Тэг: опухолевые клетки

Дихлорацетат ингибирует рост нейробластомы, специфически действуя против злокачественных недифференцированных клеток

оригинал статьи: https://sci-hub.st/10.1002/ijc.26173

Серена Велла1*, Маттео Конти2*, Роберта Тассо1, Раньери Канседда1,3 и Альдо Пагано1,3

1 Отделение онкологии, биологии и генетики (DOBiG), Университет Генуи, Генуя-Италия
2 Лаборатория клинической фармакологии и токсикологии, Ospedale S. Maria delle Croci, 48100 Равенна-Италия

3 Национальный институт исследования рака (IST) Генуя, Largo R. Benzi, 10, 16132 Генуя-Италия

Небольшая, растворимая в воде молекула дихлорацетата (ДХА) в последнее время вызывает живой интерес в области терапии рака, поскольку было показано, что она способна подавлять рост опухолей человека, действуя специфически на митохондрии раковых клеток без нарушения физиологии не злокачественных клеток. Нейробластома была одним из типов опухолей, в отношении которых DCA считался неэффективным, поскольку она состоит из клеток с небольшим количеством признанных митохондриальных аномалий. Однако нейробластома состоит из различных типов клеток с точки зрения метаболизма, фенотипа и злокачественного потенциала. Несмотря на вышеизложенное предсказание, в данной работе мы показали, что (i) DCA оказывает неожиданный противораковый эффект на опухолевые клетки НБ и (ii) этот эффект избирательно направлен на очень злокачественные клетки НБ, тогда как более дифференцированные/менее злокачественные клетки НБ рефрактерны к лечению DCA. Этот результат подтверждает необходимость детального изучения противораковых свойств DCA против этого типа опухолей с конечной целью его возможного использования в качестве терапевтического средства.

Небольшая молекула/орфанный препарат DCA недавно оказался в центре внимания благодаря своей способности ограничивать рост опухоли glioblastoma multiforme (GBM) в дозах, совместимых с отсутствием побочных эффектов.1-4 Таким образом, учитывая его хорошо переносимую токсичность и низкую стоимость, DCA вызывает живой интерес в связи с его потенциальным использованием в терапии рака и лечении некоторых типов опухолей.5 Действительно, хотя DCA показал свою эффективность в отношении мелкоклеточной карциномылегких6, рака молочнойжелезы7, простаты8, эндометрия9 и клеточных линийглиобластомы2, эффективность этой небольшой молекулы в качестве противоракового лечения пока клинически продемонстрирована только в отношении GBM человека, поэтому доказанную эффективность DCA в отношении других злокачественных опухолей еще предстоитоценить10 Более подробно, в силу своего механизма действия, DCA, как ожидается, будет неэффективен в отношении опухолей, характеризующихся низкой митохондриальной поляризацией, таких как овсяноклеточный рак легких, лимфомы, нейробластома (NB) и саркомы.5 DCA как ингибитор митохондриального фермента киназы пируватдегидрогеназы (PDK) активирует пируватдегидрогеназу (PDH), фермент-привратник, который регулирует поток пирувата в митохондрии, увеличивая соотношение окисления глюкозы и гликолиза.4-6 Bonnet и др. показали, что это усиление окислительного фосфорилирования является избирательно про-апоптотическим в раковых клетках, приводя к снижению их типичной гиперполяризации митохондрий, связанной с устойчивостью к апоптозу.6 Несмотря на то, что НБ изначально считался одним из типов опухолей, в отношении которого DCA, скорее всего, неэффективен, из-за его специфической мелкоклеточной особенности и предполагаемого отсутствия гиперполяризации митохондриальной мембраны,5 пролиферирующие клетки НБ поддерживаются гликолитическим фенотипом.11 Мы изучили возможную эффективность лечения DCA в подавлении роста узелков НБ человека, сформированных у мышей NOD-SCID. Удивительно, но мы заметили, что DCA значительно ограничивает рост опухоли in vivo. В опухолях НБ человека существует три различных типа клеток: I-тип стволовых клеток, N-тип нейробластических/нейроэндокринных предшественников и стволовые S-тип шванновских/меланобластических предшественников. Эти клетки обладают различными морфологическими, биохимическими и опухолегенными свойствами и варьируют по стадиям дифференцировки.12 Интересно, что, используя генетически сконструированные клетки SKNBE2 NB, характеризующиеся выраженной нейроноподобной приверженностью и очень низким злокачественным потенциалом, мы обнаружили, что эффект DCA ограничивается недифференцированными, очень злокачественными, полностью циклическими клетками, тогда как он не влияет на скорость пролиферации более дифференцированных, слабо злокачественных клеток. Представленные здесь эксперименты позволяют расширить возможную эффективность DCA как противоракового препарата до NB, действующего дифференцированно на сильно и/или слабо злокачественные клетки.

Ключевые слова: дихлорацетат, нейробластома, митохондрии *С.В. и М.К. внесли равный вклад в эту работу.

Спонсор гранта: Министерство университетов и исследований Италии — MIUR (2007 PRIN Program prot.); номер гранта: 2007945BZN; спонсор гранта: Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (2009 AIRC Program); номер гранта: IG9378; спонсор гранта: Министерство университетов и исследований Италии — MIUR (2007 Международная программа FIRB), Ассоциация итальянского общества по борьбе с нейробластомой (Генуя, Италия)

DOI: 10.1002/ijc.26173

История: Получено 25 февраля 2011 г.; Принято 20 апреля 2011 г.; Онлайн 9
мая 2011 г

Переписка по адресу: Альдо Пагано, отделение онкологии, биологии и генетики (DOBiG), Университет Генуи, Генуя, Италия, тел.: þ/39/ 010-5737241, факс: þ/39/010-5737257, e-mail: aldo.pagano@unige.it

Int. J. Cancer: 130, 1484-1493 (2012) VC 2011 UICC

Материал и методы

Мыши
Гомозиготные мыши NOD-SCID (NOD.CB17-Prkdcscid) были приобретены в Джексоновской лаборатории (Бар-Харбор, штат Массачусетс). Мышей использовали в возрасте от 5 до 8 недель. Все животные были выращены и содержались в питомнике Национального института исследования рака, Генуя, Италия. Уход и использование животных осуществлялись в соответствии с законами Министерства здравоохранения Италии и руководящими принципами Европейского сообщества.

Анализ опухолеродности in vivo
Суспензию клеток SKNBE2 в PBS (107 клеток) подкожно вводили 37 мышам NOD/SCID. Мыши были разделены на четыре группы: — контрольная группа (n ¼ 13 мышей): стерилизованная вода; — группа, обработанная DCA (25 мг/кг/доза) (n ¼ 14 мышей); — группа, обработанная DCA (2,5 мг/кг/доза) (n ¼ 5 мышей); — группа без обработки (n ¼ 5 мышей): мышам подкожно вводили суспензию клеток, но они были принесены в жертву перед любым видом обработки. DCA, как и стерилизованную воду, вводили внутрижелудочно, один раз в день/5 дней в неделю/в течение 4 недель. Лечение начинали, когда неоплазия достигала порогового диаметра 5 мм. Мышей еженедельно наблюдали за появлением опухолей в местах инъекций; размер опухолей измеряли каждую неделю штангенциркулем во всех группах. Изображения каждой мыши собирали в каждой рассматриваемой временной точке.

Клеточные культуры
Клетки SKNBE2 wt, Mock и S1 поддерживали на среде RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Милан, Италия), 10% FBS (GIBCO, S.Giuliano Milanese, Милан, Италия), L-глутамин (2 мМ; EuroClone, Девон, Великобритания), пенициллин-стрептомицин (100 U/мл/ 100 lg/мл; EuroClone) (стандартная среда). Клетки U2-OS поддерживали на среде Дульбекко, модифицированной Иглсом (DMEM) (Sigma-Aldrich), 10% FBS (GIBCO), L-глутамин (2 мМ; EuroClone) и пенициллин-стрептомицин (100 U/ml/ 100 lg/ml; EuroClone). Дихлорацетат готовили в виде водного раствора и добавляли в среду. Порции каждой рассматриваемой опухоли промывали в PBS и переваривали с 12,5 Ед/мл коллагеназы I типа (Biochrom AG, Берлин, Германия) и 12 Ед/мл диспазы (Roche, Германия) в PBS в течение 20 мин при 37oC. Свежевыделенные клетки использовали как для флоуцитометрического анализа, так и для экспансии in vitro в стандартной среде. Все клеточные культуры поддерживались при 37oCв атмосфере 95% воздуха/5% CO2 при 100% влажности.

Гистологический анализ и иммуногистохимия
Для гистологического исследования опухоли, полученные из каждой экспериментальной группы, были хирургически удалены, зафиксированы в 10% нейтрально-буферном формалине, обезвожены и помещены в парафин с использованием стандартных гистологических методов. Серийные 4-лм срезы вырезали и окрашивали гематоксилином и эозином (H/E) для изучения морфологических особенностей или обрабатывали для иммуногистохимии. После гидратации, извлечение антигена вызывали нагреванием в цитратном буфере pH 6.0, а эндогенные пероксидазы блокировали 3% H2O2 в воде. Неспецифическое связывание ингибировалось путем инкубации предметных стекол в 10% нормальной козьей сыворотке (Sigma-Aldrich, Милан, Италия). Использовали следующее первичное антитело: моноклональное античеловеческое Ki-67 (клон K-3; Oncogene, San Diego, CA). Отрицательные контроли с преиммунной сывороткой проводились параллельно. После тщательной промывки в Трис забуференном физиологическом растворе, слайды инкубировали с антимышиным вторичным антителом (BioSpa, Милан, Италия). После промывки добавляли стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (BioSpa), и инкубировали в течение 30 минут. Затем предметные стекла окрашивали хромогеном диаминобензидином (Lab Vision, Фримонт, Калифорния). Окрашивание проводилось гематоксилином. Изображения получали методом микроскопии в проходящем свете с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 200M, оснащенного цветной охлаждаемой 3CCD-камерой Zeiss Axio-Cam MRc (Zeiss, Wetzlar, Германия). Окрашенные H/E слайды наблюдались под тем же микроскопом в проходящем свете. Размер клеток анализировали с помощью общедоступного программного обеспечения ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ ij/). Порог был установлен для того, чтобы отличить контур каждой клетки от фона, и каждое изображение было преобразовано в двоичное (черно-белое). Для отделения одиночных клеток от скоплений использовалось разделение »Watershed». Площади рассчитывались с помощью «анализа частиц» с порогом отсечения размера частиц в 100 пикселей. Изменения в объеме клеток определялись путем деления количества пикселей с лекарственной обработкой на количество пикселей без лекарственной обработки.

Анализ апоптоза
Апоптоз анализировали методом проточной цитометрии, используя Annexin V в соответствии с инструкциями производителя (Annexin VFITC Apoptosis Kit, Immunological Sciences, Рим, Италия; Annexin V-APC Apoptosis Detection Kit I; BD Biosciences, Оксфорд, Великобритания; DAPI, Sigma-Aldrich, Милан, Италия). Вкратце, клетки, выделенные из опухолевых масс, промывали в PBS и ресуспендировали в бессывороточной среде. Аннексин V-FITC и йодистый пропидий (PI) добавляли к препаратам клеток (105 клеток) и инкубировали в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. Клетки Mock и S1 трипсинизировали, промывали в PBS и ресуспендировали в бессывороточной среде. Аннексин V-APC и DAPI добавляли к препаратам клеток (105 клеток) и инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Образцы анализировали с помощью цитофлуориметра Cyan ADP (Beckman-Coulter, Brea CA). Для каждого образца было получено 20 000 событий. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Summit 4.3.1 (DakoCytomation, Великобритания).

Анализы пролиферации клеток
(i) Для подсчета клеток, клетки Mock и S1 высевали в количестве 5 ×105 клеток в 10-см чашки для культуры ткани, инкубировали в стандартной среде с добавлением DCA (5 и 50 мМ) или без него и подсчитывали с помощью гемоцитометра после 48 ч обработки. (ii) Пролиферацию клеток также оценивали с помощью системы xCELLigence RTCA MP System (Roche, Германия), которая позволяет отслеживать клеточные события в режиме реального времени путем измерения электрического импеданса на пересекающихся золотых микроэлектродах, встроенных в дно планшетов с тканевыми культурами. Измерение импеданса дает количественную информацию о биологическом статусе клеток, включая их количество, жизнеспособность и морфологию.13 Импеданс клеточного сенсора выражается в произвольной единице, называемой клеточным индексом (КИ). Для определения клеточного индекса клетки, выделенные из каждой опухолевой массы, высевали в 100 мл стандартной среды в 96 микротитровальных планшетах (EPlate-Roche, Германия). Фоновый импеданс определялся с использованием 100 мл стандартной среды. Прикрепление, распространение и пролиферация клеток отслеживались каждые 30 минут с помощью системы xCELLigence. Пролиферацию клеток отслеживали в течение 72 ч. Результаты экспериментов проводились с использованием программного обеспечения RTCA Software 1.2, которое рассчитывало удвоение популяции путем подгонки кривой под экспоненциальное уравнение.

Количественный анализ РТ-ПЦР в реальном времени
Общую РНК из образцов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с протоколом производителя и подвергали обратной транскрипции с помощью Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Германия), следуя инструкциям производителя. Суммарную РНК из образцов определяли методом количественной РТПЦР в реальном времени с использованием PE ABI PRISM@ 7700 Sequence Detection System (Perkin Elmer Corp./Applied Biosystems, Foster City, CA) и метода Sybr Green в соответствии с инструкциями производителя. Последовательности прямого и обратного праймеров были следующими:

NF-68: для 5′ -CAAGGACGACGAGGTGTCCGAG-3′, rev 5′ — CCCGGCATGCTTCGA-3′;
NDM

29

: для 5′ -GGCAGGCAGGCGGGTTCGTTT-3′ , rev 5′ — CCACGCCTGGCTAAGTTTTTG-3′ ;
c-Kit: для 5′ -GCAAGTCAGTGCTGTCGGAA-3′ , rev 5′ — AAGATAGCTTGCTTTGGACACAGA-3′ . Для эндогенного контроля была исследована экспрессия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), поскольку было показано, что DCA не влияет на клеточную активность GAPDH.14 Последовательности праймеров для GAPDH человека были 5′ — GAAGGTGAAGGTGTCGGAGTC-3′ и 5′ — GAAGATGGTGATGGATGATTTC-3′ . Относительные уровни транскриптов определяли по относительной стандартной кривой, построенной из разведений исходной кДНК, и делили на целевое количество калибратора в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ митохондриального мембранного потенциала (∆Ψm)
Митохондриальный мембранный потенциал (∆Ψm) исследовали в живых клетках с помощью JC-1 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI). Для анализа потенциала, SKNBE2 wt, Mock, S1 и U2-OS wt высевали при плотности106 клеток/лунку с или без DCA (50 мМ). Через 72 часа после обработки клетки обрабатывали раствором JC-1 и инкубировали при 37oCв течение 15-30 минут. Клетки наблюдали с помощью микроскопа Axiophot Zeiss (Zeiss, Jena, Германия) [(Texas Red: возбуждение/эмиссия 590/610 нм) (FITC: возбуждение/эмиссия 485/ 535 нм)]. Количественную оценку флуоресценции определяли с помощью программного обеспечения ImageJ (Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/).

Статистический анализ
Статистическая значимость наблюдаемых различий между разными экспериментальными группами рассчитывалась с помощью двуххвостового t-теста. p-значения < 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

DCA действует на клетки нейробластомы человека
Сначала, чтобы проверить, влияет ли DCA на рост узлов НБ, как это наблюдается в GBM, мы проверили его способность ограничивать рост опухолевой массы НБ in vivo. Мы ввели 37 мышам NOD-SCID клетки SKNBE2, человеческую N-myc амплифицированную клеточную линию НБ, характеризующуюся высоким злокачественнымпотенциалом17, для создания опухолевых узелков, которые обрабатывались DCA. Когда опухолевые узелки достигли порогового диаметра 5 мм, пять мышей были принесены в жертву до начала лечения, пять мышей были обработаны 2,5 мг/кг/дозу DCA, 14 мышей были обработаны 25 мг/кг/дозу DCA, а остальные 13 животных были обработаны водой в качестве контроля. Мы выбрали внутрижелудочное введение DCA, поскольку в некоторых литературных данных сообщалось, что парентеральное введение неэффективно для снижения роста опухоли.16 Каждую неделю измерялась масса опухоли, что показало, что объем опухоли, полученной от мышей, получавших 2,5 мг/кг/дозу DCA, уменьшился на 30% по сравнению с контрольной группой. Это торможение роста стало статистически значимым (p ¼ 0,0008), когда мышей лечили 25 мг/кг/дозу DCA (55% снижения по сравнению с контрольной группой) (рис. 1a и 1b). Для оценки переносимости лечения DCA мы еженедельно оценивали вес мышей. Животные, получавшие DCA (2,5 и 25 мг/кг/доза), не имели статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой, хотя вес нелеченной контрольной группы был немного увеличен, скорее всего, из-за больших опухолевых масс (рис. 1в). Кроме того, потребление воды не оказывало влияния на леченных животных (данные не показаны).
В целом, приведенные выше данные свидетельствуют о мощном, дозозависимом эффекте DCA на рост опухоли НБ.

Рисунок 1. Лечение DCA опухолей НБ in vivo. (a) На графиках представлены объемы опухолей нелеченных мышей (H2O) в сравнении с мышами, получавшими DCA 2,5 мг/кг (левая панель) и объемы опухолей нелеченных мышей (H2O) в сравнении с мышами, получавшими DCA 25 мг/кг (правая панель). (b) Репрезентативные изображения опухолей, полученных от мышей, получавших и не получавших DCA, после 4 недель лечения. (c) На графике представлен вес мышей, получавших и не получавших DCA, в течение 4 недель лечения. [Цветной рисунок можно посмотреть в онлайновом выпуске, который доступен на сайте wileyonlinelibrary.com]

DCA снижает пролиферацию раковых клеток
Чтобы определить возможные механизмы действия DCA, мы проанализировали, может ли наблюдаемое снижение роста опухоли быть связано с потерей объема клеток. Для этого мы проанализировали морфологию и/или размер клеток в опухолевых узелках, обработанных или не обработанных ДКА. Были рассмотрены 12 срезов из контрольной группы и 12 срезов из групп, получавших DCA (2,5 и 25 мг/кг). Статистически значимых различий в группах, обработанных DCA, по сравнению с контрольной группой не наблюдалось (рис. 2а).
Поскольку опубликованные сообщения о проапоптотическом эффекте ДКА противоречивы, а также учитывая недавние наблюдения о возможной клеточной специфичности проапоптотического эффекта ДКА,15 мы исследовали это явление в наших экспериментальных условиях с помощью флоуцитометрического анализа клеток из опухолей, обработанных ДКА и/или не обработанных. Результаты показали, что процент аннексин V-позитивных клеток одинаков в рассматриваемых группах, что указывает на то, что лечение ДКА не провоцирует увеличение скорости апоптоза в основной массе клеток опухолевых узлов (рис. 2б).

Рисунок 2. Морфология и уровень апоптоза клеток, составляющих опухолевые узелки НБ. (a) Окрашивание гематоксилином/эозином обработанных и необработанных опухолей (левая панель) (увеличение 40). Усредненный объем клеток обработанных и необработанных образцов представлен на правой панели. (b) Диаграммы проточной цитометрии FITC-аннексина V/PI свежевыделенных клеток из обработанных и необработанных опухолей. В левом нижнем квадранте каждой панели показаны жизнеспособные клетки, которые исключают PI и являются отрицательными для связывания FITC-аннексина V. В правом верхнем квадранте (R3) находятся нежизнеспособные, некротические клетки, положительные для связывания FITC-аннексина V и для поглощения PI. В правом нижнем квадранте (R5) представлены апоптотические клетки, положительные по FITC-аннексину V и отрицательные по PI. Показан один репрезентативный эксперимент для каждого экспериментального условия. Усредненный процент жизнеспособных и апоптотических клеток в трех рассматриваемых группах мышей представлен в правой части панели. [Цветной рисунок можно посмотреть в онлайновом выпуске, который доступен на сайте wileyonlinelibrary.com]

Поскольку опухоли, образовавшиеся в нашей экспериментальной модели, были получены в результате инъекции однородной клеточной линии, и учитывая, что мы продемонстрировали, что лечение DCA не повлияло ни на уменьшение объема опухолевых клеток, ни на увеличение апоптоза, мы предположили возможное влияние DCA на пролиферативную способность клеток. Для проверки этой гипотезы мы проанализировали клетки из обработанных и необработанных узлов с помощью иммуногистохимии, используя специфическое моноклональное антитело анти-Ki67. Результаты не выявили существенных различий по доле пролиферирующих/циклирующих клеток между группами. Таким образом, этот результат указывает на то, что лечение DCA не снижает количество циклирующих клеток, что согласуется с отсутствием полной эрадикации опухоли после лечения DCA (рис. 3а). Далее мы использовали систему xCELLigence (Roche, Германия) для выявления возможного дозозависимого увеличения удвоения популяции, вызванного лечением DCA. Мы обнаружили, что опухолевые клетки, полученные от обработанных мышей (25 мг/кг), дублируются через 23,3 часа, клетки от животных, обработанных 2,5 мг/кг, дублируются через 17,1 часа, тогда как клетки, полученные от контрольных мышей, демонстрируют время удвоения популяции 14,9 часа (рис. 3б). Поскольку различия были статистически значимыми (DCA 25 мг/кг против контрольной группы; p ¼ 0,0476), эти результаты показывают, что лечение DCA вызывает дозозависимую задержку клеточного цикла. Далее мы исследовали, связана ли задержка клеточного цикла клеток из обработанных опухолей с увеличением дифференцировки/привязанности. Для этого мы измерили в режиме реального времени методом RT-PCR маркеры дифференцировки клеток NB [Neuroblastoma Differentiation Marker 29 (NDM29), Neurofilament 68 (NF68)] и c-Kit, белок, специфически экспрессируемый стволоподобными/инициирующими опухоль клетками, в опухолевых тканях, обработанных DCA и не обработанных. Как показано на рисунке 3c, общее увеличение синтеза маркеров дифференцировки клеток НБ наблюдалось в клетках из опухолей, обработанных ДКА. Действительно, DCA, использованный в более высокой концентрации, вызывал увеличение экспрессии NF68 (75%, p < 0,001), тогда как более низкая доза вызывала скромное увеличение (17%, не является статистически значимым). Аналогично, увеличение экспрессии NDM29 было статистически значимым в опухолях, обработанных DCA 25 мг/кг (51% увеличение, по сравнению с контрольной группой; p < 0,001), тогда как лишь незначительная разница наблюдалась между клетками из опухолей, обработанных 2,5 мг/кг, и клетками из необработанных опухолей. Интересно, что образцы, обработанные DCA, также характеризовались снижением экспрессии c-Kit (11% снижение при сравнении DCA 2,5 мг/кг с контрольными образцами и 19% снижение при сравнении DCA 25 мг/кг с контрольными образцами, p < 0,001), что указывает на то, что DCA индуцирует снижение стволоподобного/инициирующего опухоль потенциала в пролиферирующих опухолевых клетках. Опять же, эти результаты подтверждают замедление скорости пролиферации и, возможно, снижение злокачественного потенциала клеток, обработанных DCA.
Далее, чтобы оценить, может ли DCA влиять на фракцию недифференцированных пролиферирующих клеток, мы измерили экспрессию c-Kit в опухолевых тканях мышей, принесенных в жертву до лечения DCA, и в узлах обработанных опухолей. Мы обнаружили, что, хотя экспрессия c-Kit (и, предположительно, злокачественный потенциал) прогрессивно увеличивается в процессе роста узелков (см. H2Oпротив до лечения), доставка препарата DCA имеет тенденцию ограничивать это явление, подтверждая в тканях опухолевых образований то, что уже наблюдалось в клетках, и давая обоснование отсутствию эрадикации опухоли у мышей, леченных DCA (рис. 3д).

Рисунок 3. Анализ пролиферативного потенциала и стадии дифференцировки клеток, составляющих опухолевые узлы НБ. (a) Репрезентативные изображения опухолей, полученных от леченных и нелеченных мышей, иммуногистохимически окрашенных антителом анти-Ki67 (увеличение 40). Также показаны преиммунные контроли. (б) Определение влияния DCA на время удвоения клеточной пролиферации клеток, выделенных из обработанных и необработанных опухолей. (в) Количественная оценка экспрессии NF68, NDM29 и c-Kit в опухолевых узлах НБ с помощью RT-PCR в реальном времени. (d) Количественная оценка экспрессии c-Kit в режиме реального времени RT-PCR в опухолевых узелках НБ, полученных от мышей, принесенных в жертву до лечения ДКА (BT), нелеченных мышей (H2O) и мышей, леченных ДКА (2,5 и 25 мг/кг). [Цветной рисунок можно посмотреть в онлайновом выпуске, который доступен на сайте wileyonlinelibrary.com]

DCA действует специфически на злокачественные клетки НБ и неэффективен на дифференцированные, слабо злокачественные клетки НБ
Все больше экспериментальных данных свидетельствует о том, что прогноз НБ и его ответ на противораковое лечение зависят от стадии дифференцировки узлов НБ. Действительно, особенностью НБ является замечательная гетерогенность клеток, которые могут происходить из различных линий нервного гребня на разных стадиях.12,17 В этом контексте разумно предположить возможную различную восприимчивость к ДКА различных типов клеток. Для проверки этой гипотезы мы использовали модель дифференцировки клеток НБ in vitro, основанную на экспрессии транскрибируемой pol III нкРНК. Действительно, недавно мы выделили новую РНК-полимеразу (pol) III-транскрибируемую некодирующую (nc) РНК (а именно NDM29), экспрессия которой вызывает нейроноподобную дифференцировку клеток НБ (NB), сильно снижая их злокачественный потенциал и экспрессию маркеров опухолевых инициаторов/стволоподобных клеток. Встраивая дополнительные копии транскрипционной единицы NDM29 в опухолевые клетки SKNBE2, мы создали линию клеток SKNBE2, сверхэкспрессирующую NDM29 (далее S1), и соответствующую Mock negative, экспрессирующую NDM29 на эндогенном уровне. Клетки S1 демонстрируют частично дифференцированный/нейроноподобный фенотип, слабо злокачественны и характеризуются выраженной задержкой клеточного цикла.18,19
Чтобы исключить, что обработка DCA может индуцировать апоптоз in vitro, как это продемонстрировано в экспериментах in vivo, мы измерили процент апоптотических клеток в клеточных линиях Mock и S1, обработанных и/или не обработанных препаратом в течение 48 ч. Никаких различий между клеточными линиями (необработанными или обработанными разными дозами DCA) не наблюдалось, что подтверждает, что DCA не провоцирует апоптоз в клетках NB (рис. 4a).
Чтобы определить влияние на пролиферацию клеток Mock и S1, мы обработали клетки 5 мМ и 50 мМ DCA и измерили время удвоения клеточной популяции (PD) в четырех независимых экспериментах. Концентрация 50 мМ была выбрана в качестве максимальной дозы, поскольку в различных предыдущих исследованиях сообщалось, что DCA, по-видимому, относительно неактивен в различных клеточных линиях при использовании более низких доз.16,20 Как показано на рисунке 4b, время PD значительно увеличивается при обработке DCA в дозозависимой манере в клетках Mock. Действительно, в отсутствие лечения, Mock дуплицировались через 30 ч, тогда как доставка 5 мМ DCA индуцировала задержку клеточного цикла на 10 ч, а более высокая доза 50 мМ DCA привела к увеличению на 14 ч (p < 0,001). Эти результаты показывают, что DCA индуцирует задержку клеточного цикла в недифференцированных/полностью пролиферирующих клетках NB. Напротив, ПД для клеток S1 оставался приблизительно неизменным, смещаясь от 47 ч для необработанных клеток к 50 ч для клеток, обработанных 5 мМ ДКА, и к 49 ч для клеток, обработанных 50 мМ ДКА (рис. 4б). Этот результат показывает, что ответ на лечение DCA напрямую зависит от стадии дифференцировки/пролиферации клеток НБ, поскольку дифференцированные клетки с очень низким злокачественным потенциалом слабо реагируют на лечение, в то время как их полностью пролиферирующие/очень злокачественные аналоги сильно страдают от лечения DCA.
Чтобы лучше понять этот феномен и учитывая, что эффекты DCA связаны с ингибированием PDK, активацией окислительного фосфорилирования митохондрий и специфическим снижением гиперполяризации митохондрий,6 мы протестировали клетки Mock и S1 на предмет возможных изменений в гиперполяризации митохондрий как основы дифференциальной восприимчивости этих клеток к DCA. Для этого мы обработали клетки JC-1 (5,5′,6,6′-тетрахлор-1,1′,3,3′-тетраэтилбензимидазолокарбоцианин йодид), флуоресцентным красителем, поглощение которого пропорционально потенциалу митохондрий. JC-1 может избирательно проникать в митохондрии и обратимо меняет цвет с зеленого на красный при увеличении митохондриального потенциала, так что уменьшение соотношения красной и зеленой флуоресценции указывает на реактивацию митохондрий. Мы сравнили поляризацию митохондриальных мембран клеток остеосаркомы U2-OS (гиперполяризованные контрольные клетки21), клеток SKNBE2 wt, Mock и S1. Мы обнаружили, что клетки Mock демонстрируют сходную степень поляризации по сравнению с клетками SKNBE2 wt, тогда как клетки S1 характеризуются сниженной степенью поляризации митохондрий (p ¼ 0,0184) (рис. 4c). Результаты, полученные в трех повторах, показали, что в клетках Mock происходит реактивация митохондрий под действием ДКА (снижение отношения красной/зеленой флуоресценции на 25%; p ¼ 0,0077), тогда как в клетках S1 митохондриальная активность не изменяется в присутствии ДКА (рис. 4c). Таким образом, эти результаты показывают, что восприимчивость злокачественных/полностью циклических клеток связана с митохондриальным статусом, чувствительным к действию DCA, тогда как коммитированные/дифференцированные, плохо циклические клетки рефрактерны к действию этого препарата.
Далее, чтобы выявить возможное влияние ДКА на потенциал дифференцировки, мы измерили методом RT-PCR в реальном времени уровень экспрессии NDM29, NF68 и c-Kit в обработанных ДКА и необработанных клетках Mock. Мы провели этот анализ именно на клетках Mock, поскольку клетки S1 были рефрактерны к снижению пролиферации, вызванному DCA. Как показано на рисунке 4d, обработка DCA привела к увеличению экспрессии маркера дифференцировки NF68 (клетки Mock, обработанные 5 мМ или 50 мМ DCA по сравнению с необработанными клетками, p < 0,0001). Аналогично, экспрессия NDM29 была значительно увеличена в обработанных клетках-макетах по сравнению с контролем (p < 0,001). Напротив, экспрессия c-Kit была снижена дозозависимым образом в обработанных клетках (p < 0,0001). В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что в клетках НБ противоопухолевый эффект DCA обусловлен в основном антипролиферативным/дифференцирующим действием и не приводит к увеличению уровня апоптоза.

Рисунок 4. Лечение ДКА клеток НБ in vitro. (a) Диаграммы флоуцитометрии APC-Annexin V/DAPI обработанных ДКА и необработанных клеток Mock и S1. Показан один репрезентативный эксперимент для каждого экспериментального условия. Усредненный процент жизнеспособных и апоптотических клеток в двух рассматриваемых клеточных линиях представлен в правой части панели. (b) Определение влияния DCA на время удвоения клеточной пролиферации клеток Mock и S1. (в) Измерение флуоресценции JC-1 в клетках U2-OS wt, SKNBE wt, Mock и S1, обработанных или не обработанных DCA. U2-OS wt используются в качестве гиперполяризованных контрольных клеток. (d) Определение количества NF68, NDM29 и c-KitmRNA в режиме реального времени в клетках Mock, обработанных или не обработанных DCA.

Обсуждение

DCA — это небольшая молекула, которая уже более 30 лет используется для лечения врожденного и приобретенного молочнокислого ацидоза.22 Действительно, хорошо описано, что лечение DCA снижает уровень лактата в циркуляции путем смещения клеточного метаболизма с гликолиза на окисление глюкозы, без какого-либо пагубного влияния на нормальные клетки.6 Благодаря своей способности благоприятствовать метаболизму глюкозы путем аэробного гликолиза, DCA успешно используется в клинических испытаниях при заболеваниях сердца, включая застойную сердечную недостаточность и ишемическую болезнь сердца, поскольку постишемическая дисфункция гипертрофированного сердца связана с низкой скоростью окисления глюкозы и высокой скоростью гликолиза.23
Очень привлекательным свойством DCA является его переносимость и безопасность. Действительно, более чем в 40 клинических исследованиях ДКА сообщается, что наиболее значительным побочным эффектом длительного приема ДКА является обратимая периферическая нейропатия.24,25
В последние годы на моделях in vitro и in vivo получены убедительные доказательства того, что ДКА может быть полезен для лечения некоторых видов рака у человека.6 Действительно, ДКА способен обращать эффект Варбурга, ингибируя PDK, восстанавливая мембранный потенциал митохондрий и увеличивая продукцию ROS. По этой причине DCA прославился как волшебная пуля против рака,1 даже если в настоящее время он еще не одобрен для лечения рака.26 Несмотря на то, что нейробластома до сих пор считалась типом рака, для которого лечение ДКА, скорее всего, неэффективно, из-за предполагаемого отсутствия гиперполяризации митохондриальной мембраны в клетках, составляющих узелки НБ,27 было описано, что пролиферирующие клетки НБ поддерживают гликолитический фенотип,11 и что даже в аэробных условиях клетки НБ превращают значительное количество глюкозы в лактат вместо того, чтобы использовать окисление глюкозы.28 Исходя из этого, целью данного исследования было определить, может ли DCA оказывать благоприятное воздействие на этот тип опухоли. Наши результаты выявили непредсказуемое положительное влияние ДКА на рост опухоли НБ как в моделях in vivo, так и in vitro. Действительно, DCA был эффективен в установленных опухолях НБ, не вызывая никаких явных побочных эффектов у леченных животных.
Более подробный анализ, проведенный на клетках, полученных из обработанных опухолей, показал, что DCA приводит к задержке пролиферации без признаков усиления апоптоза или гибели клеток. Это согласуется с наблюдаемым уменьшением объема опухолевых масс, не сопровождающимся полным уничтожением рака. Механизмы действия DCA до сих пор остаются спорными. В этом контексте наши результаты контрастируют с предыдущими исследованиями, в которых клетки рака эндометрия, простаты, толстой кишки и легких обрабатывались DCA.6,9,20 В этих случаях отмечалось усиление апоптоза без влияния на распределение клеточного

цикла9

,21 или усиление апоптоза, сопровождаемое снижением пролиферации8. С другой стороны, по другим данным, DCA подавляет пролиферацию раковых клеток, но не увеличивает апоптоз или гибель клеток.7 Этот последний механизм подтверждается протеомным анализом, в котором лечение DCA вызывает изменения маркеров клеточной пролиферации, а не количество белков, связанных с апоптозом.16 Такое двойственное поведение DCA может зависеть от типа клеток, возможно, из-за различий в экспрессии изоферментов PDK в исследуемых раковых клетках. В настоящее время ведутся исследования по соотнесению экспрессии PDK с чувствительностью к DCA.
Интересно, что мы показали, что увеличение экспрессии некоторых маркеров дифференцировки, таких как NF68 и NDM29, сопровождающееся снижением экспрессии c-kit, маркера стволовых/опухолеобразующих клеток, коррелирует с наблюдаемым снижением пролиферации раковых клеток. Таким образом, DCA-зависимая индукция задержки клеточного цикла, сопровождающаяся усилением дифференцировки клеток, представляет собой новый, еще не описанный механизм действия этого препарата, который связывает эффекты DCA со стадией дифференцировки раковых клеток.
Документально подтверждено, что опухоли НБ человека характеризуются различными типами клеток, которые имеют различные морфологические, биохимические и туморигенные свойства и различные стадии дифференцировки.12 Чтобы углубить возможную корреляцию восприимчивости к DCA с уровнем дифференцировки клеток, мы использовали модель дифференцировки клеток НБ in vitro, основанную на сверхэкспрессии pol III-транскрибируемой нцРНК (NDM29). Мы создали линию клеток SKNBE2, сверхэкспрессирующую NDM29 (здесь и далее обозначается как S1), и соответствующий отрицательный контроль Mock.19 Эти линии клеток обрабатывали 5 мМ и 50 мМ DCA. Концентрация 50 мМ была выбрана в качестве максимальной дозы, поскольку в различных предыдущих исследованиях сообщалось, что DCA относительно неактивен в различных клеточных линиях при использовании более низких доз,16,20 хотя эта концентрация не может быть достигнута in vivo. Тем не менее, в наших экспериментальных условиях действие DCA проявляется при более низкой дозе (5 мМ), что является подходящей концентрацией для использования in vivo.
Как и ожидалось, мы обнаружили, что и в клетках Mock и S1 обработка DCA не вызвала признаков апоптоза, что подтверждает наши результаты in vivo. Интересно, что эффект DCA ограничивается недифференцированными, очень злокачественными, полностью циклическими клетками (клетки Mock), тогда как он не влияет на скорость пролиферации более дифференцированных, слабо злокачественных клеток (клетки S1). Этот эффект может быть связан с различной степенью поляризации митохондрий в этих типах клеток. Действительно, мы продемонстрировали, что клетки Mock имеют более высокую степень митохондриальной поляризации, чем их более дифференцированный аналог S1.
Таким образом, мы продемонстрировали, что различные клетки, составляющие опухолевые массы НБ, по-разному восприимчивы к DCA, который избирательно действует на очень злокачественные и полностью пролиферирующие клетки, тогда как на слабо злокачественные, более дифференцированные клетки он оказывает очень слабое воздействие. Подобное дифференцированное действие DCA было также отмечено в исследовании, посвященном глиобластоме (GBM)2, где авторы показали, что раковые стволовые клетки, по сравнению с более дифференцированными аналогами, составляющими GBM, демонстрируют те же метаболические и митохондриальные перестройки, но в более высокой степени, поскольку они имеют большинство гиперполяризованных митохондрий.2
В заключение, описанные здесь эксперименты поддерживают мнение о DCA как об очень избирательном препарате, который может помочь в противораковом лечении NB без значительных побочных эффектов на здоровые клетки. Таким образом, это предварительное исследование расширяет возможности использования DCA для лечения рака НБ, подтверждая необходимость детального изучения его противораковых свойств против этого типа опухолей.

Благодарности

R.C. была поддержана Министерством университетов и исследований ИталииMIUR (2007 Международная программа FIRB). А.П. был поддержан Министерством университетов и исследований Италии (2007 PRIN Program prot. 2007945BZN), Итальянской ассоциацией по изучению рака (2009 AIRC Program no. IG9378) и Итальянской ассоциацией по борьбе с нейробластомой (Генуя, Италия).

Амигдалин блокирует in vitro адгезию и инвазию клеток

почечно-клеточной карциномы с помощью интегрин-зависимого механизма

• Автор: 
  • Ева Юнгель
   
  • Масуд Афшар
   
  • Ясмина Макаревич
  
  

Аннотация

Информация о природном соединении амигдалине, которое используется в качестве противоопухолевого средства, скудна, и поэтому его эффективность остается спорной. В этом исследовании, чтобы определить, оказывает ли амигдалин противоопухолевое действие на клетки почечно-клеточной карциномы (ПКР), было изучено его влияние на метастатическую активность ПКР. Клеточные линии ПКР, Caki-1, KTC-26 и A498, были подвергнуты воздействию амигдалина из абрикосовых косточек, и была исследована адгезия к эндотелию сосудов человека, иммобилизованному коллагену или фибронектину. Было также определено влияние амигдалина на хемотаксическую и инвазивную активность, а также влияние амигдалина на поверхностную и общую клеточную экспрессию α и β интегринов, которые участвуют в метастазировании. Мы отметили, что амигдалин вызвал значительное снижение хемотаксической активности, инвазии и адгезии к эндотелию, коллагену и фибронектину. Используя анализ FACScan, мы отметили, что амигдалин также индуцировал снижение, особенно в интегринах α5 и α6, во всех трех клеточных линиях. Функциональное блокирование α5 привело к значительному снижению адгезии KTC-26 и A498 к коллагену, а также к снижению хемотаксического поведения во всех трех клеточных линиях. Блокирование интегрина α6 значительно снизило хемотаксическую активность во всех трех клеточных линиях. Таким образом, мы предполагаем, что воздействие амигдалина на клетки почечно-клеточного рака ингибирует метастатическое распространение и связано с подавлением интегринов α5 и α6. Поэтому мы предполагаем, что амигдалин оказывает противоопухолевую активность in vitro, и это может быть связано с регуляцией интегрина.

Введение

Почечно-клеточная карцинома (ПКР) является наиболее распространенной опухолью почки. Примерно у трети пациентов есть метастазы на момент постановки диагноза, и до 30% пациентов развивают метастазы во время терапии. После метастазирования прогноз для пациентов неутешительный. Лучшее понимание молекулярных механизмов действия, лежащих в основе развития и прогрессирования ПКР, способствовало разработке таргетной терапии, тем самым улучшая прогноз для пациентов на поздних стадиях этого заболевания. Однако, несмотря на эти терапевтические достижения, прогноз для пациентов с ПКР остается неблагоприятным, 5-летняя выживаемость составляет от 5 до 12%. Неудовлетворенность традиционной терапией и желание уменьшить побочные эффекты привели многих пациентов к комплементарной и альтернативной медицине (КАМ). До 80% онкологических больных в Соединенных Штатах и ​​более 50% онкологических больных в Европе используют КАМ наряду с традиционной терапией или вместо нее.

Информация об эффективности природных соединений скудна, и некоторые из этих соединений, такие как цианогенный дигликозид амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид), остаются спорными. Амигдалин получают из плодовых косточек семейства розоцветных, которое включает Prunus persica (персик), Prunus armeniaca (абрикос) и Prunus amygdalus var. amara (горький миндаль). Амигдалин, в основном в Соединенных Штатах, назначают онкологическим больным с 1920-х годов. В 1950-х годах была синтезирована и запатентована внутривенная, химически иная форма амигдалина как лаэтрил. Хотя лаэтрил отличается от амигдалина, эти термины часто используются взаимозаменяемо, что затрудняет интерпретацию данных. К 1978 году около 70 000 онкологических больных в США прошли лечение амигдалином. Однако исследования амигдалина, основанные на фактических данных, остаются ограниченными. Клиническое исследование, спонсируемое Национальным институтом рака более 30 лет назад, не выявило никаких признаков регрессии опухоли ( 1 ), тогда как ретроспективный анализ 67 пациентов с опухолями, получавших амигдалин, сообщил о двух полных и четырех частичных ответах ( 2 ). Амбивалентность также отражена в отчетах о случаях: амигдалин был неэффективен в пяти случаях и эффективен в четырех. Насколько нам известно, рандомизированные клинические испытания и последующие исследования не проводились. Сторонники считают амигдалин эффективным натуральным вариантом лечения рака, тогда как противники предупреждают о токсичности из-за метаболизма цианистого водорода.

Метастазы являются основной причиной смертности, связанной с ПКР. Трансэндотелиальная миграция и подвижное распространение являются критическими этапами в распространении и прогрессировании опухоли ( 3 ), а распространение раковых клеток в отдаленные органы представляет собой основную клиническую проблему при лечении рака. В настоящем исследовании изучалось противоопухолевое действие амигдалина на адгезию и миграционные свойства клеток ПКР. Поскольку интегрины активируют ряд внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в пролиферации, дифференцировке и подвижности клеток, был определен паттерн экспрессии рецепторов адгезии интегрина α и β между обработанными амигдалином клетками и необработанными контрольными клетками. Интегрины важны как для здоровья, так и для болезни ( 4 ) и играют ключевую роль в канцерогенезе и прогрессировании рака ( 4 ).

Настоящее исследование основано на предыдущем исследовании, посвященном влиянию амигдалина на метастатические свойства трех линий клеток рака мочевого пузыря ( 5 ). Поскольку были обнаружены некоторые различия в действии амигдалина на метастатические свойства различных линий клеток рака мочевого пузыря, возник вопрос о том, ограничиваются ли различные эффекты амигдалина определенными опухолевыми образованиями или возникают в других. Таким образом, были выбраны три линии клеток RCC, поскольку опухоли RCC являются наиболее агрессивной урологической опухолью.

Материалы и методы

Культура клеток

Клетки карциномы почки, Caki-1, KTC-26 и A498, были приобретены у LGC Promochem GmbH (Wesel, Германия). Клетки выращивали и субкультивировали в среде RPMI-1640 (Seromed, Берлин, Германия) с добавлением 10% сыворотки плода теленка (FCS), 20 мМ буфера HEPES, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 . Субкультуры из пассажей 5–24 были отобраны для экспериментального использования. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были выделены из пупочных вен человека и собраны путем ферментативной обработки диспазой (1 МЕ/мл; Gibco-Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). HUVEC выращивали в среде 199 (M199; Biozol, Мюнхен, Германия), дополненной 10% FCS, 10% объединенной человеческой сыворотки, 20 мкг /мл фактора роста эндотелиальных клеток (Boehringer, Мангейм, Германия), 0,1% гепарина, 100 нг/мл гентамицина и 20 мМ буфера HEPES (pH 7,4). Субкультуры из пассажей 1–5 были отобраны для экспериментального использования. Институциональный этический комитет больницы университета Гете, Франкфурт, Германия, отказался от необходимости получения согласия, поскольку HUVEC использовались анонимно для анализов in vitro и не имели связи с данными пациентов.

Лечение амигдалиномы

Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток, а затем добавлен к опухолевым клеткам в концентрации 10 мг/мл [ранее оцененной как оптимальная концентрация ( 6 )] либо на 24 часа, либо на 2 недели (лечение применялось три раза в неделю) для оценки острого и хронического лечения. Контрольные группы оставались необработанными. Во всех экспериментах сравнивались обработанные и необработанные культуры опухолевых клеток. Для изучения токсического действия амигдалина жизнеспособность клеток определялась трипановым синим (Gibco-Invitrogen).

Адгезия опухолевых клеток

Для анализа адгезии опухолевых клеток HUVEC переносили в 6-луночные мультипланшеты (Sarstedt, Nümbrecht, Германия) в полной среде HUVEC. Когда они достигали слияния, клетки Caki-1, KTC-26 и A498 отсоединяли от культуральных колб обработкой аккутазой (PAA Laboratories, Cölbe, Германия), а затем добавляли 0,5×10 6 клеток и оставляли на монослое HUVEC на 1, 2 или 4 часа. Затем неприкрепившиеся опухолевые клетки смывали с помощью подогретого (37°C) PBS (Ca 2+ и Mg 2+ ). Оставшиеся клетки фиксировали 1% глутаральдегидом. Подсчет адгезивных опухолевых клеток производился в пяти различных полях определенного размера (5×0,25 мм2 ) с использованием фазово-контрастного микроскопа (ID03, 471202-9903; Carl Zeiss Microscopy GmbH, Геттинген, Германия), после чего рассчитывалась средняя скорость клеточной адгезии.

Присоединение к иммобилизованным белкам внеклеточного матрикса

24-луночные планшеты покрывали коллагеном G (извлеченным из телячьей кожи, состоящим из 90% коллагена типа I и 10% коллагена типа III, и разведенным до 400 мкг /мл в PBS; Biochrom, Берлин, Германия) или фибронектином (извлеченным из мышей и разведенным до 100 мкг /мл в PBS; Becton-Dickinson, Гейдельберг, Германия) на ночь. Пластиковые чашки служили фоновым контролем. Планшеты промывали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS для блокирования неспецифической клеточной адгезии. Затем в каждую лунку добавляли опухолевые клетки (0,1×10 6 ) и оставляли на 30 минут для инкубации. Затем не прилипшие опухолевые клетки смывали, оставшиеся прилипшие клетки фиксировали 2% глутаральдегидом и подсчитывали микроскопически. Средний показатель клеточной адгезии, определяемый соотношением адгезивных клеток, хорошо покрытых слоем, и адгезивных клеток, фон, был рассчитан по пяти различным полям наблюдения.

Хемотаксическая активность

Сывороточно-индуцированное хемотаксическое движение исследовали с использованием 6-луночных камер Transwell (Greiner, Frickenhausen, Германия) с порами 8 мкм . Клетки (0,5×10 6 клеток Caki-1, KTC-26 или A498/мл) помещали в верхнюю камеру в бессывороточной среде, либо без амигдалина (контроль), либо содержащей амигдалин. Нижняя камера содержала 10% сыворотки. После ночной инкубации верхнюю поверхность мембраны transwell осторожно протирали ватным тампоном, чтобы удалить клетки, которые не мигрировали. Клетки, перемещающиеся на нижнюю поверхность мембраны, окрашивали гематоксилином и подсчитывали микроскопически. Средняя скорость миграции рассчитывалась из пяти различных полей наблюдения.

Вторжение

Вторжение исследовали с помощью хемотаксического движения, вызванного сывороткой, через мембрану (Greiner) с порами 8 мкм , предварительно покрытую коллагеном G (извлеченным из телячьей кожи, состоящим из 90% коллагена типа I и 10% коллагена типа III; разбавленным до 400 мкг /мл в PBS; Biochrom) и HUVEC, выращенными до слияния. Клетки Caki-1, KTC-26 или A498 (0,5×10 6 /мл) помещали в верхнюю камеру в бессывороточной среде, либо без амигдалина (контроль), либо содержащей амигдалин. Нижняя камера содержала 10% сыворотки. После инкубации в течение ночи верхнюю поверхность мембраны transwell осторожно протирали ватным тампоном, чтобы удалить клетки, которые не мигрировали. Клетки, которые переместились на нижнюю поверхность мембраны, окрашивали гематоксилином и подсчитывали микроскопически. Средний показатель миграции рассчитывался в пяти различных полях наблюдения.

Экспрессия поверхности интегрина

Опухолевые клетки промывали в блокирующем растворе (PBS, 0,5% BSA), а затем инкубировали в течение 60 мин при 4°C с конъюгированными с фикоэритрином (PE) моноклональными антителами, направленными против следующих подтипов интегринов: анти-α1 (мышиный IgG1; клон SR84; #559596), анти-α2 (мышиный IgG2a; клон 12F1-H6; #555669), анти-α3 (мышиный IgG1; клон C3II.1; #556025), анти-α4 (мышиный IgG1; клон 9F10; #555503), анти-α5 (мышиный IgG1; клон IIA1; #555617), анти-α6 (мышиный IgG2a; клон GoH3; #555736), анти-β1 (мышиный IgG1; клон MAR4; #555443), анти-β3 (мышиный IgG1; клон VI-PL2; #555754) или анти-β4 (крысиный IgG2b; клон 439-9B; #555720) (все от BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия). Экспрессия интегрина опухолевых клеток затем измерялась с помощью FACScan (BD Biosciences, Гейдельберг; анализ гистограммы канала FL-2H (log); 1×10 4 клеток/сканирование) и выражалась как средняя относительная интенсивность флуоресценции (RFI). В качестве изотипических контролей использовали мышиный IgG1-PE (MOPC-21; #555749), IgG2a-PE (G155-178; #555574) и крысиный IgG2b-PE (R35-38; #555848; все от BD Biosciences).

вестерн-блоттинг

Для исследования содержания интегрина лизаты опухолевых клеток наносили на 7–12% полиакриламидный гель (в зависимости от размера белка) и подвергали электрофорезу в течение 90 мин при 100 В. Затем белок переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования обезжиренным сухим молоком в течение 1 часа мембраны инкубировали в течение ночи со следующими антителами: интегрин α1 (кроличий, поликлональный, 1:1000; #AB1934; Chemicon/Millipore GmbH, Швальбах, Германия), интегрин α2 (мышиный IgG1, 1:250, клон 2; #611017; BD Biosciences), интегрин α3 (кроличий, поликлональный, 1:1000; #AB1920; Chemicon/Millipore GmbH), интегрин α4 (мышиный, 1:200, клон: C-20; #sc-6589; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта-Крус, Калифорния, США)], интегрин α5 (мышиный IgG2a, 1:5000, клон 1; #610634; BD Biosciences), интегрин α6 (кролик, 1:200, клон H-87; #sc-10730; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) и интегрин β1 (мышиный IgG1, 1:2500, клон 18; #610468), интегрин β3 (мышиный IgG1, 1:2500, клон 1; #611141) и интегрин β4 (мышиный IgG1, 1:250, клон 7; #611233) (все от BD Biosciences). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG и конъюгированные с HRP козьи антикроличьи IgG (оба 1:5000; Upstate Biotechnology, Лейк-Плэсид, штат Нью-Йорк, США) служили в качестве вторичных антител. Кроме того, сигнализация, связанная с интегрином, была исследована с помощью антител к антиинтегрин-связанной киназе (ILK) (клон 3, разведение 1:1000; № 611803), антифокальной адгезионной киназе (FAK) (клон 77, разведение 1:1000; № 610088) и анти-p-специфической FAK (pY397; клон 18, разведение 1:1000; № 611807) (все от BD Biosciences). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG (разведение 1:5000; Upstate Biotechnology) служили в качестве вторичных антител. Мембраны были кратковременно инкубированы с реагентом для обнаружения ECL (ECL™; Amersham, GE Healthcare, Мюнхен, Германия) для визуализации белков, а затем проанализированы с помощью системы Fusion FX7 (Peqlab, Эрланген, Германия). β-актин (1:1000; Sigma-Aldrich) служил в качестве внутреннего контроля.

Для анализа плотности пикселей белковых полос использовалось программное обеспечение Gimp 2.8. Было рассчитано соотношение интенсивности белка/интенсивности β-актина, выраженное в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%.

Блокировка экспериментов

Чтобы определить, влияют ли интегрины α5 и α6 на метастатическое распространение независимо от амигдалина в клеточных линиях Caki-1, KTC-26 и A498, клетки инкубировали в течение 60 мин с 10 мкг /мл мышиных моноклональных антител против интегрина α5 (клон P1D6) или крысиных моноклональных антител против интегрина α6 (клон NKI-GoH3) (оба от Millipore). Контрольные образцы инкубировали только с клеточной культуральной средой. Затем адгезию опухолевых клеток к иммобилизованному коллагену, а также хемотаксис анализировали, как описано выше.

Статистический анализ

В настоящем исследовании все эксперименты проводились 3–6 раз. Статистическая значимость определялась с помощью U-критерия Вилкоксона, Манна-Уитни. Значение p < 0,05 считалось указывающим на статистически значимое различие.

Результаты

Амигдалин блокирует взаимодействие между эндотелием опухолевых клеток и матриксом опухолевых клеток

После 24 часов обработки амигдалином адгезия опухолевых клеток A498 к HUVEC значительно снизилась, но адгезия клеток Caki-1 и KTC-26 не снизилась (по сравнению с необработанными контролями, принятыми за 100%) ( рис. 1 ). Увеличение времени воздействия амигдалина до 2 недель значительно снизило адгезию к HUVEC во всех трех линиях опухолевых клеток ( рис. 1 ).

Рисунок 1 Адгезия Caki-1, KTC-26 и A498 к эндотелию (эндотелиальные клетки пуповины человека; HUVEC). Опухолевые клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные образцы оставались необработанными. Опухолевые клетки (0,5×106 клеток/лунку) добавляли и оставляли на монослое HUVEC в течение 1, 2 или 4 ч. Оценивалось среднее количество адгезированных опухолевых клеток из пяти полей, а также рассчитывался процент обработанных клеток почечно-клеточной карциномы (RCC) по сравнению с необработанными контрольными клетками (принято за 100%, пунктирная линия). *Значительное различие с контрольными образцами. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). n=5 экспериментов, p≤0,05.

Амигдалин вызвал значительное снижение связывающей способности всех трех линий клеток RCC с иммобилизованным коллагеном и фибронектином по сравнению с контрольной группой ( рис. 2 ). Прикрепление всех трех линий клеток к матричным белкам было снижено через 24 часа, а также через 2 недели. В клеточной линии KTC-26 кратковременное применение амигдалина (24 часа) вызвало большее снижение адгезии, чем долгосрочное применение амигдалина (2 недели).

Рисунок 2 (A) Адгезия Caki-1, KTC-26 и A498 к иммобилизованному коллагену (слева) и (B) фибронектину (справа). Опухолевые клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалином в течение 24 ч или 2 недель. Необработанные клетки почечно-клеточной карциномы (ПКР) служили в качестве контроля. Клетки (0,1×106 клеток/лунка) добавляли к иммобилизованному коллагену или фибронектину. Среднее количество адгезированных опухолевых клеток из пяти полей рассчитывали через 30 мин. *Значительное различие с контролем. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). n=6 экспериментов, p≤0,05.

Амигдалин изменяет подвижность опухолевых клеток почечно-клеточного рака

Хемотаксическая активность клеток Caki-1, KTC-26 и A498 значительно снизилась после 24 ч и 2 недель применения амигдалина по сравнению с необработанными контрольными клетками ( рис. 3A ). Инвазия опухолевых клеток через покрытые коллагеном мембраны transwell также значительно снизилась в клетках Caki-1 и A498 после 24 ч и 2 недель применения амигдалина ( рис. 3B ). Однако 2 недели применения амигдалина не снизили инвазивную способность клеток KTC-26.

Рисунок 3 Влияние амигдалина на клетки почечно-клеточной карциномы (ПКР): хемотаксис (A) и инвазия (B). Клетки ПКР, обработанные амигдалином в течение 24 ч или 2 недель, высевали в верхнюю камеру с хемоаттрактантом в лунке ниже. Подсчитывали клетки, мигрирующие через мембрану через 20 ч. Контрольные клетки не получали амигдалин и были установлены на 100% (пунктирная линия). *Значительное различие с контрольными клетками. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). n=5 экспериментов, p≤0,05.

Амигдалин модулирует поверхностную экспрессию интегрина α и β

Клетки Caki-1, KTC-26 и A498 характеризовались различными базальными поверхностными паттернами экспрессии интегринов α и β ( рис. 4A ). Caki-1 заметно экспрессировал α3 и β1, умеренно экспрессировал α5 и β3, тогда как α1, α2, α4, α6 и β4 были лишь незначительно обнаружены. KTC-26 сильно экспрессировал α3 и β1. Члены подтипа α1, α2, α5, α6, β3 и β4 были умеренно экспрессированы, а α4 не был обнаружен. Профиль экспрессии интегринов A498 был похож на профиль KTC-26, за исключением α4, который был обнаружен для A498. Мы также отметили, что β4 присутствовал в клетках KTC-26, но не в клетках A498.

Рисунок 4 (A) Базальная поверхностная экспрессия подтипов интегрина почечно-клеточной карциномы (RCC) и (B) разница (%) с необработанным контролем через 24 часа или 2 недели воздействия амигдалина. RFI, относительная интенсивность флуоресценции. nd, не обнаруживается. *Значительная разница с контролем. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD), p≤0,05.

Применение амигдалина в течение двадцати четырех часов и в течение двух недель изменило профиль поверхности интегрина, который является специфическим для типа клеток ( рис. 4B ). Мы отметили, что α5 и α6 были значительно подавлены во всех клеточных линиях после двух недель воздействия амигдалина. β1, который был сильно выражен во всех трех клеточных линиях, также был значительно снижен после двух недель применения амигдалина. Высокая базальная экспрессия рецептора α3 была снижена в Caki-1 и KTC-26, но не в A498, под действием амигдалина. Различия также были отмечены в отношении α2 и β3, оба из которых были снижены в клетках Caki-1, но повышены в клетках KTC-26 и A498 через две недели. Сниженные уровни экспрессии β4 были обнаружены в клетках Caki-1 и KTC-26 после воздействия амигдалина.

Амигдалин влияет на общее содержание клеточных интегринов

Оценка содержания белка интегрина после 24 ч воздействия амигдалина выявила значительную положительную регуляцию α2 и отрицательную регуляцию α3 и p-FAK ( рис. 5 ). β1 был значительно повышен в Caki-1 и KTC-26, тогда как α6 был значительно снижен в Caki-1 и A498, а общее содержание α5 было снижено в клетках A498 через 24 ч. В клетках Caki-1 α4 и β4 увеличились, а β3 уменьшился.

Рисунок 5 (A) Вестерн-блот-анализ общего содержания интегрина в клетках Caki-1, KTC-26 и A498, подвергнутых воздействию амигдалина в течение 24 ч или 2 недель, и необработанных контролях. В качестве внутреннего контроля использовался β-актин. (B) Анализ плотности пикселей белковых полос вестерн-блоттинга. Соотношение интенсивности белка/интенсивности β-актина было рассчитано и выражено в процентах по отношению к контролям, установленным на 100% (0) после того, как клетки подвергались воздействию амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов. nd, не обнаружено. *Значительное различие с контролями, p≤0,05.

После 2 недель воздействия амигдалина интегрин α2 значительно увеличился, даже больше, чем после воздействия в течение 24 часов. В клетках A498 α3 и β3 увеличились после 2 недель воздействия амигдалина. Снижение β1 и p-FAK произошло в клетках KTC-26, а β4 был подавлен как в Caki-1, так и в KTC-26 после 2 недель воздействия амигдалина ( рис. 5 ).

Блокировка экспериментов

Профили экспрессии интегрина всех трех линий клеток были изменены амигдалином. Поскольку поверхностный интегрин α5 и интегрин α6 были сильно снижены во всех трех линиях клеток после применения амигдалина, эти интегрины были выбраны для исследований функциональной блокировки, чтобы выяснить, коррелируют ли эти снижения с изменениями адгезии и миграции опухолевых клеток. Блокирование α5 привело к значительному ингибированию адгезии клеток KTC-26 и A498 к коллагену ( рис. 6A ). Однако адгезия клеток Caki-1 к коллагену не была существенно затронута. Блокирование интегрина α5 привело к снижению хемотаксической активности во всех трех линиях клеток ( рис. 6B ). Блокирование рецептора α6 не оказало существенного влияния на адгезию к коллагену ни в одной из линий клеток ( рис. 6A ), но значительно снизило хемотаксис во всех трех линиях клеток ( рис. 6B ).

Рисунок 6 Влияние функциональной блокировки интегрина α5 и α6 на (A) адгезию клеток к коллагену и (B) хемотаксис. Неблокированные клетки служили в качестве контроля (100%, пунктирная линия). Оценивалось среднее количество адгезированных или хемотаксически активных клеток из пяти полей (0,25 мм2). Полосы указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). *Значительное различие с контролем. n=3 эксперимента, p≤0,05.

Обсуждение

Было отмечено, что взаимодействие между опухолевыми клетками и эндотелием играет решающую роль в метастатической прогрессии; адгезия клеток немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) к эндотелию стенки сосудов была связана с трансмиграцией опухолевых клеток, что приводит к метастазам в мозг и лимфатические узлы ( 7 ). Более агрессивный, метастазирующий фенотип рака также был связан с повышенной адгезией ( 7 ). В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что воздействие амигдалина привело к значительному ингибированию связывающего взаимодействия между клетками RCC и монослоем HUVEC, коллагеном и фибронектином. Таким образом, была ингибирована хемотаксическая и инвазивная активность клеток RCC. Такое ингибирование является клинически значимым, поскольку трансэндотелиальная миграция и подвижное распространение являются критическими этапами в распространении и прогрессировании опухоли ( 3 ) и коррелируют с плохой выживаемостью. Снижение миграционного потенциала было связано с успешной терапией опухолей и менее злокачественным фенотипом опухоли ( 8 ). Таким образом, мы предполагаем, что ингибирование адгезии и подвижности клеток почечно-клеточного рака амигдалином снижает распространение метастазов.

Эффект амигдалина на блокирование адгезии и миграции не ограничивается клетками почечно-клеточного рака. Недавно было показано, что амигдалин также подавляет адгезивное поведение клеток рака мочевого пузыря ( 5 ). Хотя амигдалин оказывал схожее подавляющее действие на адгезионные свойства клеток рака мочевого пузыря и почечно-клеточного рака, миграция клеток рака мочевого пузыря была затронута амигдалином по-разному. Хемотаксис был подавлен в двух, но повышен в одной линии клеток рака мочевого пузыря после воздействия амигдалина, что указывает на то, что влияние амигдалина, вероятно, зависит от сущности опухоли. Таким образом, важно исследовать влияние амигдалина на различные сущности опухоли.

Семейство интегринов вовлечено во все этапы метастатической прогрессии опухоли ( 4 , 7 ). Интегрин α5 повышается в опухолевых клетках эпителиального происхождения, и была установлена ​​положительная корреляция между экспрессией интегрина α5 и адгезией клеток почечно-клеточного рака ( 9 ). В настоящем исследовании введение амигдалина значительно снизило поверхностный интегрин α5 во всех трех клеточных линиях. Кроме того, общее клеточное содержание интегрина α5 в зависимости от времени снижалось в присутствии амигдалина. Блокирование функции интегрина α5 вызвало значительное ингибирование адгезии клеток KTC-26 и A498 к коллагену и снижение хемотаксической активности всех используемых клеточных линий. В соответствии с настоящими данными, снижение регуляции интегрина α5 ранее было связано со снижением адгезивного и инвазивного поведения нескольких типов раковых клеток ( 10–12 ) .

В настоящем исследовании мы отметили, что адгезия коллагена клеток Caki-1 не снизилась после блокирования интегрина α5, в отличие от вызванного амигдалином снижения в клетках A498 и KTC-26. Подобное различие в функции интегрина между типами опухолевых клеток наблюдалось ранее. Было показано, что блокирование интегрина α5 ингибирует взаимодействие клеток с матриксом клеток рака мочевого пузыря HCV29 и BC3726, но усиливает связывание линий клеток рака мочевого пузыря T24 и Hu456 (оснащенных другим набором интегринов) ( 13 ). Аналогичным образом, было показано, что блокирование интегрина β1 ингибирует прикрепление клеток рака мочевого пузыря UMUC-3 к коллагену, но оказывает противоположный адгезивный эффект на клетки TCCSUP, которые характеризуются другим профилем экспрессии интегринов ( 5 ). В настоящем исследовании воздействие амигдалина вызвало увеличение поверхностного β3 интегрина в клетках KTC-26 и A498, но уменьшение в клетках Caki-1. Контррегуляция с участием другого подтипа интегрина, в данном случае β3, может объяснить, почему блокирование α5 не остановило адгезию в клетках Caki-1. Потеря интегрина α5 вызвала снижение хемотаксиса во всех трех клеточных линиях. Поэтому мы предполагаем, что потеря поверхностного интегрина α5 является механизмом, посредством которого амигдалин действует на миграцию клеток RCC, а тонкая настройка производительности интегрина зависит от конкретного профиля интегрина в конкретной клеточной линии.

Было показано, что интегрин α6 облегчает миграцию эпителиальных клеток и коррелирует с риском прогрессирования, метастазирования и смерти в клинических испытаниях ( 14 ). Другие исследования показали, что интегрин α6 способствует миграции и инвазии при колоректальном раке ( 15 ), а также карциномах поджелудочной железы ( 16 ) и молочной железы ( 17 ). Было отмечено, что интегрин α6 активирует FAK ( 18 ) и связанную с FAK нисходящую сигнализацию, которая имеет отношение к контролю подвижности клеток, выживаемости и пролиферации ( 4 ). В настоящем исследовании поверхностная экспрессия интегрина α6 была значительно снижена, а FAK был дезактивирован амигдалином во всех трех клеточных линиях. Блокирование поверхностного интегрина α6 показало, что α6 не мешает адгезии опухолевых клеток, но регулирует подвижность клеток. Поэтому вполне вероятно, что снижение α6 представляет собой механизм, с помощью которого амигдалин замедляет распространение клеток.

Было показано, что интегрин β1 способствует инвазии клеток при раке молочной железы, легких, поджелудочной железы и колоректальном раке, а также при глиоме, меланоме ( 4 ) и нейробластоме ( 19 ). В клетках рака предстательной железы было показано, что повышение уровня интегрина β1 сопровождается повышенным подвижным поведением, тогда как блокада интегрина β1 способствует снижению хемотаксиса, миграции и адгезии клеток ( 10 ). Ингибирование интегрина β1 было связано с уменьшением инвазии и метастазирования рака яичников ( 12 ), а ингибитор пептида интегрина α5β1, как было показано, блокирует метастазирование рака молочной железы in vivo ( 20 ). В настоящем исследовании поверхностный интегрин β1 был снижен во всех трех линиях опухолевых клеток после 2 недель воздействия амигдалина. Таким образом, амигдалин может воздействовать на интегрин β1, замедляя подвижное распространение клеток почечно-клеточного рака.

Исследования in vitro и in vivo показывают, что α3 является еще одним интегрином, участвующим в инвазии глиомы, меланомы, гепатоцеллюлярной и молочной карциномы, а также способствует метастазированию клеток молочной железы в легкие ( 4 ). Блокирование интегрина α3 привело к ингибированию адгезии клеток рака простаты ( 21 ). В настоящем исследовании поверхностный интегрин α3 был снижен в клетках Caki-1 и KTC-26, но не в клетках A498. Это неоднородное снижение указывает на специфичный для клеточной линии эффект, вызванный амигдалином.

Применение амигдалина, помимо модуляции экспрессии поверхностного интегрина, также изменило общее содержание клеточного интегрина. В настоящем исследовании общая экспрессия клеточного интегрина α2 была повышена во всех трех линиях опухолевых клеток после воздействия амидалина. Предыдущие исследования показали, что снижение уровня интегрина α2 в опухолевых клетках потенциально увеличивает распространение опухолевых клеток, а повторная экспрессия интегрина α2, как было показано, обращает вспять злокачественные свойства клеток рака молочной железы ( 22 ). Следовательно, мы предполагаем, что индуцированное амигдалином ингибирование адгезии и миграции опухолевых клеток, наблюдаемое здесь, связано с повышением регуляции интегрина α2.

Общий клеточный интегрин α3 снизился через 24 ч после нанесения амигдалина во всех трех клеточных линиях. Это согласуется с вызванным амигдалином снижением поверхностного α3 в клетках Caki-1 и KTC-26. Поскольку поверхностный α3 не был изменен в клетках A498, возможно, что амигдалин в этой клеточной линии действует через внутриклеточные сигнальные пути α3. p-FAK, который был сильно снижен в клетках A498 через 24 ч после нанесения амигдалина, подтверждает эту гипотезу, поскольку ось α3-FAK участвует в инициации и прогрессировании рака ( 23 ). Ли и др. продемонстрировали, что FAK является критическим медиатором опухолеобразования и метастазирования, которые частично зависят от интегрина α3 ( 24 ). Поэтому мы предполагаем, что снижение как интегрина α3, так и FAK дезактивирует двигательный аппарат клеток A498.

Общий клеточный интегрин β1 был повышен в клетках Caki-1 после применения амигдалина, в то время как поверхностная экспрессия была снижена. Этот тип сдвига не является необычным и указывает на транслокацию рецептора с поверхности во внутриклеточный компартмент. Хотя значимость этого процесса не полностью понята, было показано, что перемещение интегрина β1 к плазматической мембране увеличивает метастатический потенциал клеток RCC, тогда как остановка рециркуляции β1 путем поддержания высокого содержания цитоплазматической и низкого содержания плазматической мембраны снижает метастазирование ( 25 ). Было показано, что повышение внутриклеточного β1 связано с дезактивацией FAK ( 25 ), что коррелирует с настоящими результатами.

Эффекты амигдалина на экспрессию подтипа интегрина зависели от клеточной линии, от того, было ли время применения острым (24 ч) или хроническим (2 недели) и от того, находился ли интегрин на поверхности клетки или в цитоплазме. Таким образом, молекулярный способ действия амигдалина в отношении экспрессии подтипа интегрина не является однородным и может влиять как на механическое межклеточное сцепление, запускаемое интегрином, так и на активацию биохимического пути, контролируемого интегрином.

В трех исследованных линиях клеток RCC применение амигдалина значительно снизило инвазивное и подвижное поведение. Однако 2 недели применения амигдалина не снизили инвазивную способность клеток KTC-26. Снижение было преимущественно связано с уменьшением поверхностных интегринов α5 и α6. Однако этот механизм не следует обобщать. Хотя было показано, что амигдалин также ингибирует адгезию и миграцию в клетках рака мочевого пузыря, интегрины изменяются по-разному. Интегрины α5 и α6, по-видимому, являются важной мишенью амигдалина в клетках RCC, тогда как модуляция интегринов β1 или β4 была наиболее очевидна в клетках рака мочевого пузыря ( 5 ). Были начаты дальнейшие исследования in vitro , чтобы оценить, влияет ли амигдалин также на рост клеток RCC, как это наблюдалось для клеток рака мочевого пузыря ( 6 ).

В заключение, воздействие амигдалина на клетки RCC подавляет метастатическое распространение и связано с подавлением α5 и α6 интегринов. Таким образом, амигдалин проявляет противоопухолевую активность in vitro в RCC. Эта активность in vitro должна быть оценена на модели животных.

Благодарности

Настоящее исследование было поддержано «Фондом Бригитты и Норберта Мут» и «Друзья и сторонники Франкфуртского университета Гете».