Тэг: простата

Амигдалинин дуцирует апоптоз через регуляцию экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP

Хён-Кён Чанг, Мал-Сун Шин, Хе-Ян Ян, Джин-Ву Ли, Ён-Сик Ким, Мён-Хва Ли, Джулия Ким, Кхе-Хван Ким и Чанг-Джу Ким*

*Кафедра физиологии, Медицинский колледж, Университет Кён Хи; #1 Хоиги-дон, Донгдэмун-гу, Сеул 130–701, Южная Корея. Получено 8 сентября 2005; принято 1 марта 2006*

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Амигдалин является одним из нитрилозидов, природных веществ, содержащих цианид, в изобилии содержащихся в семенах растений семейства пруназин, которые использовались для лечения раков и облегчения боли. В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. Апоптоз, запрограммированная клеточная смерть, является важным механизмом в лечении рака. В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen (семена абрикоса) и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. В настоящих результатах, клетки DU145 и LNCaP, обработанные амигдалином, проявляли несколько морфологических характеристик апоптоза. Обработка амигдалином увеличивала экспрессию Bax, проапоптотического белка, уменьшала экспрессию Bcl-2, антиапоптотического белка, и увеличивала активность фермента каспазы-3 в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Здесь мы показали, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP путем активации каспазы-3 через down-регуляцию (подавление экспрессии) Bcl-2 и up-регуляцию (усиление экспрессии) Bax. Настоящее исследование показывает, что амигдалин может предложить ценный вариант для лечения раков предстательной железы.

Ключевые слова амигдалин; рак предстательной железы; апоптоз; Bcl-2; Bax; Каспаза-3

Амигдалин (витамин B1717​; ранее называвшийся лаэтрилом) является одним из многих нитрилозидов, которые являются природными веществами, содержащими цианид, в изобилии содержащимися в семенах семейства пруназин, растений, таких как абрикосы, миндаль, персики, яблоки и другие розоцветные растения. Среди пруназинов, Armeniacae semen (семена абрикоса) использовались для лечения астмы, бронхита, эмфиземы, проказы, колоректального рака, витилиго и боли. 1−31−3 Амигдалин состоит из двух молекул глюкозы, одной бензальдегида, который индуцирует анальгезирующее действие, и одной синильной кислоты, которая является противоопухолевым соединением. Помимо вышеуказанных показаний, амигдалин использовался для лечения раков и облегчения боли. 4−64−6 В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. 77

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Эта злокачественная опухоль чаще всего возникает в наружной части предстательной железы, и по мере роста опухоли она метастазирует в ткани вокруг предстательной железы или в семенные пузырьки. 88

Апоптоз, также известный как запрограммированная клеточная смерть, происходит в нескольких патологических ситуациях у многоклеточных организмов и составляет часть общего механизма замены клеток, ремоделирования тканей и удаления поврежденных клеток. Апоптоз представляет собой сложный процесс, характеризующийся сморщиванием клеток, конденсацией хроматина, интернуклеосомной фрагментацией ДНК и образованием «апоптотических тел». 99

Две важные группы белков, вовлеченных в апоптотическую гибель клеток, это члены семейства Bcl-2 1010 и класс цистеиновых протеаз, известных как каспазы. 1111 Семейство Bcl-2 можно классифицировать на две функционально различные группы: антиапоптотические белки и проапоптотические белки. Bcl-2, антиапоптотический белок, как известно, регулирует апоптотические пути и защищает от клеточной смерти. Bax, проапоптотический белок этого семейства, экспрессируется обильно и избирательно во время апоптоза и способствует клеточной смерти. Увеличение соотношения Bcl-2 к Bax обычно использовалось для определения индукции апоптоза в нескольких тканях. 1212 Каспазы являются аспартат-специфичными цистеиновыми протеазами, которые emerged as (проявились как) центральный исполнитель апоптоза. Среди каспаз, активация каспазы-3 рассматривается как первичный механизм апоптоза. 1313 Каспаза-3 может быть активирована через цитозольный выброс цитохрома c белком Bax. 1414

Многочисленные исследования задокументировали, что индукция апоптоза является очень важным механизмом в спонтанном регрессе опухолей и в разработке противоопухолевых агентов. 1515 Апоптоз опухолевых клеток способствует уменьшению опухоли и promotes (способствует) регрессии опухоли. 1616 Более того, известно, что противораковые препараты индуцируют апоптоз опухолевых клеток, повреждая их ДНК, ингибируя синтез ДНК, истощая внутриклеточный пул нуклеотидов и разрушая митотический аппарат. 17,1817,18

В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. Для этого исследования использовались анализ с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ), окрашивание 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), анализ мечения ник-концов dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) (TUNEL-анализ), обратная транскриптаза-полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Вестерн-блоттинг анализ и анализ активности фермента каспазы-3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экстракция амигдалина Armeniacae semen, использованные в этом эксперименте, были получены с рынка Кёндон (Сеул, Корея). 500 г Armeniacae semen, вылущенных из скорлупы, и 10 л 4% раствора лимонной кислоты упаривали в течение 2 ч. После фильтрования в горячем состоянии, фильтрат пропускали через колонку, заполненную HP-20. Вещество, поглощенное в колонке, концентрировали после его элюирования этанолом. Амигдалин (4,2 г для получения выходной скорости 0,84%) был получен путем перекристаллизации экстракта с этанолом. Амигдалин использовали после того, как чистота была

• Кому следует направлять корреспонденцию. e-mail: changju@khu.ac.kr

© 2006 Фармацевтическое общество Японии

===== Страница 2 =====

1598 Vol. 29, No. 8

определена как >99,0% с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ; Shiseido, Токио).

Препараты и реагенты МТТ и DAPI были получены от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, МО, США). TUNEL-анализ был получен от Boehringer Mannheim (Маннхайм, Германия), и набор для анализа каспазы-3 от CLONTECH (Пало-Альто, Калифорния, США).

Культура клеток Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP были purchased (приобретены) из Корейского банка клеточных линий (KCLB, Сеул, Корея). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Jell Biotechservices Inc., Тэгу, Корея) с добавлением 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) при 37°C во влажном клеточном инкубаторе с атмосферой 5% CO22​-95% O22​. Среду меняли каждые 2 дня. Клетки высевали на чашки для культивирования при плотности 2$\times$1044 клеток/см22 за 24 ч до обработок амигдалином.

Анализ цитотоксичности МТТ Клетки рака предстательной железы DU145 и LNCaP выращивали в конечном объеме 100 мкл культуральной среды на лунку в 96-луночных планшетах. Для определения цитотоксичности амигдалина, клетки обрабатывали амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Клетки контрольной группы оставляли необработанными. После добавления 10 мкл меточного реагента МТТ, содержащего 5 мг/мл МТТ в фосфатно-солевом буфере (PBS), в каждую лунку, планшеты инкубировали в течение 4 ч. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора для солюбилизации, содержащего 10% додецилсульфат натрия (SDS) в 0,01 М соляной кислоте (HCl), и клетки инкубировали еще в течение 12 ч. Затем оптическую плотность (ОП) измеряли с помощью микропланшетного ридера (Bio-Tek, Уинуски, Вермонт, США) при тестовой длине волны 595 нм с референсной длиной волны 690 нм. Оптическая плотность (O.D.) рассчитывалась как разница между поглощением на референсной длине волны и наблюдаемым на тестовой длине волны. Процент жизнеспособности рассчитывали как (O.D. обработанного препаратом образца/контрольный O.D.)$\times$100.

Окрашивание DAPI Клетки сначала культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International, Нейпервилл, Иллинойс, США). После обработки амигдалином клетки собирали и фиксировали путем инкубации в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин. После промывки в PBS клетки инкубировали в 1 мкг/мл DAPI в метаноле в течение 30 мин в темноте. Затем клетки наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Zeiss, Оберкохен, Германия).

Окрашивание TUNEL Для in-situ детекции апоптотических клеток, TUNEL-анализ проводили с использованием набора для детекции апоптоза in situ ApoTag® пероксидаза. Клетки культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International) при плотности 2$\times$1044 клеток/камеру. После обработки амигдалином клетки промывали PBS и фиксировали путем инкубации в 4% PFA при 4°C в течение 10 мин. Затем фиксированные клетки инкубировали с конъюгированным с дигоксигенином dUTP в реакции, катализируемой TdT, при 37°C во влажной атмосфере в течение 60 мин и погружали в стоп/промывочный буфер при комнатной температуре на 10 мин. Затем клетки инкубировали с анти-дигоксигениновым антителом, конъюгированным с пероксидазой, в течение 30 мин. Фрагменты ДНК окрашивали с использованием 3,3-диаминобензидина (DAB; Sigma Chemical Co., США) в качестве субстрата для пероксидазы.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР Для идентификации экспрессии мРНК Bcl-2 и Bax, проводили ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли из клеток DU145 и LNCaP с использованием RNAzoI™B (TEL-TEST, Френдсвуд, Техас, США). Два микрограмма РНК и 2 мкл случайных гексамеров (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) добавляли вместе, и смесь нагревали при 65°C в течение 10 мин. Затем один микролитр AMV обратной транскриптазы (Promega), 5 мкл 10 мМ dNTP (Promega), 1 мкл RNasin (Promega) и 5 мкл 10× буфера для AMV RT (Promega) добавляли к смеси, и конечный объем доводили до 50 мкл водой, обработанной диметилпирокарбонатом (DEPC). Затем реакционную смесь инкубировали при 42°C в течение 1 ч.

ПЦР-амплификацию проводили в реакционном объеме 40 мкл, содержащем 1 мкл соответствующей кДНК, 1 мкл каждого набора праймеров в концентрации 10 пМ, 4 мкл 10× ПЦР буфера, 1 мкл 2,5 мМ dNTP и 2 единицы Taq ДНК-полимеразы (TaKaRa, Сига). Для человеческого Bcl-2, последовательности праймеров были 5'-CGAGACTTCTCCGGCGGCTACCGCA-3' (25-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 334) и 5'-CGGCATGTGGGGCCGTACAGTTCC-3' (25-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 628). Для человеческого Bax, последовательности праймеров были 5'-GTGCACAAAGTGGCGGAAAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 375) и 5'-TCAGCCATCTTCTCCAGAT-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 560). Для циклофилина, внутреннего контроля, использованного в этом исследовании, последовательности праймеров были 5'-ACCCCACCGTTCTTCTGAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 52) и 5'-CATTTGCCATGGACAAGATG-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 332). Ожидаемый размер ПЦР-продукта составлял 318 п.н. для Bcl-2, 205 п.н. для Bax и 299 п.н. для циклофилина.

Для Bcl-2 и Bax, процедуры ПЦР проводили с использованием системы ПЦР GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer, Норуолк, Коннектикут, США) в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 30 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 58°C в течение 30 с и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Для циклофилина, процедура ПЦР выполнялась в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 25 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 55°C и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Конечное количество продукта ОТ-ПЦР для каждого вида мРНК рассчитывали денситометрически с использованием Molecular Analyst™ версия 1.4.1 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).

Вестерн-блот анализ Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP лизировали в ледяном буфере для лизиса целых клеток, содержащем 50 мМ HEPES (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 1% Тритон X-100, 1,5 мМ гексагидрат хлорида магния, 1 мМ этиленгликоль-бис-(β-аминоэтиловый эфир)-N,N'-тетрауксусная кислота (EGTA), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 2 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин, 1 мМ ортованадат натрия и 100 мМ фторид натрия. Смесь инкубировали при 4°C в течение 30 мин. Клеточный дебрис удаляли путем микроцентрифугирования, с последующей быстрой заморозкой супернатанта. Концентрацию белка измеряли с использованием колориметрического набора для определения белка Bio-Rad (Bio-Rad). Сорок микрограмм белка разделяли на SDS-полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher & Schuell GmbH, Дассель, Германия). Мышиные анти-актин, анти-Bcl-2 и анти-Bax ан-

===== Страница 3 =====

Август 2006 1599

титела (1:1000; Santa Cruz Biotech, Калифорния, США) использовали в качестве первичных антител. Конъюгированное с пероксидазой хрена кроличье анти-мышиное антитело (1:2000; Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Фрайбург, Германия) использовали в качестве вторичного антитела. Детекцию полос проводили с использованием системы детекции с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech GmbH).

Анализ активности фермента каспазы Активность фермента каспазы измеряли с использованием набора для анализа каспазы-3 ApoAlert® в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, после обработки амигдалином клетки лизировали 50 мкл охлажденного буфера для лизиса клеток. Пятьдесят микролитров 2× реакционного буфера (содержащего DTT) и 5 мкл соответствующего конъюгированного субстрата в концентрации 1 мМ добавляли к каждому лизату. Смесь инкубировали в водяной бане при 37°C в течение 1 ч, и поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера при тестовой длине волны 405 нм.

Статистический анализ Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.). Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим пост-хок тестом Дункана с использованием SPSS. Различия считались статистически значимыми при $p<0,05$.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние амигдалина на жизнеспособность клеток рака предстательной железы Для оценки цитотоксического эффекта амигдалина на клетки рака предстательной железы человека, клетки DU145 и LNCaP культивировали с амигдалином в конечных концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, после чего проводили анализы МТТ. Клетки, культивируемые в средах без амигдалина, использовали в качестве контроля.

Жизнеспособность человеческих клеток DU145, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 82,67±2,22% ($n=8,p<0,05$), 77,25±2,06% ($n=8,p<0,05$), 76,09±1,90% ($n=8,p<0,05$) и 45,63±1,65% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Жизнеспособность человеческих клеток LNCaP, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 96,68±1,11% ($n=8,p<0,05$), 91,33±1,57% ($n=8,p<0,05$), 57,11±0,81% ($n=8,p<0,05$) и 45,02±0,73% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Тенденция к снижению жизнеспособности с увеличением концентрации амигдалина была достоверно observed (наблюдаема) при 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в обоих типах клеток DU145 и LNCaP. Результаты анализа МТТ показали, что амигдалин оказывает дозозависимый цитотоксический эффект на клетки рака предстательной железы.

Морфологические изменения, индуцированные амигдалином Анализ DAPI выявил возникновение конденсации ядра, фрагментации ДНК и перинуклеарных апоптотических тел при обработке амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Апоптотические тельца, один из строгих морфологических критериев апоптоза, характерно присутствовали в обработанных амигдалином клетках DU145 и LNCaP, окрашенных DAPI (Рис. 2).

Разрывы цепей ДНК происходят во время апоптоза, и известно, что ники в молекулах ДНК могут быть обнаружены с помощью TUNEL-анализа. TUNEL-позитивные клетки были окрашены в темно-коричневый цвет при световой микроскопии, и конденсация ядра наблюдалась в клетках, обработанных 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл амигдалина. В настоящем исследовании, TUNEL-позитивные клетки, которые указывали на возникновение апоптоза, наблюдались среди обработанных амигдалином клеток DU145 и LNCaP (Рис. 2).

Влияние амигдалина на экспрессию мРНК Bcl-2 и Bax Анализ ОТ-ПЦР уровней мРНК Bcl-2 и Bax был performed (проведен) для оценки относительных уровней экспрессии этих генов. В настоящем исследовании, уровень мРНК Bcl-2 и Bax в контрольных клетках был установлен как 1,00.

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках DU145, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,89±0,05 ($n=4,p<0,05$), 0,69±0,03 ($n=4,p<0,05$) и 0,21±0,03 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно increased (увеличен) до 1,08±0,07 ($n=4,p<0,05$), 2,07±0,17 ($n=4,p<0,05$) и 2,43±0,15 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках LNCaP, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,78±0,20 ($n=4,p<0,05$), 0,52±0,20 ($n=4,p<0,05$) и 0,48±0,38 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно увеличен до 2,25±0,25 ($n=4,p<0,05$), 2,42±0,27 ($n=4,p<0,05$) и 3,64±0,50 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

Настоящие результаты показали, что амигдалин оказывает снижающее действие на экспрессию мРНК Bcl-2 и ускоряющее действие на экспрессию мРНК Bax дозозависимым образом на обе клеточные линии рака предстательной железы DU145 и LNCaP.

Вестерн-блот анализ белков Bcl-2 и Bax Эф-

===== Страница 4 =====

1600 Vol. 29, No. 8

A B C D
DAPI

TUNEL

A B C D
DAPI

TUNEL

Рис. 2. Морфологические наблюдения клеток, обработанных амигдалином (A) Контрольная группа; (B) группа, обработанная амигдалином 0,1 мг/мл; (C) группа, обработанная амигдалином 1 мг/мл; (D) группа, обработанная амигдалином 10 мг/мл. Эксперименты повторялись по крайней мере четыре раза. Вверху: Влияние амигдалина на клетки DU145, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL. Внизу: Влияние амигдалина на клетки LNCaP, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL.

фекты амигдалина на экспрессию белков Bcl-2 и Bax были исследованы. Уровень экспрессии актина indicated (указывал), что количество образца было загружено одинаково. После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл на клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP, экспрессия белка Bcl-2 (25 кДа) дозозависимо снижалась, тогда как экспрессия белка Bax (26 кДа) дозозависимо увеличивалась (Рис. 4).

Анализ активности фермента каспазы-3 Активность фермента каспазы-3 измеряли с использованием DEVD-пептид-нитроанилида (pNA). После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках DU145 было достоверно increased (увеличено) с контрольного значения 5,25±0,50 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 9,47±0,11 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 11,66±0,67 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 11,62±0,59 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 7,28±0,35 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk. DEVD-fmk является ингибитором каспазы-3 (Рис. 5)

После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках LNCaP было достоверно увеличено с контрольного значения 4,21±0,07 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 6,82±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 7,36±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 7,50±0,24 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 4,26±0,28 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk (Рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Разнообразные сигналы могут запускать апоптотический процесс во время развития опухоли. В некоторых случаях, истощение факторов роста/выживания, гипоксия, радиация, потеря клеточно-матриксных взаимодействий, повреждение ДНК и нарушения теломер могут быть включены в число триггеров апоптоза.20 Исследование действий большинства противоопухолевых агентов было сосредоточено на их внутриклеточных сигналах-мишенях, которые индуцируют гибель опухолевых клеток. Противоопухолевые действия подразумевают клеточные ответы, происходящие во время взаимодействий, которые индуцируют гибель опухолевых клеток.21,22 Индукция апоптоза в раковых клетках нарушает инициацию, прогрессию и метастазирование опухолевых клеток.23

В настоящем исследовании, оценка жизнеспособности клеток с использованием анализа МТТ подтвердила, что амигдалин в высоких концентрациях проявляет дозозависимую цитотоксичность в отношении клеток рака предстательной железы DU145 и LNCaP (Рис. 1). Более того, амигдалин индуцировал характерные апоптотические изменения в морфологии клеток рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Разрывы цепей ДНК, которые происходят во время апоптоза,24 наблюдались как TUNEL-позитивные клетки в обработанных амигдалином клетках. Кроме того, апоптотические тельца были обнаружены с помощью окрашивания DAPI в клетках DU145 и LNCaP, обработанных амигдалином (Рис. 2).

Bcl-2, антиапоптотический белок семейства Bcl-2, как известно, способствует неопластической прогрессии, усиливая выживаемость опухолевых клеток через ингибирование апоптоза.26 В большинстве андроген-независимых раков предстательной железы можно наблюдать сверхэкспрессию Bcl-2.27,28 Экспрессия Bcl-2 также значительно усилена при ранних раках предстательной железы.29 В доклинических моделях рака предстательной железы, ингибирование экспрессии Bcl-2 потенцировало химиотерапевтический эффект путем увеличения апоптоза в

===== Страница 5 =====

клетках рака предстательной железы.[30, 31] В настоящем исследовании, амигдалин подавлял экспрессию мРНК Bcl-2, а также down-регулировал (подавлял) экспрессию белка Bcl-2 в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP дозозависимым образом.

Многочисленные исследования сообщали, что сверхэкспрессия белка Bax вызывает выброс цитохрома c, активацию каспазного пути и апоптоз в большинстве клеточных линий рака предстательной железы.[32, 33] Модуляция экспрессии Bax имеет широкое применение для индукции терапевтического апоптоза в лечении рака. Марчелли и др.[34] сообщили, что сверхэкспрессия Bax может индуцировать апоптотическую гибель клеток в нескольких клетках рака предстательной железы, таких как линии клеток DU145 и PC-3, которые устойчивы к некоторым типам химически индуцированного апоптоза. Более того, Лоу и др.[35] сообщили, что сверхэкспрессия белка Bax с помощью промотора, специфичного для предстательной железы, может индуцировать апоптоз в клетках карциномы предстательной железы человека LNCaP, предполагая, что генная терапия Bax является перспективным подходом для лечения раков предстательной железы. В настоящем исследовании, амигдалин усиливал экспрессию мРНК Bax и up-регулировал (усиливал) экспрессию белка Bax в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP дозозависимым образом.

Каспазы, семейство цистеиновых протеаз, как известно, образуют неотъемлемые части апоптотического пути. В частности, каспаза-3 имеет множество клеточных мишеней, и активация этого белка производит типичные морфологические особенности апоптоза.[11] Активированная каспаза-3 расщепляет свой субстрат, и этот процесс знаменует начало расщепления ДНК.[36] В настоящем исследовании, активность фермента каспазы-3 была increased (увеличена) обработкой амигдалином в клетках DU145 и LNCaP, что позволяет предположить, что амигдалин оказывает противораковый эффект, индуцируя апоптоз в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP.

В настоящем исследовании, обработка высокими концентрациями амигдалина клеток рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP индуцировала апоптотическую гибель клеток. Наиболее сильный апоптотический

Рис. 4: Вестерн-блот анализ уровней белка Bcl-2 и Bax

Рис. 5: Активность фермента каспазы-3

Рис. 3: Результаты анализа ОТ-ПЦР уровней мРНК Bcl-2 и Bax

===== Страница 6 =====

эффект наблюдался при 10 мг/мл амигдалина в этом исследовании. В некоторых клинических исследованиях, $2-9\text{г/кг}$ амигдалина вводили внутривенно для достижения противораковых эффектов у мужчин. Следовательно, возможно, что высокие дозы амигдалина, использованные в этом исследовании, могут совпадать с клиническими дозировками для пациентов. Недавно сообщалось, что \textit{Armeniacae semen}, содержащие abundant (обильное количество) амигдалина, проявляют анальгезирующий и противовоспалительный эффекты, показывая, что низкие дозы амигдалина могут облегчать боль.11 Было предложено много гипотез для объяснения противораковых эффектов амигдалина. Например, амигдалин может быть специфично расщеплен бета-глюкозидазой, которая в изобилии содержится в раковых клетках, и, следовательно, цианид высвобождается на раковые поражения, где он оказывает токсичность на раковые клетки.37−3937−39 Другое предположение заключается в том, что амигдалин усиливает функции панкреатических ферментов, которые могут предотвращать трансформацию первичных зародышевых клеток рака.4,384,38 Третья гипотеза состоит в том, что амигдалин (витамин B1717​) восстанавливает дефицит витаминов, который мог привести к метаболическим нарушениям у больных раком.4040 В частности, Бхатти и др.4141 сообщили, что амигдалин может стимулировать иммунную систему для производства противораковой активности у пациентов с раком предстательной железы.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток путем активации каспазы-3 через down-регуляцию антиапоптотического белка Bcl-2 и up-регуляцию проапоптотического белка Bax в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Основываясь на этих результатах, амигдалин показывает considerable (значительные) перспективы в лечении раков предстательной железы.

Благодарности Это исследование было поддержано грантом проекта по разработке восточной медицины, Министерство здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея. (0405-OD00-0815-В050049)

ЛИТЕРАТУРА

1. Chang H. K., Yang H. Y., Lee T. H., Shin M. C., Lee M. H., Shin M. S., Kim C. J., Kim O. J., Hong S. P., Cho S., \textit{Biol. Pharm. Bull.}, 28, 449—454 (2005).

2. Hwang D. R., Kang Y. S., Kim S. S., Kim D. H., Shin M. K., Song H. J., \textit{Kor. J. Herbol.}, 18, 201—208 (2003).

3. Pak J. U., Moon S. J., Moon K., Won J. H., \textit{J. Kor. Orient. Oncol.}, 5, 137—150 (1999).

4. Ellison N. M., Byar D. P., Newell G. R., \textit{New Engl. J. Med.}, 299, 549—552 (1978).

5. Fukuta T., Ito H., Mukainaka T., Tokuda H., Nishino H., Yoshida T., \textit{Biol. Pharm. Bull.}, 26, 271—273 (2003).

6. Shim B. S., Park J. K., Choi S. H., \textit{J. Kor. Orient. Oncol.}, 6, 19—28 (2000).

7. Koo J. Y., Hwang E. Y., Cho S., Lee J. H., Lee Y. M., Hong S. P., \textit{J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.}, 814, 69—73 (2005).

8. Landis S. H., Murray T., Bolden S., Wingo P. A., \textit{Cd Cancer J. Clin.}, 49, 8—31 (1999).

9. Wylie A. H., Kerr J. F., Currie A. R., \textit{Int. Rev. Cytol.}, 68, 251—306 (1980).

10. Korsmeyer S. J., \textit{Cancer Res.}, 59, 1693—1700 (1999).

11. Cohen G. M., \textit{Biochem. J.}, 326, 1—16 (1997).

12. Oliva Z. N., Milliman C. L., Korsmeyer S. J., \textit{Cell.}, 74, 609—619 (1993).

13. Nagata S., \textit{Cell.}, 88, 355—365 (1997).

14. Communal C., Sumandea M., de Tombe P., Narula J., Solano R. J., Hajjar R. J., \textit{Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.}, 99, 6252—6256 (2002).

15. Thompson C. B., \textit{Science}, 267, 1456—1462 (1995).

16. Lowe S. W., Lin A. W., \textit{Corcinogenesis}, 21, 485—495 (2000).

17. Fisher D. E., \textit{Cell.}, 78, 539—542 (1994).

18. Steller H., \textit{Science}, 267, 1445—1449 (1995).

19. Wright S. C., Wei Q. S., Kinder D. H., Larrick J. W., \textit{J. Exp. Med.}, 183, 463—471 (1996).

20. Raff M. C., \textit{Nature} (London), 356, 397—400 (1992).

21. Dive C., Hickman J. A., \textit{Br. J. Cancer}, 64, 192—196 (1991).

22. Eastman A., \textit{Cancer Cells}, 2, 275—280 (1990).

23. Frisch S. M., Francis H., \textit{J. Cell Biol.}, 124, 619—626 (1994).

24. Qiao L., Hanif R., Sphicas E., Shiff S. J., Rigas B., \textit{Biochem. Pharmacol.}, 55, 53—64 (1998).

25. Eastman A., Barry M. A., \textit{Cancer Invest.}, 10, 229—240 (1992).

26. Tsujimoto Y., Croce C. M., \textit{Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.}, 83, 5314—5218 (1986).

27. Colombel M., Symmans F., Gil S., O’Toole K. M., Chopin D., Benson M., Olsson C. A., Korsmeyer S., Buttyan R., \textit{Am. J. Path.}, 143, 390—400 (1993).

28. McDonnell T. J., Navone N. M., Troncoso P., Pisters L. L., Conti C., von Eschenbach A. C., Brisbay S., Logothetis C. J., \textit{J. Urol.}, 157, 569—574 (1997).

29. McDonnell T. J., Troncoso P., Brisbay S. M., Logothetis C., Chung L. W., Hsieh J. T., Tu S. M., Campbell M. L., \textit{Cancer Res.}, 52, 6940—6944 (1992).

30. Gleave M. E., Tolcher A., Miyake H., Nelson C., Brown B., Beraldi E., Goldie J., \textit{Clin. Cancer Res.}, 5, 2891—2898 (1999).

31. Miyake H., Monia B. P., Gleave M. E., \textit{Int. J. Cancer}, 86, 855—862 (2000).

32. Du C., Fang M., Li Y., Li L., Wang X., \textit{Cell.}, 102, 33—42 (2000).

33. Verdagren A. M., Ekert P. G., Pakusch M., Silke J., Connolly L. M., Reid G. E., Moritz R. M., Simpson R. J., Vaux D. L., \textit{Cell.}, 102, 55—66 (2000).

34. Marcelli M., Marani M., Li X., Sturgis L., Haidacher S. J., Trial J. A., Mannucci R., Nicoletti I., Denner L., \textit{Prostate}, 42, 260—273 (2000).

35. Lowe S. L., Rubinchik S., Honda T., McDonnell T. J., Dong J. Y., Norris J. S., \textit{Gene Therapy}, 8, 1363—1371 (2001).

36. Hoshi T., Sasano H., Kato K., Yabuki N., Ohara S., Konno R., Asaki S., Toyota T., Tateno H., Nagura H., \textit{Anticancer Res.}, 18, 4347—4353 (1998).

37. Dorr R. T., Paxinos J., \textit{Ann. Intern. Med.}, 89, 389—397 (1978).

38. Greenberg D. M., \textit{Cancer}, 45, 799—807 (1980).

39. Herbert V., \textit{Am. J. Clin. Nutr.}, 32, 1121—1158 (1979).

40. Young V. R., Newberne P. M., \textit{Cancer}, 47, S1226—1240 (1981).

41. Bhatti R. A., Ablin R. J., Guinan P. D., \textit{IRCS Med. Sci. Biochem.}, 9, 19 (1981).