Тэг: простата

Амигдалинин дуцирует апоптоз через регуляцию экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP

Хён-Кён Чанг, Мал-Сун Шин, Хе-Ян Ян, Джин-Ву Ли, Ён-Сик Ким, Мён-Хва Ли, Джулия Ким, Кхе-Хван Ким и Чанг-Джу Ким*

*Кафедра физиологии, Медицинский колледж, Университет Кён Хи; #1 Хоиги-дон, Донгдэмун-гу, Сеул 130–701, Южная Корея. Получено 8 сентября 2005; принято 1 марта 2006*

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Амигдалин является одним из нитрилозидов, природных веществ, содержащих цианид, в изобилии содержащихся в семенах растений семейства пруназин, которые использовались для лечения раков и облегчения боли. В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. Апоптоз, запрограммированная клеточная смерть, является важным механизмом в лечении рака. В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen (семена абрикоса) и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. В настоящих результатах, клетки DU145 и LNCaP, обработанные амигдалином, проявляли несколько морфологических характеристик апоптоза. Обработка амигдалином увеличивала экспрессию Bax, проапоптотического белка, уменьшала экспрессию Bcl-2, антиапоптотического белка, и увеличивала активность фермента каспазы-3 в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Здесь мы показали, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP путем активации каспазы-3 через down-регуляцию (подавление экспрессии) Bcl-2 и up-регуляцию (усиление экспрессии) Bax. Настоящее исследование показывает, что амигдалин может предложить ценный вариант для лечения раков предстательной железы.

Ключевые слова амигдалин; рак предстательной железы; апоптоз; Bcl-2; Bax; Каспаза-3

Амигдалин (витамин B1717​; ранее называвшийся лаэтрилом) является одним из многих нитрилозидов, которые являются природными веществами, содержащими цианид, в изобилии содержащимися в семенах семейства пруназин, растений, таких как абрикосы, миндаль, персики, яблоки и другие розоцветные растения. Среди пруназинов, Armeniacae semen (семена абрикоса) использовались для лечения астмы, бронхита, эмфиземы, проказы, колоректального рака, витилиго и боли. 1−31−3 Амигдалин состоит из двух молекул глюкозы, одной бензальдегида, который индуцирует анальгезирующее действие, и одной синильной кислоты, которая является противоопухолевым соединением. Помимо вышеуказанных показаний, амигдалин использовался для лечения раков и облегчения боли. 4−64−6 В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. 77

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Эта злокачественная опухоль чаще всего возникает в наружной части предстательной железы, и по мере роста опухоли она метастазирует в ткани вокруг предстательной железы или в семенные пузырьки. 88

Апоптоз, также известный как запрограммированная клеточная смерть, происходит в нескольких патологических ситуациях у многоклеточных организмов и составляет часть общего механизма замены клеток, ремоделирования тканей и удаления поврежденных клеток. Апоптоз представляет собой сложный процесс, характеризующийся сморщиванием клеток, конденсацией хроматина, интернуклеосомной фрагментацией ДНК и образованием «апоптотических тел». 99

Две важные группы белков, вовлеченных в апоптотическую гибель клеток, это члены семейства Bcl-2 1010 и класс цистеиновых протеаз, известных как каспазы. 1111 Семейство Bcl-2 можно классифицировать на две функционально различные группы: антиапоптотические белки и проапоптотические белки. Bcl-2, антиапоптотический белок, как известно, регулирует апоптотические пути и защищает от клеточной смерти. Bax, проапоптотический белок этого семейства, экспрессируется обильно и избирательно во время апоптоза и способствует клеточной смерти. Увеличение соотношения Bcl-2 к Bax обычно использовалось для определения индукции апоптоза в нескольких тканях. 1212 Каспазы являются аспартат-специфичными цистеиновыми протеазами, которые emerged as (проявились как) центральный исполнитель апоптоза. Среди каспаз, активация каспазы-3 рассматривается как первичный механизм апоптоза. 1313 Каспаза-3 может быть активирована через цитозольный выброс цитохрома c белком Bax. 1414

Многочисленные исследования задокументировали, что индукция апоптоза является очень важным механизмом в спонтанном регрессе опухолей и в разработке противоопухолевых агентов. 1515 Апоптоз опухолевых клеток способствует уменьшению опухоли и promotes (способствует) регрессии опухоли. 1616 Более того, известно, что противораковые препараты индуцируют апоптоз опухолевых клеток, повреждая их ДНК, ингибируя синтез ДНК, истощая внутриклеточный пул нуклеотидов и разрушая митотический аппарат. 17,1817,18

В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. Для этого исследования использовались анализ с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ), окрашивание 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), анализ мечения ник-концов dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) (TUNEL-анализ), обратная транскриптаза-полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Вестерн-блоттинг анализ и анализ активности фермента каспазы-3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экстракция амигдалина Armeniacae semen, использованные в этом эксперименте, были получены с рынка Кёндон (Сеул, Корея). 500 г Armeniacae semen, вылущенных из скорлупы, и 10 л 4% раствора лимонной кислоты упаривали в течение 2 ч. После фильтрования в горячем состоянии, фильтрат пропускали через колонку, заполненную HP-20. Вещество, поглощенное в колонке, концентрировали после его элюирования этанолом. Амигдалин (4,2 г для получения выходной скорости 0,84%) был получен путем перекристаллизации экстракта с этанолом. Амигдалин использовали после того, как чистота была

• Кому следует направлять корреспонденцию. e-mail: changju@khu.ac.kr

© 2006 Фармацевтическое общество Японии

===== Страница 2 =====

1598 Vol. 29, No. 8

определена как >99,0% с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ; Shiseido, Токио).

Препараты и реагенты МТТ и DAPI были получены от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, МО, США). TUNEL-анализ был получен от Boehringer Mannheim (Маннхайм, Германия), и набор для анализа каспазы-3 от CLONTECH (Пало-Альто, Калифорния, США).

Культура клеток Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP были purchased (приобретены) из Корейского банка клеточных линий (KCLB, Сеул, Корея). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Jell Biotechservices Inc., Тэгу, Корея) с добавлением 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) при 37°C во влажном клеточном инкубаторе с атмосферой 5% CO22​-95% O22​. Среду меняли каждые 2 дня. Клетки высевали на чашки для культивирования при плотности 2$\times$1044 клеток/см22 за 24 ч до обработок амигдалином.

Анализ цитотоксичности МТТ Клетки рака предстательной железы DU145 и LNCaP выращивали в конечном объеме 100 мкл культуральной среды на лунку в 96-луночных планшетах. Для определения цитотоксичности амигдалина, клетки обрабатывали амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Клетки контрольной группы оставляли необработанными. После добавления 10 мкл меточного реагента МТТ, содержащего 5 мг/мл МТТ в фосфатно-солевом буфере (PBS), в каждую лунку, планшеты инкубировали в течение 4 ч. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора для солюбилизации, содержащего 10% додецилсульфат натрия (SDS) в 0,01 М соляной кислоте (HCl), и клетки инкубировали еще в течение 12 ч. Затем оптическую плотность (ОП) измеряли с помощью микропланшетного ридера (Bio-Tek, Уинуски, Вермонт, США) при тестовой длине волны 595 нм с референсной длиной волны 690 нм. Оптическая плотность (O.D.) рассчитывалась как разница между поглощением на референсной длине волны и наблюдаемым на тестовой длине волны. Процент жизнеспособности рассчитывали как (O.D. обработанного препаратом образца/контрольный O.D.)$\times$100.

Окрашивание DAPI Клетки сначала культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International, Нейпервилл, Иллинойс, США). После обработки амигдалином клетки собирали и фиксировали путем инкубации в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин. После промывки в PBS клетки инкубировали в 1 мкг/мл DAPI в метаноле в течение 30 мин в темноте. Затем клетки наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Zeiss, Оберкохен, Германия).

Окрашивание TUNEL Для in-situ детекции апоптотических клеток, TUNEL-анализ проводили с использованием набора для детекции апоптоза in situ ApoTag® пероксидаза. Клетки культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International) при плотности 2$\times$1044 клеток/камеру. После обработки амигдалином клетки промывали PBS и фиксировали путем инкубации в 4% PFA при 4°C в течение 10 мин. Затем фиксированные клетки инкубировали с конъюгированным с дигоксигенином dUTP в реакции, катализируемой TdT, при 37°C во влажной атмосфере в течение 60 мин и погружали в стоп/промывочный буфер при комнатной температуре на 10 мин. Затем клетки инкубировали с анти-дигоксигениновым антителом, конъюгированным с пероксидазой, в течение 30 мин. Фрагменты ДНК окрашивали с использованием 3,3-диаминобензидина (DAB; Sigma Chemical Co., США) в качестве субстрата для пероксидазы.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР Для идентификации экспрессии мРНК Bcl-2 и Bax, проводили ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли из клеток DU145 и LNCaP с использованием RNAzoI™B (TEL-TEST, Френдсвуд, Техас, США). Два микрограмма РНК и 2 мкл случайных гексамеров (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) добавляли вместе, и смесь нагревали при 65°C в течение 10 мин. Затем один микролитр AMV обратной транскриптазы (Promega), 5 мкл 10 мМ dNTP (Promega), 1 мкл RNasin (Promega) и 5 мкл 10× буфера для AMV RT (Promega) добавляли к смеси, и конечный объем доводили до 50 мкл водой, обработанной диметилпирокарбонатом (DEPC). Затем реакционную смесь инкубировали при 42°C в течение 1 ч.

ПЦР-амплификацию проводили в реакционном объеме 40 мкл, содержащем 1 мкл соответствующей кДНК, 1 мкл каждого набора праймеров в концентрации 10 пМ, 4 мкл 10× ПЦР буфера, 1 мкл 2,5 мМ dNTP и 2 единицы Taq ДНК-полимеразы (TaKaRa, Сига). Для человеческого Bcl-2, последовательности праймеров были 5'-CGAGACTTCTCCGGCGGCTACCGCA-3' (25-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 334) и 5'-CGGCATGTGGGGCCGTACAGTTCC-3' (25-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 628). Для человеческого Bax, последовательности праймеров были 5'-GTGCACAAAGTGGCGGAAAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 375) и 5'-TCAGCCATCTTCTCCAGAT-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 560). Для циклофилина, внутреннего контроля, использованного в этом исследовании, последовательности праймеров были 5'-ACCCCACCGTTCTTCTGAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 52) и 5'-CATTTGCCATGGACAAGATG-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 332). Ожидаемый размер ПЦР-продукта составлял 318 п.н. для Bcl-2, 205 п.н. для Bax и 299 п.н. для циклофилина.

Для Bcl-2 и Bax, процедуры ПЦР проводили с использованием системы ПЦР GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer, Норуолк, Коннектикут, США) в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 30 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 58°C в течение 30 с и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Для циклофилина, процедура ПЦР выполнялась в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 25 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 55°C и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Конечное количество продукта ОТ-ПЦР для каждого вида мРНК рассчитывали денситометрически с использованием Molecular Analyst™ версия 1.4.1 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).

Вестерн-блот анализ Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP лизировали в ледяном буфере для лизиса целых клеток, содержащем 50 мМ HEPES (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 1% Тритон X-100, 1,5 мМ гексагидрат хлорида магния, 1 мМ этиленгликоль-бис-(β-аминоэтиловый эфир)-N,N'-тетрауксусная кислота (EGTA), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 2 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин, 1 мМ ортованадат натрия и 100 мМ фторид натрия. Смесь инкубировали при 4°C в течение 30 мин. Клеточный дебрис удаляли путем микроцентрифугирования, с последующей быстрой заморозкой супернатанта. Концентрацию белка измеряли с использованием колориметрического набора для определения белка Bio-Rad (Bio-Rad). Сорок микрограмм белка разделяли на SDS-полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher & Schuell GmbH, Дассель, Германия). Мышиные анти-актин, анти-Bcl-2 и анти-Bax ан-

===== Страница 3 =====

Август 2006 1599

титела (1:1000; Santa Cruz Biotech, Калифорния, США) использовали в качестве первичных антител. Конъюгированное с пероксидазой хрена кроличье анти-мышиное антитело (1:2000; Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Фрайбург, Германия) использовали в качестве вторичного антитела. Детекцию полос проводили с использованием системы детекции с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech GmbH).

Анализ активности фермента каспазы Активность фермента каспазы измеряли с использованием набора для анализа каспазы-3 ApoAlert® в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, после обработки амигдалином клетки лизировали 50 мкл охлажденного буфера для лизиса клеток. Пятьдесят микролитров 2× реакционного буфера (содержащего DTT) и 5 мкл соответствующего конъюгированного субстрата в концентрации 1 мМ добавляли к каждому лизату. Смесь инкубировали в водяной бане при 37°C в течение 1 ч, и поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера при тестовой длине волны 405 нм.

Статистический анализ Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.). Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим пост-хок тестом Дункана с использованием SPSS. Различия считались статистически значимыми при $p<0,05$.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние амигдалина на жизнеспособность клеток рака предстательной железы Для оценки цитотоксического эффекта амигдалина на клетки рака предстательной железы человека, клетки DU145 и LNCaP культивировали с амигдалином в конечных концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, после чего проводили анализы МТТ. Клетки, культивируемые в средах без амигдалина, использовали в качестве контроля.

Жизнеспособность человеческих клеток DU145, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 82,67±2,22% ($n=8,p<0,05$), 77,25±2,06% ($n=8,p<0,05$), 76,09±1,90% ($n=8,p<0,05$) и 45,63±1,65% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Жизнеспособность человеческих клеток LNCaP, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 96,68±1,11% ($n=8,p<0,05$), 91,33±1,57% ($n=8,p<0,05$), 57,11±0,81% ($n=8,p<0,05$) и 45,02±0,73% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Тенденция к снижению жизнеспособности с увеличением концентрации амигдалина была достоверно observed (наблюдаема) при 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в обоих типах клеток DU145 и LNCaP. Результаты анализа МТТ показали, что амигдалин оказывает дозозависимый цитотоксический эффект на клетки рака предстательной железы.

Морфологические изменения, индуцированные амигдалином Анализ DAPI выявил возникновение конденсации ядра, фрагментации ДНК и перинуклеарных апоптотических тел при обработке амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Апоптотические тельца, один из строгих морфологических критериев апоптоза, характерно присутствовали в обработанных амигдалином клетках DU145 и LNCaP, окрашенных DAPI (Рис. 2).

Разрывы цепей ДНК происходят во время апоптоза, и известно, что ники в молекулах ДНК могут быть обнаружены с помощью TUNEL-анализа. TUNEL-позитивные клетки были окрашены в темно-коричневый цвет при световой микроскопии, и конденсация ядра наблюдалась в клетках, обработанных 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл амигдалина. В настоящем исследовании, TUNEL-позитивные клетки, которые указывали на возникновение апоптоза, наблюдались среди обработанных амигдалином клеток DU145 и LNCaP (Рис. 2).

Влияние амигдалина на экспрессию мРНК Bcl-2 и Bax Анализ ОТ-ПЦР уровней мРНК Bcl-2 и Bax был performed (проведен) для оценки относительных уровней экспрессии этих генов. В настоящем исследовании, уровень мРНК Bcl-2 и Bax в контрольных клетках был установлен как 1,00.

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках DU145, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,89±0,05 ($n=4,p<0,05$), 0,69±0,03 ($n=4,p<0,05$) и 0,21±0,03 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно increased (увеличен) до 1,08±0,07 ($n=4,p<0,05$), 2,07±0,17 ($n=4,p<0,05$) и 2,43±0,15 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках LNCaP, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,78±0,20 ($n=4,p<0,05$), 0,52±0,20 ($n=4,p<0,05$) и 0,48±0,38 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно увеличен до 2,25±0,25 ($n=4,p<0,05$), 2,42±0,27 ($n=4,p<0,05$) и 3,64±0,50 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

Настоящие результаты показали, что амигдалин оказывает снижающее действие на экспрессию мРНК Bcl-2 и ускоряющее действие на экспрессию мРНК Bax дозозависимым образом на обе клеточные линии рака предстательной железы DU145 и LNCaP.

Вестерн-блот анализ белков Bcl-2 и Bax Эф-

===== Страница 4 =====

1600 Vol. 29, No. 8

A B C D
DAPI

TUNEL

A B C D
DAPI

TUNEL

Рис. 2. Морфологические наблюдения клеток, обработанных амигдалином (A) Контрольная группа; (B) группа, обработанная амигдалином 0,1 мг/мл; (C) группа, обработанная амигдалином 1 мг/мл; (D) группа, обработанная амигдалином 10 мг/мл. Эксперименты повторялись по крайней мере четыре раза. Вверху: Влияние амигдалина на клетки DU145, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL. Внизу: Влияние амигдалина на клетки LNCaP, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL.

фекты амигдалина на экспрессию белков Bcl-2 и Bax были исследованы. Уровень экспрессии актина indicated (указывал), что количество образца было загружено одинаково. После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл на клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP, экспрессия белка Bcl-2 (25 кДа) дозозависимо снижалась, тогда как экспрессия белка Bax (26 кДа) дозозависимо увеличивалась (Рис. 4).

Анализ активности фермента каспазы-3 Активность фермента каспазы-3 измеряли с использованием DEVD-пептид-нитроанилида (pNA). После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках DU145 было достоверно increased (увеличено) с контрольного значения 5,25±0,50 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 9,47±0,11 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 11,66±0,67 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 11,62±0,59 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 7,28±0,35 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk. DEVD-fmk является ингибитором каспазы-3 (Рис. 5)

После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках LNCaP было достоверно увеличено с контрольного значения 4,21±0,07 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 6,82±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 7,36±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 7,50±0,24 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 4,26±0,28 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk (Рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Разнообразные сигналы могут запускать апоптотический процесс во время развития опухоли. В некоторых случаях, истощение факторов роста/выживания, гипоксия, радиация, потеря клеточно-матриксных взаимодействий, повреждение ДНК и нарушения теломер могут быть включены в число триггеров апоптоза.20 Исследование действий большинства противоопухолевых агентов было сосредоточено на их внутриклеточных сигналах-мишенях, которые индуцируют гибель опухолевых клеток. Противоопухолевые действия подразумевают клеточные ответы, происходящие во время взаимодействий, которые индуцируют гибель опухолевых клеток.21,22 Индукци