Тэг: Рак кишечника

Дихлорацетат вызывает апоптоз и остановку клеточного цикла в клетках колоректального рака

оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1038/sj.bjc.6605701

.М. Мадхок*, 1 , С. Йелури 1 , С.Л. Перри 1 , Т.А. Хьюз 2 и Д.Г. Джейн 1

1 Секция трансляционной анестезии и хирургии, Университет Лидса, 7 этаж здания клинических наук, Университетская больница Св. Джеймса, Лидс, Великобритания
2 Институт молекулярной медицины Лидса, Университет Лидса, Университетская больница Св. Джеймса, Лидс, Великобритания

Адрес для переписки: д-р Б. М. Мадхок; Электронная почта: umbm@leeds.ac.uk

Исправлено: 23 марта 2010 г.
Принято: 26 апреля 2010 г.
Опубликовано: 18 мая 2010 г.

Абстрактный

Фон
Раковые клетки сильно зависят от гликолиза. Нашей целью было определить, приведет ли переключение метаболизма с гликолиза на митохондриальное дыхание к снижению роста преимущественно колоректальных раковых клеток по сравнению с нормальными клетками, и изучить лежащие в основе этого механизмы.

Методы.
Репрезентативные линии клеток колоректального рака и нераковых клеток обрабатывались дихлорацетатом (ДХА), ингибитором киназы пируватдегидрогеназы.

Результаты
Дихлорацетат (20 мМ) не снижал рост нераковых клеток, но вызывал значительное снижение пролиферации раковых клеток ( P = 0,009), что было связано с апоптозом и остановкой клеточного цикла в фазе G 2.  Наибольший апоптотический эффект был очевиден в метастатических клетках LoVo, в которых DCA индуцировал до десятикратного увеличения количества апоптотических клеток через 48 ч. Наиболее выраженный арест в фазе G 2  был очевиден в хорошо дифференцированных клетках HT29, в которых DCA вызывал восьмикратное увеличение количества клеток в фазе G 2  через 48 ч. Дихлорацетат снижал уровень лактата в ростовой среде и индуцировал дефосфорилирование субъединицы E1 α  пируватдегидрогеназного комплекса во всех клеточных линиях, но внутренний митохондриальный мембранный потенциал был снижен только в раковых клетках ( P = 0,04).

Выводы
Ингибирование киназы пируватдегидрогеназы ослабляет гликолиз и облегчает митохондриальное окислительное фосфорилирование, что приводит к снижению роста клеток колоректального рака, но не нераковых клеток.

Ключевые слова: дихлорацетат, колоректальный рак, пируватдегидрогеназа, киназа пируватдегидрогеназы
British Journal of Cancer (2010) 102, 1746 – 1752, www.bjcancer.com
doi: 10.1038/sj.bjc.6605701

© 2010 Cancer Research UK

ВВЕДЕНИЕ

Колоректальный рак является третьим по распространенности видом рака в мире и четвертой по значимости причиной смерти от рака (Shike et al, 1990). В 2007 году колоректальный рак стал причиной 17,1 смертей на 100 000 человек в Соединенном Королевстве (UK Bowel Cancer Statistics, 2009). Несмотря на недавние достижения, прогноз для пациентов с запущенным и метастатическим колоректальным раком остается неблагоприятным. Нацеливание на метаболизм опухоли для терапии рака является быстро развивающейся областью (Pan and Mak, 2007). Ранние наблюдения относительно метаболических различий между раковыми и нормальными клетками были сделаны Отто Варбургом, который показал, что раковые клетки по своей природе зависят от гликолиза для производства химической энергии (Warburg, 1956). В настоящее время появляется все больше доказательств того, что этот повышенный гликолиз является результатом влияния множественных молекулярных путей, включая адаптивные ответы на гипоксическую микросреду опухоли, онкогенную сигнализацию и митохондриальную дисфункцию (Gatenby и Gillies, 2004; Gillies и Gatenby, 2007; Wu et al, 2007). Гликолитический фенотип дает раковым клеткам преимущества в росте, противодействуя апоптозу и способствуя распространению опухоли и метастазированию (Yeluri et al, 2009).

Ключевым регулятором клеточного метаболизма является пируватдегидрогеназа (ПДГ). Пируватдегидрогеназа преобразует пируват, полученный в результате гликолиза, в ацетил-КоА, который окисляется в цикле трикарбоновых кислот в митохондриях. Активность пируватдегидрогеназы строго регулируется ингибирующим фосфорилированием киназой пируватдегидрогеназы (ПДК). Фосфорилирование происходит на субъединице E1  α ПДГ (ПДГЭ1 α ) в трех местах: Ser 232 , Ser 293 и Ser 300  (Rardin et al, 2009). Дихлорацетат (DCA) является ингибитором всех четырех изоферментов PDK(1–4) (Stacpoole, 1989), и недавно было показано, что он снижает рост линий клеток рака легких, эндометрия и молочной железы (Bonnet et al, 2007; Wong et al, 2008; Sun et al, 2009). Сообщалось, что он снижает рост этих раковых клеток в основном за счет снижения ингибирующего фосфорилирования PDH, тем самым способствуя окислительному фосфорилированию митохондрий и вызывая апоптоз через митохондриальные, NFAT-Kv 1.5 и p53-активируемый модулятор апоптоза (PUMA)-опосредованные пути.

Было обнаружено, что клетки колоректального рака подвергаются повышенному гликолизу (Bi et al, 2006), а микроокружение опухоли является гипоксическим и ацидотическим, в основном из-за плохо развитого кровоснабжения (Dewhirst et al, 1989; Milosevic et al, 2004). Ранее мы показали, что это особенно верно для более агрессивного фенотипа (Thorn et al, 2009), и экспрессия важных маркеров гипоксии увеличивается при колоректальном раке, особенно на инвазивном крае (Rajaganeshan et al, 2008, 2009). Целью данного исследования было изучение влияния DCA на рост клеток колоректального рака в попытке изучить ингибирование PDK как новую терапевтическую стратегию против колоректального рака.

Материалы и методы

Клеточные культуры
Все клеточные линии были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США) или Европейской коллекции клеточных культур (Солсбери, Уилтшир, Великобритания): HB2 (клетки эпителия молочной железы неракового происхождения), 293 (клетки эпителия из почки эмбриона человека), HT29 (высокодифференцированная первичная колоректальная аденокарцинома), SW480 (низкодифференцированная первичная колоректальная аденокарцинома) и LoVo (метастатический левый надключичный лимфатический узел из колоректальной аденокарциномы). Клетки 293 и HB2 содержались в среде DMEM, HT29 и SW480 — в среде RPMI 1640, а LoVo — в среде F12 (все от Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки, в инкубаторе с влажностью 37°C и 5% CO2  . Для экспериментов в гипоксических условиях мы инкубировали клетки в увлажненном гипоксическом инкубаторе (1% O2 , 5% CO2 , 94% N2 , 37°C). Дихлорацетат натрия (Specials Lab, Prudhoe, Великобритания) был предоставлен фармацевтическим отделением больницы St. James's University Hospital, Лидс, Великобритания.

Анализы МТТ
Клетки (1 × 10 4 ) на лунку высевали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей. После ночной инкубации мы заменили среду на свежую среду, содержащую возрастающие дозы DCA (0, 10, 15, 20, 30, 50 и 100 мМ). Через 24 и 48 ч инкубации мы провели анализ МТТ, заменив среду на 50  мкл 1 мг мл -1  раствора МТТ, и планшеты инкубировали в темноте в течение 3 ч. Затем раствор МТТ удаляли, а темно-синие осадки формазана растворяли в 100  мкл пропан-1-ола. Оптическую плотность измеряли с помощью микропланшетного ридера (Opsys MR; Dynex Technologies Ltd, Worthing, West Sussex, UK) при 570 нм.

Анализы аннексина V и 7-AAD
Клетки высевали в колбы для культивирования тканей площадью 25 см2 и  инкубировали в течение ночи в стандартных условиях. Среду заменяли свежей средой, содержащей ряд доз DCA (0, 10, 20 и 50 мМ). Анализ проточной цитометрии проводили после 24 и 48 ч инкубации. Клетки дважды промывали холодным PBS и ресуспендировали в 1 × связывающем буфере (BD Bioscience, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) при концентрации 5 × 106 клеток  на мл. 100  мкл раствора (5 × 105 клеток  ) переносили в культуральные пробирки объемом 5 мл. Эти клетки окрашивали 5  мкл аннексина V-FITC и 10  мкл 7-AAD (BD Bioscience), осторожно встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. После этого в каждую пробирку добавляли 400  мкл однократного связывающего буфера и анализировали в течение часа на проточном цитофлуориметре LSR II (BD Bioscience).

Анализы с йодидом пропидия
Клетки размножали, как указано для анализа апоптоза. Использовали дихлорацетат (50 мМ) и сравнивали с контролем-носителем. После сбора мы ресуспендировали клетки в 350  мкл PBS в концентрации 0,5–1,0 × 10 6  клеток на мл. К суспензии клеток добавляли 100  мкл 0,25 мг мл -1  йодида пропидия (PI)/5% Triton (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Затем добавляли 50  мкл 1 мг мл -1  рибонуклеазы A (Sigma). Пробирки с образцами тщательно встряхивали и инкубировали в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре. Проточную цитометрию проводили на проточном цитометре LSR II (BD Bioscience), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (FlowJo, Эшленд, штат Орегон, США).

Измерения лактата
Измерения лактата в питательных средах проводились отделением химической патологии в General Infirmary, Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. Клетки инкубировали в колбах площадью 25 см2 в  течение ночи в нормоксии. На следующий день среду заменяли на ряд доз DCA (0, 10, 20 и 50 мМ). Через 48 часов инкубации мы собрали 2 мл среды во фторидные пробирки и немедленно перенесли в лабораторию химической патологии. Во время переноса пробирки хранились на льду. Уровни лактата измеряли с помощью автоматического анализатора (система Advia 1200 Chemistry; Siemens Healthcare Diagnostics, Кэмберли, Суррей, Великобритания).

Анализы TMRM
Клетки обрабатывали DCA, как описано для анализа апоптоза. После 24 и 48 ч инкубации мы промывали клетки в PBS и суспендировали 1 × 10 6  клеток на мл в буферном солевом растворе Хэнкса с 50 нМ метиловым эфиром тетраметилродамина (TMRM) (Invitrogen). 100  мкл клеточной суспензии (1 × 10 5  клеток на лунку) переносили в непрозрачные 96-луночные планшеты, инкубировали в течение 30 мин и измеряли флуоресценцию при 530/620 нм при 37 °C с помощью планшетного ридера (Mithras LB 40; Berthold Technologies, Bad, Wildbad, Германия).

Вестерн-блоттинг
Клетки обрабатывали DCA, как описано выше. Через 8 ч обработки мы извлекали белки из клеток в буфере Лэммли (2% SDS, 10% глицерина, 0,7% 2-меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего и 0,5 M Tris-HCl). Лизаты разделяли электрофорезом на гелях NuPAGE Novex 12% Bis-Tris (Invitrogen) в буфере MOPS-SDS (Invitrogen). Белки переносили на поливинилиденфторидную мембрану (GE Healthcare, Chalford St Giles, Bucks, UK). Мембрану блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 5% обезжиренном молоке в TBS-T (трис-буферный физиологический раствор с 0,1% Tween). Затем мембрану зондировали первичными антителами в 1% обезжиренном молоке в TBS-T в течение 90 мин, промывали в TBS-T, а затем зондировали соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), в течение 60 мин. Первичные антитела: кроличьи поликлональные фосфодетектные анти-PDH-E1 α  (pSer 293 ), 1 : 500 (AP1062; EMD Chemicals, Дармштадт, Германия), и мышиные моноклональные анти-PDHE1 α , 1 : 500 (459400; Invitrogen). Вторичные антитела антикроличьи или антимышиные конъюгаты HRP, 1 : 1000 (Dako, Glostrup, Дания). Белки визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата Supersignal West Pico или Femto (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США) и системы Chemidoc XRS (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).  В качестве контроля нагрузки использовали β -актин.

Статистический анализ
Данные проточной цитометрии были получены с использованием специального программного обеспечения, BD FACSDiva 6.0 и программного обеспечения FlowJo. Статистический анализ был выполнен с использованием SPSS для Windows (SPSS версии 15.0, Чикаго, Иллинойс, США). Различия между группами, получавшими DCA, и контрольными группами, получавшими плацебо, оценивались с использованием  U -критерия Манна-Уитни и 95% доверительных интервалов разницы средних значений между двумя группами.  Значение P менее 0,05 считалось статистически значимым. Данные представлены как среднее значение по меньшей мере из трех независимых экспериментов, а планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего значения.

Результаты

DCA снижает пролиферацию раковых клеток, и эффект схож при нормоксии и гипоксии
Во-первых, мы хотели определить, ингибирует ли лечение DCA клеточную пролиферацию и будет ли дифференциальный ответ в раковых и нераковых клетках в нормоксических и гипоксических условиях. Что касается гипоксии, наша гипотеза заключалась в том, что влияние DCA будет особенно сильным при уровнях кислорода, которые недостаточны для поддержки дополнительного окислительного фосфорилирования. Все клеточные линии (HB2, 293, HT29, SW480 и LoVo) обрабатывали диапазоном доз DCA в течение 24–48 ч в нормоксических и гипоксических условиях. Относительное количество клеток оценивали с помощью анализов MTT.

Обработка возрастающими дозами DCA снижала клеточную пролиферацию дозозависимым образом (рисунок 1A-D). Вопреки нашим ожиданиям, профили снижения роста клеток были схожи при гипоксии и нормоксии. Через 24 и 48 ч до 20 мМ DCA не влияли на рост культур нераковых клеток, HB2 и 293. Однако 20 мМ DCA значительно снижали рост культур всех трех линий клеток колоректального рака ( P ⩽ 0,009). Эффект DCA был сильнее на слабодифференцированных клетках SW480 и метастатических клетках LoVo, чем на хорошо дифференцированных клетках HT29. Рост культур клеток LoVo, обработанных 20 мМ DCA, снижался до 40% по сравнению с клетками, обработанными контрольным раствором. Поскольку наблюдалась сравнительно небольшая разница в снижении роста культур, обработанных ДХА в условиях гипоксии и нормоксии, дальнейшие эксперименты проводились только в условиях нормоксии.

Рисунок 1. Дихлорацетат (20 мМ) не оказал значительного снижения роста культур нераковых клеток 293 и HB2, но вызвал значительное снижение роста культур всех клеток колоректального рака ( * P ⩽ 0,009). Клетки обрабатывали различными дозами DCA или контрольным раствором в условиях нормоксии ( A  и  C ) или гипоксии ( B  и  D ), а относительное количество жизнеспособных клеток оценивали через 24 ч ( A  и  B ) и 48 ч ( C  и  D ) с помощью анализа МТТ. Данные выражены в процентах от контроля (доза 0 мМ) ( *  – значительное различие относительно контроля – белый столбец (0 мМ)).

DCA способствует апоптозу в раковых клетках, щадя нераковые клетки
Далее мы хотели исследовать, было ли связано снижение роста культур при обработке DCA с индукцией апоптоза. Клетки обрабатывали диапазоном доз DCA (0, 10, 20 и 50 мМ) в течение 24 и 48 ч, и доля клеток, подвергающихся апоптозу, оценивалась путем обнаружения мембранного фосфатидилсерина с аннексином V-FITC. Клетки окрашивали аннексином V-FITC и витальным красителем 7-AAD и анализировали с помощью проточной цитометрии. Была дозозависимая индукция апоптоза в линиях раковых клеток через 24 и 48 ч обработки, с небольшим, если вообще, апоптозом, вызванным в нераковых клетках (рис. 2A и B). Наибольший эффект наблюдался в метастатических клетках LoVo; 50 мМ DCA вызвал десятикратное увеличение доли апоптотических клеток через 48 ч, тогда как наблюдалось семи- и пятикратное увеличение клеток HT29 и SW480 соответственно. Увеличение среднего процента от общего числа апоптотических клеток при 50 мМ DCA составило: 2,8 (95% ДИ: 2–3) в клетках HT29, 3,5 (95% ДИ: 2–5) в клетках SW480 и 21 (95% ДИ: 8–34) в клетках LoVo. Был минимальный апоптоз, индуцированный в 293 клетках даже при 50 мМ DCA, 0,2 (95% ДИ: −0,2 до 0,6). В клетках HB2 наблюдалось незначительное снижение процента апоптотических клеток при обработке 50 мМ DCA, −0,9 (95% ДИ: −2,2 до 0,4).

Рисунок 2. Дихлорацетат индуцировал дозозависимое увеличение процента апоптотической популяции в раковых клетках с минимальным апоптозом в нераковых клетках. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 ч ( A ) и 48 ч ( B ), окрашивали аннексином V-FITC и 7-AAD и анализировали с помощью проточной цитометрии. Точки данных представляют собой среднее значение (±sd) трех независимых экспериментов для 0 и 50 мМ DCA ( *  – значимое различие относительно контроля).

DCA вызывает остановку фазы G 2  в клетках колоректального рака, но не влияет на профиль клеточного цикла нераковых клеток 293
Мы также хотели изучить, было ли снижение роста культур при обработке DCA связано с индукцией остановки роста. Клетки обрабатывали 50 мМ DCA в течение 24 или 48 ч, а профили клеточного цикла анализировали с помощью проточной цитометрической оценки содержания ДНК после окрашивания PI. Обработка дихлорацетатом вызвала изменения в профилях клеточного цикла всех раковых клеток, но не повлияла на нераковые клетки. Изменения в профиле клеточного цикла были обнаружены через 24 ч обработки и сохранялись через 48 ч (рисунок 3A и B).

Рисунок 3. Дихлорацетат вызвал остановку фазы G 2  в клетках колоректального рака без влияния на профили клеточного цикла нераковых клеток; 293 и HB2. Клетки обрабатывали 50 мМ DCA или контрольным раствором в течение 24 ч ( A ) и 48 ч ( B ), окрашивали PI и анализировали с помощью проточной цитометрии. Для анализа статистической значимости мы сравнили среднюю долю клеток в каждой фазе клеточного цикла (G 1 , S и G 2 ) в клетках, обработанных DCA, со средней долей клеток в соответствующих фазах в необработанных клетках ( *  – значимое различие по сравнению с контролем).

После 48 ч обработки 50 мМ DCA наблюдалось восьмикратное увеличение клеток в фазе G 2  в клетках HT29 и SW480 и трехкратное увеличение клеток LoVo. Увеличение среднего процента всех раковых клеток в фазе G 2  составило: 21 (95% ДИ: 13–30) для клеток HT29, 19 (95% ДИ: 13–24) для клеток SW480 и 14 (95% ДИ: 10–21) для клеток LoVo; тогда как не было никакой разницы в клетках 293, 1 (95% ДИ: −4 до 7), и клетках HB2, −0,3 (95% ДИ: −9 до 9). Было соответствующее уменьшение клеток в фазе G 0 /G 1  во всех линиях раковых клеток. Интересно, что в клетках HT29 наблюдалось небольшое снижение, но в клетках SW480 и LoVo наблюдалось значительное увеличение доли клеток, считающихся находящимися в фазе S (см. раздел «Обсуждение»). Профиль клеточного цикла клеток 293 и HB2 изменился минимально при обработке DCA.

DCA снижает внеклеточный уровень лактата в питательной среде

Чтобы установить, коррелируют ли изменения в росте и апоптозе, вызванные DCA, со снижением гликолиза, мы измерили уровни лактата в ростовой среде. Молочная кислота является конечным продуктом гликолиза. Если бы DCA вызывал митохондриальное окислительное фосфорилирование, пируват декарбоксилировался бы до ацетил-КоА и не восстанавливался бы до лактата, следовательно, уровни лактата в ростовой среде снизились бы. Уровни лактата в ростовой среде всех клеточных линий измеряли через 48 ч обработки диапазоном доз DCA (рисунок 4). Уровни лактата определяли с помощью автоматического анализатора, который обычно используется для биохимического измерения уровней лактата; анализы основаны на колориметрической реакции, катализируемой лактатоксидазой. Обработка DCA снижала внеклеточные уровни лактата в ростовой среде дозозависимым образом во всех раковых и нераковых клеточных линиях.

Рисунок 4. Дихлорацетат снижал уровень лактата в питательной среде в зависимости от дозы как в раковых, так и в нераковых клетках. Клетки обрабатывались различными дозами DCA в течение 48 часов, а внеклеточные уровни лактата измерялись в питательной среде с помощью автоматического анализатора. Результаты выражены как относительные к контролю.

DCA деполяризует внутреннюю митохондриальную мембрану в клетках колоректального рака, но не в нераковых клетках
Чтобы проверить, была ли индукция апоптоза в раковых клетках при лечении DCA связана с усилением митохондриального окислительного фосфорилирования, мы измерили внутренний митохондриальный мембранный потенциал (ΔΨm). Эскалация митохондриального дыхания реактивировала бы цепь переноса электронов и снизила бы гиперполяризованный ΔΨm в раковых клетках. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 и 48 часов и окрашивали красителем TMRM, который позволяет проводить флуоресцентное измерение ΔΨm.

Как и в предыдущих экспериментах, эффект DCA был очевиден через 24 часа обработки и сохранялся через 48 часов (рисунок 5A и B). Обработка дихлорацетатом снизила гиперполяризованный ΔΨm во всех раковых клетках дозозависимым образом. Дихлорацетат не оказал никакого влияния на ΔΨm нераковых клеток HB2, тогда как, что удивительно, ΔΨm нераковых клеток 293 увеличился дозозависимым образом. Через 24 часа обработки 50 мМ DCA значительно снизили ΔΨm во всех раковых клетках; однако в клетках LoVo наблюдалось значительное снижение даже при 20 мМ DCA (рисунок 5A,  P = 0,02). В нераковых клетках 293 наблюдалась тенденция к увеличению ΔΨm при обработке DCA, хотя это не было статистически значимым ( P = 0,08). Через 48 ч лечения наблюдалось значительное снижение ΔΨm во всех раковых клетках и увеличение в 293 клетках при 20–50 мМ DCA (рисунок 5B,  P ⩽ 0,04).

Рисунок 5. Обработка дихлорацетатом снизила внутренний митохондриальный мембранный потенциал (ΔΨm) во всех раковых клетках, увеличила ΔΨm в нераковых клетках 293 и не оказала никакого влияния на ΔΨm в нераковых клетках HB2. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 ч ( A ) и 48 ч ( B ), окрашивали TMRM, а флуоресценцию измеряли при 530/620 нм при 37°C ( *  – значительная разница по сравнению с контролем).

Обработка DCA приводит к дефосфорилированию  субъединицы PDHE1 α
. Считается, что DCA ингибирует все четыре изофермента PDK и, следовательно, снижает фосфорилирование субъединицы PDHE1 α  , что, в свою очередь, приводит к активации комплекса PDH. Чтобы проверить, происходило ли дефосфорилирование PDHE1 α  при обработке DCA в используемых клеточных линиях, мы использовали вестерн-блот-анализы лизатов обработанных и необработанных клеток DCA. Во всех клеточных линиях обработка 20 мМ DCA в течение 8 ч вызвала резкое снижение сигнала фосфорилирования на сайте pSer 293  , но никаких изменений в уровнях общего PDHE1 α обнаружено не было  (рисунок 6). Фосфо-специфические антитела для двух других сайтов фосфорилирования, Ser 232  и Ser 300 , пока не доступны в продаже.

Рисунок 6. Обработка дихлорацетатом снизила фосфорилирование PDHE1 α  на сайте pSer 293  , не оказав влияния на уровни общего PDHE1 α  во всех исследованных клеточных линиях. Лизаты цельных клеток были приготовлены после обработки клеток 20 мМ DCA в течение 8 ч и из необработанных клеток, и были проведены анализы вестерн-блоттинга.

Обсуждение

Мы показали, что DCA вызывает дозозависимое снижение роста  in vitro  культур колоректальных раковых клеток и нераковых клеток. Однако раковые клетки были более чувствительны к DCA, при этом доза 20 мМ вызывала значительное ингибирование роста раковых клеток, но оказывала незначительное влияние на нераковые клетки. Мы показали, что компоненты этого дифференциального эффекта следующие: мощная индукция апоптоза и остановка клеточного цикла в раковых клетках, но не в нераковых клетках.

Эти выводы подтверждают простую модель дифференциальной чувствительности к DCA. Однако некоторые данные требуют дальнейшего обсуждения. Во-первых, 50 мМ DCA снизили рост культур нераковых клеток 293 и HB2, однако не наблюдалось увеличения апоптотических клеток или изменения профиля клеточного цикла этих клеток. Возможным объяснением этих результатов может быть то, что эта доза DCA привела к более медленному прохождению этих нераковых клеток через все стадии клеточного цикла, не изменяя относительных пропорций в пределах каждой стадии. Во-вторых, наши результаты указывают на то, что DCA вызвал остановку G 2  в клетках колоректального рака. Это контрастирует с предыдущими исследованиями, которые показали остановку G 1  или отсутствие изменений в профиле клеточного цикла при лечении DCA (Cao et al, 2008; Wong et al, 2008). Wong et al (2008) показали повышенную экспрессию PUMA во всех линиях клеток эндометриального рака, которые имели апоптотический ответ на DCA, и пришли к выводу, что эта активация p53 привела к остановке G 1.  Однако клетки колоректального рака в нашем исследовании остановились в фазе G 2  при лечении DCA, и мы не обнаружили никакой индукции p53 DCA в наших линиях клеток колоректального рака (данные не показаны). Интересно, что Cao et al (2008) обнаружили, что сочетание DCA и радиотерапии остановило клетки рака простаты в фазе G 2  , хотя DCA сам по себе не влиял на профиль клеточного цикла. В-третьих, в клетках SW480 и LoVo лечение DCA привело к увеличению доли клеток, которые, как считается, находятся в фазе S. Это предполагает увеличение пролиферации, а также индукцию апоптоза. Аналогичное открытие было сообщено Wong et al (2008) в одной из нескольких протестированных клеток эндометриального рака. Альтернативное объяснение заключается в том, что часть клеток, находящихся в «S-фазе» после обработки линий раковых клеток DCA, на самом деле представляют собой апоптотические клетки в области «sub-G2 » , как это было ранее описано для клеток лимфомы (Klucar и Al-Rubeai, 1997).

Изменения в клеточном метаболизме при лечении DCA
DCA, по-видимому, подавлял выработку молочной кислоты из пирувата как в раковых, так и в нераковых клетках. Кроме того, лечение DCA приводило к дефосфорилированию PDHE1 α и, следовательно, активации PDH во всех исследованных клеточных линиях. Следовательно, основа дифференциального эффекта DCA на раковые и нераковые клетки может заключаться в его влиянии на митохондриальную функцию. Лечение DCA снижало высокий ΔΨm всех раковых клеток, но не нераковых клеток. Это говорит о том, что DCA, ингибируя PDK и, следовательно, активируя PDH, стимулирует митохондриальное дыхание, что приводит к деполяризации внутренней митохондриальной мембраны, и индуцирует апоптоз по проксимальному митохондриальному пути, как описано в предыдущих исследованиях (Bonnet et al, 2007; Cao et al, 2008; Wong et al, 2008). Индукция апоптоза и изменения в митохондриальной функции были наиболее выражены в высокоинвазивных и метастатических клетках LoVo, чем в менее инвазивных клетках HT29 и SW480. Это может иметь клинические последствия для лечения метастатического колоректального рака, поскольку обычно именно высокоинвазивные метастатические раковые опухоли наиболее устойчивы к традиционной химиотерапии и могут быть наиболее чувствительны к ингибированию PDK. В поддержку этого недавнее исследование показало, что колоректальные опухоли, устойчивые к 5-фторурацилу, с большей вероятностью имеют повышенный гликолиз и, следовательно, более поддаются терапии, направленной на метаболизм рака (Шин и др., 2009). В этом отношении наши результаты противоречат выводам Вонга и др. (2008), которые обнаружили, что высокоинвазивные клетки рака эндометрия наиболее устойчивы к лечению DCA.

Ингибирование PDK в качестве терапии рака против колоректального рака
Мы обнаружили, что дозы 20–50 мМ DCA давали дифференциальные ответы между раковыми и нераковыми клетками. Таким образом, потенциальные терапевтические дозы DCA будут находиться в диапазоне от 20 до 50 мМ. Кроме того, недавнее исследование показало, что IC 50  DCA для клеток рака молочной железы составляет от 20 до 30 мМ (Ko и Allalunis-Turner, 2009). Это контрастирует с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что DCA снижает пролиферацию и вызывает апоптоз в раковых клетках при дозах всего 0,5–10 мМ (Bonnet et al, 2007; Wong et al, 2008; Sun et al, 2009). Было обнаружено, что дихлорацетат относительно безопасен для людей при использовании для лечения лактоацидоза (Stacpoole et al, 2003). Основные побочные эффекты при дозе до 100 мг/кг DCA  оказываются на нервную систему и печень, вызывая легкую седацию или сонливость, обратимую периферическую невропатию и легкое бессимптомное повышение уровня сывороточных трансаминаз, отражающее повреждение гепатоцеллюлярной ткани (Stacpoole et al, 1998). Кроме того, недавние исследования показали, что DCA эффективно снижает рост опухоли в клинически достижимых дозах как  in vitro  , так и  in vivo  (Bonnet et al, 2007; Sun et al, 2009). Было высказано предположение, что DCA может быстро перейти на раннюю фазу клинических испытаний рака (Michelakis et al, 2008). Однако доза DCA, необходимая для ингибирования роста клеток колоректального рака в нашем исследовании, вряд ли будет достигнута клинически без возникновения значительных побочных эффектов. Доза DCA, необходимая для достижения эквивалентных концентраций в плазме  in vivo,  будет примерно в пять-десять раз больше, чем та, которая используется в клинических испытаниях против лактатацидоза. Похоже, что клетки колоректального рака, использованные в нашем исследовании, более устойчивы к DCA, чем клетки рака легких, эндометрия и молочной железы. Интересно, что Сан и др. (2009) в своем исследовании клеток рака молочной железы обнаружили, что DCA подавляет пролиферацию раковых клеток, но не вызывает апоптоз или гибель клеток. Эти результаты заметно отличались от эффектов DCA, наблюдаемых на клетках рака легких (Бонне и др., 2007), эндометрия (Вонг и др., 2008) и колоректального рака в нашем исследовании. Таким образом, хотя DCA подавляет рост различных раковых клеток, эффект и основные механизмы, по-видимому, зависят от типа клеток. Вероятным объяснением этих дифференциальных эффектов может быть разница в экспрессии изоферментов PDK в исследованных раковых клетках. Дихлорацетат является неспецифическим ингибитором PDK (Whitehouse и Randle, 1973) и имеет различную  Ki для  каждого из четырех изоферментов PDK (Bowker-Kinley et al ,1998). Кроме того, известно, что четыре изофермента PDK по-разному экспрессируются в различных тканях. Таким образом, необходимо разработать ингибиторы для отдельных изоферментов PDK, которые должны позволять проводить специфичные для типа раковых клеток метаболические манипуляции.

Дихлорацетат восстанавливает химиочувствительность колоректального рака через p53/miR-149-3p/PDK2-опосредованный путь метаболизма глюкозы

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1038/s41388-019-1035-8

Yu Liang1, Lidan Hou1, Linjing Li1, Lei Li1, Liming Zhu1, Yu Wang1, Xin Huang1, Yichao Hou1, Danxi Zhu1, Huimin Zou1, Yan Gu2, Xiaoling Weng3,4, Yingying Wang5, Yue Li6, Tianqi Wu3, Mengfei Yao3, Isabelle Gross7,8, Christian Gaiddon9,10, Meng Luo2, Jianhua Wang3, Xiangjun Meng1

1 Отделение гастроэнтерологии, Девятая народная больница Шанхая, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай
2 Отделение общей хирургии, Девятая народная больница Шанхая, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай

3

Онкологический институт, Шанхайский онкологический центр Университета Фудань, Университет Фудань, Шанхай, Китай

4

Ningbo Aitagene Technology Co. LTD, Шанхай, Китай
5 Кафедра биохимии и молекулярной и Клеточная биология, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай
6 Центр патологии, Первая народная больница Шанхая, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай

7

INSERM UMR_S1113, Страсбург F-67200, Франция

8

FMTS, Страсбургский университет, Страсбург F-67000, Франция
9Universite de Strasbourg, Inserm IRFAC UMR_S1113, Laboratory Stress Response and Innovative Therapy «Streinth», Strasbourg 67200, France
10 CLCC Paul Strauss, Strasbourg, France

Meng Luo luotysy@sina.com
Jianhua Wang jianhuaw2007@qq.com
Xiangjun Meng meng_xiangjun@yahoo.com
Эти авторы внесли равный вклад: Yu Liang, Lidan Hou

Received: 16 марта 2019 г.
Пересмотрено: 17 сентября 2019 г.
Принято: 19 сентября 2019 г.
Опубликовано: 9 октября 20199 октября 2019 г

Аннотация

Развитие химиорезистентности остается одной из основных проблем, объясняющих летальность при колоректальном раке (КРР). Дихлорацетат (ДХА) первоначально использовался как регулятор метаболизма при лечении метаболических заболеваний; здесь ДХА был исследован для выявления механизмов, лежащих в основе химиорезистентности CRC. Мы обнаружили, что DCA заметно повышает химиочувствительность клеток CRC к флуороурацилу (5-FU) и снижает образование колоний из-за высокого уровня апоптоза. Используя анализ микрочипов, мы отметили, что miR-149-3p участвует в химиорезистентности CRC, которая была модулирована p53 дикого типа после лечения DCA. Кроме того, PDK2 был идентифицирован как прямая мишень miR-149-3p. Механический анализ показал, что сверхэкспрессия miR-149-3p усиливала 5-FU-индуцированный апоптоз и снижала метаболизм глюкозы, аналогично эффектам нокдауна PDK2. Кроме того, сверхэкспрессия PDK2 частично отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на метаболизм глюкозы. Наконец, было установлено, что лечение DCA и сверхэкспрессия miR-149-3p в клетках CRC, устойчивых к 5-FU, заметно повышают чувствительность к химиотерапевтическому эффекту 5-FU in vivo, и этот эффект также был подтвержден в небольшой ретроспективной когорте пациентов CRC. В целом, мы определили, что сигнальный путь p53/miR-149-3p/PDK2 потенциально может быть направлен на лечение DCA для преодоления химиорезистентности CRC.

Дополнительная информация: Онлайн-версия этой статьи (https:// doi.org/10.1038/s41388-019-1035-8) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Введение

Колоректальный рак (КРР) является четвертой ведущей причиной смертности от рака в Китае [1] и второй ведущей причиной смертности от рака в США [2], что в основном объясняется метастазированием и неудачей химиотерапии из-за устойчивости к лекарствам, что приводит к ~50 000 смертей ежегодно [3].

В последнее время, хотя появившаяся звезда PD1/PDL1 привлекла большой интерес, и все больше биотерапевтических агентов показывают обнадеживающие результаты в лечении рака, ограниченный уровень эффективности и неизбежные побочные эффекты сдерживают их использование в клинике [4,5]. В настоящее время химиотерапия по-прежнему является основным методом выбора в клинике, особенно для пациентов с неоперабельными поздними стадиями и метастатическим раком [6], но развитие лекарственной устойчивости остается самым большим ограничением в химиотерапии [7]. Следовательно, изучение механизмов лекарственной устойчивости и поиск новых комбинаций классических противораковых препаратов для оптимизации эффективности может принести пользу в лечении КРР. Поскольку фторурацил (5-FU) является наиболее часто используемым химиотерапевтическим препаратом при РПК, в данном исследовании использовались 5-FUрезистентные клеточные линии РПК [8,9].

Нарушение метаболизма глюкозы представляет собой один из основных аспектов отличительных признаков рака [10]. Известно, что развитие неконтролируемой клеточной массы приводит к плохой васкуляризации опухоли, что вызывает снижение поступления кислорода. Следовательно, раковые клетки адаптируются к изменениям в микроэнвироменте, переключая свой метаболизм с окислительного обмена на гликолитический, который основан на снабжении глюкозой и производит лактат. Этот сдвиг называется «эффектом Варбурга» и обычно наблюдается в различных раковых клетках как одна из замечательных отличительных черт [11- 13]. Накопление данных последних исследований привело к необходимости уточнения теории Варбурга [14]; например, было показано, что метаболический сдвиг вовлечен в химиорезистентность [15]; следовательно, для преодоления химиорезистентности потенциально может быть использовано воздействие на метаболизм раковых клеток [16,17].

В частности, сообщалось о многочисленных механизмах контроля метаболического сдвига в раковых клетках, включая микроРНК (миРНК) [18-20]. МиРНК представляют собой класс малых эндогенных некодирующих РНК, которые регулируют трансляцию и деградацию мРНК [21] и вовлечены во многие другие биологические процессы, включая клеточную пролиферацию, миграцию, апоптоз, самообновление, инициацию, развитие рака и химиорезистентность [22-24].

Полученные данные свидетельствуют о том, что воздействие на аномальный метаболизм раковых клеток стало интенсивным направлением исследований, нацеленных на «удушение опухоли», стратегии которых заключаются в ингибировании ключевых ферментов, участвующих в гликолитическом метаболизме [15]. В данной рукописи дихлорацетат (ДХА) первоначально использовался для лечения молочнокислого ацидоза и наследственной митохондриальной болезни [25]. ДХА ингибирует ферментативную активность киназ пируватдегидрогеназы (PDK1-4), которая необходима для превращения пирувата в ацетил-КоА, связывая гликолитический метаболизм с циклом лимонной кислоты [26,27]; недавно сообщалось, что ДХА обладает противораковым действием [28-31]. Однако механизм, лежащий в основе влияния ДКА на лечение CRC, остается неустановленным.

Настоящее исследование было посвящено изучению молекулярного механизма, участвующего в регуляции метаболизма глюкозы и устойчивости к химиотерапии в CRC. Используя DCA в клетках CRC, мы изучили роль соответствующих миРНК и тем самым раскрыли сигнальный путь, объясняющий устойчивость к лечению 5-ФУ.

Результаты

DCA восстанавливает химиочувствительность клеток CRC, устойчивых к 5-FU
Сообщалось, что DCA является эффективным противоопухолевым препаратом, который действует на энергетические пути в некоторых видах рака [32]; однако влияние DCA на химиорезистентные клетки CRC не было изучено. Используя анализ CCK8, мы обнаружили, что по сравнению с родительскими клеточными линиями HCT-8 и HCT116, устойчивые к 5-ФУ клетки HCT-8/F и HCT116/F были нечувствительны к 5-ФУ (Дополнительный рис. 1A), а полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC50) DCA в клетках HCT-8/F и HCT116/F составляли ~15 и 20 мМ, соответственно, что согласуется с предыдущими сообщениями [33, 34] (Дополнительный рис. 1B). Далее мы отметили, что DCA значительно подавлял синтез ДНК (дополнительная рис. 1С, верхняя панель) и индуцировал генерацию ROS (дополнительная рис. 1С, нижняя панель) в устойчивых к 5-FU клетках CRC. Маркеры энергетического метаболизма, включая потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз, были заметно повышены в клетках CRC, устойчивых к 5-FU, по сравнению с клетками CRC, чувствительными к 5-FU, в то время как добавление DCA заметно снижало экспрессию этих маркеров (рис. 1a). Учитывая 6 ч предварительной обработки без сыворотки при измерении гликолиза, использовали набор для определения гликолитической скорости Seahorse XF, чтобы устранить эффект предварительной обработки и измерить гликолитическую скорость в реальном времени. Скорость гликолитического оттока протонов (glycoPER) отражает скорость внеклеточного закисления в результате гликолиза. Добавление DCA значительно снижало индуцированный гликолиз по сравнению с соответствующим контролем (рис. 1b и дополнительный рис. 1D).

Рисунок S1. DCA оказывает противоопухолевое действие
(A) Клетки CRC обрабатывали различными концентрациями 5-ФУ в течение 24 часов. Рассчитывали IC50 5-ФУ в каждой клетке. (B) Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали различными концентрациями DCA в течение 24 часов. Рассчитывали IC50 DCA в каждой клетке. (C) Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 часов. Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания Edu (верхняя панель) и репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания ROS (нижняя панель), масштабная линейка: 200 мкм. (D) Определение скорости гликолиза, включая базальный гликопер, индуцированный гликопер и компенсаторный гликопер, рассчитывали с помощью Seahorse Glycolytic Rate Assay Report Generator. (E) Рост клеток определяли с помощью анализа CCK8 после обработки 5-FU и DCA. Диапазон доз 5-ФУ составлял от 100 мкг/мл до 500 мкг/мл для клеток HCT-8/F и от 25 мкг/мл до 150 мкг/мл для клеток HCT116/F. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент проводился в 3-6 биологических репликах. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

DCA значительно преодолевал резистентность к 5-ФУ в клетках HCT-8/F и HCT116/F, что проявлялось в измерении роста клеток (Дополнительный рис. 1E). Способность к образованию колоний была значительно подавлена (рис. 1c), а апоптоз был заметно индуцирован при комбинированном лечении (рис. 1d), все из которых были дополнительно оценены количественно. Эти результаты свидетельствуют о том, что DCA может восстанавливать химиочувствительность клеток CRC, устойчивых к 5-FU.

Рисунок 1. DCA восстанавливает хемочувствительность устойчивых к 5-FU клеток CRC путем изменения метаболизма глюкозы. a Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. Измеряли потребление глюкозы, продукцию лактата и гликолиз клеток CRC. b Гликопер измеряли в режиме реального времени при введении 15/20 мМ DCA, 0,5 мкМ Rot + AA и 50 мМ 2-DG с помощью прибора Seahorse XF. c, d Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали DCA (15 мМ)/5-FU (50 мкг/мл) и DCA (20 мМ)/5-FU (25 мкг/мл), соответственно. Образование колоний определяли с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым. Апоптоз клеток измеряли путем окрашивания Annexin V/PI. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент проводился в трех биологических репликах. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001

miR-149-3p играет решающую роль в химиочувствительности клеток CRC
миРНК считаются перспективным терапевтическим инструментом благодаря их влиянию на подавление опухоли [35]. В связи с этим мы сначала определили профили экспрессии миРНК с помощью массива миРНК, содержащего 2059 человеческих миРНК. В общей сложности 119 миРНК дифференциально экспрессировались в ответ на DCA в клетках HCT116 (рис. 2a и дополнительный рис. S2A). Среди них уровни экспрессии восьми миРНК были дополнительно подтверждены количественной ПЦР в реальном времени (рис. 2b), и было установлено, что miR-149-3p повышается под действием ДКА в дозозависимой манере (дополнительный рис. S2B).

Далее мы обнаружили, что клетки HCT116 с более высоким базальным уровнем miR-149-3p обладают большей чувствительностью к 5-FU и L-OHP, как показано на дополнительном рис. 2C. Более того, трансфекция клеток HCT116 анти-miR-149-3p значительно снижала химиотерапевтический эффект 5-FU (Дополнительный рис. 2D-E). Примечательно, что уровни miR-149-3p в химиочувствительных клетках CRC были значительно выше, чем в химиорезистентных клетках CRC (рис. 2c). Поэтому трансфекция мимиков miR-149-3p значительно увеличивала скорость ингибирования; способствовала апоптозу клеток, индуцированному 5-FU; снижала потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз в клетках HCT-8/F и HCT116/F (рис. 2d-f). Анализ гликолитической скорости Seahorse XF показал, что экспрессия miR-149-3p снижала базальный гликопер в устойчивых к 5-ФУ клетках CRC, что согласуется с вышеприведенными результатами (рис. 2g и дополнительный рис. 2F). Эти результаты позволяют предположить, что miR-149-3p благоприятствует преодолению химиорезистентности в клетках CRC.

Рисунок S2. Нокдаун miR-149-3p снижает химиорезистентность
(A) Тепловая карта профиля дифференциально экспрессированных микроРНК в клетках HCT116, обработанных контролем, 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ DCA в течение 24 часов. (B) Тотальная РНК была получена через 24 часа после обработки 10/7,5 мМ и 20/15 мМ DCA из клеток HCT116 и HCT-8. Уровень miR-149-3p анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. (C) Клетки HCT-8 и HCT116 обрабатывали различными концентрациями 5-FU и оксалиплатина (L-OHP) соответственно в течение 24 часов и рассчитывали половину максимальной ингибирующей концентрации (IC50) (левая панель). Базальные уровни miR-149-3p определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в клетках HCT-8 и HCT116 (правая панель). (D-E) Клетки HCT116 были трансфицированы Anti-NC или ингибитором miR-149-3p. После трансфекции клетки обрабатывали 25 мкг/мл 5-ФУ в течение 24 часов. Рост и апоптоз клеток определяли с помощью CCK8 и проточной цитометрии соответственно. (F) Определение скорости гликолиза, включая базальный гликопер и компенсаторный гликопер в 5-FU-резистентных CRC-клетках, трансфицированных NC или мимиком miR-149-3p, рассчитывали с помощью Seahorse Glycolytic Rate Assay Report Generator. Данные трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент проводился в 3-6 биологических репликах. *p < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ns, нет значимости.

Рисунок 2. miR-149-3p повышает химиочувствительность 5-FU в CRC. a Тепловая карта профиля дифференциально экспрессированных микроРНК в клетках HCT116, обработанных 20 мМ DCA в течение 24 ч. b Из клеток HCT116 готовили тотальную РНК через 24 ч после обработки DCA. Очевидные изменения микроРНК после обработки ДКА были определены с помощью количественной ПЦР в реальном времени. c Общая РНК была получена из клеток HCT116, HCT116 /F, HCT-8 и HCT-8/F. Базальные уровни miR-149-3p были измерены количественной ПЦР в реальном времени. d, e Клетки HCT-8/F и HCT116/F были трансфицированы NC и мимиком miR-149-3p в течение 24 ч, после чего клетки обрабатывались 5-ФУ (50 мкг/мл для HCT-8/F и 25 мкг/мл для HCT116/F) или без него. Измеряли скорость ингибирования и скорость апоптоза. f, g Измеряли потребление глюкозы, продукцию лактата, гликолиз и гликоПЭР клеток CRC, трансфицированных NC или мимиком miR-149-3p. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент содержал не менее трех биологических реплик. *P<0,05; **P<0,01

DCA индуцирует экспрессию miR-149-3p через p53 дикого типа (wt)
Учитывая, что несколько недавних исследований показали, что miR-149-3p регулируется несколькими препаратами [36,37], мы определили, как miR-149-3p регулируется DCA. Мы обнаружили, что DCA значительно увеличивает экспрессию wt p53 и его нижележащих сигналов, включая экспрессию p21, PUMA и MDM2, в клетках CRC (рис. 3a, b). Более того, мы отметили, что изменения в экспрессии wt p53 способны значительно модулировать экспрессию miR-149-3p, как показано на рис. 3c, d, что указывает на то, что miR-149-3p положительно регулируется wt p53. Поэтому, используя р53-нулевую клеточную линию HCT116 (TP53-/-), мы обнаружили, что miR-149-3p не повышалась при обработке DCA, но эктопическая экспрессия р53 отменяла этот эффект. Более того, мы использовали nutlin-3, мощный ингибитор, который подавляет взаимодействие MDM2-p53, что приводит к активации p53 в качестве положительного контроля, при этом экспрессия miR-149-3p была повышена в wt линии клеток HCT116 (TP53+/+) (рис. 3e-g). С помощью программного обеспечения для биоинформационного анализа (IGV) были предсказаны четыре предполагаемых сайта связывания р53 с фланкирующим участком геномной ДНК miR-149. Затем в клетках были проведены анализы ChIP с использованием антитела против wt p53. Вытянутая ДНК была амплифицирована с помощью обычной ПЦР с праймерами, которые были разработаны на основе этих сайтов. Наши результаты показали, что по сравнению с регионом 4, регион 3 был заметно обогащен после обработки DCA в хроматине HCT116, иммунопреципитированном wt p53 (рис. 3h), что указывает на то, что только регион 3 содержит специфический сайт связывания, активируемый DCA. Эти результаты показывают, что DCA модулирует miR-149-3p через wt p53.

Рисунок 3. DCA индуцирует экспрессию miR-149-3p через p53. a Клетки HCT116 и HCT-8 обрабатывали 20 мМ и 15 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. Экспрессию p53 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. b Уровни мРНК p21, puma и MDM2 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. c Клетки HCT116 и клетки HCT-8 были трансфицированы siRNA р53, плазмидой р53 и соответствующим отрицательным контролем в течение 48 ч. Экспрессия р53 определялась с помощью Вестерн-блот анализа. d Экспрессия miR-149-3p измерялась с помощью количественной ПЦР в реальном времени. e Клетки TP53-/- HCT116 обрабатывались DCA, а клетки TP53+/+ HCT116 обрабатывались нутлином-3. Экспрессию р53 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. f TP53-/- HCT116 клетки обрабатывали DCA в течение 24 ч или трансфецировали плазмидой р53 или контрольной плазмидой. g TP53+/+ HCT116 клетки обрабатывали DCA и nutlin-3 в течение 24 ч или трансфецировали р53 siRNA после обработки DCA. Экспрессия miR-149-3p измерялась с помощью количественной ПЦР в реальном времени. h Анализ связывания р53 с фланкирующим miR-149 участком геномной ДНК клеток HCT116, обработанных 20 мМ DCA или без него в течение 24 ч. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент содержал три биологические реплики. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ns нет значимости

PDK2 является прямой мишенью miR-149-3p
Для выяснения механизмов, посредством которых miR-149-3p регулирует химиочувствительность клеток CRC, мы проанализировали гены, связанные с энергетическим метаболизмом, которые регулируются miR-149-3p, используя две общедоступные платформы (TargetScan и miRDB). Наконец, мы определили, что киназа пируватдегидрогеназы 2 (PDK2) и гексокиназа 1 (HK1) являются потенциальными кандидатами (рис. 4a). Для подтверждения этих выводов мимикр или ингибитор miR-149-3p был трансфецирован в клетки CRC. Мы обнаружили, что уровни мРНК PDK2 негативно регулировались miR-149-3p, но не HK1 (рис. 4b и дополнительный рис. 3A). Было обнаружено два возможных сайта связывания miR-149-3p в 3′-UTR PDK2, а двойной люциферазный репортерный анализ показал, что miR-149-3p связывается с предсказанным сайтом (686-693) 3′-UTR PDK2 (рис. 4c, d). Затем мы подтвердили, что уровень белка PDK2 отрицательно регулируется miR-149-3p (рис. 4e).

PDK имеет четыре изофермента PDK1, 2, 3 и 4, все из которых, как сообщалось, регулируются DCA [26, 38, 39]. Затем мы проанализировали экспрессию мРНК PDK1-4 в клетках HCT8 и HCT116 после обработки ДКА. DCA значительно подавлял экспрессию мРНК PDK2, но не других изоферментов PDK (Дополнительный рис. S3B). Кроме того, трансфекция анти-149-3p частично отменяла снижение PDK2 под действием DCA (рис. 4f). Далее мы определили уровни белка PDK2 и его субъединицы пируватдегидрогеназы E1-альфа (PDHA1) в чувствительных к 5-ФУ и устойчивых к 5-ФУ клетках CRC. Базальные уровни PDK2 были повышены в химиорезистентных клетках CRC по сравнению с химиочувствительными клетками. В соответствии с этим повышением, фосфорилирование PDHA1 также было повышено (рис. 4g).

Рисунок 4. PDK2 является прямой мишенью miR-149-3p. a Схематическая диаграмма протокола, использованного для поиска генов-кандидатов, которые предсказуемо регулируются miR-149-3p. b Клетки HCT-8 и HCT116 были транзиторно трансфицированы мимиком или ингибитором miR-149-3p. Уровни мРНК PDK2 и HK1 анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. c Диаграмма предполагаемых сайтов связывания miR-149-3p в 3′-UTR PDK2. Мутантные последовательности, использованные в люциферазных репортерах, обозначены красным цветом. d Клетки эмбриональной почки человека 293 T и клетки HCT116 были котрансфицированы люциферазными репортерными конструкциями и мимикой miR-149-3p (50 нмоль/л) или контрольной миРНК в течение 48 ч. Данные относительной люциферазной активности нормированы на соответствующий контроль. e Клетки HCT-8 и HCT116 трансфицировали мимиком miR-149-3p или ингибитором в течение 48 ч, а экспрессию PDK2 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. f Клетки HCT116, трансфицированные ингибитором miR-149-3p или анти-НК, обрабатывали с или без DCA в течение 24 ч. Экспрессию PDK2 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. g Экспрессию PDK2 и p-PDHA1 в химиочувствительных и химиорезистентных клетках CRC анализировали с помощью Вестерн анализа. Приведенные данные являются репрезентативными снимками трех экспериментов. Результаты трех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах, представлены как среднее ± SEM. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001

Путь miR-149-3p/PDK2 регулирует химиочувствительность
Чтобы понять, как путь miR-149-3p/PDK2 регулирует ответ клеток CRC на 5-FU, клеточная линия HCT-8/F была выбрана в качестве репрезентативной клеточной линии для исследования того, влияют ли уровни экспрессии miR-149-3p и PDK2 на ответ клеток на 5-FU. Нокдаун PDK2 в клетках HCT-8/F подавлял фосфорилирование PDHA1 (рис. 5a) и снижал маркеры энергетического метаболизма, такие как потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз (рис. 5b). Более того, снижение PDK2 усиливало действие 5-ФУ на повышение уровней расщепленного PARP (c-PARP) и Bax, которые являются признанными биомаркерами апоптоза клеток HCT-8/F (рис. 5c). Кроме того, нокдаун PDK2 повышал химиочувствительность к 5-ФУ в клетках HCT-8/F, что определялось с помощью анализа CCK8 и колониеобразования (рис. 5d, e). Нокдаун PDK2 способствовал 5-ФУ-индуцированному апоптозу в клетках HCT-8/F и HCT116/F, что показано на дополнительном рис. S4A, тогда как сверхэкспрессия PDK2 способствовала фосфорилированию PDHA1 и смягчала апоптоз клеток, индуцированный 5-ФУ в клетках HCT-8 и HCT116 (дополнительные рис. S4B-S4C).

Кроме того, сверхэкспрессия PDK2 отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на PDK2 (рис. 5f) и частично отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз (рис. 5g). Эктопическая экспрессия PDK2 заметно отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на рост клеток и образование колоний в клетках HCT-8/F, обработанных 5-ФУ (рис. 5h, i). В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что путь miR-149-3p/PDK2 восстанавливает химиочувствительность, по крайней мере, частично регулируя метаболизм глюкозы в химиорезистентных клетках CRC.

Рисунок 5. Сигнализация miR-149-3p/PDK2 подавляет метаболизм глюкозы и повышает химиочувствительность. a PDK2 был нокаутирован путем транзиторной трансфекции с помощью siRNA в клетках HCT-8/F. Нокдаун привел к изменению p-PDHA1. b Были измерены потребление глюкозы, выработка лактата и гликолиз клеток CRC, трансфецированных PDK2 siRNA или NC. c Клетки HCT-8/F обрабатывали 50 мкг/мл 5-ФУ или без него в течение 24 ч после трансфекции PDK2 siRNA или NC. Признанные биомаркеры (c-PARP, Bax) для апоптоза клеток определяли с помощью Вестерн-блот анализа. d Клетки HCT-8/F, трансфецированные PDK2 siRNA или NC, обрабатывали 5-ФУ. Рост клеток определяли с помощью анализа CCK8. e Клетки HCT-8/F, инфицированные PDK2 shRNA или вирусом отрицательного контроля, обрабатывали 5-ФУ. Способность к образованию колоний определяли окрашиванием кристаллическим фиолетовым. f Клетки HCT-8/F трансфицировали NC или мимиком miR-149-3p в течение 24 ч, а затем инфицировали вирусом, сверхэкспрессирующим PDK2. Экспрессию PDK2 и p-PDHA1 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. g Измеряли потребление глюкозы, продукцию лактата и гликолиз. h, i После инфицирования клетки обрабатывали 5-ФУ и измеряли рост клеток и способность к образованию колоний. Репрезентативные результаты трех независимых экспериментов, проведенных как минимум в трех экземплярах, представлены как среднее ± SEM. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001

DCA повышает химиочувствительность 5-FU in vivo
Далее 5-FU, DCA или комбинацию 5-FU с DCA вводили внутрибрюшинно в модель подкожного ксенотрансплантата (отмечена как внутрибрюшинная группа). Учитывая недостаточное кровоснабжение центральной части подкожных опухолей, мы также интратуморально вводили DCA или PBS плюс интраперитонеальную инъекцию 5-ФУ (отмечена как интратуморальная группа). Комбинации DCA и 5-FU показали лучший ингибирующий эффект на рост опухоли, чем DCA или 5-FU по отдельности после четырех недель инъекций в группе внутрибрюшинного введения (рис. 6a, b). Экспрессия Ki-67 была снижена после комбинированного лечения в группе внутрибрюшинного введения (рис. 6c). DCA значительно подавлял рост опухоли в интратуморальной группе по сравнению с группой PBS (рис. 6d), а miR-149-3p был повышен в группе интратуморального введения DCA, что согласуется с результатами in vitro (рис. 6e). Интратуморальное введение DCA также способствовало апоптозу опухоли (рис. 6F).

Для дальнейшей оценки влияния miR-149-3p на ответ клеток CRC на 5-ФУ in vivo, в модели подкожного ксенотрансплантата проводили интратуморальное введение agomiR-149-3p или agomiR-NC плюс внутрибрюшинное введение 5-ФУ. miR-149-3p значительно подавлял рост опухоли в интратуморальной группе по сравнению с контрольной группой, в которой интратуморально вводили agomiR-отрицательный контроль (NC) (рис. 6g, h). Сверхэкспрессия miR-149-3p была подтверждена количественной ПЦР в реальном времени (рис. 6i), а сверхэкспрессия miR-149-3p способствовала апоптозу (рис. 6j) и снижала экспрессию PDK2 и p-PDHA1 (рис. 6k, l). С помощью микропозитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)-КТ с 18F-фтордезоксиглюкозой (ФДГ) визуализацию опухоли проводили через 3 недели лечения. в местах имплантации опухоли наблюдалось поглощение 18F-ФДГ, измерялись максимальное стандартизированное поглощение (SUVmax) и метаболические объемы опухоли (MTVs). Разницы в SUVmax между двумя группами не наблюдалось, в то время как MTV значительно уменьшился в группе miR-149-3p (рис. 6m).

Рисунок 6. Комбинированное лечение 5-ФУ с DCA или miR-149-3p усиливает эффект химиотерапии in vivo. a Репрезентативные изображения опухолей в каждой группе. b Объемы опухолей ксенотрансплантата были рассчитаны в группе внутрибрюшинного введения. Показаны средние значения ± SD, n× 6. c Иммуноокрашивание срезов ксенотрансплантатов опухолей с Ki-67 в группе внутрибрюшинного введения. Положительное окрашивание коричневым цветом (масштабные линейки: 100 мкм) (верхняя панель). Рассчитывался показатель иммунореактивности Ki67 (нижняя панель). Показаны средние значения ± SD, n× 4. d Объемы опухолей ксенотрансплантатов рассчитывались до 39 дня после инокуляции опухоли в интратуморальной группе. e Экспрессия miR-149-3p определялась количественным ПЦР в реальном времени в опухолях ксенотрансплантатов после интратуморального введения DCA. Показаны средние ± SD, n× 6. f Показаны репрезентативные TUNEL окрашенные срезы от мышей в интратуморальной группе (масштабные линейки: 50 мкм). g Репрезентативное изображение опухолей от мышей, которые получали интратуморальную инъекцию agomiR-NC или agomiR-149-3p в течение 3 недель. h Объемы опухолей ксенотрансплантатов рассчитывались до 21 дня после лечения. Показаны средние значения ± SD, n× 6. i Уровни miR-149-3p анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Показаны средние значения ± SD, n× 5. *P< 0.05. j Апоптоз опухолевых клеток определяли с помощью анализа TUNEL (масштабные линейки: 50 мкм). k Ксенотрансплантаты опухолей от трех мышей в каждой группе анализировали методом иммуноблота с указанными антителами. l Изображения для визуализации положительного окрашивания PDK2 в ксенотрансплантатах опухолей (масштабные линейки: 100 мкм) (левая панель). Подсчитан иммунореактивный балл PDK2 (правая панель). Показаны средние значения ± SD, n× 3. m Репрезентативные изображения 18F-ФДГ микро-ПЭТ/КТ мышей, несущих опухоли. Опухоли обозначены красными стрелками и кругами. Значения SUVmax и MTV получены в опухолях. Показаны средние значения ± SD, n× 3. *P<0,05; ns не имеет значения

miR-149-3p обратно коррелирует с PDK2 у пациентов с CRC
Значительная обратная корреляция между уровнями мРНК miR-149-3p и PDK2 наблюдалась в тканях CRC человека (рис. 7a, b). Среди них восемь пациентов в стабильном состоянии/болезни (SD) в течение 3 лет после химиотерапии экспрессировали более высокий уровень miR-149-3p, чем пять пациентов с прогрессирующей болезнью (PD) (Дополнительный рис. S5A). Были проанализированы пять пар пациентов с PD и SD с одинаковой патологией и стадией TNM, и окрашивание PDK2 значительно различалось в образцах от пациентов с PD и SD (Дополнительный рис. S5B). Пациенты CRC из базы данных TCGA с высокой экспрессией PDK2 также характеризовались худшей общей выживаемостью (OS) (рис. 7c). База данных TCGA также показала, что экспрессия PDK2 в группе wt p53 была снижена по сравнению с группой мутантных p53 (рис. 7d). Эти результаты позволили предположить, что PDK2 негативно регулируется miR-149-3p у пациентов с CRC.

Рисунок 7. Экспрессия miR-149-3p обратно коррелирует с PDK2 у больных CRC. a Корреляция между экспрессией miR-149-3p и PDK2 была определена с помощью линейного регрессионного анализа(n× 28, r× -0,5058, P<0,01) и b парным t-тестом с теми же образцами(P<0,001) у больных CRC. c OS больных CRC была стратифицирована по экспрессии PDK2 в наборе данных TCGA(n× 603, P× 0.0486, значения P были получены с помощью теста log-rank). d Уровень мРНК PDK2 в группах wt p53 и мутантных p53 был определен с помощью непарного t-теста(P× 0,0057) в наборах данных TCGA. e Мультипликационная зарисовка, изображающая, как DCA восстанавливает ответ CRC на химиотерапию через p53/miR-149-3p/PDK2-опосредованный путь метаболизма глюкозы

Обсуждение

CRC характеризуется туморигенными аномалиями и измененными метаболическими путями и является одной из основных причин смерти от рака [2]. Резистентность к химиотерапии является основной причиной неудачного лечения [7]. В этом исследовании мы обнаружили, что DCA может увеличить химиотерапевтический эффект 5-FU в химиорезистентных клетках CRC и что активация пути p53/miR-149-3p/PDK2 способна увеличить химиочувствительность in vitro и in vivo.

Все больше данных указывают на то, что повышенный гликолиз тесно связан с устойчивостью к химиотерапии [15, 17, 40]. Здесь мы также обнаружили, что по сравнению с родительскими клеточными линиями, химиорезистентные клетки CRC показали повышенное потребление глюкозы, выработку лактата и гликолиз, что говорит о том, что метаболические нарушения являются типичной особенностью, но молекулярные механизмы все еще остаются неясными в клетках CRC.

Было отмечено, что DCA снижает уровень лактата в крови in vivo у грызунов в дозах ~25-50 мг/кг/24 ч [41], а также применение DCA в широком диапазоне доз от 1 до 50 мМ [26]. Примечательно, что неблагоприятное действие DCA у людей обычно ограничивается обратимой сенсорной и моторной периферической нейропатией, которая зависит от возраста и генотипа [42]. Недавно DCA был определен в качестве новой метаболической терапии для различных онкологических больных [26, 29].

Сообщается, что DCA способен ингибировать активность PDK и преобразовывать пируват в ацетил-КоА, что приводит к переходу выработки энергии от гликолиза к митохондриальному окислительному фосфорилированию [43,44]. Также было показано, что DCA ослабляет вызванную гипоксией устойчивость к 5-ФУ при раке желудка [45], преодолевает устойчивость к сорафенибу при гепатоцеллюлярной карциноме [46] и ослабляет устойчивость к цисплатину при раке головы и шеи [47]. Наше исследование показало, что DCA способен ослаблять химиорезистентность клеток CRC к 5-ФУ. Более того, мы продемонстрировали, что DCA снижает потребление глюкозы и выработку лактата в химиорезистентных клетках CRC до базового уровня химиочувствительных клеток CRC. Учитывая, что аутофагия способна подпитывать метаболизм рака [48], было определено влияние DCA и miR-149-3p на аутофагию. Мы обнаружили, что DCA активирует аутофагию, а miR-149-3p не влияет на аутофагию. Это позволило предположить, что аутофагия не вовлечена в эффект DCA/miR-149-3p в регуляции метаболизма глюкозы (Дополнительный рисунок S6).

PDKs, как ключевые регуляторы гликолиза при раке, вызвали большую озабоченность в связи с результатами многих исследований [49]. Существует четыре изоформы PDK (PDK1-4), и каждая из них проявляется в тканеспецифической манере следующим образом: PDK1 высоко экспрессируется в сердце, PDK2 экспрессируется повсеместно, PDK3 имеет относительно ограниченное тканевое распределение, а PDK4 экспрессируется в сердце и скелетных мышцах [27]. PDK2 экспрессируется на более высоких уровнях по сравнению с другими изоферментами, что позволяет предположить, что он может быть основной изоформой, ответственной за регуляцию ферментативной активности пируватдегидрогеназного комплекса (ПДГК) [50]. Кроме того, изоферменты PDK различаются по остроте регуляции метаболитами [51]. Здесь мы сосредоточились на PDK2, наиболее чувствительной изоформе к ДКА [31]. Хотя молекулярные взаимодействия между ДКА и PDK были изучены, потенциальный механизм транскрипционной регуляции PDK остается неясным. В недавнем исследовании сообщалось, что miR-182 играет регуляторную роль в метаболических путях рака легких, нацеливаясь на PDK4 [52]. Настоящее исследование показало, что PDK2 регулируется miR-149-3p в CRC и что уровни PDK2 в первичных опухолях пациентов CRC обратно коррелируют с экспрессией miR-149-3p. Поскольку PDK2 широко присутствует в большинстве тканей, воздействие на PDK2 может стать более важным и эффективным способом уничтожения опухолевых клеток и преодоления химиорезистентности.

Сообщалось, что miR-149-3p играет важную роль в различных видах рака и индуцируется некоторыми противоопухолевыми препаратами [36, 37, 53]. В частности, мы обнаружили, что обработка DCA может индуцировать связывание p53 с восходящей областью (от -677 до -477) miR-149 и что miR-149-3p повышается под воздействием обработки DCA в зависимости от p53. TP53, классический опухолевый супрессор, часто инактивируется в опухолях [54], и недавно сообщалось, что он регулирует метаболизм глюкозы при раке. Было показано, что Wt p53 может подавлять «эффект Варбурга», контролируя PDK2. Однако частота мутаций TP53 в CRC составляет ~40-50% [55, 56], что приводит к потере его супрессивной функции. Сообщалось, что пациенты CRC с wt TP53 получают преимущество в выживании после химиотерапии на основе 5-FU, а пациенты с мутантным TP53 — нет [57]. Наши результаты показывают новый механизм между р53 и PDK2, который модулируется miR-149-3p. Эти данные позволяют предположить, что пациенты с мутантным TP53 могут получить больше пользы от смежной химиотерапии с miR-149-3p, а не с DCA. Учитывая высокую частоту мутаций TP53 в CRC, мы считаем, что miR-149-3p играет важную роль в мониторинге и модуляции химиочувствительности в CRC.

Раковые клетки потребляют большое количество глюкозы и демонстрируют высокий уровень аэробного гликолиза, поэтому снижение поглощения глюкозы является перспективной стратегией для ограничения роста рака [58]. Мы наблюдали, что повышение уровня miR-149-3p значительно подавляло гликолиз в химиорезистентных клетках CRC; однако, по сравнению с контрольной группой, в группе ксенотрансплантатов, которым интратуморально вводили мимикрирующий miR-149-3p, SUVmax оставался неизменным. Возможно, этот противоречивый результат может быть связан с развитием некроза в основной части подкожных опухолевых тканей, что требует изучения.

В целом, мы обнаружили, что сигнальный путь p53/miR-149-3p/PDK2 потенциально может быть направлен на преодоление химиорезистентности CRC при лечении DCA, что обеспечивает потенциальную стратегию лечения CRC с точки зрения вмешательства в метаболизм опухоли (рис. 7e).

Материалы и методы

Раковая ткань
В период с 2013 по 2016 год в исследование были включены 28 пациентов с раком CRC из Девятой народной больницы при Медицинской школе Шанхайского университета Цзяо Тун. Тринадцать из этих пациентов получили послеоперационную химиотерапию на основе 5-ФУ и наблюдались в течение не менее 3 лет. Все ткани были собраны после получения информированного согласия, а все процедуры с участием пациентов проводились в соответствии с правилами, установленными Этическим комитетом Девятой народной больницы при Медицинском колледже Шанхайского университета Цзяо Тун. Клиническая информация о пациентах с КРК представлена в Дополнительной таблице 1.

Дополнительная таблица 1.

Культура клеток
Устойчивая к 5-ФУ клеточная линия HCT-8/F и ее родительская клеточная линия HCT-8 были приобретены у iCell Bioscience, Inc. (Шанхай, Китай). Устойчивая к 5-ФУ клеточная линия HCT116/F и ее родительская клеточная линия HCT116 были любезно предоставлены доктором Гу (Yanhong Gu, Нанкинский медицинский университет, Цзянсу, Китай). Клетки HCT116-/- были подарены доктором Лу (Hua Lu, Университет Фудань, Шанхай, Китай). Линия клеток эмбриональной почки человека 293T была получена из American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Клетки линий 293T, HCT116, HCT-8 культивировали в среде Дульбекко (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, HyClone, Utah, US) или среде RPMI-1640 (HyClone, Utah, US), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Gemini, California, US), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (HyClone, Utah, US) в увлажненном инкубаторе при 37 °C, 5%CO2. В культуральную среду клеточных линий HCT-8/F и HCT116/F добавляли 15 мкг/мл 5-ФУ и 5 мкг/мл 5-ФУ, соответственно. Все клеточные линии были подтверждены путем секвенирования коротких тандемных повторов компанией Genetic Testing Biotechnology Corporation (Сучжоу, Цзянсу, Китай). DCA был приобретен у компании Sigma-Aldrich Co. Ltd. (МО, США).

Иммунофлуоресцентное окрашивание Edu и ROS
Клетки HCT-8/F и HCT116/F высевали в 96-луночные планшеты в количестве 15 000 клеток/лунку. После ночной инкубации клетки обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. Окрашивание Edu проводили в соответствии с инструкцией производителя (Ribobio, Гуанчжоу, Китай). Уровень ROS измеряли в клетках, инкубированных с 10 мкМ 2′,7′-дихлорфлуоресцеин диацетата (DCF-DA) (Beyotime, Шанхай, Китай) в течение 30 мин при 37 °C. Затем планшеты промывали дважды, и клетки анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

Рост клеток
Клетки высевали в 96-луночные планшеты по 5000 клеток/лунку на ночь, обрабатывали препаратами в течение 24 ч, после чего каждую лунку заменяли смесью из 10

мкл

CCK8 (Dojindo, Япония) и 90

мкл

культуральной среды. Абсорбцию измеряли при значении OD 450 нм с помощью энзимного микропланшетного ридера (BioTeck, Вермонт, США) через два часа. Коэффициент ингибирования препарата рассчитывали по следующей формуле: 1-ODdrug/ODctrl. IC50 каждой клетки рассчитывали с помощью GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Анализ апоптоза клеток
Клетки HCT-8/F и HCT116/F высевали в шестилуночные планшеты в концентрации 2 ×105 клеток/лунку. Клетки обрабатывали DCA (15 мМ) / 5-ФУ (50 мкг/мл) и DCA (20 мМ) / 5-ФУ (25 мкг/мл), соответственно, в течение 48 ч. Затем клетки трипсинизировали, промывали и окрашивали антителами Annexin V-FITC/PI или Annexin V-PE/7-AAD в соответствии с протоколом производителя (BD, CA, США). Апоптоз измеряли методом проточной цитометрии (BD, CA, США).

Анализ образования колоний
Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали DCA (15 мМ)/5-FU (50 мкг/мл) и DCA (20 мМ)/5-FU (25

мкг/мл

), соответственно, в течение 24 часов. Затем клетки высевали в шестилуночные планшеты по 1000 клеток в лунку и культивировали в свежей среде при 37 °C в течение 1-2 недель, после чего фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин; затем клетки окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым и подсчитывали количество колоний клеток с помощью счетчика (Gelcount, Optronix, Oxford).

Переходная трансфекция генов
Мимики miR-149-3p, ингибиторы, siPDK2, sip53 и соответствующие им последовательности олигонуклеотидов NC были синтезированы компанией GenePharma (Шанхай, Китай). Плазмида Flag-p53 была любезно предоставлена доктором Лу (Хуа Лу, Университет Фудань, Шанхай, Китай). Трансфекцию проводили с помощью Lipofectamine 3000 (Invitrogen, CA, США) при конечной концентрации 50 нмоль/л (мимики и siRNAs) или 100 нмоль/л (ингибиторы). Клетки собирали для анализа через 24 или 48 ч после трансфекции. Последовательности siRNA, мимиков и ингибиторов представлены в Дополнительной таблице 2.

Дополнительная таблица 2.

Трансфекция стабильных генов
LV-PDK2 и соответствующий NC-вирус были приобретены у компании GeneChem (Шанхай, Китай). shPDK2-1, shPDK2-2 и контрольная плазмида были приобретены у компании GeneChem (Шанхай, Китай). Вирусный супернатант собирали из 293 Т-клеток. Затем клетки CRC были инфицированы вирусом и обследованы с помощью пуромицина. Эффективность инфекции была подтверждена проточной цитометрией и флуоресцентной микроскопией. Экспрессию мРНК и белка PDK2 далее анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени и Вестерн-блота.

репортерные люциферазные анализы 3′-UTR
wt или мутантные последовательности связывания miR-149-3p в 3′UTR PDK2 человека были клонированы в downstream люциферазы pmiR-RB-Reporter (Ribobio, Guangzhou, China), обозначенные как WT, MUT1, MUT2 и MUT3 на рис. 3c. клетки 293 T и HCT116 высевали в 24-луночные планшеты с последующей котрансфекцией 500 нг репортерных конструкций и либо 50 нмоль/л мимика miR-149-3p, либо NC с помощью Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA). Активность люциферазы измеряли после 48 ч инкубации с помощью системы Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Мэдисон, США) в соответствии с протоколом производителя.

Потребление глюкозы и выработка лактата
Клетки HCT-8/F и HCT116/F высевали в 24-луночные планшеты в количестве 1 ×105 клеток/лунку на ночь, затем обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. После обработки клетки культивировали в среде без фенолового красного, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, в течение 24 ч. Культурную среду собирали, измеряли потребление глюкозы и выработку лактата. Лактат измеряли с помощью набора Lactate Assay Kit (Njjcbio, Нанкин, Китай), а глюкозу — с помощью набора Glucose Assay Kit (Rsbio, Шанхай, Китай). Все значения были стандартизированы путем подсчета равного количества клеток. Для оценки состояния гликолиза в культивируемые клетки добавляли 100 нг/мл олигомицина (ингибитор АТФ-синтазы; Sangon Biotech) на 6 ч. Соотношение концентрации лактата в присутствии и отсутствии олигомицина измеряли и определяли, как описано ранее [46].

Seahorse XF-96 glycolytic rate assay
Клетки высевали в 96-луночный культуральный планшет при плотности 25 000 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи в ростовой среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Сенсорный картридж увлажняли в течение ночи. На следующий день среду для клеток меняли на безбикарбонатную низкобуферную среду анализа, дополненную глюкозой, пируватом натрия и глутамином. После того как клетки инкубировали в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе без CO2, скорость потребления кислорода и скорость внеклеточного закисления измеряли до и после введения DCA/ctrl, ротенона (Rot) + антимицина A (AA) и 2-дезокси-d-глюкозы (2-DG) с помощью прибора Seahorse XF (Agilent, Santa Clara, CA), как описано ранее [59, 60]. Эксперименты проводились в режиме реального времени в пяти-шести повторных лунках. Гликоперы, включая базальный гликопер, индуцированный гликопер и компенсаторный гликопер, рассчитывались автоматически с помощью программного обеспечения Wave (Agilent, Santa Clara, CA).

Количественная ПЦР в реальном времени и микрочипы миРНК
Общая РНК была выделена из тканей или клеток CRC с помощью TRIzol Reagent (Life, CA, USA). кДНК была синтезирована с помощью PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, Tokyo, Japan). Анализ микрочипов проводили с тремя репликами клеток HCT116, обработанных 5 мМ, 10 мМ или 20 мМ DCA в течение 12, 24 или 48 ч. Исходные данные были загружены в базу данных GEO (GSE125309). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием премикса Ex Taq 420 A (TaKaRa, Токио, Япония) на платформе ABI-7500. Актин и U6 использовали в качестве внутренних контролей. Последовательности праймеров представлены в Дополнительной таблице 3.

Вестерн-блоты
Загружали тридцать микрограммов лизатов общего белка и наносили первичные антитела: анти-PDK2 (sc-100534, Santa Cruz, California, US), анти-p-PDHA1 (S293) (ABS204, Merck, Darmstadt, Germany), анти-PDHA1 (ab168379, Abcam, Cambridge, UK), анти-p53 (sc-126, Santa Cruz, California, US), anti-c-PARP (D64E10, CST, Массачусетс, США), anti-Bax (D2E11, CST, Массачусетс, США), anti-LC3B (L7543, sigma, MO, США), anti-GAPDH (Proteintech, Ухань, Китай) и anti-α-tubulin (Proteintech, Ухань, Китай). Вторичные антитела были приобретены у компании Sungene (Тяньцзинь, Китай). Блот-анализы визуализировали с помощью системы хемилюминесценции (Bioshine, Шанхай, Китай).

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)
Клетки HCT116, посеянные в 10-см планшеты, обрабатывали 20 мМ DCA или без него в течение 24 ч, затем проводили фиксацию клеток и фрагментацию хромосом в соответствии с инструкциями производителя (Pierce Agarose ChIP Kit, Thermo). Хроматин инкубировали с антителами IgG и анти-р53 (Sigma, MO, США) при 4°C в течение ночи. После инкубации добавляли 60 ul протеина А агарозы/ДНК спермы лосося. Затем осажденный комплекс промывали буферами для промывки IP 1, 2, 3 и элюировали буфером для элюирования. Сшивание было отменено добавлением 6 мкл 5 М NaCl и 2 мл протеиназы К при 65°C в течение 1,5 ч. Иммунопреципитированная ДНК и ДНК цельноклеточного экстракта (входная) были очищены и затем использованы для ПЦР-анализа с использованием соответствующих праймеров. Для контроля эксперимента использовался контрольный праймер. Последовательности праймеров для ПЦР представлены в Дополнительной таблице 3.

Подкожная ксенотрансплантация опухоли у голых мышей и микро-ПЭТ/КТ визуализация
Сначала 1 ×107 клеток HCT-8/F, разведенных в 100

мкл

PBS, подкожно имплантировали голым мышам (самцы, 6 недель). Через 12 дней мышей случайным образом разделили на шесть групп (по шесть на группу). Мыши из групп I — IV получали ежедневную внутрибрюшинную инъекцию PBS, DCA (50 мг/кг)/PBS, 5-FU (10 мг/кг)/PBS и 5-FU (10 мг/кг)/DCA (50 мг/кг), соответственно. Мышам из группы V и группы VI интратуморально вводили PBS или DCA (50 мг/кг), соответственно, каждый второй день и внутрибрюшинную инъекцию 5-FU (10 мг/кг) каждый второй день. Объем опухоли измеряли вслепую каждые 3 дня. Мышей приносили в жертву после 3 недель лечения, опухоли иссекали, взвешивали и замораживали при -80 °C для дальнейшего изучения.

Чтобы оценить, оказывает ли miR-149-3p эффект химиосенсибилизации, были созданы еще две группы животных моделей. Вкратце, мышам подкожно имплантировали 6 ×106 клеток HCT-8/F. После того, как размеры опухоли достигали ~50 мм3, мыши получали внутрибрюшинную дозу 5-FU (10 мг/кг) каждый второй день, а также интратуморальную инъекцию 5 нмоль холестерин-конъюгированных мимиков miR-149-3p или NC каждые 3 дня в течение 3 недель. Затем трех мышей из каждой группы постили на ночь и внутривенно вводили 0,15 мКи 18F-ФДГ. через 60 мин проводилось микро-ПЭТ-КТ сканирование с 18F-ФДГ (Siemens, Берлин, Германия). Изображения, полученные в ходе ПЭТ, были представлены с использованием псевдоцветной карты, где красный цвет указывал на высокое поглощение 18F-ФДГ. SUVmax и MTV использовались для определения активности 18F-ФДГ-ПЭТ. Все эксперименты и уход за животными были одобрены Этическим комитетом Девятой народной больницы при медицинском колледже Шанхайского университета Цзяо Тун.

Иммуногистохимическое и иммунофлуоресцентное окрашивание
Вкратце, срезы тканей инкубировали с первичными антителами Ki67 (Servicebio, Ухань, Китай) и PDK2 (Proteintech, Ухань, Китай) при 4 °C в течение ночи, а затем инкубировали со вторичным антителом. Хромогенную реакцию проводили с 3,3-диаминобензидином и контрастировали гематоксилином. Иммунореактивный балл (IRS) рассчитывался двумя исследователями, слепыми к распределению по группам. IRS = SI (интенсивность окрашивания) × PP (процент положительных клеток). SI присваивался следующим образом: 0 × отрицательный; 1 × слабый; 2 × умеренный; 3 × сильный. PP определяется как 0 × 0%; 1 × 0-25%; 2 × 25-50%; 3 × 50-75%; 4 × 75-100%. Шестимиллиметровые замороженные срезы окрашивали с помощью набора для реакции TUNEL (Roche, Базель, Швейцария) и контрастировали DAPI. Изображения получали с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующими фильтрами возбуждения и испускания.

Статистический анализ
Данные анализировали с помощью программы GraphPad Prism 6.0. Данные представлены как среднее ± SD/SEM из трех независимых экспериментов. Каждый эксперимент проводился как минимум в трех повторах. Для сравнения различий между двумя группами использовали двухфакторный t-тест Стьюдента. Для множественных сравнений использовался односторонний ANOVA с последующим пост-хок тестом Бонферрони. Кривые Каплана-Мейера для анализа выживаемости определялись с помощью теста log-rank. Связь между miR-149-3p и PDK2 оценивали с помощью анализа коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81272745, 81872419 и 81272404) и Программой для профессора специального назначения (Восточный стипендиат JW) в Шанхайских высших учебных заведениях. Мы благодарим д-ра Yanhong Gu за предоставление клеточных линий HCT116, устойчивых к 5-FU, и д-ра Hua Lu за предоставление плазмиды p53.

Соблюдение этических норм

Конфликт интересов
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Примечание издателя
Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и институциональной принадлежности.

Открытый доступ
Эта статья лицензирована по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, обмен, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате при условии, что вы отдаете должное оригинальному автору (авторам) и источнику, даете ссылку на лицензию Creative Commons и указываете, были ли внесены изменения. Изображения или другие материалы третьих лиц в этой статье включены в статью по лицензии Creative Commons, если иное не указано в кредитной строке к материалу. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а предполагаемое вами использование не разрешено законом или выходит за рамки разрешенного использования, вам необходимо получить разрешение непосредственно у правообладателя. Чтобы ознакомиться с копией этой лицензии, посетите сайт http://creativecommons. org/licenses/by/4.0/.