта комбинация не подавляла значительно образование колоний этих линий клеток [ 47 ]. Различия в экспериментальных условиях между вышеупомянутым отчетом и нашим исследованием могут объяснить такие переменные результаты. В своем клоногенном анализе исследователи обрабатывали отдельные клетки в течение трех последовательных дней, а затем инкубировали в среде без лекарственных средств в течение 15 дней для формирования колоний; Однако в наших экспериментах клетки сначала инкубировали в течение десяти дней для формирования колоний, а затем подвергали обработке в течение семи и четырнадцати дней.Подводя итог, можно сказать, что это исследование продемонстрировало, что DCA является перспективным противораковым средством для лечения НМРЛ, подавляя жизнеспособность клеток и рост колоний клеток НМРЛ in vitro, а также рост опухолей у эмбрионов цыплят CAM и голых мышей, в которых также оценивалась безопасность этого средства. DCA подавляет способность эндотелиальных клеток образовывать капилляроподобные структуры и прорастать in vitro, что позволяет предположить ингибирование ангиогенеза как потенциальный механизм противоракового эффекта. Это исследование также выявило потенциальную ценность DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. Результаты этого исследования прокладывают путь для подтверждения влияния комбинации DCA с гефитинибом или эрлотинибом на рост опухоли in vivo, в дополнение к исследованию влияния DCA в сочетании с EGFR-TKi второго и третьего поколения.

4. Материалы и методы

4.1. Культура клеток и реагенты

Клетки NSCLC, A549 и LNM35, поддерживались в среде RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 . Среда была дополнена 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Hyclone, Cramlington, UK) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Cramlington, UK). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) поддерживались в полном наборе сред EndoGRO TM -VEGF (Merck Millipore, Massachusetts, USA) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в колбах, покрытых 0,2% желатином. Культуральную среду всех клеток меняли каждые 3 дня, а клетки пересевали один раз в неделю, когда культура достигала 95% конфлюэнтности для раковых клеток и 80% для HUVEC.Натрий DCA, цисплатин, камптотецин, гемцитабин HCl, эрлотиниб HCl и гефитиниб были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). DCA был свежерастворен в воде HyPure (Hyclone, Крамлингтон, Великобритания) перед началом любого эксперимента для приготовления исходного раствора 1 М, который затем был разбавлен до требуемых концентраций для лечения.

4.2 Жизнеспособность клеток

Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночный планшет. Через 24 часа клетки обрабатывали возрастающей концентрацией DCA (3,125–100 мМ) в двух повторностях в течение 24, 48 и 72 часов, тогда как контрольные клетки обрабатывали лекарственным средством (вода Hypure), смешанным со средой. В указанные временные точки использовали анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) для определения влияния DCA на жизнеспособность клеток путем количественной оценки АТФ, которая будет пропорциональна количеству метаболически активных клеток. Люминесцентный сигнал измеряли с помощью люминометра GloMax ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность клеток была представлена ​​в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности клеток, обработанных DCA, с контрольными клетками, жизнеспособность которых предполагалась равной 100%.Во втором наборе экспериментов клетки обрабатывали в течение 48 ч возрастающей концентрацией гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ). Кроме того, клетки обрабатывали в течение 48 ч комбинацией DCA и других противораковых агентов, а именно цисплатина, камптотецина, гемцитабина, гефитиниба и эрлотиниба. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа люминесцентной жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® и люминометра GloMax ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность представляли в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности обработанных лекарством клеток с контрольными клетками.

4.3 Клоногенный анализ

В 6-луночный планшет высевали клетки A549 и LNM35, соответственно, по 50 и 100 клеток на лунку. Клетки выдерживали для роста в колонии в течение 7–10 дней во влажной атмосфере при 37 °C и 5% CO2 , при этом среду меняли каждые три дня. Образованные колонии обрабатывали каждые 3 дня в течение 7 дней возрастающими концентрациями DCA (6,25–50 мМ). После этого колонии промывали три раза 1× PBS, фиксировали и окрашивали в течение 2 часов 0,5% кристаллическим фиолетовым, растворенным в 50% метаноле ( об. / об. ). Наконец, колонии промывали 1× PBS и фотографировали, и подсчитывали колонии с более чем 50 клетками. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных DCA, с контрольными колониями. Плотность клеток колоний оценивали путем фотографирования колоний в каждой группе с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа (4×).Во втором наборе экспериментов сформированные колонии обрабатывались каждые 3 дня в течение 7 или 14 дней комбинацией DCA и гефитиниба или DCA и эрлотиниба. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных препаратом, с контрольными колониями.

4.4 Анализ роста опухоли in ovo

Оплодотворенные яйца леггорнов инкубировались в инкубаторе для яиц, установленном на температуру 37,5 °C и влажность 50% в течение первых 3 дней после оплодотворения. На 3-й день эмбрионального развития (E3) САМ удалялся путем просверливания небольшого отверстия в яичной скорлупе напротив круглого, широкого конца с последующей аспирацией ~1,5–2 мл альбумина с помощью шприца объемом 5 мл с иглой 18G. Затем в яичной скорлупе над САМ вырезалось небольшое окно с помощью тонких ножниц и заклеивалось полупроницаемой клейкой пленкой (Suprasorb ® F). Яйца снова содержались в инкубаторе до 9-го дня эмбрионального развития (E9), на котором раковые клетки были трипсинизированы, центрифугированы и суспендированы в 80% матрице Matrigel ® (Corning, Bedford, UK) для получения 1 × 10 6 клеток/100 мкл для A549 и 0,3 × 10 6 клеток/100 мкл для LNM35. 100 мкл инокулята добавляли на САМ каждого яйца, в общей сложности 10–13 яиц на состояние. На 11-й день эмбрионального развития (E11) образовавшиеся опухоли обрабатывали местно, капая 100 мкл DCA, приготовленного на 0,9% NaCl для первой группы или лекарственного носителя для контрольной группы. Лечение повторяли на E13 и E15. Все описанные шаги выполняли в асептических условиях. Наконец, на 17-й день эмбрионального развития (E17) эмбрионы были гуманно умерщвлены путем нанесения 10–30 мкл пентобарбитона натрия (300 мг/мл, Jurox, Окленд, Новая Зеландия). Опухоли были осторожно извлечены из нормальных верхних тканей CAM, промыты 1× PBS и взвешены для определения влияния DCA на рост опухоли. Данные представлены в виде сравнений среднего веса опухолей в контрольной группе и группе, обработанной DCA. Токсичность препарата оценивалась путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах в конце эксперимента. Живые эмбрионы определялись путем проверки произвольных движений эмбрионов в дополнение к целостности и пульсации кровеносных сосудов.Этот анализ представляет собой рандомизированный открытый анализ, который был проведен в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных в Университете Объединенных Арабских Эмиратов. Согласно Европейской директиве 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях, эксперименты с использованием куриных эмбрионов на E18 и до нее не требуют одобрения со стороны Комитета по уходу и использованию институциональных животных (IACUC).

4.5 Анализ роста опухоли и метастазирования

Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных университета ОАЭ в марте 2019 года (код протокола ERA_2019_5872). Шести-восьминедельные бестимусные самцы мышей NMRI nude (nu/nu, Charles River, Германия) содержались в ламинарных шкафах с фильтрованным воздухом и обрабатывались в асептических условиях. Клетки A549 (5 × 10 6 клеток/200 мкл PBS) и клетки LNM35 (0,4 × 10 6 клеток/200 мкл PBS) вводились подкожно в боковой бок мышей nude. Через десять дней, когда опухоли достигли объема приблизительно 50 мм 3 , животные с ксенотрансплантатами A549 были случайным образом разделены на три группы по 9–10 мышей в каждой. Эти группы лечились перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 50 мг/кг или 200 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 38 дней. С другой стороны, животные с ксенотрансплантатами LNM35 лечились перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 200 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 10 дней и DCA 500 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 24 дней. Размеры опухолей и вес животных проверялись каждые три или четыре дня. Кроме того, физические признаки и поведение проверялись каждый день. Объем опухоли рассчитывался по формуле V = L × W 2 × 0,5, где L представляет собой длину, а W - ширину опухоли. В конце экспериментов животных анестезировали и умерщвляли путем смещения шейных позвонков, а опухоли удаляли и взвешивали. Влияние DCA на рост опухоли было представлено путем сравнения среднего веса опухоли в конце эксперимента между контрольной группой и группой, получавшей DCA. Его также оценивали путем сравнения объема опухоли между контрольной и обработанной DCA группами на протяжении всего эксперимента. Образцы крови собирали у каждой мыши и анализировали с помощью SCIL VET ABC™ Animal Blood Counter для полного анализа крови. Кроме того, плазму крови отделяли центрифугированием для биохимического анализа. Для изучения влияния DCA на метастазирование подмышечные лимфатические узлы вырезали и взвешивали у животных с ксенотрансплантатами LNM35 в конце эксперимента.

4.6 Анализ формирования сосудистой трубки

Matrigel ® Matrix (Corning, Bedford, UK) размораживали и добавляли 40–50 мкл в лунки 96-луночного планшета для покрытия. Для того чтобы Matrigel затвердел, планшет держали во влажном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч. HUVEC трипсинизировали и высевали на покрытый планшет с плотностью 2,5 × 104 клеток /100 мкл/лунку в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA. Через 8 ч инкубации сети трубок в разных лунках фотографировали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Влияние DCA на способность HUVEC образовывать капилляроподобные структуры оценивали путем измерения общей длины сформированных трубок в контрольных и обработанных DCA лунках. Общая длина трубок измерялась вручную и с помощью программного обеспечения для онлайн-анализа изображений, разработанного Wimasis ( https://www.wimasis.com/en/products/13/WimTube - дата доступа 1 марта 2019 г.). Влияние различных концентраций DCA на жизнеспособность HUVEC определялось с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), как ранее описано в разделе о жизнеспособности клеток.

4.7. Анализ прорастания сфероидов HUVEC

Сфероиды HUVEC были приготовлены путем первого окрашивания клеток путем инкубации 190 000 клеток с 2 мкМ раствором красителя CellTracker TM Green CMFDA (Invitrogen Molecular probes, Paisley, UK) в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе, установленном на 37 °C и 5% CO2 , с последующим центрифугированием в течение 5 мин и удалением супернатанта. Осадок HUVEC был суспендирован в дополненной среде HUVEC (5 мл), смешанной с раствором метоцела (1,25 мл), который должен быть приготовлен ранее [ 48 ]. Затем 25 мкл клеточной суспензии пипеткой наносили на крышку чашки Петри. Примерно 50 капель пипеткой наносили в каждую чашку Петри. Наконец, капли держали перевернутыми в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе, установленном на 37 °C и 5% CO2 .Образованные сфероиды в каждой чашке (~50 сфероидов) собирали отдельно с 1× PBS и центрифугировали при 150× g в течение 5 мин. Тем временем рабочий раствор коллагена I готовили на льду путем осторожного смешивания исходного коллагена I из хвоста крысы (1500 мкл) (Millipore, MA, США) с 10× средой 199 (150 мкл) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, США) и ледяным стерильным 1N NaOH (34 мкл), который приобрел красный цвет. Каждый сфероидный осадок покрывали слоем раствора метоцела, содержащего 4% FBS (0,25 мл), рабочего раствора коллагена I (0,25 мл) и 60 мкл базальной среды или VEGF 30 нг/мл или DCA 25 мМ или их комбинации. Сразу после осторожного перемешивания смесь добавляли в предварительно нагретый 24-луночный планшет и инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов, что позволяло полимеризовать коллаген и прорасти сфероидам. Через 24 часа сфероиды были захвачены с помощью инвертированного микроскопа с 20-кратным увеличением. Длина проростков в 12 сфероидах в каждом состоянии была измерена с помощью ImageJ.

4.8. Анализ подвижности при заживлении ран

Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 1 × 10 6 клеток/лунку в 6-луночный планшет. Через 24 часа с помощью наконечника объемом 200 мкл делали царапину через сливающийся монослой. После этого клетки дважды промывали 1× PBS с последующим добавлением свежей среды с лекарственным носителем или DCA. В верхней части планшета отмечали два места для мониторинга уменьшения размера раны с течением времени с использованием инвертированного микроскопа при объективе 4× (Olympus 1X71, Токио, Япония). Планшеты инкубировали во влажной атмосфере при 37 °C и 5% CO 2 , а ширину раны измеряли через 0, 2, 6 и 24 часа после инкубации. Расстояние миграции выражали как среднее значение разницы между измерениями в нулевой момент времени и в периоды времени 2, 6 и 24 часа.

4.9. Анализ камеры вторжения Матригеля

Следуя протоколу производителя (Corning, Bedford, MA, USA), в нижние камеры добавляли 0,5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS. После этого раковые клетки высевали с плотностью 1 × 10 5 клеток/0,5 мл в верхние камеры в среде без FBS в присутствии и отсутствии DCA. Планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO 2 в течение 24 часов. Инвазивные клетки разрушают Матригель и проходят через 8 мкм поры вставки. Непроникающие клетки верхних камер удаляли, осторожно протирая область ватным тампоном. Затем полупроницаемую мембрану удаляли с помощью очень тонких ножниц. Инвазивные клетки были обнаружены с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), ранее описанного в разделе жизнеспособности клеток. Влияние DCA на клеточную инвазию было представлено в процентах (%) путем сравнения инвазирующих клеток в присутствии DCA с контролем.

4.10 Статистический анализ

За исключением анализа in ovo и экспериментов на голых мышах, каждый эксперимент проводился не менее трех раз. Данные выражены как среднее значение ± SEM Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 8.3.1 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Для оценки разницы между двумя группами использовался непарный t -тест. Для сравнения 3 или более групп с контрольной группой использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Даннетта. Кроме того, для комбинированных экспериментов использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Тьюки. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001 указывают на значимые различия.

Вклады авторов

Концептуализация, SA; методология, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; валидация, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; формальный анализ, SA и AA-A.; расследование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; курирование данных, SA; написание — подготовка первоначального черновика, SA и AA-A.; написание — рецензирование и редактирование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; визуализация, SA, AA-A. и AN; руководство, SA; администрирование проекта, SA; получение финансирования, SA Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование частично финансировалось за счет гранта Центра медицинских наук имени Зайеда при Университете Объединенных Арабских Эмиратов, № 31R136.

Отчет о клиническом случае длительной полной ремиссии метастатического плоскоклеточного рака почки после паллиативной лучевой терапии и адъювантной терапии дихлорацетатом

оригинал статьи: https://ibimapublishing.com/articles/ACRT/2012/441895/

Акбар Хан

Медицинский директор, Medicor Cancer Centres Inc., Торонто, Канада

Том 2012 (2012), идентификатор статьи 441895, Достижения в области исследований и лечения рака, 7 страниц, DOI: 10.5171/2012.441895Дата публикации: 19 июля 2012 г.

Авторские права © 2012 Akbar Khan. Это статья открытого доступа, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License unported 3.0, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.

Плоскоклеточный рак почек — редкая форма рака почек, которая считается неизлечимой после появления метастазов. Прогноз неблагоприятный, а средняя выживаемость на поздней стадии заболевания обычно составляет несколько месяцев, несмотря на все доступные традиционные методы лечения. Мы описываем случай 72-летней женщины с метастатическим плоскоклеточным раком почек, у которой была проведена радикальная нефрэктомия с положительными хирургическими краями, инвазией почечной вены и метастазами в несколько абдоминальных лимфатических узлов. Она получила курс паллиативной лучевой терапии брюшной полости с дозой 4500 сГр в 25 фракций в течение 5 недель. После лучевой терапии ее лечили циклическим режимом перорального дихлорацетата натрия («DCA»). Лечение было прекращено через 3 месяца из-за развития периферической нейропатии. Последующая визуализация после завершения лечения DCA не выявила признаков метастатического заболевания. Нейропатия постепенно улучшилась, и компьютерная томография через четыре года не выявила рецидива рака. Пациент продолжает чувствовать себя хорошо, клинических признаков рецидива не наблюдается спустя пять лет после завершения терапии, он ведет нормальную и активную жизнь.

Введение

Плоскоклеточный рак почек («RSCC») — редкая форма рака почек, которая возникает из почечной лоханки. RSCC составляет около 0,5–0,8% всех злокачественных опухолей почек (Bhaijee 2012). Хотя хирургическое вмешательство иногда излечивает локализованное заболевание, метастатический плоскоклеточный рак почек («mRSCC») считается неизлечимым (Holmang et al. 2007). Многочисленные публикации врачей, имеющих опыт лечения RSCC, установили, что этот тип рака является радиорезистентным, и что системная химиотерапия дает мало пользы. (Bhandari et al. 2010), (Di Battista et al. 2012), (Kimura et al. 2000), (Li and Cheung 1987). Средняя выживаемость при поздней стадии заболевания крайне низкая (в пределах нескольких месяцев), а пятилетняя выживаемость, как сообщается, составляет менее 10% (Holmang et al. 2007). В обзоре 15 случаев Ли и др. сообщили о медианной выживаемости в 3,5 месяца (Lee et al. 1998).

Был проведен поиск в Medline (Medline RSCC 2012) для определения того, были ли зарегистрированы какие-либо случаи длительной полной ремиссии mRSCC. Он выявил более 200 ссылок на RSCC, но только один опубликованный случай 5-летней полной ремиссии/излечения (Carlson 1960). В этом случае пациенту была проведена полная нефроуретерэктомия, включая резекцию околопочечного жира и манжеты мочевого пузыря. Патология не выявила какого-либо вовлечения хирургических краев, и не было зарегистрировано никаких метастазов.

Дихлорацетат натрия («DCA») — это препарат, который был тщательно изучен для лечения врожденного лактоацидоза, входящего в группу наследственных митохондриальных заболеваний (Stacpoole et al. 2006), (Stacpoole et al. 1992), (Stacpoole et al. 1988). Профиль безопасности использования DCA у людей был установлен в ходе этой работы. Было обнаружено, что это относительно безопасный препарат, не обладающий гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичностью. Основная токсичность — неврологическая (в первую очередь периферическая невропатия), и она обратима (Kaufmann et al. 2006). Наблюдался делирий, вызванный DCA, который также обратим после отмены препарата (Brandsma et al. 2010). У небольшого процента пациентов может наблюдаться незначительное обратимое повышение уровня печеночных ферментов (Stacpoole et al., 2008).

В январе 2007 года была опубликована знаменательная статья, в которой было показано, что DCA эффективен при лечении рака груди, легких и мозга человека in vitro и in vivo (крысы) с помощью новых метаболических путей (Bonnet et al. 2007). Было показано, что DCA ингибирует митохондриальную пируватдегидрогеназную киназу, что приводит к ингибированию аэробного гликолиза, обычного пути производства энергии в раковых клетках человека (известного как эффект Варбурга). Поскольку раковые клетки обычно не способны переходить к окислению глюкозы при ингибировании гликолиза, обработанные DCA клетки будут истощены в своем энергоснабжении АТФ (Xu et al. 2005). Также было показано, что DCA селективно запускает апоптоз в раковых клетках за счет снижения мембранного потенциала гиперполяризованных митохондрий и активации потенциалзависимых калиевых каналов Kv1.5 (Bonnet et al. 2007).

С 2007 года исследования DCA продолжались, и было показано, что DCA имеет эффективность in vitro против нескольких линий клеток рака человека, включая яичники (Saed et al. 2011), нейробластому (Vella et al. 2012), толстую кишку (Tong et al. 2011), карциноид легких (Fiebiger et al. 2011), шейку матки (Xie et al. 2011) и эндометрий (Wong et al. 2008). Синергизм с радиотерапией также был продемонстрирован на линиях клеток рака простаты (Cao et al. 2008). Механизм синергизма, предложенный Cao et al., заключается в повышенной экспрессии связанного с BCL-2 белка X (проапоптотического внутриклеточного белка), что приводит к повышению скорости апоптоза. DCA также показал эффективность in vivo у людей против глиобластомы (Michelakis et al. 2010).

Автор начал использовать терапию DCA «не по назначению» с 2007 года для лечения онкологических больных с плохим прогнозом или не поддающихся лечению традиционными методами лечения рака. Наблюдение за пациентами, получавшими лечение DCA, показало, что значительное число пациентов, по всей видимости, извлекло пользу из использования этого препарата либо по субъективным критериям, таким как уменьшение боли, либо по объективным критериям, таким как уменьшение опухоли (Medicor DCA Data 2009). Презентация случая
 

Женщина 72 лет первоначально обратилась к своему семейному врачу с болью в правом бедре, гематурией и потерей веса. Масса в правой почке была диагностирована с помощью ультразвука. Была проведена компьютерная томография («КТ»), которая показала опухоль, поражающую правую почечную лоханку, верхний и нижний полюса почки и распространяющуюся на проксимальный правый мочеточник (рисунок 1). Были обнаружены множественные увеличенные лимфатические узлы в брюшной полости (рисунок 2). Было проведено сканирование костей, которое было отрицательным для метастазов в кости.

Рисунок 1 – КТ брюшной полости, показывающая опухоль правой почки до начала лечения.

Рисунок 2 – КТ брюшной полости, показывающая патологический забрюшинный лимфатический узел размером 2 см до начала лечения.

Пациентке была проведена правосторонняя радикальная нефрэктомия в мае 2007 года. В отчете об операции было отмечено, что полное иссечение невозможно. Была затронута почечная вена, и ее не удалось полностью очистить от опухоли. Во время операции были визуализированы множественные патологические лимфатические узлы, простирающиеся вверх по нижней полой вене, но они не были удалены. Была проведена интраоперационная биопсия одного из лимфатических узлов. Окончательная гистопатология подтвердила диагноз плоскоклеточного рака почки с положительным хирургическим краем и метастазами в лимфатические узлы. После операции пациентку направили на консультацию к радиоонкологу. Она получила курс внешней лучевой терапии с паллиативной целью на парааортальную область живота с дозой 4500 сГр в 25 фракциях в течение 5 недель с августа по сентябрь 2007 года. Была проведена консультация терапевтического онколога, и ей не было предложено лечение химиотерапией.

Пациентка узнала об исследовании рака DCA из местных СМИ и решила изучить возможность DCA в качестве постоянного лечения, учитывая ее плохой прогноз. Она посетила клинику автора для консультации по терапии DCA.

При первом посещении клиники была изучена ее полная история болезни. Обследование показало, что это здоровая на вид женщина с нормальными жизненными показателями и без существенных физических данных. Первоначальные анализы крови были в целом хорошими. Единственными отклонениями были небольшое повышение мочевины до 7,4 (норма 3,0–7,1 ммоль/л) и низкое количество лимфоцитов до 0,6 (норма 1,2–3,4 x 10 9 /л). Это не было тревожным, так как небольшое повышение мочевины или креатинина было бы ожидаемым у пациента после нефрэктомии. Лечение DCA
 

Были обсуждены риски и преимущества DCA, и пациентка согласилась на лечение DCA, которое было начато в течение 3 недель после последней фракции паллиативной лучевой терапии. Пациентке был назначен DCA по 500 мг перорально два раза в день (18 мг/кг/день) циклом 2 недели приема / 1 неделя перерыва. Циклическое лечение было выбрано из-за предыдущего опыта автора с неприемлемым уровнем побочных эффектов у взрослых пациентов, использующих непрерывную дозировку DCA. Ей был назначен бенфотиамин (жирорастворимая форма витамина B1) по 80 мг перорально два раза в день и R-альфа-липоевая кислота по 150 мг перорально 3 раза в день для снижения риска невропатии DCA, поскольку оба этих природных соединения доказали свою эффективность в лечении невропатии другой этиологии (Ziegler et al. 1999), (Winkler et al. 1999). Ей также назначили пантопразол 40 мг перорально один раз в день для профилактики расстройства желудка от DCA. После первого 3-недельного цикла DCA увеличили до 500 мг перорально три раза в день (27 мг/кг/день). Дозу увеличивали постепенно, чтобы обеспечить переносимость из-за сниженного метаболизма DCA с возрастом пациента (Shroads et al. 2008).

Пациент в целом чувствовал себя хорошо в течение первого месяца лечения DCA, за исключением легкой усталости, которая также могла быть побочным эффектом радиотерапии. Даже при увеличении дозы DCA через 3 недели никаких проблем не возникло в течение второго месяца терапии. DCA была остановлена ​​к концу третьего месяца из-за новых симптомов, указывающих на периферическую невропатию.

На момент остановки DCA пациенту сделали трехфазную КТ, которая не показала никаких признаков остаточного рака. Еще через 6 месяцев пациенту сделали КТ, которая снова не показала никаких признаков рака (рисунок 3).

Рисунок 3 – КТ брюшной полости, показывающее отсутствие рецидива заболевания через 6 месяцев после завершения лечения DCA. Стрелки указывают на хирургические клипсы в правом почечном ложе после нефрэктомии.

Пациентка продолжала регулярно наблюдаться в онкологической клинике своей местной больницы с плановыми КТ-сканированиями примерно каждые 6 месяцев. Последнее КТ-сканирование в октябре 2011 года не показало никаких признаков рецидива mRSCC. Последующий визит к онкологу-радиологу в декабре 2011 года подтвердил отсутствие рецидива. Физическое обследование было нормальным, а ее статус работоспособности был на уровне ECOG 0. Сентябрь 2011 года ознаменовал 4-летнюю точку с момента лучевой терапии и начала лечения DCA, а декабрь 2011 года ознаменовал 4-летнюю точку с момента завершения 3-месячной терапии DCA. По состоянию на сентябрь 2012 года, через 5 лет с даты начала терапии DCA, у пациентки не было никаких симптомов. Она не получала никакого другого лечения рака в течение этого времени (включая DCA), поскольку не было никаких признаков рецидива заболевания.

Обсуждение

Мы считаем, что это первый опубликованный случай длительной полной ремиссии (и вероятного излечения) mRSCC. В литературе, проиндексированной в Medline, за последние 50 лет описан только один похожий случай 5-летней полной ремиссии RSCC, однако у этого пациента не было метастатического заболевания. Наш случай требует пристального внимания, поскольку mRSCC очень агрессивен, медиана выживаемости составляет несколько месяцев при использовании всех доступных традиционных методов лечения.

Радиотерапия сама по себе обеспечивает незначительный эффект на выживаемость при mRSCC (Holmang et al. 2007). Увеличенное до 5 недель время лечения паллиативной радиотерапией в этом случае еще больше снижает вероятность излечения (маловероятную, поскольку она изначально основана на типе рака) в силу снижения гибели клеток посредством процесса, называемого «ускоренной репопуляцией». Репопуляция определяется как способность клеток в ткани восстанавливаться после дозы радиации. Репопуляция увеличивается по мере увеличения общего времени лечения для доставки дозы радиации во время курса фракционированной радиотерапии. Этот эффект снижает вред для здоровой ткани, но также снижает гибель раковых клеток — что соответствует цели паллиативной терапии. Репопуляция наиболее выражена при общем времени лучевой терапии 4-6 недель и более, и эта пациентка получила свою фракционированную радиотерапию в течение 5 недель (Abeloff 21 мая 2008 г.).

Как отмечалось ранее, DCA имеет синергизм с радиотерапией при раке простаты. Опыт автора в лечении пациентов с помощью DCA предполагает, что синергизм с радиотерапией может иметь место при различных типах рака, отличных от рака простаты. Примеры включают: 53-летнюю женщину с 3-летней полной ремиссией карциномы бартолиновой железы, леченной с помощью лучевой терапии и адъювантной DCA, и 32-летнюю женщину с 3-летней полной ремиссией анапластической астроцитомы после химиолучевой терапии с адъювантной DCA (случаи готовятся к публикации).

В этом случае mRSCC адъювантное использование DCA после курса лучевой терапии привело к удивительно полной ремиссии без каких-либо вредных побочных эффектов, кроме обратимой периферической невропатии. У этого пациента профилактический бенфотиамин и R-альфа-липоевая кислота не остановили развитие периферической невропатии от DCA. Теперь автор добавляет ацетил L-карнитин к режиму профилактики невропатии DCA, поскольку он также доказал свою эффективность при лечении невропатии другой этиологии, такой как диабетическая, химио- и антиретровирусная невропатия (Herzmann et al. 2005), (Quatraro et al. 1995), (De Grandis and Minardi 2002), (Bianchi et al. 2005).

В настоящее время нет активных клинических испытаний, изучающих роль DCA в сочетании с радиотерапией. В настоящее время проводится одно испытание, изучающее DCA в сочетании с химиотерапией и облучением при карциноме головы и шеи (Clinicaltrials.gov 2012). Из-за непатентованного статуса DCA исследователям было сложно собрать средства для проведения дорогостоящих испытаний на людях. Мы надеемся, что публикация ясных случаев, иллюстрирующих преимущества DCA в качестве адъюванта к традиционным методам лечения рака, побудит исследователей найти новые креативные механизмы сбора средств, чтобы DCA можно было официально исследовать в дальнейших испытаниях на людях. Мы надеемся, что DCA таким образом станет более широко принятой в онкологическом сообществе и будет использоваться на благо пациентов с неизлечимыми злокачественными новообразованиями.

Поскольку завершение клинических испытаний на людях может занять много лет, в промежуточный период мы считаем этичным осторожно назначать DCA «не по назначению» в сочетании с паллиативной радиотерапией или после нее для пациентов, которые полностью понимают и принимают риски и преимущества. DCA может сыграть еще одну роль в качестве нового терапевтического подхода в сочетании с радиотерапией для радиорезистентных неметастатических видов рака, но это еще предстоит прояснить. Подтверждение
 

Автор хотел бы поблагодарить доктора Хумайру Хан и доктора Айзека Элиаза за их помощь в подготовке этого отчета о случае, а также пациентку за согласие опубликовать ее случай.

Заявление автора о раскрытии информации

Автор назначает лекарства для лечения рака (включая дихлорацетат), которые предоставляются через онкологические центры Medicor за плату. Эта клиника принадлежит члену семьи автора.
 

(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Ссылки

Abeloff, MD, Armitage, JO, Niederhuber, JE, Kastan, MB & McKenna, WG (21 мая 2008 г.). Клиническая онкология Абелоффа , 4-е издание, Глава: Биологические эффекты радиации.
Издатель – Google Scholar

Бхайджи, Ф. (2012). « Плоскоклеточная карцинома почечной лоханки », Энн Диагн Патол, 16(2), 124-7.
Издатель – Google Scholar

Бхандари, А., Аласси, О., Роджерс, К. и Макленнан, Г. Т. (2010). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки », J Urol, 183(5), 2023-4.
Издатель – Google Scholar

Bianchi, G., Vitali, G., Caraceni, A., Ravaglia, S., Capri, G., Cundari, S., Zanna, C. и Gianni, L. (2005). « Симптоматические и нейрофизиологические ответы невропатии, вызванной паклитакселом или цисплатином, на пероральный ацетил-L-карнитин », Eur J Cancer, 41(12), 1746-50.
Издатель – Google Scholar

Bonnet, S., Archer, SL, Allalunis-Turner, J., Haromy, A., Beaulieu, C., Thompson, R., Lee, CT, Lopaschuk, GD, Puttagunta, L., Bonnet, S., Harry, G., Hashimoto, K., Porter, CJ, Andrade, MA, Thebaud, B. и Michelakis, ED (2007). « Ось митохондриального канала K+ подавляется при раке, а ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака », Cancer Cell, 11(1), 37-51.
Издатель – Google Scholar

Брандсма, Д., Дорло, ТПК, Хаанен, Дж. Х., Бейнен, Дж. Х. и Бугерд, В. (2010). « Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом », J Neurol, 257 (12), 2099–100.
Издатель – Google Академия

Cao, W., Yacoub, S., Shiverick, KT, Namiki, K., Sakai, Y., Porvasnik, S., Urbanek, C. и Rosser, CJ (2008). « Дихлорацетат (DCA) сенсибилизирует как дикие, так и сверхэкспрессирующие Bcl-2 клетки рака простаты in vitro к радиации », Prostate, 68(11), 1223-31.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Карлсон, Х. Э. (1960). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки: пятилетнее лечение », J Urol, 83, 813-4.
Издатель – Google Scholar

Clinicaltrials.Gov (2012). [Онлайн], Доступно: http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=dichloroacetate+radiotherapy [доступ 1 сентября 2012 г.].
Издатель

De Grandis, D. & Minardi, C. (2002). « Ацетил-L-карнитин (левацекарнин) в лечении диабетической невропатии. Долгосрочное, рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование », Drugs RD, 3(4), 223-31.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Ди Баттиста Л., Стио Ф., Гуарино С., Галани А., Матуро А., Димко М., Манчини М. и Галло П. (2012). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки с камнями и инфильтрацией нижней полой вены. Отчет о случае », Дж. Чир, 33 (5), 182–5.
Издатель – Google Академия

Fiebiger, W., Olszewski, U., Ulsperger, E., Geissler, K. & Hamilton, G. (2011). « Цитотоксичность in vitro новых препаратов на основе платины и дихлорацетата против линий клеток карциноида легких », Clin Transl Oncol, 13(1), 43-9.
Издатель – Google Scholar

Herzmann, C., Johnson, MA и Youle, M. (2005). « Долгосрочный эффект ацетил-L-карнитина при антиретровирусной токсической нейропатии », HIV Clin Trials, 6(6), 344-50.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Холманг, С., Леле, СМ и Йоханссон, СЛ (2007). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки и мочеточника: заболеваемость, симптомы, лечение и исход », J Urol, 178(1), 51-6.
Издатель – Google Scholar

Kaufmann, P., Engelstad, K., Wei, Y., Jhung, S., Sano, MC, Shungu, DC, Millar, WS, Hong, X., Gooch, CL, Mao, X., Pascual, JM, Hirano, M., Stacpoole, PW, Dimauro, S. и De Vivo, DC (2006). « Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование », Neurology, 66(3), 324-30.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Kimura, T., Kiyota, H., Asano, K., Madarame, J., Yoshino, Y., Miki, K., Abe, K., Hasegawa, T. и Ohishi, Y. (2000). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки с расширением нижней полой вены », Int J Urol, 7(8), 316-9; Обсуждение 320.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Lee, TY, Ko, SF, Wan, YL, Cheng, YF, Yang, BY, Huang, DL, Hsieh, HH, Yu, TJ и Chen, WJ (1998). « Плоскоклеточный рак почек: результаты КТ и клиническое значение », Abdom Imaging, 23(2), 203-8.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Ли, МК и Чунг, ВЛ (1987). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки », J Urol, 138(2), 269-71.
Издатель – Google Scholar

Medicor (данные DCA 2009) [онлайн], доступно: www.medicorcancer.com/DCAdata.html [дата обращения: 1 октября 2012 г.].

Medline (RSCC 2012) [онлайн], доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed , критерии поиска: почки [название] или почки [название] и («плоскоклеточная карцинома» [название]) [доступ 1 октября 2012 г.].
Издатель

Michelakis, ED, Sutendra, G., Dromparis, P., Webster, L., Haromy, A., Niven, E., Maguire, C., Gammer, TL, Mackey, JR, Fulton, D., Abdulkarim, B., McMurtry, MS и Petruk, KC (2010). « Метаболическая модуляция глиобластомы с помощью дихлорацетата », Sci Transl Med, 2(31), 31ra34.
Издатель – Google Scholar 

Кватраро А., Рока П., Донцелла К., Акампора Р., Марфелла Р. и Джулиано Д. (1995). « Ацетил-L-карнитин при симптоматической диабетической нейропатии », Diabetologia, 38(1), 123.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Saed, GM, Fletcher, NM, Jiang, ZL, Abu-Soud, HM и Diamond, MP (2011). « Дихлорацетат индуцирует апоптоз эпителиальных клеток рака яичников посредством механизма, включающего модуляцию окислительного стресса », Reprod Sci, 18(12), 1253-61.
Издатель – Google Scholar 

Shroads, AL, Guo, X., Dixit, V., Liu, HP, James, MO и Stacpoole, PW (2008). « Кинетика и метаболизм дихлорацетата, зависящие от возраста: возможная связь с токсичностью », J Pharmacol Exp Ther, 324(3), 1163-71.
Издатель – Google Scholar

Stacpoole, PW, Gilbert, LR, Neiberger, RE, Carney, PR, Valenstein, E., Theriaque, DW и Shuster, JJ (2008). « Оценка долгосрочного лечения детей с врожденным лактатацидозом с помощью дихлорацетата », Pediatrics, 121(5), E1223-8.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Stacpoole, PW, Kerr, DS, Barnes, C., Bunch, ST, Carney, PR, Fennell, EM, Felitsyn, NM, Gilmore, RL, Greer, M., Henderson, GN, Hutson, AD, Neiberger, RE, O'Brien, RG, Perkins, LA, Quisling, RG, Shroads, AL, Shuster, JJ, Silverstein, JH, Theriaque, DW и Valenstein, E. (2006). « Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактатацидоза у детей », Pediatrics, 117(5), 1519-31.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Stacpoole, PW, Lorenz, AC, Thomas, RG и Harman, EM (1988). « Дихлорацетат в лечении лактоацидоза », Ann Intern Med, 108(1), 58-63.
Издатель – Google Scholar

Stacpoole, PW, Wright, EC, Baumgartner, TG, Bersin, RM, Buchalter, S., Curry, SH, Duncan, CA, Harman, EM, Henderson, GN, Jenkinson, S. & Et Al. (1992). « Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения лактатацидоза у взрослых. Группа по изучению дихлорацетата и лактатацидоза », N Engl J Med, 327(22), 1564-9.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Tong, J., Xie, G., He, J., Li, J., Pan, F. и Liang, H. (2011). « Синергический противоопухолевый эффект дихлорацетата в сочетании с 5-фторурацилом при колоректальном раке », J Biomed Biotechnol, 2011, 740564.
Издатель – Google Scholar

Велла, С., Конти, М., Тассо, Р., Канседда, Р. и Пагано, А. (2012). « Дихлорацетат подавляет рост нейробластомы, действуя специфически против злокачественных недифференцированных клеток », Int J Cancer, 130(7), 1484-93.
Издатель – Google Scholar 

Winkler, G., Pal, B., Nagybeganyi, E., Ory, I., Porochnavec, M. & Kempler, P. (1999). « Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии », Arzneimittelforschung, 49(3), 220-4.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Wong, JYY, Huggins, GS, Debidda, M., Munshi, NC и De Vivo, I. (2008). « Дихлорацетат индуцирует апоптоз в клетках рака эндометрия », Gynecol Oncol, 109(3), 394-402.
Издатель – Google Scholar

Xie, J., Wang, BS, Yu, DH, Lu, Q., Ma, J., Qi, H., Fang, C. и Chen, HZ (2011). « Дихлорацетат переключает метаболизм с гликолиза на окисление глюкозы и проявляет синергическое ингибирование роста с цисплатином в клетках Hela », Int J Oncol, 38(2), 409-17.
Издатель – Google Scholar

Xu, RH, Pelicano, H., Zhou, Y., Carew, JS, Feng, L., Bhalla, KN, Keating, MJ и Huang, P. (2005). « Ингибирование гликолиза в раковых клетках: новая стратегия преодоления лекарственной устойчивости, связанной с митохондриальным респираторным дефектом и гипоксией », Cancer Res, 65(2), 613-21.
Издатель – Google Scholar 

Ziegler, D., Hanefeld, M., Ruhnau, KJ, Hasche, H., Lobisch, M., Schutte, K., Kerum, G. и Malessa, R. (1999). « Лечение симптоматической диабетической полинейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой: 7-месячное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN III). Группа исследования ALADIN III. Альфа-липоевая кислота при диабетической нейропатии », Diabetes Care, 22(8), 1296-301.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct