Влияние дихлорацетата натрия как отдельного препарата, так и в составе комбинированной терапии на рост и метастазирование опухолей легких

Влияние дихлорацетата натрия как отдельного препарата, так и в составе комбинированной терапии на рост и метастазирование опухолей легких

Кафедра фармакологии и терапии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты2Медицинский факультет, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты3Кафедра физиологии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты4Центр медицинских наук имени Зайеда, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты5Национальный институт здоровья и медицинских исследований (INSERM), 75013 Париж, Франция*Автор, которому следует адресовать корреспонденцию.

Международный журнал молекулярных наук 2021 , 22 (22), 12553; https://doi.org/10.3390/ijms222212553Получено: 24 октября 2021 г. / Пересмотрено: 14 ноября 2021 г. / Принято: 17 ноября 2021 г. / Опубликовано: 21 ноября 2021 г.(Эта статья относится к разделу Биохимия )

Абстрактный

Метаболическое перепрограммирование было признано важнейшим признаком нового рака. Сообщалось, что дихлорацетат (DCA), ингибитор пируватдегидрогеназной киназы (PDK), обладает противораковыми эффектами, обращая вспять гликолиз, связанный с опухолью. Это исследование было проведено для изучения противоракового потенциала DCA при раке легких отдельно и в сочетании с химио- и таргетной терапией с использованием двух линий клеток немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), а именно A549 и LNM35. DCA заметно вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности и роста колоний клеток A549 и LNM35 in vitro. DCA также снижал рост опухолевых ксенотрансплантатов как в хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, так и в моделях голых мышей in vivo. Кроме того, DCA снижал ангиогенную способность эндотелиальных клеток пупочной вены человека in vitro. С другой стороны, DCA не ингибировал in vitro клеточную миграцию и инвазию, а также in vivo заболеваемость и рост метастазов подмышечных лимфатических узлов у голых мышей. Лечение DCA не показало никакой токсичности у куриных эмбрионов и голых мышей. Наконец, мы продемонстрировали, что DCA значительно усилил противораковый эффект цисплатина в LNM35. Кроме того, сочетание DCA с гефитинибом или эрлотинибом приводит к аддитивным эффектам на ингибирование роста колоний LNM35 после семи дней лечения и к синергетическим эффектам на ингибирование роста колоний A549 после 14 дней лечения. В совокупности это исследование демонстрирует, что DCA является безопасным и перспективным терапевтическим средством для лечения рака легких.Ключевые слова:рак легких ; дихлорацетат ; ингибитор киназы пируватдегидрогеназы ; рост опухоли ; ангиогенез ; гефитиниб ; эрлотиниб

1. Введение

Рак легких является вторым по частоте встречаемости видом рака с самым высоким уровнем смертности в мире, составив 2,2 миллиона случаев и 1,8 миллиона смертей в 2020 году. Прогнозируется, что заболеваемость и смертность продолжат расти примерно на 60%, до предполагаемых 3,6 миллиона и 3 миллионов соответственно в 2040 году [ 1 ]. Большинство случаев рака легких — это НМРЛ, на которые приходится 80–85% всех случаев рака легких [ 2 ]. Развитие таргетной и иммунотерапии произвело революцию в лечении НМРЛ. Однако побочные эффекты, резистентность и эффективность в небольшой терапевтически чувствительной группе пациентов создают неравенство в доступе к таким агентам [ 3 , 4 , 5 ]. Таким образом, это подчеркивает необходимость в более безопасных и эффективных агентах.Метаболическое перепрограммирование является одним из отличительных признаков рака, который является многообещающей целью для разработки эффективных терапевтических подходов [ 6 ]. По сравнению с нормальными клетками, которые в основном полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) в аэробных условиях, раковые клетки отклоняются от этого нормального метаболического фенотипа, полагаясь в основном на цитозольный гликолиз и молочнокислое брожение, даже в присутствии кислорода, чтобы удовлетворить потребности высокой пролиферации [ 7 ]. Это явление известно как эффект Варбурга, который использовался в качестве терапевтической цели для ингибирования роста опухоли [ 8 ]. PDK является одним из основных ферментов, контролирующих гликолиз и OXPHOS [ 9 ]. Он отключает митохондриальный OXPHOS путем фосфорилирования и ингибирования пируватдегидрогеназы (PDH), ключевого фермента, катализирующего окислительное превращение пирувата в ацетилкофермент А в митохондриях [ 10 ].DCA — это препарат с небольшой молекулярной массой, который использовался при лактоацидозе, врожденных митохондриальных дефектах и ​​диабете [ 11 ]. Интересно, что DCA продемонстрировал способность переключать метаболизм опухоли с цитозольного аэробного гликолиза на митохондриальный OXPHOS путем ингибирования PDK и повышения активности PDH [ 12 ]. Таким образом, сообщалось, что DCA оказывает противораковое действие за счет увеличения оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, а также повышения уровня ROS с последующей гибелью раковых клеток [ 11 , 13 , 14 , 15 ]. Однако в клинических исследованиях профиль безопасности DCA вызывал беспокойство. 

2. Результаты

2.1 Влияние DCA на жизнеспособность клеток и рост колоний линий клеток НМРЛ

Эффект увеличения концентрации DCA (3,125–100 мМ) был исследован на двух линиях клеток NSCLC, а именно, A549 и LNM35. Как показано на рисунке 1 , DCA снижал жизнеспособность A549 ( рисунок 1 A) и LNM35 ( рисунок 1 B) в зависимости от концентрации и времени. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC 50 ) DCA через 48 ч составляет приблизительно 25 мМ для обеих линий клеток.Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие раковые клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) инкубировали в отсутствие или в присутствии увеличивающихся концентраций DCA (3,125–100 мМ) в течение 24, 48 и 72 ч. Жизнеспособность клеток оценивали, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее трех раз. Формы представляют средние значения, столбцы представляют SEM. Раковые клетки A549 ( C ) и LNM35 ( D ) выращивали в течение 7 дней для формирования колоний, которые обрабатывали различными концентрациями DCA (6,25–50 мМ) в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E ) Репрезентативные фотографии контрольных и обработанных DCA колоний показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Результаты представлены в виде процента колоний (среднее значение ± SEM) обработанных клеток по сравнению с контролем. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Для дальнейшей оценки противоракового эффекта DCA было исследовано его влияние на рост предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. Для этого обе клеточные линии выращивали при определенной плотности в течение 1 недели для формирования колоний, а затем обрабатывали возрастающей концентрацией DCA в течение 1 недели. Как показано на рисунке 1 , DCA вызывал зависимое от концентрации сокращение числа колоний для обеих клеточных линий, с более высокой чувствительностью, показанной в колониях LNM35 ( рисунок 1 D,E) по сравнению с колониями A549 ( рисунок 1 C,E). Эти результаты подтверждают противораковый эффект DCA in vitro.

2.2 Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухоли НМРЛ в курином эмбрионе CAM и голых мышах in vivo

Для подтверждения фармакологической значимости наших результатов in vitro противораковый эффект DCA оценивали in vivo с использованием анализа CAM на курином эмбрионе. Ксенотрансплантированные опухоли A549 и LNM35 на CAM обрабатывали 50 мМ DCA каждые 48 ч в течение 1 недели. На E17 опухоли извлекали из верхней части CAM и взвешивали. Как показано на рисунке 2 , 50 мМ DCA значительно снизили рост ксенотрансплантатов опухоли A549 примерно на 40% ( рисунок 2 A), в то время как не показали значительного снижения роста ксенотрансплантатов опухоли LNM35 ( рисунок 2 B). Поэтому 100 мМ DCA исследовали на ксенотрансплантатах опухоли LNM35, и это значительно снизило рост примерно на 40% ( рисунок 2 C). Токсичность также оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах. На E17 DCA не проявил цитотоксичности, поскольку процент живых эмбрионов был аналогичен контрольной группе и группе DCA ( рисунок 2 D–F).Рисунок 2. Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухолей A549 и LNM35 в CAM куриного эмбриона in vivo. ( A ) Масса опухоли раковых клеток A549, ксенотрансплантированных на CAM при плотности 1 миллион клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ) в течение 1 недели. ( B , C ) Масса опухоли раковых клеток LNM35, ксенотрансплантированных на CAM при плотности 0,3 миллиона клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ и 100 мМ). ( D ) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах A549. ( E , F ) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах LNM35. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Влияние DCA на опухолевые ксенотрансплантаты также оценивалось in vivo с использованием бестимусных мышей, инокулированных клетками A549 и LNM35. Сообщалось, что средние летальные дозы (LD50) DCA составляли 4,5 г/кг и 5,5 г/кг у крыс и мышей соответственно [ 17 ]. Поэтому мыши с опухолевыми ксенотрансплантатами A549 получали перорально ежедневно (5 дней в неделю) 50 мг/кг и 200 мг/кг DCA в течение 38 последовательных дней. Лечение DCA (50 мг/кг) не вызвало значительного уменьшения объема опухолевых ксенотрансплантатов A549, в то время как DCA (200 мг/кг) значительно уменьшил объем примерно на 45% ( Рисунок 3 A). Аналогичная разница также наблюдалась в весе опухоли в конце эксперимента ( Рисунок 3 B). Не было выявлено никаких явных признаков токсичности или каких-либо проявлений нежелательного воздействия DCA на поведение животных, массу тела ( рисунок 3 C), компоненты крови, функцию печени и почек ( рисунок 3 D).Рисунок 3. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата A549, инокулированного голым мышам in vivo. ( A ) Объем опухоли ксенотрансплантата A549, инокулированного подкожно голым мышам и леченного DCA (50 и 200 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем в течение 38 дней. ( B ) Вес опухоли, полученный от тех же контрольных и обработанных DCA голых мышей. ( C ) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. ( D ) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. * Значительно отличается при <0,05. ** Значительно отличается при <0,01. ns — незначимо.С другой стороны, наблюдался рост ксенотрансплантатов опухоли LNM35, и мышам вводили перорально 200 мг/кг и 500 мг/кг DCA каждый день (5 дней в неделю) в течение 10 и 24 дней соответственно. Лечение DCA (200 мг/кг) вызвало незначительное уменьшение объема ксенотрансплантатов опухоли LNM35 ( Рисунок 4 A), в то время как DCA (500 мг/кг) значительно уменьшило объем опухоли почти на 75% ( Рисунок 4 B). Почти такие же различия наблюдались в весе опухоли в конце экспериментов ( Рисунок 4 C). Никаких признаков токсичности не наблюдалось в поведении животных или не было обнаружено по весу мышей ( Рисунок 4 D,E), компонентам крови, печени и функции почек ( Рисунок 4 F).Рисунок 4. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата LNM35, инокулированного голым мышам in vivo. ( A , B ) Объем опухоли ксенотрансплантата LNM35, инокулированного подкожно голым мышам и леченного, соответственно, DCA (200 и 500 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем ежедневно в течение 10 и 24 дней. ( C ) Вес опухоли, полученный от контрольных и голых мышей, получавших 500 мг/кг DCA. ( D , E ) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. ( F ) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–11 мышей/группу. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. ns — недостоверно.

2.3 Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур и прорастание HUVEC in vitro

Ангиогенез является одним из признаков рака, который обеспечивает поставку питательных веществ и кислорода для роста и распространения раковых клеток. Влияние DCA на ангиогенез было исследовано in vitro с использованием HUVEC, которые могут образовывать капилляроподобные структуры при посеве на Матригель. Как показано на рисунке 5 A, HUVEC образовывали организованные капилляроподобные структуры в отсутствие DCA, и эта организация была нарушена после добавления DCA. Длины трубок измеряли вручную ( рисунок 5 B) и с помощью анализа изображений Wimasis ( рисунок 5 C), и было обнаружено, что 25 мМ DCA были способны значительно ингибировать способность HUVEC образовывать нитевидные структуры почти на 30–40%. Это ингибирование наблюдалось при концентрациях, которые не показывали никакого снижения жизнеспособности HUVEC ( рисунок 5 D).Рисунок 5. Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур HUVEC in vitro. ( A ) Формы ангиогенеза, индуцированного в HUVEC, культивируемых на матрице Matrigel в 96-луночном планшете в отсутствие и в присутствии различных концентраций DCA. Для контрастной фотографии использовался инвертированный микроскоп (4×), а для уточнения изображений использовалось программное обеспечение Wimasis. ( B , C ) Количественная оценка канальцевого ангиогенеза, индуцированного в клетках HUVEC, культивируемых в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ) вручную и с помощью программного обеспечения Wimasis соответственно. ( D ) Жизнеспособность клеток HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы», в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ). Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Столбцы представляют средние значения; полосы представляют SEM *** Значительно отличается при <0,001. **** Значимое отличие при <0,0001. ns — незначимо.В анализе прорастания сфероиды HUVECs были встроены в 3D коллагеновую матрицу в присутствии и отсутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или комбинации VEGF и DCA. Рисунок 6A показывает в репрезентативном эксперименте, что проростки, образованные в присутствии VEGF, были ингибированы DCA, 25 мМ. Были измерены общие длины проростков, и было обнаружено, что общая длина была значительно увеличена в присутствии VEGF, а DCA значительно уменьшил длину проростков, индуцированных VEGF ( Рисунок 6B ). Это ингибирование наблюдалось при концентрации, которая не показывала никакого снижения жизнеспособности HUVECs ( Рисунок 6C ).Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков внедренными сфероидами HUVEC in vitro. ( A ) Представительные изображения предварительно окрашенных сфероидов HUVEC через 24 часа внедрения в коллагеновую матрицу в присутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или VEGF + DCA. Использовался инвертированный микроскоп с 20-кратным увеличением. ( B ) Среднее значение общей длины ростков различных сфероидов для каждого условия из одного представительного эксперимента. ( C ) Жизнеспособность HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты были повторены 2 раза. Столбцы представляют средние значения 12 сфероидов; полосы представляют SEM **** Значительно отличается при <0,0001. #### Значительно отличается при <0,0001. ns: незначимо.Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование ангиогенеза в опухолях может быть потенциальным механизмом, выходящим за рамки противоракового действия DCA.

2.4 Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro

Метастазирование — многоступенчатый процесс, включающий отделение клеток от первичной опухоли, миграцию клеток в соседние ткани с последующей инвазией клеток в кровь или лимфатическую систему до колонизации этих клеток в отдаленных органах. Влияние DCA на метастазирование у мышей, которым ксенотрансплантировали клетки рака легких с высокой степенью метастазирования, а именно LNM35, оценивали путем проверки веса и частоты подмышечных лимфатических узлов в контрольной и обработанной DCA группах. DCA снижает рост метастазов в лимфатических узлах, не достигая статистической значимости ( рисунок 7 A). Кроме того, он не влияет на частоту метастазов в лимфатических узлах ( рисунок 7 B).Рисунок 7. Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro. ( A ) Вес подмышечных лимфатических узлов с метастазами LNM35 в контрольной группе и группе, получавшей DCA (500 мг/кг перорально). ( B ) Процент мышей с метастазами в лимфатических узлах LNM35 в контрольной группе и группе, получавшей DCA. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. Используя анализ в камере инвазии Бойдена, клетки LNM35 ( C ) и A549 ( D ) инкубировали в течение 24 ч в отсутствие и в присутствии DCA (6,25, 12,5 мМ). Клетки, которые проникли в Матригель и пересекли поры 8 мкм, определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». Царапины были нанесены на сливающиеся монослои клеток LNM35 ( E ) и A549 ( F ), культивируемых в 6-луночном планшете в отсутствие и в присутствии DCA (6,25, 12,5 мМ). Инвертированный микроскоп с 4-кратным увеличением использовался для измерения среднего расстояния, на которое клетки мигрировали от края соскобленной области в течение 2, 6 и 24 ч. Фотографии индуцированных царапин на сливающихся монослоях клеток LNM35 ( G ) и клеток A549 ( H ) в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA через 0, 2, 6 и 24 ч. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы или формы являются средними значениями; столбцы являются SEM * Значительно отличается при <0,05. ** Значительно отличается при <0,01. ns — незначимо.Для оценки способности DCA инвазии и миграции клеток A549 и LNM35 in vitro использовались анализ инвазии в камере Бойдена и анализ миграции при заживлении ран. Чтобы убедиться, что потенциальное влияние DCA на миграцию и инвазию не обусловлено гибелью клеток, мы использовали более низкие концентрации DCA. В этих условиях 6,25 мМ и 12,5 мМ DCA не смогли ингибировать клеточную инвазию LNM35 ( Рисунок 7 C) и A549 ( Рисунок 7 D). Аналогично, эти концентрации не смогли ингибировать клеточную миграцию обеих клеточных линий ( Рисунок 7 E–H).

2.6 Влияние DCA в сочетании с EGFR-TKi на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний

Влияние 48-часовой инкубации с увеличивающимися концентрациями гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ) было исследовано на раковых клетках A549 и LNM35. Гефитиниб вызывал зависимое от концентрации снижение жизнеспособности раковых клеток A549 и LNM35 ( Рисунок 9 A,B); аналогично, эрлотиниб показал ту же картину снижения в двух клеточных линиях ( Рисунок 9 C,D). Количество 20 мкМ гефитиниба и эрлотиниба обладает способностью в обеих клеточных линиях ингибировать клеточную жизнеспособность A549 и LNM35 примерно на 40%, и эта концентрация использовалась в комбинированных экспериментах с DCA.Рисунок 9. Влияние EGFR-Tki на жизнеспособность клеток НМРЛ. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A , C ) и LNM35 ( B , D ) обрабатывали лекарственным носителем, гефитинибом или эрлотинибом (5–80 мкМ) в течение 48 ч. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Столбцы — средние значения; полосы — SEM * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Обработка клеток в течение 48 ч 25 мМ DCA значительно усилила эффект гефитиниба на жизнеспособность клеток A549 ( Рисунок 10 A) и LNM35 ( Рисунок 10 B). Затем был проведен клоногенный анализ для оценки эффекта комбинации на рост предварительно сформированных колоний обеих клеточных линий после семи дней обработки. Концентрация 20 мкМ гефитиниба вызвала 20–40%-ное снижение количества колоний A549 ( Рисунок 10 C) и LNM35 ( Рисунок 10 D). По сравнению с индивидуальными обработками, комбинация DCA с гефитинибом приводит к значительному снижению количества колоний обеих клеточных линий ( Рисунок 10 C, D), вызывая аддитивный эффект в LNM35 по сравнению с расчетным аддитивным значением отдельных обработок (86% против 90%). Кроме того, эта комбинация показывает значительное снижение плотности клеток отдельных колоний обеих клеточных линий ( рисунок 10 E,F).Рисунок 10. Влияние DCA в сочетании с гефитинибом на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) обрабатывали, соответственно, DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo. ( C , D ) Обработка предварительно сформированных колоний клеток A549 и LNM35, соответственно, DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E , F ) Репрезентативные изображения колоний для контрольной и обработанной групп показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Аналогично, DCA усиливает ингибирующее действие эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35 ( Рисунок 11 A, B). Количество колоний A549 и LNM35 было значительно снижено при применении эрлотиниба на 30–40% ( Рисунок 11 C, D), и это снижение было усилено DCA в LNM35 ( Рисунок 11 D), но не в A549 ( Рисунок 11 C). Комбинация вызвала аддитивные эффекты в LNM35, уменьшив количество колоний на 76 ± 2,8%, что статистически незначимо по сравнению с расчетным аддитивным значением отдельных обработок (91 ± 5,8%). Несмотря на незначительное снижение количества колоний A549 при использовании комбинации по сравнению с обработкой одним препаратом, плотность клеток каждой колонии была значительно снижена по сравнению с отдельными обработками ( Рисунок 11 E). Аналогичным образом, плотность клеток колоний LNM35 была снижена в группе, получавшей комбинированную терапию ( рисунок 11 F).Рисунок 11. Влияние DCA в сочетании с эрлотинибом на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) обрабатывали, соответственно, DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo. ( C , D ) Обработка предварительно сформированных колоний клеток A549 и LNM35, соответственно, DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E , F ) Репрезентативные изображения колоний для контрольной и обработанной групп показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Для изучения различий между двумя клеточными линиями в воздействии комбинированной терапии на рост колоний была исследована более длительная продолжительность лечения DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом на рост колоний A549. Как показано на рисунке 12 , комбинация DCA с гефитинибом приводит к значительному сокращению числа колоний ( рисунок 12 A,B). Эта комбинация вызвала большее ингибирование числа колоний по сравнению с рассчитанными аддитивными эффектами препаратов, используемых по отдельности ( рисунок 12 C). Аналогичное наблюдение было отмечено при комбинации DCA и эрлотиниба ( рисунок 12 D–F). В заключение следует отметить, что увеличение продолжительности лечения с семи до четырнадцати дней приводит к синергетическим эффектам предлагаемых комбинированных протоколов.Рисунок 12. Влияние более длительного лечения DCA в сочетании с гефитинибом и эрлотинибом на рост колоний A549. Обработка предварительно сформированных колоний A549 DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ ( A , B ) и DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ ( D , E ) в течение 14 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( C , F ) Влияние комбинаций DCA и гефитиниба или эрлотиниба на рост колоний по сравнению с рассчитанными аддитивными эффектами двух препаратов по отдельности. Все эксперименты были повторены 3 раза. Столбцы представляют собой средние значения; полосы представляют собой SEM ** Значительно отличается при <0,01. *** Значительно отличается при <0,001. **** Значительно отличается при <0,0001.

3. Обсуждение

Несмотря на недавние достижения в скрининге, диагностике и лечении рака легких, в дополнение к замечательному прогрессу в понимании его молекулярной биологии, рак легких является вторым наиболее часто диагностируемым видом рака с самым высоким уровнем смертности во всем мире в 2020 году [ 1 ]. Поэтому прилагаются различные усилия для разработки эффективных агентов и подходов с хорошими пределами безопасности для воздействия на рак легких в попытке обеспечить излечение или улучшить общую выживаемость пациента. Целью данного исследования было изучение влияния метаболического препарата DCA на рост, миграцию, инвазию и ангиогенез рака легких in vitro и рост опухоли и метастазы in vivo, а также влияние целевого метаболизма DCA на цитотоксический эффект одобренной химиотерапии и таргетной терапии в качестве шага к достижению лучшей эффективности и лучшего профиля безопасности.Настоящее исследование показало, что DCA (3,125–100 мМ) вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности клеток и роста предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. IC50 DCA через 48 ч составлял приблизительно 25 мМ в обеих клеточных линиях. Наши результаты согласуются с другими отчетами, в которых DCA (10–90 мМ) подавлял жизнеспособность клеток линий колоректального рака (КРР), а именно SW620, LS174t, LoVo и HT-29, в зависимости от концентрации через 48 ч с диапазоном IC50 30–50 мМ в соответствии с типом клеточной линии [ 18 ]. Аналогично, DCA (20 мМ) значительно снизил жизнеспособность клеток CRC, а именно SW480, LoVo и HT-29 через 48 ч, с большим эффектом на слабодифференцированные клетки SW480 и метастатические клетки LoVo по сравнению с хорошо дифференцированными клетками HT-29 [ 19 ]. С другой стороны, более высокий IC50 был зарегистрирован в клетках рака шейки матки, клетках Hela и SiHa [ 20 ], в то время как DCA (20 мМ) не смог ингибировать жизнеспособность клеток линии рака молочной железы MCF-7 [ 21 ].Наши данные in vitro были подтверждены путем тестирования влияния DCA на прогрессирование опухоли in vivo с использованием моделей CAM куриного эмбриона и бестимусных мышей. Во-первых, мы продемонстрировали, что значительное снижение роста было достигнуто в A549 и LNM35, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона, при использовании доз DCA 50 мМ и 100 мМ соответственно. Во время написания этой рукописи было опубликовано исследование, в котором изучалось влияние натрия DCA на линии клеток глиобластомы U87 MG и PBT24, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона [ 22 ]. Авторы сообщили об изменении роста опухолей U87 MG и PBT24 в ответ на различные концентрации натрия DCA. Сообщалось, что 10 мМ натрия DCA были эффективны в снижении роста опухоли PBT24, но не опухоли U87, что отражает некоторые различия в биологии двух линий клеток [ 22 ]. Во-вторых, мы продемонстрировали, что лечение DCA в дозах 200 мг/кг ежедневно (5 дней в неделю) вызвало значительное снижение роста ксенотрансплантированной опухоли A549 на 40%, в то время как для значительного снижения роста ксенотрансплантированной опухоли LNM35 потребовалась более высокая доза DCA (500 мг/кг). В этом контексте ранее сообщалось, что DCA (100 мг/кг) увеличил время удвоения опухолей A549 и H1975 NSCLC примерно с 3 до 6,5 дней [ 15 ], но не оказал значительного ингибирующего эффекта у мышей с опухолью MDA-MB-231 [ 23 ]. С другой стороны, значительная задержка роста также наблюдалась у ксенотрансплантатов HT-29, леченных пероральным DCA (200 мг/кг) ежедневно в течение четырех дней [ 24 ].Исследование токсичности потенциальных противораковых препаратов так же важно, как и исследование их эффективности, поскольку тяжелая токсичность может помешать их использованию в клинике. DCA не показал цитотоксичности для куриных эмбрионов и бестимусных мышей. Процент живых эмбрионов был одинаковым в группах, получавших DCA, и контрольных группах. Кроме того, DCA не повлиял на поведение мышей, вес, общий анализ крови, параметры функции печени и почек по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с предыдущими доклиническими и клиническими отчетами, которые не показали никаких доказательств тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности при лечении DCA [ 13 , 14 ]. Немногие пациенты, получавшие лечение DCA, жаловались на общие желудочно-кишечные эффекты. Кроме того, наиболее распространенным ограничением для введения DCA является обратимая периферическая невропатия, которую можно свести к минимуму путем снижения дозы или дополнительного введения антиоксидантов [ 11 ]. Включение DCA в системы доставки лекарств (СДЛ), такие как наночастицы, является многообещающим подходом для сохранения противораковой активности DCA с минимальными побочными эффектами [ 25 , 26 , 27 ].Сообщалось, что противораковый эффект DCA частично обусловлен индукцией апоптоза, как это наблюдалось в клетках колоректального рака [ 19 ] и клетках НМРЛ [ 15 ] или ингибированием ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза, такие как антитело к VEGF бевацизумаб и блокатор рецепторов VEGF рамуцирумаб, были клинически одобрены для лечения рака легких [ 28 ]. Несмотря на их подтвержденную эффективность, их скромные общие терапевтические эффекты с сопутствующими побочными эффектами подчеркивают очевидную необходимость в более эффективном подходе, нацеленном на ангиогенез [ 28 ]. Наше исследование показало, что DCA (25 мМ) является перспективным антиангиогенным средством, поскольку он способен значительно ингибировать образование и прорастание эндотелиальных клеток in vitro. Кроме того, более низкие концентрации DCA (6,25 и 12,5 мМ) не влияли на образование трубок HUVEC. Эти результаты согласуются с отчетом Шунджанса и его коллег, которые продемонстрировали, что 5 мМ и 10 мМ DCA не повлияли на формирование трубок HUVEC in vitro [ 29 ]. В соответствии с нашими данными, DCA вызвал снижение плотности микрососудов опухоли у обработанных крыс, у которых также было отмечено подавление HIF1α в опухолевых клетках [ 30 ]. С другой стороны, Чжао и его коллеги недавно сообщили, что DCA стимулирует ангиогенез в модели сосудистой деменции у крыс за счет улучшения функции эндотелиальных клеток-предшественников [ 31 ].Примерно у 30–40% пациентов с НМРЛ на момент постановки диагноза наблюдалось метастатическое заболевание. Отдаленные метастазы отрицательно влияют на варианты лечения, ответ и выживаемость [ 32 ] и являются основной причиной смерти от рака легких [ 33 ]. Метастазирование — это многоступенчатый процесс, включающий отсоединение раковых клеток, миграцию, инвазию и колонизацию в отдаленных участках. Поэтому терапевтические агенты и схемы, уменьшающие такой отличительный признак рака, имеют большое значение в терапии рака. Несмотря на продемонстрированную антиангиогенную активность DCA, это исследование не показало влияния DCA на метастазирование клеток LNM35, ксенотрансплантированных бестимусным мышам, получавшим перорально эффективную дозу. В этом исследовании клетки LNM35, ксенотрансплантированные путем подкожной инокуляции бестимусным мышам, вызвали 90% случаев метастазов в подмышечных лимфатических узлах, и DCA не смог снизить частоту и рост этих метастазов в лимфатических узлах. Линия клеток LNM35 была создана в 2000 году как первая линия клеток рака легких человека, имеющая лимфогенные метастатические свойства со 100% частотой после подкожной инъекции в боковой бок голых мышей [ 34 ]. Кроме того, DCA не показал никаких ингибирующих эффектов на миграционные и инвазивные свойства клеток LNM35 и A549 in vitro. Аналогичным образом сообщалось, что монотерапия DCA не была эффективна в снижении метастазов в легких из метастатических клеток рака груди, ксенотрансплантированных голым мышам [ 23 ].Комбинированная терапия является фундаментальным подходом в лечении рака. Сочетание различных противораковых препаратов позволяет воздействовать на различные основные сигнальные пути для усиления терапевтических преимуществ, избегания приобретенной резистентности и снижения тяжести побочных эффектов [ 35 ]. Химиотерапия играет неотъемлемую роль в лечении пациентов с НМРЛ. Обычно используется схема с платиной (цисплатин или карбоплатин) плюс паклитаксел, гемцитабин, доцетаксел, винорелбин, иринотекан или пеметрексед [ 36 ]. Неселективные характеристики химиотерапевтических агентов приводят к скромному увеличению выживаемости при значительной токсичности для пациента [ 37 ]. Это подчеркивает необходимость в более эффективных стратегиях для улучшения результатов лечения пациентов с минимальными побочными эффектами. В настоящем исследовании DCA не удалось усилить противораковый эффект камптотецина и гемцитабина в обеих линиях клеток НМРЛ. Кроме того, DCA не смог значительно усилить противораковые эффекты цисплатина в клеточной линии A549 in vitro, но он усилил цитотоксический эффект цисплатина в клеточной линии LNM35, что отражает роль генетического фона раковых клеток в определении пути гибели клеток, вызванного препаратами. Ким и др. сообщили, что клетки A549 имеют более низкую скорость аэробного гликолиза по сравнению с клетками H460 из-за дифференциальной экспрессии некоторых метаболических ферментов [ 38 ]. Аэробный гликолиз при раке был связан с химиорезистентностью, и ингибирование связанных путей было предложено в качестве механизма преодоления такой резистентности. Например, сверхэкспрессия PDK4 при раке мочевого пузыря высокой степени злокачественности заставляет совместное введение DCA с цисплатином вызывать резкое снижение роста опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [ 39 ]. Аналогичным образом, введение DCA с паклитакселом было описано как успешный подход к преодолению резистентных к паклитакселу клеток НМРЛ из-за сверхэкспрессии PDK2 [ 40 ]. Кроме того, Галгамува и др. заявили, что предварительное лечение DCA значительно ослабило нефротоксичность, вызванную цисплатином у мышей, сохранив противораковые эффекты цисплатина [ 41 ].Открытие таргетной терапии помогло врачам адаптировать варианты лечения для пациентов с НМРЛ. Было разработано много таргетных препаратов, которые стали частью первой линии лечения НМРЛ, например, гефитиниб и эрлотиниб, которые считаются первым поколением EGFR-TKi [ 42 ]. Гефитиниб и эрлотиниб были одобрены более 10 лет назад для лечения пациентов с прогрессирующим мутантным EGFR НМРЛ, не получавших химиотерапию, в качестве первой линии лечения. Они также используются в качестве второй линии терапии после неудачи химиотерапии [43]. Некоторые отчеты показали, что эрлотиниб имеет хорошую эффективность у пациентов с НМРЛ с диким типом EGFR [ 44 ]. Поддерживающая доза может принести пользу этим пациентам после химиотерапии на основе платины, которая считается основной терапией при НМРЛ с диким типом EGFR [ 45 ]. Несмотря на значительные преимущества, у многих пациентов после 10–14 месяцев лечения развилась терапевтическая резистентность из-за вторичной мутации в гене EGFR [ 46 ].В этом исследовании мы стремились изучить способность DCA сенсибилизировать линии клеток NSCLC дикого типа EGFR при сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. DCA значительно усилил ингибирующий эффект гефитиниба и эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35. Это исследование также показало аддитивные эффекты на рост колоний LNM35 при сочетании DCA с гефитинибом или эрлотинибом в течение семи дней лечения. Более того, эта комбинация оказала синергическое действие на рост колоний A549 после четырнадцати дней лечения. Кроме того, все эти протоколы комбинирования привели к существенному снижению клеточной плотности отдельных колоний как A549, так и LNM35. В этом контексте сообщалось, что DCA с гефитинибом или эрлотинибом синергически подавляет жизнеспособность и способность к образованию колоний мутантных клеток EGFR (NCI-H1975 и NCI-H1650) из-за синергического эффекта в продвижении апоптоза. В клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460) они показали, по сравнению с индивидуальными обработками, что комбинация вызывала повышенное значение фракции, затронутой (Fa), в жизнеспособности клеток, не достигая уровня синергизма в клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460), и эта комбинация не подавляла значительно образование колоний этих линий клеток [ 47 ]. Различия в экспериментальных условиях между вышеупомянутым отчетом и нашим исследованием могут объяснить такие переменные результаты. В своем клоногенном анализе исследователи обрабатывали отдельные клетки в течение трех последовательных дней, а затем инкубировали в среде без лекарственных средств в течение 15 дней для формирования колоний; Однако в наших экспериментах клетки сначала инкубировали в течение десяти дней для формирования колоний, а затем подвергали обработке в течение семи и четырнадцати дней.Подводя итог, можно сказать, что это исследование продемонстрировало, что DCA является перспективным противораковым средством для лечения НМРЛ, подавляя жизнеспособность клеток и рост колоний клеток НМРЛ in vitro, а также рост опухолей у эмбрионов цыплят CAM и голых мышей, в которых также оценивалась безопасность этого средства. DCA подавляет способность эндотелиальных клеток образовывать капилляроподобные структуры и прорастать in vitro, что позволяет предположить ингибирование ангиогенеза как потенциальный механизм противоракового эффекта. Это исследование также выявило потенциальную ценность DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. Результаты этого исследования прокладывают путь для подтверждения влияния комбинации DCA с гефитинибом или эрлотинибом на рост опухоли in vivo, в дополнение к исследованию влияния DCA в сочетании с EGFR-TKi второго и третьего поколения.

4. Материалы и методы

4.1. Культура клеток и реагенты

Клетки NSCLC, A549 и LNM35, поддерживались в среде RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 . Среда была дополнена 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Hyclone, Cramlington, UK) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Cramlington, UK). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) поддерживались в полном наборе сред EndoGRO TM -VEGF (Merck Millipore, Massachusetts, USA) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в колбах, покрытых 0,2% желатином. Культуральную среду всех клеток меняли каждые 3 дня, а клетки пересевали один раз в неделю, когда культура достигала 95% конфлюэнтности для раковых клеток и 80% для HUVEC.Натрий DCA, цисплатин, камптотецин, гемцитабин HCl, эрлотиниб HCl и гефитиниб были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). DCA был свежерастворен в воде HyPure (Hyclone, Крамлингтон, Великобритания) перед началом любого эксперимента для приготовления исходного раствора 1 М, который затем был разбавлен до требуемых концентраций для лечения.

4.2 Жизнеспособность клеток

Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночный планшет. Через 24 часа клетки обрабатывали возрастающей концентрацией DCA (3,125–100 мМ) в двух повторностях в течение 24, 48 и 72 часов, тогда как контрольные клетки обрабатывали лекарственным средством (вода Hypure), смешанным со средой. В указанные временные точки использовали анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) для определения влияния DCA на жизнеспособность клеток путем количественной оценки АТФ, которая будет пропорциональна количеству метаболически активных клеток. Люминесцентный сигнал измеряли с помощью люминометра GloMax ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность клеток была представлена ​​в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности клеток, обработанных DCA, с контрольными клетками, жизнеспособность которых предполагалась равной 100%.Во втором наборе экспериментов клетки обрабатывали в течение 48 ч возрастающей концентрацией гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ). Кроме того, клетки обрабатывали в течение 48 ч комбинацией DCA и других противораковых агентов, а именно цисплатина, камптотецина, гемцитабина, гефитиниба и эрлотиниба. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа люминесцентной жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® и люминометра GloMax ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность представляли в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности обработанных лекарством клеток с контрольными клетками.

4.3 Клоногенный анализ

В 6-луночный планшет высевали клетки A549 и LNM35, соответственно, по 50 и 100 клеток на лунку. Клетки выдерживали для роста в колонии в течение 7–10 дней во влажной атмосфере при 37 °C и 5% CO2 , при этом среду меняли каждые три дня. Образованные колонии обрабатывали каждые 3 дня в течение 7 дней возрастающими концентрациями DCA (6,25–50 мМ). После этого колонии промывали три раза 1× PBS, фиксировали и окрашивали в течение 2 часов 0,5% кристаллическим фиолетовым, растворенным в 50% метаноле ( об. / об. ). Наконец, колонии промывали 1× PBS и фотографировали, и подсчитывали колонии с более чем 50 клетками. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных DCA, с контрольными колониями. Плотность клеток колоний оценивали путем фотографирования колоний в каждой группе с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа (4×).Во втором наборе экспериментов сформированные колонии обрабатывались каждые 3 дня в течение 7 или 14 дней комбинацией DCA и гефитиниба или DCA и эрлотиниба. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных препаратом, с контрольными колониями.

4.4 Анализ роста опухоли in ovo

Оплодотворенные яйца леггорнов инкубировались в инкубаторе для яиц, установленном на температуру 37,5 °C и влажность 50% в течение первых 3 дней после оплодотворения. На 3-й день эмбрионального развития (E3) САМ удалялся путем просверливания небольшого отверстия в яичной скорлупе напротив круглого, широкого конца с последующей аспирацией ~1,5–2 мл альбумина с помощью шприца объемом 5 мл с иглой 18G. Затем в яичной скорлупе над САМ вырезалось небольшое окно с помощью тонких ножниц и заклеивалось полупроницаемой клейкой пленкой (Suprasorb ® F). Яйца снова содержались в инкубаторе до 9-го дня эмбрионального развития (E9), на котором раковые клетки были трипсинизированы, центрифугированы и суспендированы в 80% матрице Matrigel ® (Corning, Bedford, UK) для получения 1 × 10 6 клеток/100 мкл для A549 и 0,3 × 10 6 клеток/100 мкл для LNM35. 100 мкл инокулята добавляли на САМ каждого яйца, в общей сложности 10–13 яиц на состояние. На 11-й день эмбрионального развития (E11) образовавшиеся опухоли обрабатывали местно, капая 100 мкл DCA, приготовленного на 0,9% NaCl для первой группы или лекарственного носителя для контрольной группы. Лечение повторяли на E13 и E15. Все описанные шаги выполняли в асептических условиях. Наконец, на 17-й день эмбрионального развития (E17) эмбрионы были гуманно умерщвлены путем нанесения 10–30 мкл пентобарбитона натрия (300 мг/мл, Jurox, Окленд, Новая Зеландия). Опухоли были осторожно извлечены из нормальных верхних тканей CAM, промыты 1× PBS и взвешены для определения влияния DCA на рост опухоли. Данные представлены в виде сравнений среднего веса опухолей в контрольной группе и группе, обработанной DCA. Токсичность препарата оценивалась путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах в конце эксперимента. Живые эмбрионы определялись путем проверки произвольных движений эмбрионов в дополнение к целостности и пульсации кровеносных сосудов.Этот анализ представляет собой рандомизированный открытый анализ, который был проведен в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных в Университете Объединенных Арабских Эмиратов. Согласно Европейской директиве 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях, эксперименты с использованием куриных эмбрионов на E18 и до нее не требуют одобрения со стороны Комитета по уходу и использованию институциональных животных (IACUC).

4.5 Анализ роста опухоли и метастазирования

Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных университета ОАЭ в марте 2019 года (код протокола ERA_2019_5872). Шести-восьминедельные бестимусные самцы мышей NMRI nude (nu/nu, Charles River, Германия) содержались в ламинарных шкафах с фильтрованным воздухом и обрабатывались в асептических условиях. Клетки A549 (5 × 10 6 клеток/200 мкл PBS) и клетки LNM35 (0,4 × 10 6 клеток/200 мкл PBS) вводились подкожно в боковой бок мышей nude. Через десять дней, когда опухоли достигли объема приблизительно 50 мм 3 , животные с ксенотрансплантатами A549 были случайным образом разделены на три группы по 9–10 мышей в каждой. Эти группы лечились перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 50 мг/кг или 200 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 38 дней. С другой стороны, животные с ксенотрансплантатами LNM35 лечились перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 200 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 10 дней и DCA 500 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 24 дней. Размеры опухолей и вес животных проверялись каждые три или четыре дня. Кроме того, физические признаки и поведение проверялись каждый день. Объем опухоли рассчитывался по формуле V = L × W 2 × 0,5, где L представляет собой длину, а W - ширину опухоли. В конце экспериментов животных анестезировали и умерщвляли путем смещения шейных позвонков, а опухоли удаляли и взвешивали. Влияние DCA на рост опухоли было представлено путем сравнения среднего веса опухоли в конце эксперимента между контрольной группой и группой, получавшей DCA. Его также оценивали путем сравнения объема опухоли между контрольной и обработанной DCA группами на протяжении всего эксперимента. Образцы крови собирали у каждой мыши и анализировали с помощью SCIL VET ABC™ Animal Blood Counter для полного анализа крови. Кроме того, плазму крови отделяли центрифугированием для биохимического анализа. Для изучения влияния DCA на метастазирование подмышечные лимфатические узлы вырезали и взвешивали у животных с ксенотрансплантатами LNM35 в конце эксперимента.

4.6 Анализ формирования сосудистой трубки

Matrigel ® Matrix (Corning, Bedford, UK) размораживали и добавляли 40–50 мкл в лунки 96-луночного планшета для покрытия. Для того чтобы Matrigel затвердел, планшет держали во влажном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч. HUVEC трипсинизировали и высевали на покрытый планшет с плотностью 2,5 × 104 клеток /100 мкл/лунку в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA. Через 8 ч инкубации сети трубок в разных лунках фотографировали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Влияние DCA на способность HUVEC образовывать капилляроподобные структуры оценивали путем измерения общей длины сформированных трубок в контрольных и обработанных DCA лунках. Общая длина трубок измерялась вручную и с помощью программного обеспечения для онлайн-анализа изображений, разработанного Wimasis ( https://www.wimasis.com/en/products/13/WimTube - дата доступа 1 марта 2019 г.). Влияние различных концентраций DCA на жизнеспособность HUVEC определялось с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), как ранее описано в разделе о жизнеспособности клеток.

4.7. Анализ прорастания сфероидов HUVEC

Сфероиды HUVEC были приготовлены путем первого окрашивания клеток путем инкубации 190 000 клеток с 2 мкМ раствором красителя CellTracker TM Green CMFDA (Invitrogen Molecular probes, Paisley, UK) в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе, установленном на 37 °C и 5% CO2 , с последующим центрифугированием в течение 5 мин и удалением супернатанта. Осадок HUVEC был суспендирован в дополненной среде HUVEC (5 мл), смешанной с раствором метоцела (1,25 мл), который должен быть приготовлен ранее [ 48 ]. Затем 25 мкл клеточной суспензии пипеткой наносили на крышку чашки Петри. Примерно 50 капель пипеткой наносили в каждую чашку Петри. Наконец, капли держали перевернутыми в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе, установленном на 37 °C и 5% CO2 .Образованные сфероиды в каждой чашке (~50 сфероидов) собирали отдельно с 1× PBS и центрифугировали при 150× g в течение 5 мин. Тем временем рабочий раствор коллагена I готовили на льду путем осторожного смешивания исходного коллагена I из хвоста крысы (1500 мкл) (Millipore, MA, США) с 10× средой 199 (150 мкл) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, США) и ледяным стерильным 1N NaOH (34 мкл), который приобрел красный цвет. Каждый сфероидный осадок покрывали слоем раствора метоцела, содержащего 4% FBS (0,25 мл), рабочего раствора коллагена I (0,25 мл) и 60 мкл базальной среды или VEGF 30 нг/мл или DCA 25 мМ или их комбинации. Сразу после осторожного перемешивания смесь добавляли в предварительно нагретый 24-луночный планшет и инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов, что позволяло полимеризовать коллаген и прорасти сфероидам. Через 24 часа сфероиды были захвачены с помощью инвертированного микроскопа с 20-кратным увеличением. Длина проростков в 12 сфероидах в каждом состоянии была измерена с помощью ImageJ.

4.8. Анализ подвижности при заживлении ран

Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 1 × 10 6 клеток/лунку в 6-луночный планшет. Через 24 часа с помощью наконечника объемом 200 мкл делали царапину через сливающийся монослой. После этого клетки дважды промывали 1× PBS с последующим добавлением свежей среды с лекарственным носителем или DCA. В верхней части планшета отмечали два места для мониторинга уменьшения размера раны с течением времени с использованием инвертированного микроскопа при объективе 4× (Olympus 1X71, Токио, Япония). Планшеты инкубировали во влажной атмосфере при 37 °C и 5% CO 2 , а ширину раны измеряли через 0, 2, 6 и 24 часа после инкубации. Расстояние миграции выражали как среднее значение разницы между измерениями в нулевой момент времени и в периоды времени 2, 6 и 24 часа.

4.9. Анализ камеры вторжения Матригеля

Следуя протоколу производителя (Corning, Bedford, MA, USA), в нижние камеры добавляли 0,5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS. После этого раковые клетки высевали с плотностью 1 × 10 5 клеток/0,5 мл в верхние камеры в среде без FBS в присутствии и отсутствии DCA. Планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO 2 в течение 24 часов. Инвазивные клетки разрушают Матригель и проходят через 8 мкм поры вставки. Непроникающие клетки верхних камер удаляли, осторожно протирая область ватным тампоном. Затем полупроницаемую мембрану удаляли с помощью очень тонких ножниц. Инвазивные клетки были обнаружены с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), ранее описанного в разделе жизнеспособности клеток. Влияние DCA на клеточную инвазию было представлено в процентах (%) путем сравнения инвазирующих клеток в присутствии DCA с контролем.

4.10 Статистический анализ

За исключением анализа in ovo и экспериментов на голых мышах, каждый эксперимент проводился не менее трех раз. Данные выражены как среднее значение ± SEM Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 8.3.1 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Для оценки разницы между двумя группами использовался непарный t -тест. Для сравнения 3 или более групп с контрольной группой использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Даннетта. Кроме того, для комбинированных экспериментов использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Тьюки. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001 указывают на значимые различия.

Вклады авторов

Концептуализация, SA; методология, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; валидация, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; формальный анализ, SA и AA-A.; расследование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; курирование данных, SA; написание — подготовка первоначального черновика, SA и AA-A.; написание — рецензирование и редактирование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; визуализация, SA, AA-A. и AN; руководство, SA; администрирование проекта, SA; получение финансирования, SA Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование частично финансировалось за счет гранта Центра медицинских наук имени Зайеда при Университете Объединенных Арабских Эмиратов, № 31R136.