Анти-рак: научные исследования

DCA усиливает противоопухолевое действие капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 мыши и ксенотрансплантате немелкоклеточного рака легкого A549 человека

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1007/s00280-013-2281-z

Кафедрабиохимии, факультет наук о жизни, Фуданьский университет, Хандан Роуд 220, Шанхай, 200433, Китай.
Электронная почта: e-mail: whuang@fudan.edu.cn


Получено: 16 мая 2013 г.
Принято: 27 августа 2013 г.
Опубликовано: 17 сентября 2013 г

Аннотация

Цель: Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью. Недавно дихлорацетат натрия (ДХА) показал большой потенциал в качестве противоракового агента. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином при раке со скромной экспрессией TP.

Методы: Для оценки эффекта комбинированного лечения DCA и капецитабином использовали аллотрансплантат меланомы мыши B16 и ксенотрансплантат немелкоклеточного рака легкого человека A549. Гистология и иммуногистохимия использовались для выявления апоптоза и пролиферации раковых клеток. ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот проводились для определения экспрессии TP и каспаз, соответственно.

Результаты: Впервые мы сообщаем, что DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в мышином аллотрансплантате B16 и человеческом ксенотрансплантате A549, способствуя апоптозу опухолевых клеток. DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP.

Выводы: Наши результаты свидетельствуют о том, что DCA в комбинации с капецитабином может стать потенциально новым терапевтическим режимом против некоторых видов рака.

Ключевые слова: DCA, капецитабин, комбинация, противоопухолевый эффект

ВВЕДЕНИЕ

Дихлорацетат натрия (ДХА) — это маленькая молекулярная соль дихлоруксусной кислоты с молекулярной массой 150 Да. DCA ингибирует активность киназы пируватдегидрогеназы, тем самым активируя митохондриальный ферментный комплекс пируватдегидрогеназы [1] и переводя гликолитический путь метаболизма на окислительное фосфорилирование. В течение последних 40 лет DCA использовался в качестве сиротского препарата для лечения врожденного молочнокислого ацидоза у детей и молочнокислого ацидоза, осложненного другими заболеваниями [2], и показал высокую эффективность и низкую токсичность как в доклинических, так и в клинических испытаниях [3]. Недавно DCA продемонстрировал большой потенциал в качестве противоракового средства из-за сходства метаболического ремоделирования некоторых опухолевых клеток с процессами, происходящими при молочнокислом ацидозе [4]. Раковые клетки, особенно раковые стволовые клетки (РСК), сопротивляются апоптозу, производя энергию путем гликолиза и молочнокислого брожения, а не окислительного фосфорилирования, из-за гипоксической природы опухолевой микросреды — явления, известного как эффект Варбурга [5,6]. Было показано, что после перорального приема DCA восстанавливает функцию митохондрий и избирательно способствует апоптозу опухолевых клеток по митохондриально-зависимому пути [7,8]. Терапевтическая активность DCA против глиобластомы была проверена в клинических испытаниях (NCT00540176) и показала некоторые положительные результаты [9]. Однако исследование II фазы NCT01029925 по определению частоты ответа на пероральный прием дихлорацетата у пациентов с рецидивирующим и/или метастатическим и предварительно леченным раком молочной железы и немелкоклеточным раком легкого было прекращено из-за более высокого, чем ожидалось, риска и проблем с безопасностью. Таким образом, клиническая польза DCA для борьбы с раком нуждается в более тщательной оценке.

Как сенсибилизатор апоптоза, DCA также использовался в комбинации с другими методами лечения рака. Cao и другие [10] сообщили, что DCA сенсибилизировал клетки рака простаты к радиации in vitro. Сяо и др. [11] установили, что DCA усиливает гибель опухолевых клеток в сочетании с онколитическим аденовирусом, экспрессирующим опухолевый супрессор MDA-7/IL-24. Недавно метаболическая таргетная терапия с использованием DCA была продемонстрирована как новая стратегия лечения для улучшения результатов фотодинамической терапии [12]. Тонг и др. [13] обнаружили, что DCA и 5-фторурацил проявляют синергетический противоопухолевый эффект в клетках колоректального рака in vitro. Однако до сих пор существуют противоречивые результаты и сомнения относительно применения DCA отдельно или в комбинации с другими препаратами. Шахрзад и др. [14] показали, что DCA снижает апоптоз раковых клеток в гипоксических условиях как in vitro, так и in vivo. Хеше и др. [15] предупредили, что DCA снижает цитотоксичность некоторых стандартных противораковых препаратов, таких как цисплатин и доксорубицин, но не влияет на активность темозоломида в 7 из 10 клеточных линий в их исследовании. Эти противоречивые результаты означают, что применение DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения может зависеть от типа рака и конкретного агента.

Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью и лицензирован в качестве первой линии лечения метастатического рака прямой кишки или альтернативного лечения метастатического рака молочной железы в сочетании с доцетакселом [16,17]. Капецитабин является пролекарством 5-фторурацила (5-ФУ) и требует 3 ферментативных реакций для окончательного превращения в 5-ФУ в опухолевых клетках. Последняя реакция катализируется тимидинфосфорилазой (TP), которая в некоторых опухолях выражена в большей степени, чем в нормальных тканях [18]. Поэтому цитотоксический 5-ФУ образуется в большей степени в опухолевых клетках, чем в тканях вне опухоли, что делает капецитабин малотоксичным химиотерапевтическим препаратом [18]. Уровни экспрессии TP различны в разных типах опухолей [18]; это ограничивает применение капецитабина только несколькими типами рака. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином для раковых опухолей со скромной экспрессией TP. Мы предположили, что DCA усиливает противораковый эффект и снижает эффективную дозу капецитабина. Комбинация DCA с капецитабином может дать хорошую схему лечения, поскольку оба агента можно принимать перорально при хорошей приверженности пациентов. Кроме того, генерические формы DCA могут снизить эффективную дозу капецитабина, тем самым уменьшая побочные эффекты и стоимость лечения рака.

Материалы и методы

Материалы
Дихлорацетат натрия (ДХА, CSA:2156-56-1), чистота 99 %, был получен от компании Shanghai Jieshi Chemical Co. (Китай). 5-фторурацил (5-FU) и 5′-дезокси-фторуридин (5DFUR) были получены от Sigma-Aldrich (США). МТТ был получен от Shanghai Biological Engineering Co. (Китай). Таблетки капецитабина (Xeloda) были получены от Roche (США). Мышиная меланома B16 и человеческая немелкоклеточная линия клеток рака легкого A549 были получены из Американской коллекции клеточных культур (ATCC, США).

Исследования на животных моделях

Модель аллотрансплантата

Мыши C57BL/6, самки, возраст 6-8 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Один миллион одиночных клеток B16 был подкожно (s.c.) инокулирован в правый фланг мышей C57BL/6. Мышей разбили на случайные группы, по 6 мышей на группу в клетке. Было две группы мышей. DCA и капецитабин вводили этим двум группам мышей через 3 и 10 дней после инокуляции, соответственно. DCA добавляли в стерильную питьевую воду до конечной концентрации 1,4 г/л. Измерение объема потребленной воды показало, что количество ДКА, введенного каждой мыши, было приблизительно равно 100 мг/кг/день. Таблетки капецитабина измельчали и суспендировали в стерильной воде с 4 % карбоксиметилцеллюлозы для получения различных концентраций. Двести микролитров суспензии капецитабина вводили внутрижелудочно каждой мыши. Каждые 2 дня длинный (a) и короткий (b) диаметры опухолей измеряли с помощью штангенциркуля, а также регистрировали массу тела. Объем опухоли рассчитывали по формуле V = 0,5ab2. Через 22 дня после инокуляции мышей умертвили, опухоли удалили и взвесили.

Модель ксенотрансплантата

Мыши BALB/c-nu, самцы, возраст 5-6 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Приблизительно 2 × 2 мм срезы только что измельченных опухолевых тканей A549, полученных от мышей BALB/c-nu, ранее инокулированных клетками A549, были введены внутривенно в область правого фланга самцов мышей BALB/c-nu. DCA и капецитабин вводили мышам, когда объем опухоли достигал ~0,2 см3. Через тридцать-тридцать пять дней после лечения мышей умерщвляли, опухоли удаляли и взвешивали. Другие методы были такими же, как описанные в эксперименте с аллотрансплантацией.

Исследования на животных были одобрены группой по благополучию животных и этике факультета лабораторных животных Фуданьского университета.

Гистология и иммуногистохимия
Гистологическое исследование опухолевых узлов проводили с использованием дополнительных животных (по 3 мыши в каждой группе), которые не рассматривались для мониторинга роста опухоли. Ткани фиксировали в 4 % (w/v) параформальдегиде, после фиксации в течение ночи при комнатной температуре образцы обезвоживали в градуированном этаноле и встраивали в парафин. После этого различные части опухоли произвольно вырезали для получения 4-мкм срезов на микротоме Leica. После депарафинизации и регидратации три среза из разных частей каждого образца были отобраны для последующих операций. Терминальное дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованное никелирование концевого участка ДУТФ (TUNEL) и окрашивание 4′6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) проводили в соответствии с инструкциями производителей наборов TUNEL и DAPI (Beyotime, Китай). Срезы анализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Olympus, Япония). Выявление ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) проводили после депарафинизации срезов и инкубации при 96-100 °C в течение 20 мин. Активность эндогенной пероксидазы гасили 0,3 % (v/v) перекисью водорода в 60 % (v/v) метаноле в течение 30 мин. Неспецифическую адсорбцию минимизировали путем инкубации срезов в 2 % (v/v) нормальной козьей сыворотке в PBS в течение 20 мин. Участки тканей инкубировали в течение ночи с кроличьим поликлональным антителом анти-PCNA (Abcam; 1:100 в PBS), промывали PBS 3 раза, по 30 мин каждый раз, и инкубировали с биотин-конъюгированным козьим антирабическим IgG в течение 2 ч при 37 °C и авидин-биотин-пероксидазным комплексом в течение 1 ч при 37 °C. Срезы контрастировали гематоксилином (Sigma-Aldrich) и анализировали с помощью световой микроскопии (Olympus, Япония). Для анализа иммуногистохимии использовали по три опухоли на группу. Один или два среза на опухоль были слепо отобраны для измерения PCNA- или TUNEL-позитивных клеток. Пять случайных полей на слайде при увеличении 400× измеряли вслепую (n = 250 клеток на группу). При проведении количественного анализа TUNEL-позитивных клеток, возможные некротические клетки исключались путем наблюдения за ядерной морфологией с помощью окрашивания DAPI. Для обеспечения точности результатов проводили как положительный, так и отрицательный контроль.

Выделение белка и вестерн-блоттинг
Опухолевые ткани из каждой группы (3 дополнительные мыши в каждой группе) были объединены вместе и измельчены под жидким азотом, а затем лизированы в 150

мкл

буфера для лизиса тканей (Beyotime, Китай). Пробирки энергично встряхивали в течение 1 мин, помещали на лед на 20 мин и центрифугировали при 5 000g в течение 5 мин при 4 °C. Концентрацию общего белка определяли с помощью набора для определения белка BCA (BioRad). Тридцать микрограммов общего белка из каждого образца разделяли методом SDS-PAGE на 10 % геле, переносили на PVDF мембрану, блокировали, инкубировали в течение ночи с первичным антителом, инкубировали в течение 1 ч с вторичным антителом и окрашивали хромогенным субстратом NBT/BCIP. Мышиное моноклональное антитело против антикаспазы 3 (1:500), антитело против антикаспазы 9 (1:1 000), анти-β-актин (1:2 000) и кроличье поликлональное антитело против антикаспазы 8 (1:1 000) были получены от Beyotime (Нанкин, Китай). Мышиное моноклональное антитело анти-ТФ (1:2,000) было получено от Abcam (Великобритания). в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Плотность полос вестерн-блота анализировали с помощью программы Clinx Gel Analysis V2.02 (Clinx Science, Китай).

ПЦР в реальном времени
Опухоли B16 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши C57BL/6, ранее инокулированной клетками B16 (использовали 3 мышей, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Colo205/A549 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши BALB/c-nu, ранее инокулированной клетками Colo205/A549 (3 мыши были использованы, соответственно, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Для анализа экспрессии TP после лечения образцы опухолей объединяли из 3 опухолевых тканей одинакового веса в каждой группе. Тотальную РНК выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США) и подвергали обратной транскрипции с помощью набора реагентов PrimeScript® RT (Takara, Япония). кДНК нормировали на β-актин. ПЦР в реальном времени проводили трехэтапным методом с использованием набора SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takata, Япония) с температурой отжига 55 °C и 40 циклами амплификации. Отдельный тест проводили в трех экземплярах. в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Относительное количество каждой кДНК анализировали с помощью2-△△Ct. Праймеры для ПЦР в реальном времени: β-актин F: 5′-TCAAGATCATTGCTC CTCCTG-3′ и β-актин R: 5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′, hTP F: 5′-TGGCTCAGTCGGGACAGCAG-3′ и hTP R: 5′-TCCGCTGATCATTG GCACCT-3′, mTP F: 5′-GCCTAGCTAAAGCATTGTGCTC-3′ и mTP R: 5′-AAGGGTGCT CGATCTGATAGCA-3′.

Статистика
Мы использовали множественные сравнения ANOVA с post hoc анализом (тест Тьюки), используя программное обеспечение SPSS 16.0 (SPSS Inc., США). Данные представлены как среднее ± SEM, значимым считалось P < 0,05.

Результаты

Экспрессия TP в меланоме мыши B16 и опухолях человека A549 NSCLC
Экспрессия TP в опухолях B16 и A549, удаленных у мышей, была проанализирована методом ПЦР в реальном времени. Печень человека экспрессирует относительно больше TP, чем другие нормальные ткани [18]. В типичных типах рака, подходящих для лечения капецитабином, экспрессия TP в опухоли близка или выше, чем в печени, например, в колоректальном раке и раке молочной железы [18,19]. В ксенотрансплантатах рака человека раковые опухоли с высокой активностью TP были более восприимчивы к лечению капецитабином, чем раковые опухоли с низкой активностью TP [20]. Клеточная линия колоректального рака Colo205 была выбрана в качестве эталона на основании ее умеренной экспрессии TP и умеренной чувствительности к капецитабину [21]. Как показано на рис. 1a, уровень транскрипции TP в Colo205 был немного выше, чем в печени мыши BALB/c-nu. Как показано на рис. 1б, в, уровни транскрипции TP в опухолях B16 и A549 были близки к таковым в печени мышей. Таким образом, B16 и A549 также являются умеренно экспрессирующими TP клеточными линиями. Мы можем сделать вывод, что B16 и A549 будут в определенной степени реагировать на лечение капецитабином, не перекрывая эффект DCA. Таким образом, модели аллотрансплантата B16 и ксенотрансплантата A549 были пригодны для изучения противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина в комбинации.

Рисунок 1. По сравнению с печенью мыши, опухоли B16 и A549 скромно экспрессируют TP ПЦР в реальном времени Анализ уровня транскрипции TP. Использовались праймеры, специфически нацеленные на ТП мыши и человека. Праймер на β-актин подходит как для мышей, так и для человека. a Уровень транскрипции TP в опухоли Colo205 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. b Уровень транскрипции TP в опухоли A549 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. c Уровень транскрипции TP в опухоли B16 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей C57BL/6. В каждой группе использовались образцы от 3 мышей

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате мышиной меланомы B16 без дополнительной токсичности
Поскольку гипоксическая природа опухолевой микросреды является критической для оптимальной активности DCA, противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин был протестирован на животных моделях вместо клеточных линий. Тридцать шесть мышей C57BL/6 были инокулированы 1 ×106 клетками меланомы B16 и случайным образом разделены на 6 групп (n = 6): контрольная группа, не получавшая лекарств, группа, получавшая только DCA, группа, получавшая только капецитабин 10 мг/день, и три группы, получавшие DCA плюс капецитабин 5, 10 или 20 мг/день. Через три дня после инокуляции опухолевых клеток мышам вводили DCA в питьевой воде и перорально (p.o.) капецитабин в качестве отдельных агентов или в комбинации с возрастающими концентрациями капецитабина. Как показано на верхней панели рис. 2a, как DCA, так и капецитабин в дозе 10 мг/день в одиночку незначительно подавляли рост опухолей меланомы B16 по сравнению с контрольной группой. Напротив, DCA плюс 10 мг/день капецитабина значительно усиливали ингибирование роста опухоли (P < 0,05). Противоопухолевый эффект DCA плюс 20 мг/день капецитабина был аналогичен тому, который наблюдался при использовании DCA плюс 10 мг/день капецитабина; рост опухоли был почти полностью подавлен. Примечательно, что у мышей, получавших DCA плюс 20 мг/день капецитабина, наблюдалось резкое снижение массы тела (рис. 2а, нижняя панель), в то время как DCA плюс 10 мг/день капецитабина практически не влиял на массу тела по сравнению с контролем.

Рисунок 2. DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 у мышей без дополнительной токсичности. a Через три дня после инокуляции мышам вводили DCA и капецитабин (CAP) по отдельности или в комбинации. Вводили эскалированные дозы [5, 10 и 20 мг/день (мг/день)] капецитабина в комбинации с постоянной дозой DCA. Показаны кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель). b Через 10 дней после прививки мышам вводили DCA и 7,5 мг/день капецитабина отдельно или в комбинации. Представлены кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель)

Для оценки противоопухолевого эффекта DCA плюс капецитабин против пальпируемых, обнаруживаемых опухолей, через 10 дней после инокуляции опухолевых клеток, DCA и капецитабин отдельно или в комбинации вводили второй группе из 36 мышей C57BL/6, инокулированных 1 ×106 клетками меланомы B16. Мыши с пальпируемыми опухолями были случайным образом разделены на 4 группы (n = 9, 3 мыши использовались для анализа иммуногистохимии): контроль, только DCA, только капецитабин в дозе 7,5 мг/день и DCA плюс капецитабин в дозе 7,5 мг/день. Как показано на верхней панели рис. 2б, DCA плюс капецитабин 7,5 мг/день значительно подавляли рост опухоли по сравнению с DCA или капецитабином (P < 0,05). Через 22 дня после инокуляции DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина подавляли рост опухоли на 75 % (P < 0,05), в то время как только DCA и капецитабин подавляли рост только на 25 % и 35 %, соответственно (P < 0,05). DCA не вызывал резкой потери массы тела по сравнению с лечением только капецитабином (рис. 2b, нижняя панель). Эти результаты показывают, что DCA и капецитабин могут оказывать синергетический противоопухолевый эффект в опухолях меланомы B16.

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели НСКЛ человека A549 без дополнительной токсичности
Ранее сообщалось, что НСКЛ человека можно лечить либо DCA [7], либо капецитабином [22-24]. В настоящем исследовании мы изучили противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин в модели ксенотрансплантата НСКЛ A549 человека. Шестьдесят шесть самцов мышей BALB/c-nu с опухолями человека NSCLC A549 (~2 × 2 мм), привитыми внутривенно в правый фланг, были случайным образом разделены на 9 групп: контроль; только DCA; 2,5, 5, 7,5 или 10 мг/день только капецитабина; или DCA плюс 2,5, 5 или 7.5 мг/день капецитабина (n = 6, кроме контроля, только DCA, 7,5 мг/день капецитабина и DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина; в этих группах n = 9, 3 мыши были использованы для иммуногистохимического анализа и анализа Вестерн-блот или ПЦР в реальном времени). Капецитабин в дозе 10 мг/день был установлен в качестве контроля высокой дозы. Когда объем опухоли достигал 0,15-0,2 см3, мышам вводили препараты. Капецитабин вводили внутривенно по схеме 14 дней в день/7 дней в день. Как показано на левой панели рис. 3a, b и c, только DCA оказывал незначительное ингибирующее действие на опухоли A549; этот результат не согласуется с данными предыдущих отчетов [7], в которых только DCA проявлял больший противоопухолевый эффект. Только капецитабин в дозе 10 мг/день значительно подавлял рост опухолей A549, но при этом отмечалось резкое снижение массы тела, что указывает на сильную токсичность (рис. 3a, b, c, правые панели). Как показано на левой панели рис. 3а, 2,5 мг/день только капецитабина значительно уменьшали рост опухолей A549; комбинация DCA плюс 2,5 мг/день капецитабина усиливала ингибирование роста. Кривая увеличения объема опухоли при лечении только DCA предполагает, что капецитабин оказывает доминирующее противоопухолевое действие при комбинированном лечении. Эффект DCA плюс 5 мг/сут капецитабина был немного лучше, чем DCA плюс 2,5 мг/сут капецитабина, хотя и хуже, чем 10 мг/сут капецитабина, и не наблюдалось значительного снижения массы тела (рис. 3б, правая панель). Примечательно, что DCA плюс 5 мг/сут капецитабина значительно усилили ингибирование роста опухоли по сравнению с 5 мг/сут только капецитабина (рис. 3б, левая панель). Противоопухолевый эффект комбинации был близок к лечению капецитабином 10 мг/день, но без значительной потери массы тела (рис. 3б, правая панель). Эффект только капецитабина 7,5 мг/сут (рис. 3c) был немного лучше, чем капецитабина 5 мг/сут; однако при сочетании с ДКА не было значительной разницы между ДКА плюс капецитабин 7,5 мг/сут и ДКА плюс капецитабин 5 мг/сут. Эти результаты означают, что DCA может снизить дозу капецитабина без потери противоопухолевого эффекта или увеличения токсичности.

Рисунок 3. DCA увеличивает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели NSCLC A549 человека без дополнительной токсичности. a DCA плюс 2,5 мг/день (мг/день) капецитабина. b DCA плюс 5 мг/день капецитабина. c DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. Группа лечения капецитабином 10 мг/день использовалась в качестве контроля больших доз. Показаны кривые роста опухоли(левые панели) и кривые массы тела(правые панели). Объем опухоли представлен на логарифмической оси

DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина на клетки B16 и A549 in vivo
Гистологическое исследование опухолей меланомы B16 проводилось через 7 дней после начала лечения. Окрашивание TUNEL показало, что лечение опухолей меланомы B16 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало клеточный апоптоз на 8 и 17 %, соответственно. В комбинации DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина индуцировали апоптоз примерно на 30 %, что больше, чем сумма отдельных препаратов вместе взятых (рис. 4a, c, левая панель). Окрашивание PCNA в опухолях меланомы B16 показало, что только DCA оказывал незначительное влияние на пролиферацию, в то время как капецитабин 7,5 мг/день значительно снижал пролиферацию. DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина не усиливали ингибирование пролиферации только капецитабином в опухолевых клетках B16 (рис. 4b, c, правая панель).

Рисунок 4. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях меланомы B16. a Иммунофлуоресцентное окрашивание TUNEL образцов опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Иммуногистохимический анализ антигена пролиферации PCNA в образцах опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. c Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток(слева) и PCNA-позитивных клеток(справа). *P < 0.05

Подобно опухолям меланомы B16, лечение опухолей NSCLC A549 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало апоптоз на 15 и 30 %, соответственно. При совместном применении DCA плюс 7,5 мг/сут капецитабина индуцировали апоптоз на 50 %, что больше, чем сумма лечения одним агентом вместе взятым (рис. 5a, b). Эти результаты позволяют предположить, что DCA и капецитабин оказывают синергетическое действие на апоптоз опухолевых клеток NSCLC A549. DCA не усиливал ингибирование пролиферации капецитабином в опухолевых клетках NSCLC A549 (данные не показаны).

Рисунок 3. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях NSCLC A549. a Иммуногистохимический анализ TUNEL образцов опухолей NSCLC A549 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток. c Вестерн-блот активации каспаз в опухолях NSCLC A549. Активация инициаторных каспаз (каспазы 8 и каспазы 9) и эффекторных каспаз (каспазы 3) была обнаружена в опухолях NSCLC A549, инокулированных мышам BALB/c-nu, получавшим DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. d Плотный анализ расщепленных каспаз (C. caspase). Нормализовано по β-актину. *P < 0.05

Вестерн-блот показал, что DCA не оказывает значительного влияния на экспрессию и активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3 в опухолях NSCLC A549 по сравнению с контролем на 7-й день после лечения (рис. 5c, d). Только капецитабин в дозе 7,5 мг/день увеличивал активацию всех трех прокаспаз (рис. 5c, d). Интересно, что хотя DCA сам по себе не оказывал значительного влияния на экспрессию и активацию трех прокаспаз, DCA плюс капецитабин повышали экспрессию прокаспазы 8 и прокаспазы 3 по сравнению с лечением только капецитабином и усиливали активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3.

DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP в опухоли
Мы проанализировали экспрессию TP в образцах опухоли из ксенотрансплантата A549 на 7-й день после лечения. ПЦР в реальном времени (рис. 6a) и Вестерн-блот (рис. 6b) показали, что DCA как отдельный агент или в комбинации с капецитабином мало влияет на экспрессию TP, что означает, что механизм действия DCA и капецитабина в комбинации отличается от других синергистов капецитабина, о которых сообщалось ранее [19,25-27]. ПЦР в реальном времени также показала, что DCA не влияет на экспрессию других ферментов метаболизма капецитабина (тимидилат синтазы, оротат фосфорибозилтрансферазы, дигидропиримидин дегидрогеназы, тимидин киназы 1 и цитидин деаминазы, данные не показаны). Полученные результаты позволяют предположить, что DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не приведет к повышению токсичности капецитабина.

Рисунок 6. Транскрипция и экспрессия TP в опухоли A549 после лечения. a Анализ транскрипции TP методом ПЦР в реальном времени. Нормализовано по β-актину. b Вестерн-блот анализ экспрессии TP. в качестве внутреннего контроля использовался β-актин. Опухоли A549 резецировали у мышей BALB/c-nu через 7 дней после лечения DCA, 7,5 мг/день капецитабина, DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина или контрольной группы. Образцы из трех опухолей каждой группы были объединены вместе

Обсуждение

DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения был протестирован в клинических испытаниях; однако нет сообщений о противоопухолевом действии DCA в комбинации с капецитабином. Мы предположили, что стимулирующее апоптоз действие DCA на клетки солидных опухолей сделает их более чувствительными к капецитабину. В настоящем исследовании только 1,4 г/л DCA не оказывал значительного влияния на рост опухоли NSCLC A549 у мышей. Однако совместное введение DCA и капецитабина позволило снизить эффективную дозу капецитабина на 50 %. DCA усиливал противоопухолевый эффект капецитабина in vivo через сенсибилизацию апоптоза. DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не увеличивает токсичность капецитабина.

Поскольку были получены как положительные, так и отрицательные результаты (как показано в разделе «Введение»), до сих пор существуют разногласия по поводу использования DCA в качестве противоракового агента. Это расхождение может быть связано с различными экспериментальными условиями, особенно между результатами in vivo и in vitro. Клеточные анализы, использованные в настоящем исследовании, показали, что опухолевые клетки нечувствительны к DCA при культивировании in vitro, IC50 превышает 50 мМ. (данные не показаны). Действие DCA на раковые клетки не связано с прямой цитотоксичностью, а зависит от метаболического паттерна раковых клеток [7, 28]. Клеточные линии, культивируемые in vitro, не могут воспроизвести микроокружение опухоли и могут утратить «эффект Варбурга». Поэтому клеточные анализы in vitro могут быть не самыми подходящими модельными системами для определения применения DCA. Поэтому в настоящем исследовании комбинированный противоопухолевый эффект DCA и капецитабина был оценен на мышиных моделях опухолей in vivo. Мы также обнаружили, что эффект DCA на ксенотрансплантат NSCLC A549 в настоящем исследовании был меньше, чем в работе Bonnet et al. [7], даже несмотря на использование большей дозы DCA. Это может быть связано с разницей в метаболической способности ДКА у мышей и крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что на эффект ДКА может влиять состояние раковых клеток и состояние пациентов, что требует тщательного изучения при клиническом использовании ДКА в лечении рака.

В настоящем исследовании на животных моделях было показано, что DCA сам по себе проявляет слабый противоопухолевый эффект против установленных опухолей. Но в сочетании с капецитабином DCA резко усиливал противоопухолевый эффект капецитабина, что видно как из исследований на животных моделях, так и из результатов иммуногистохимии апоптоза. В соответствии с этим, анализ вестерн-блотов показал, что DCA сам по себе оказывает незначительное влияние на экспрессию и расщепление прокаспаз. Но в сочетании с капецитабином DCA значительно увеличивает экспрессию и расщепление прокаспаз 8, 9 и 3. Сообщается, что цитотоксический агент, такой как 5-Fu, может привести к увеличению экспрессии и активации каспазы 8 [29,30]. Причина, по которой капецитабин приводит к увеличению экспрессии и активации каспазы 9, до сих пор не ясна. Возможно, это связано с антиангиогенетическим действием капецитабина. Сообщается, что DCA может нормализовать ось митохондрий-K+ каналов и действовать как сенсибилизатор апоптоза [7]. Мы предполагаем, что DCA может деполяризовать митохондриальный потенциал раковых клеток, нормализуя эту ось, и тем самым усиливать активацию каспазы 8 и каспазы 9 капецитабином. Повышенная активация каспазы 8 и каспазы 9 приводит к повышенной активации каспазы 3.

Недавно был подчеркнут критический вклад CSCs с их повышенной опухолеродной способностью и устойчивостью к радио- и химиотерапии в злокачественное поведение [31]. Сообщается, что CSCs в солидных опухолях играют важную роль в антихимиотерапевтических и антирадиотерапевтических характеристиках опухолей [32, 33]. Обсуждается множество методов лечения, направленных на CSCs [34, 35], а комбинированные методы лечения, направленные как на CSCs, так и на «нормальные» раковые клетки, вызывают большой интерес [36-38]. Сообщается, что DCA индуцирует апоптоз в предполагаемых стволовых клетках глиобластомы как in vitro, так и in vivo [9]. В нашем исследовании после 7 дней лечения DCA количество CD133-положительных клеток в опухолевых срезах A549, определенных с помощью иммуногистохимии, уменьшилось до 0,5 % по сравнению с 6 % в контрольной группе (данные не показаны), что позволяет предположить, что DCA может также влиять на индуцирование апоптоза в КСК рака легких. Мы предполагаем, что DCA может сенсибилизировать опухолевые клетки, особенно КСК, к капецитабину. Комбинация DCA и капецитабина действует против опухолевых клеток двумя способами: капецитабин нацелен на «нормальные» раковые клетки, щадя CSCs, а DCA нацелен на CSCs и способствует апоптозу капецитабина. Другой вероятный сценарий объяснения эффекта комбинации заключается в том, что DCA подавляет ангиогенез рака in vivo [9], при котором DCA не проявляет прямого действия на раковые клетки. В дополнение к своей классической противоопухолевой активности, капецитабин может действовать как антиангиогенетическая молекула, согласно последним исследованиям [39]. DCA может усиливать антиангиогенный эффект капецитабина, что объясняет противоопухолевый эффект комбинации. Для определения подробного механизма будут проведены углубленные исследования.

В заключение, мы использовали модели опухолей, привитых сингенетически, и ксенотрансплантированных опухолей для изучения комбинированного противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина и обнаружили, что DCA впервые потенцировал противоопухолевый эффект капецитабина. Мы определили, что DCA обладает способностью сенсибилизировать раковые клетки и усиливать апоптотическое действие капецитабина. При комбинированном применении DCA позволял снизить эффективную дозу капецитабина без увеличения токсичности. Недорогой, непатентованный и пероральный DCA в сочетании с пероральным капецитабином может стать хорошей терапевтической схемой против рака.

Благодарности

Мы очень благодарны Венлонг Рену из Шанхайского института фармацевтической промышленности за помощь в подготовке мышиных опухолевых моделей.

Конфликт интересов

Нет.

Амигдалин задерживает прогрессирование клеточного цикла и блокирует рост клеток рака простаты in vitro

оригинал статьи: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S002432051630039X

Ясмина Макаревич а 1,Игорь Цаур а 1,Ева Юнгель а,Хендрик Боргманн а,Карен Нельсон б,Кристиан Томас а,Георг Барч а,Аксель Хаферкамп а 2,Роман А. Блахета а 2

Кафедра урологии, Университет Гёте, Франкфурт-на-Майне, ГерманиябКафедра сосудистой и эндоваскулярной хирургии, Университет Гёте, Франкфурт-на-Майне, Германия

Получено 10 августа 2015 г., пересмотрено 22 января 2016 г., принято 26 января 2016 г., доступно онлайн 29 января 2016 г., версия записи 10 февраля 2016 г.

Цели

Несмотря на впечатляющие преимущества в выживании от новых препаратов для лечения метастазирующего рака простаты (РПЖ), прогрессирующая лекарственная устойчивость препятствует долгосрочному ответу и ограничивает эффективность последующей терапии. В связи с зарегистрированной противоопухолевой активностью амигдалина и растущей популярностью комплементарной и альтернативной медицины был оценен потенциал этого природного, широко используемого вещества для оказания противоопухолевого воздействия на клетки рака простаты.

Основные методы

Клетки LNCaP (чувствительные к кастрации), DU-145 и PC3 (устойчивые к кастрации) подвергались воздействию различных концентраций амигдалина в течение 24  ч или 2 недель. Рост клеток измерялся с помощью теста МТТ, клонирование — с помощью клоногенного анализа . Проточная цитометрия служила для исследования апоптоза и фаз клеточного цикла . Белки, регулирующие клеточный цикл, и сигнальная ось mTOR–akt анализировались с помощью вестерн-блоттинга . 

Основные выводы

Амигдалин дозозависимо уменьшал рост опухолевых клеток с максимальным эффектом при 10 Белки клеточного цикла cdk 1, cdk 2 и cdk 4, а также циклин A , циклин B и циклин D3 модулировались амигдалином как через 24 часа, так и через 2 недели. Отчетливое влияние на экспрессию p19 и p27, а также на активацию Akt, Rictor и Raptor стало очевидным только через 2 недели. мг/мл. Апоптоз клеток PC3 и LNCaP , но не DU-145, был снижен, тогда как образование колоний было подавлено во всех клеточных линиях. Было зарегистрировано снижение числа клеток G2/M- и S-фазы наряду с повышенным числом клеток G0/G1-фазы.   

Значение

Амигдалин проявляет значительную противоопухолевую активность как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-резистентных линиях клеток РПЖ и заслуживает дальнейшей оценки в терапевтических целях.

Введение

 В 2015 году в США было зарегистрировано 220 800 новых случаев рака предстательной железы (РПЖ), в то время как 27  540 мужчин умрут, что делает РПЖ, помимо рака кожи, наиболее часто диагностируемой злокачественной опухолью и второй по значимости причиной смерти от рака у мужчин [1]. Исключительная клиническая и экономическая значимость РПЖ способствовала проведению множества исследований, способствуя быстрому расширению возможностей лечения метастатического РПЖ [2]. Таким образом, значительное улучшение выживаемости на кастрационно-резистентной стадии было достигнуто за счет клинического применения новых препаратов для биосинтеза андрогенов и рецепторного таргетирования, радиофармацевтических препаратов, циторедуктивных и иммунотерапевтических агентов [3]. Предварительные данные также указывают на многообещающий результат ранней химиотерапии доцетакселом при кастрационно-чувствительном РПЖ, хотя для этой терапевтической концепции необходимы дальнейшие исследования [4]. Несмотря на обнадеживающие результаты новых протоколов, первичная или приобретенная лекарственная резистентность исключает долгосрочный ответ. Перекрестная резистентность часто ограничивает эффективность последующей терапии [5]. Кроме того, побочные эффекты, требующие тщательного наблюдения за пациентами и даже прерывания лечения, могут ограничивать клиническое применение [6].Чтобы избежать токсичности, укрепить иммунную систему и, возможно, предотвратить рецидив РПЖ [7], наблюдается рост популярности комплементарной и альтернативной медицины (КАМ), несмотря на скудную доказательную эффективность [8]. Около трети пациентов с РПЖ, и даже больше с запущенным заболеванием, используют КАМ в форме натуральных продуктов для здоровья, таких как витамин Е, пальма сереноа, селен и ликопин [9], [10]. Из-за зарегистрированной противоопухолевой активности цианогенное вещество, диглюкозид амигдалин ( d -манделонитрил-β-гентиобиозид), использовалось в качестве синергического партнера с известными средствами для лечения РПЖ. Предполагается, что это вещество, в изобилии встречающееся в косточках плодов видов Rosaceae, поможет предотвратить негативные эффекты химиотерапии [11]. Однако воздействие амигдалина на РПЖ и его молекулярный механизм активности еще предстоит выяснить.Целью настоящего исследования было изучение влияния амигдалина на способность к росту и молекулярные механизмы в трех линиях клеток РПЖ.

Культура клеток

Клеточные линии рака простаты человека PC3, DU-145 (устойчивые к кастрации) и LNCaP (чувствительные к кастрации) были получены из DSMZ (Брауншвейг, Германия). Опухолевые клетки выращивали и субкультивировали в RPMI 1640 (Gibco/Invitrogen; Карлсруэ, Германия). Среда содержала 10% сыворотки плода теленка (FCS), 2% буфера HEPES (1  М, pH  7,4), 2% глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина.

Лечение амигдалином

Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток (1–10  мг/мл) и

Анализ зависимости реакции от дозы

Воздействие амигдалина на опухолевые клетки PC3, DU-145 и LNCaP в течение 24  ч привело к зависимому от концентрации снижению числа опухолевых клеток, причем наиболее выраженные эффекты были очевидны в присутствии 10  мг/мл (рис. 1А, 24  -часовая инкубация). Тот же ответ наблюдался, когда опухолевые клетки хронически обрабатывались амигдалином в течение 2  недель (рис. 1А, 2-недельная инкубация). Тест исключения трипанового синего не выявил токсических эффектов на линии опухолевых клеток после воздействия  амигдалина в концентрации 10 мг/мл (данные не показаны). Поскольку

Обсуждение

Это исследование показывает, что лечение амигдалином значительно снижает скорость роста как кастрационно-чувствительных (LNCaP), так и кастрационно-устойчивых (PC3, DU-145) клеточных линий и ослабляет образование клонов во всех трех клеточных линиях без токсических эффектов. Эти результаты согласуются с отчетами, показывающими ингибирующее рост, антипролиферативное и проапоптотическое действие амигдалина на промиелоцитарный лейкоз [12], рак толстой кишки [13], рак шейки матки [14] и клетки рака мочевого пузыря [15]. В настоящее время

Заключение

Эти результаты указывают на заслуживающую внимания противоопухолевую активность природного соединения, амигдалина, как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-устойчивых клетках РПЖ. Дальнейшая проверка этих предварительных данных необходима in vitro и in vivo, чтобы выяснить, заслуживает ли амигдалин оценки в надлежащим образом спланированных будущих клинических испытаниях.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана « Фондом Бригитты и Норберта Мут » и « Vereinigung von Freunden und Förderern der Goethe-Universität ».

Амигдалин как химиопротекторное средство при совместном лечении с цисплатином

оригинал статьи: https://www.frontiersin.org/journals/pharmacology/articles/10.3389/fphar.2022.1013692/full

ОРИГИНАЛЬНАЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ статья

Фронт. Фармакол. , 20 сентября 2022 г.Секция Экспериментальная фармакология и открытие лекарствТом 13 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fphar.2022.1013692

Панайота Христодулу1,2 *Панайотис Буцикос1Кристиана М. Неофиту3Теодора-Кристина Кириаку1,3Мария-Иоанна Христодулу2Панайотис Папагеоргис3Анастасис Стефану1Иоаннис Патрикиос1

• 1 Медицинский факультет Европейского университета Кипра, Никосия, Кипр
• 2 Лаборатория иммунологии опухолей и биомаркеров, Центр фундаментальных и трансляционных исследований рака, Факультет наук о жизни, Европейский университет Кипра, Никосия, Кипр
• 3 Лаборатория микроокружения опухоли, метастазирования и экспериментальной терапии, Центр фундаментальных и трансляционных исследований рака, Факультет наук о жизни, Европейский университет Кипра, Никосия, Кипр

Амигдалин — это природный гликозид, используемый в традиционной китайской медицине, который, как известно, обладает противораковыми свойствами. Несмотря на то, что противораковые свойства амигдалина хорошо известны, его воздействие на нормальные клетки не было тщательно изучено. Целью настоящего исследования было изучение возможной химиопротекторной роли амигдалина против цитотоксических эффектов химиотерапии для нормальных клеток человека. В частности, он был протестирован в сочетании с сильным химиотерапевтическим препаратом цисплатином. Человеческая неканцерогенная эпителиальная клеточная линия MCF12F, клетки человеческих фибробластов, клетки человеческого рака молочной железы MCF7 и MDA-MB-231 были обработаны цисплатином в зависимости от дозы и времени в отсутствие или в присутствии амигдалина. Когда клетки MCF12F и фибробласты подвергались предварительной обработке амигдалином с последующей обработкой цисплатином (24 ч амигдалин + 24 ч цисплатин), жизнеспособность клеток увеличивалась (22%, p < 0,001), как показано с помощью анализа МТТ. Как подтверждается проточной цитометрией, комбинированное лечение было связано с уменьшением процента поздних апоптотических клеток по сравнению с монотерапией (кратность изменения снижения = 1,6 и 4,5 для 15 и 20 мкМ соответственно). Кроме того, экспрессия белков PUMA, p53, фосфо-p53 и Bax снижалась, когда использовалась комбинированная обработка по сравнению с одним цисплатином, в то время как проапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL демонстрировали повышенную тенденцию в присутствии амигдалина. Более того, уровни проапоптотических генов PUMA , p53 и мРНК BAX были значительно снижены (∼83%, ∼66% и ∼44% соответственно) по сравнению с одним цисплатином, в то время как уровни мРНК антиапоптотических генов BCl-2 и Bcl-XL были повышены (∼44,5% и ∼51% соответственно) по сравнению с одним цисплатином после 24 ч комбинированного лечения. Исследование анализа индекса комбинации (CI) показало, что амигдалин, возможно, можно рассматривать как антагонист цисплатина (2,2 и 2,3) для клеток MCF12F и фибробластов соответственно. Напротив, для клеток рака молочной железы MCF7 и MDA-MB-231 амигдалин и цисплатин показали синергический эффект (0,8 и 0,65) соответственно. Наши текущие результаты показывают, что амигдалин оказывает химиомодулирующее действие при совместном лечении с цисплатином и способен защищать нормальные клетки молочной железы, а также фибробласты во время химиотерапии, что указывает на сильную селективную химиопротекторную способность и может способствовать улучшению качества жизни онкологических больных.

Введение

Рак является второй по значимости причиной смерти в мире, после сердечно-сосудистых заболеваний ( Nagai and Kim, 2017 ). Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным видом рака среди женщин во всем мире и представляет собой серьезную проблему для общественного здравоохранения [Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), 2021]. Химиотерапия является наиболее эффективным и часто используемым методом лечения большинства злокачественных новообразований ( Huang et al., 2017 ). Несмотря на многочисленные достижения за последнее десятилетие в области адъювантной терапии РМЖ, остаются нерешенными многочисленные проблемы, включая неблагоприятные побочные эффекты, вызываемые химиотерапевтическими препаратами, такие как тошнота, выпадение волос, рвота, усталость и в тяжелых случаях даже смерть ( Waris and Ahsan, 2006 ; Ye et al., 2017 ). Управление по контролю за продуктами и лекарствами США одобрило в общей сложности 132 химиотерапевтических препарата, из которых 56, как сообщается, вызывают окислительный стресс ( Chen et al., 2018 ). Многие классы химиотерапевтических препаратов, такие как таксаны и производные платины, могут вызывать окислительный стресс ( Cauli, 2021 ).

Цис-диаммининдихлорплатина (II) (цисплатин) — неорганическое соединение, «алкилирующий агент», используемый в качестве основного лечебного препарата, способного уменьшать рост раковых клеток, против различных видов рака человека, включая рак молочной железы, яичек, яичников и легких ( Dasari and Tchounwou, 2014 ). Цисплатин образует внутри- и межцепочечные аддукты с ДНК и, таким образом, является мощным индуктором остановки клеточного цикла, приводящей к апоптозу для большинства типов раковых клеток. Сшивающие взаимодействия цисплатина с ДНК способствуют ингибированию репликации, транскрипции и других ядерных функций, которые могут останавливать пролиферацию раковых клеток и рост опухоли ( Zwelling et al., 1979 ; Dasari and Tchounwou, 2014 ). Эффективность цисплатина зависит от способности клеток либо восстанавливать повреждения ДНК, либо приступать к гибели ( Mirmalek et al., 2016 ). Таким образом, сигнальные пути, регулирующие апоптоз, играют ключевую роль в том, как клетки будут реагировать на цисплатин ( Истман, 1990 ).

Амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид) — это цианогенный диглюкозид, который естественным образом содержится в косточках многочисленных фруктов и растений семейства розоцветных, таких как Prunus armeniaca (абрикос) и Prunus persica (персик). Все больше доказательств подтверждают, что амигдалин (также известный как «лаэтрил») может действовать как противораковый агент, вызывая остановку клеточного цикла и апоптоз ( Guo et al., 2013 ; Makarevic et al., 2014 ; Lee and Moon, 2016 ; Saleem et al., 2018 ). Амигдалин проявляет синергический эффект в сочетании с другими соединениями, такими как синильная кислота (противоопухолевое вещество) и бензальдегид (обезболивающее соединение); вызывая гибель раковых клеток ( Song and Xu, 2014 ). Кроме того, in vitro сообщалось, что амигдалин связан с противораковой активностью в отношении клеток рака молочной железы, главным образом, посредством окислительного стресса; он способствует дифференциальному ингибированию пролиферации клеток MCF7 и T470 ( Abboud et al., 2019 ).

Амигдалин может быть расщеплен ферментом, известным как β -глюкозидаза, высвобождающим цианистый водород, бензальдегид и глюкозу. Бензальдегид является обезболивающим, который может быть преобразован в бензойную кислоту кислородом в нормальных/здоровых тканях. Цианистый водород может вызывать токсичность цианида и, следовательно, убивать раковые клетки ( Blaheta et al., 2016 ). С другой стороны, другой фермент, роданеза, который присутствует только в нормальных тканях, а не в раковых, по-видимому, обладает способностью детоксифицировать цианид и, следовательно, защищать нормальные ткани ( Newmark et al., 1981 ). Эти два вышеупомянутых фермента, вероятно, могут способствовать избирательной токсичности амигдалина, контролируя рост и метастазирование раковых клеток.

Теперь мы намерены изучить влияние амигдалина, цисплатина и их комбинированной терапии на жизнеспособность клеток с использованием как нормальных, так и раковых клеточных линий, а также оценить потенциальную химиопротекторную роль амигдалина.

Материалы и методы

Культура клеток

Амигдалин был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США) и растворен в воде (концентрат 1М). Концентрат цисплатина 1 мг/мл для приготовления раствора для инфузий был приобретен у Accord. Клеточные линии MCF12F, MCF7 и MDA-MB-231 были приобретены у American Type Culture Collection (ATCC, Роквилл, Мэриленд). Фибробласты, извлеченные из ткани поджелудочной железы, были любезно предоставлены Университетом Кипра. Клетки MCF12F и фибробласты культивировались в модифицированной среде Дульбекко с питательной смесью Ham's F-12 (DMEM/F12), содержащей 5% лошадиной сыворотки, обработанной Chelex, приобретенной Sigma-Aldrich, эпидермальный фактор роста (EGF, 10 мкг/500 мл), холерный токсин (50 мкг/500 мл), инсулин (5 мг/500 мл) и гидрокортизон (250 мкг/500 мл) вместе с 1% антибиотиков и антимикотиков. Клетки MCF7 и MDA-MB-231 культивировались в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотика, приобретенного Sigma-Aldrich. Клетки инкубировались при 37°C в увлажненной камере при 95% O2 / 5% CO2 . Bcl-2, фосфо-p53, p53, Bax, GAPDH, каспаза-9, антитела были приобретены в Cell Signalling Technology (Дэнверс, Массачусетс, США). β -Актин и каспаза-8 были приобретены в Santa Cruz Biotechnology Inc. Реагенты для культивирования клеток (DMEM, FBS, HS, антибиотик/противогрибковый препарат и трипсин) были приобретены в Gibco, Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США).

Анализ комбинированного индекса

Анализ индекса комбинации (CI) является самым простым способом оценки фармакологических взаимодействий препаратов и в нашем случае использовался для количественной оценки синергизма или антагонизма. Синергизм используется для описания улучшения ответа опухоли, тогда как антагонизм используется, когда эффект комбинации менее токсичен, чем результат индивидуальных эффектов.

Результаты анализа индекса комбинации основаны на теории Chou-Talalay ( Chou, 2010 ). CompuSyn — это компьютерная программа для количественной оценки синергизма и антагонизма в комбинациях лекарственных средств и определения значений IC50 и ED50. Когда этот конкретный анализ дает CI = 1, это означает, что реагирующие вещества имеют аддитивный эффект, CI < 1 означает, что реагирующие вещества имеют синергический эффект, а CI > 1 означает, что реагирующие вещества имеют антагонистический эффект ( таблица 1 и дополнительный материал 2 ) ( Chou, 2010 ).

ТАБЛИЦА 1

ТАБЛИЦА 1. Значения IC50 различных линий клеток.

МТТ-тест

Для оценки жизнеспособности клеток был проведен анализ пролиферации клеток с использованием МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромида, M2128 от Sigma-Aldrich] ( Gasparini et al., 2017 ). После трипсинизации и подсчета с помощью гемоцитометра клетки MCF12F и MCF7 были высеяны в 96-луночный планшет ( Green and Sambrook, 2019 ). После проверки адгезии (примерно через 18 ч после высевания) клетки инкубировали с 10 мМ амигдалина и через 24 ч добавляли 15 мкМ цисплатина еще на 24 ч. После обработки клеток 20 мкл красителя МТТ в течение 4 ч, а затем инкубации с 150 мкл ДМСО (диметилсульфоксид, D8418 от Sigma-Aldrich) в течение 15 мин. Поглощение при 595 нм измеряли с помощью микропланшетного ридера (ThermoFisher Scientific).

синтез кДНК

Общая РНК из каждой популяции клеток была выделена с помощью набора RNeasy Micro Kit (50), а концентрация, а также чистота были измерены с помощью поглощения в λ = 280 и 260 нм/280 нм соответственно. кДНК каждого образца синтезирована с помощью набора primeScript first strand cDNA Synthesis kit (Takara) для смеси 1 и 2. Смесь 1 инкубировали при 65°C в течение 10 мин, а затем во льду в течение 3 мин перед добавлением смеси 2 до конечного объема 20 мкл. Последним шагом была инкубация смесей при определенных температурах в машине RT-qPCR (Bio-Rad) ( Neophytou et al., 2019 ).

ОТ-ПЦР в реальном времени

Для измерения экспрессии мРНК была проведена ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) с использованием набора KAPA SYBR FAST qPCR (KK4610). Были использованы следующие праймеры: Bax, прямой: 5′-ACA​TGG​AGC​TGC​AGA​GGA​TG-3′, обратный: 5′-CCA​GTT​GAA​GTT​GCC​GTC​AG-3′; p53, прямой: 5′-CCT​CAG​CAT​CTT​ATC​CGA​GTG​G-3′, обратный: 5′-TGG​ATG​GTG​GTA​CAG​TCA​GAG​C-3′; PUMA, прямой: 5′-ACG​ACC​TCA​ACG​CAC​AGT​ACG​A-3′, обратный: 5′-GTA​AGG​GCA​GGA​GTC​CCA​TGA​T-3′; Bcl-2, прямой: 5′-GGA​TAA​CGG​AGG​CTG​GGA​TG-3′, обратный: 5′-GGC​CAA​ACT​GAG​CAG​AGT​CT-3′; Bcl-xL, прямой: 5′-AGA​GCC​TTG​GAT​CCA​GGA​GA-3′, обратный: 5′-TCA​GGA​ACC​AGC​GGT​TGA​AG-3′; GADPH, прямой: 5′-GTC​TCC​TCT​GAC​TTC​AAC​AGC​G-3′, обратный: 5′-ACC​ACC​CTG​TTG​CTG​TAG​CCA​A-3′. GADPH использовали в качестве гена домашнего хозяйства. В конце реакции регистрировали значения Ct, и среднее значение трехкратных повторов использовали для расчета кратности изменения экспрессии гена с использованием метода 2[-Delta Delta C(T)] ( Livak and Schmittgen, 2001 ), как описано ранее ( Papageorgis et al., 2010 ). Для оценки эффекта лечения использовали данные по крайней мере трех независимых биологических повторов.

Извлечение белка

Среду удаляли из 6-луночного планшета и добавляли 1 мл PBS для промывки лунок, а затем аспирировали. После этого добавляли 150 мкл RIPA для лизиса клеток. Гомогенизированные образцы переносили в пробирки Eppendorf на льду на 30 мин с частым встряхиванием. Образцы центрифугировали при 10 000 об/мин/10 мин/4°C ( Ngoka, 2008 ). Образцы хранили при температуре –80 до дальнейшего использования ( Дополнительные материалы 1 и 3).

вестерн-блоттинг

Для определения уровня белка мы провели анализ вестерн-блоттинга. Смеси белков инкубировали при 98°C в течение 5 минут, а затем переносили на мембрану PVDF и блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в первичном антителе в течение ночи при 4°C, а затем добавляли вторичное антитело в течение 60 минут при комнатной температуре. MCF12F обрабатывали цисплатином и амигдалином по отдельности или в комбинации в течение 48 часов. Белки экстрагировали и разделяли с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и зондировали с помощью антител против Bcl-2, фосфо-p53, p53, Bax, PUMA, PARP-1 и каспазы-9. Bcl-2 (CST 15071, 1:1000), PARP-1 (CST 9542, 1:1000), Bax (CST 2772, 1:1000), каспаза-9 (CTS 9502, 1:1000), фосфо-p53 (CST 9286 (Ser15), 1:1000), p53 (CST 9282, 1:1000), PUMA (CST 12450, 1:1000) были приобретены для Cell Signalling Technology (Дэнверс, Массачусетс, США), а Bcl-2 (sc-783, 1:1000), GAPDH (sc-25778, 1:1000) были приобретены у Santa Cruz Biotechnology Inc. Мы визуализировали полосы белков с использованием субстрата вестерн-блоттинга с улучшенной хемилюминесценцией (ECL) (Thermo Fisher Scientific) и машины Chemidoc от Biorad. Значения интенсивности из денситометрического анализа вестерн-блотов были нормализованы относительно GAPDH или β -актина с использованием программного обеспечения для анализа ImageJ. Значения интенсивности были выражены как кратное изменение по сравнению с контролем ( Ngoka, 2008 ).

Оценка апоптоза/некроза методом проточной цитометрии

Исследование индукции апоптоза/некроза оценивалось с помощью проточного цитометрического анализа при двойном окрашивании Annexin-V-FITC/пропидиум йодидом (PI). Клетки высевали в концентрации 1 × 10 5 клеток на лунку в 6-луночные планшеты для культивирования тканей и обрабатывали цисплатином (15 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ) и/или амигдалином (10 мМ), как указано. Клетки, обработанные только цисплатином, использовали в качестве положительного контроля, а необработанные клетки — в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали и окрашивали с помощью набора Annexin V/Dead Cell Apoptosis (Life Technologies, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Апоптоз и некроз клеток анализировали с помощью проточного цитометра Attune NxT (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) и программного обеспечения FlowJo v10 (BD Biosciences, США) ( Steensma et al., 2003 ).

Статистический анализ

Все результаты были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка между самой низкой и самой высокой точками измерения. Непарные t -тесты были применены для исследования возможных различий в непрерывных переменных для двух групп. p -значения представлены как двусторонние с доверительными интервалами 95%. Статистический тест и анализ были проведены с использованием программного обеспечения Prism версии 5.0 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США). Для взаимодействия лекарств использовался метод Chou-Talalay (индекс комбинации) для оценки эффекта комбинированного лечения на основе данных о концентрации-эффекте ( Chou, 2010 ). Этот метод для комбинации лекарств основан на уравнении медианы-эффекта, которое исходит из принципа закона действия масс, который связывает один объект и несколько объектов, а также динамику первого и более высокого порядка ( Chou, 2011 ). Для результатов программного обеспечения уравнения индекса комбинации используется программа CompuSyn ( Chou, 2010 ).

Результаты

Оценка жизнеспособности нормальных и раковых клеток молочной железы после однократного лечения цисплатином или амигдалином

Чтобы определить влияние лечения амигдалином и цисплатином на нормальные (MCF12F) и раковые (MCF7, MDA-MB-231) клетки молочной железы, а также на фибробласты (FBS), мы использовали анализ MTT для оценки жизнеспособности клеток в зависимости от дозы в различные моменты времени. Во-первых, влияние амигдалина и цисплатина оценивалось по отдельности. Когда была указана идеальная концентрация (цисплатин 15 мкМ, амигдалин 10 мМ) для обоих видов лечения, была проведена комбинированная терапия с использованием цисплатина и амигдалина вместе для оценки разницы в количестве клеток.

Клетки MCF12F, MCF7, MDA-MB-231 и FBS обрабатывали 1, 10, 15, 20 и 30 мкМ цисплатина, а жизнеспособность клеток оценивали через 24, 48 и 72 ч ( рисунок 1A ). Цисплатин повлиял на все клеточные линии, уменьшив количество жизнеспособных клеток. Клетки рака молочной железы были поражены цисплатином больше, чем нормальные клетки молочной железы, а также фибробласты. Однако обе клеточные линии были значительно затронуты цисплатином.

РИСУНОК 1

РИСУНОК 1. Эффект цисплатина и амигдалина в линиях клеток молочной железы, а также в фибробластах. (A) Анализ МТТ использовался для оценки цитотоксичности (% жизнеспособности клеток) возрастающих концентраций цисплатина (1, 10, 15, 20 и 30 мкМ) в i) MCF-12F, ii) FBS, iii) MCF-7 и iv) MDA-MB-231 в течение 24, 48, 72 ч и (B) возрастающих концентраций амигдалина (10, 25, 50, 75 и 100 мМ) в i) MCF-12F, ii) FBS, iii) MCF-7 и iv) MDA-MB-231 в течение 24, 48, 72 ч лечения. Звездочки указывают на силу статистической значимости между столбцами [* (0,05) < ** (0,01) < ***(0,001)].

Кроме того, клетки MCF12F, MCF7, MDA-MB-231 и FBS обрабатывали 10, 25, 50, 75 и 100 мМ амигдалина в течение 24, 48 и 72 ч ( Рисунок 1B ). Во всех клеточных линиях количество жизнеспособных клеток уменьшалось с увеличением концентрации амигдалина. Однако при использовании 10 мМ обработки амигдалином существенных различий не наблюдалось, поскольку уровень жизнеспособности клеток составлял >90% во всех временных точках. IC 50 цисплатина был определен равным 23,8 мкМ в MCF12F и 21,7 мкМ в MCF7, тогда как IC 50 амигдалина был равен 85,4 мМ в MCF12F и 64,5 мМ в MCF7 после 24, 48 и 72 ч обработки соответственно ( таблица 1 ).

Комбинированное лечение демонстрирует химиопротекторный эффект в нормальных клетках молочной железы

Комбинированное лечение применялось к клеткам MCF12F с использованием 10 мМ амигдалина и 1, 10, 15, 20 и 30 мкМ цисплатина. Сначала клетки обрабатывали амигдалином в течение 24 ч, а затем добавляли цисплатин на 24, 48 и 72 ч ( рисунки 2Ai–iii ). Затем мы предварительно обработали клетки 10 мМ амигдалином в течение 24 ч и наиболее подходящей концентрацией цисплатина, 15 мкМ в течение 24, 48 и 72 ч. Концентрация цисплатина основывалась на жизнеспособности клеток, которая составляла >50% при лечении одним агентом. Результаты показывают, что комбинированное лечение повышает жизнеспособность клеток во всех временных точках по сравнению с лечением одним цисплатином ( рисунок 2B ). Наиболее значительное увеличение жизнеспособности клеток ( ∼ 22%) наблюдалось через 48 ч при комбинированном лечении (24 ч амигдалин + 24 ч цисплатин). Анализ индекса комбинации, указывающий на синергизм или антагонизм амигдалина с цисплатином, представлен в таблице 1 .

РИСУНОК 2

РИСУНОК 2. Эффект цисплатина отдельно и в сочетании с амигдалином в нормальных клетках молочной железы, MCF12F. Клетки были предварительно обработаны 10 мМ амигдалином, а затем цисплатин (1, 10, 15, 20 и 30 мкМ) был добавлен в течение (A) i) 24 ч, ii) 48 ч и iii) 72 ч. Анализ МТТ был применен для измерения жизнеспособности клеток в этих условиях. (B) Амигдалин (10 мМ) снижает цитотоксичность цисплатина (15 мкМ) и увеличивает выживаемость во всех временных точках с пиком на 48 ч общей обработки. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM трех различных повторов и являются репрезентативными по крайней мере для трех различных экспериментов [* (0,05) < ** (0,01) < ***(0,001)].

Оценка апоптоза, опосредованного комбинированным лечением

Окрашивание аннексином V/PI использовалось для оценки апоптотического эффекта возрастающих концентраций цисплатина 15 и 20 мкМ с 10 мМ амигдалином или без него в течение 48 часов лечения.

Как показано на рисунке 3 , в клетках MCF12F процент поздних апоптотических клеток (двойной положительный результат по аннексину-V/PI) после 48-часовой комбинированной обработки (% среднего ± SE; цисплатин 15 мкМ + 10 мМ амигдалин: 5,8 ± 1,2 или цисплатин 20 мкМ + 10 мМ амигдалин: 4,3 ± 0,6) был значительно ниже по сравнению с обработкой цисплатином (15 мкМ: 9,5 ± 1,8; кратность изменения снижения = 1,6 или 20 мкМ: 19,3 ± 2,4; кратность изменения снижения = 4,5). Более того, % живых клеток при комбинированном лечении был увеличен (цисплатин 15 мкМ + 10 мМ амигдалин: 90,1 ± 1,2 или цисплатин 20 мкМ + 10 мМ амигдалин: 90,2 ± 0,5) по сравнению с применением только цисплатина (15 мкМ: 86,8 ± 0,5; p = 0,05 или 20 мкМ: 74,4 ± 1,9; p = 0,03 соответственно). Процент живых, ранних, поздних апоптотических и некротических клеток для всех условий лечения представлен на рисунке 3B . Была использована концентрация 30 мкМ, поскольку было обнаружено, что это самая высокая концентрация, способная убить более 50% обработанных клеток. Кроме того, 30 мкМ использовали в качестве положительного контроля для остальных экспериментов.

РИСУНОК 3

РИСУНОК 3. Влияние амигдалина на апоптоз, вызванный цисплатином в клетках MCF-12F. (A) Окрашивание аннексином V/PI использовалось для оценки апоптотического эффекта (% по сравнению с контролем) 15 и 20 мкМ цисплатина с 10 мМ амигдалином или без него в течение 48 ч. Приведены диаграммы зебра % живых (Q4), ранних (Q3), поздних апоптотических (Q2) и некротических клеток (Q1) при каждой стимуляции. (B) Сложенные столбчатые диаграммы, изображающие изменения в вышеупомянутых популяциях. Показаны данные трех независимых экспериментов.

Амигдалин и цисплатин регулируют белки, связанные с апоптозом

Комбинация цисплатина и амигдалина снизила уровни проапоптотических BAX, фосфо-p53, p53 и PUMA, медиаторов апоптотических ответов ( Рисунок 4 ). Напротив, уровни антиапоптотического BCl-2, известного ингибитора процесса проницаемости митохондриальной наружной мембраны (MOMP), были повышены ( Рисунок 4A ). PARP-1, фермент репарации ДНК, который расщепляется во время апоптоза, не представил свою расщепленную форму во время комбинированного лечения ( Рисунок 4B ). Расщепленная каспаза-9, мишень проапоптотических белков, высвобождаемых из митохондрий, была обнаружена в клетках, обработанных цисплатином, но не в группе комбинированного лечения ( Рисунок 4C ). Расщепленная каспаза-9 является активной формой, которая расщепляется от прокаспазы-9 (полной длины), показывая инициацию апоптотического пути. Эти результаты показывают, что комбинированное лечение с амигдалином подавляло апоптоз по сравнению с лечением только цисплатином.

РИСУНОК 4

РИСУНОК 4. Влияние амигдалина и цисплатина на уровни и локализацию апоптотических белков в нормальных клетках. (A) Сочетание 10 мМ амигдалина и 15 мкМ цисплатина снизило уровни белков Bax, phosho-p53, p53, PUMA и увеличило уровни белков Bcl-2 после 48 ч обработки в MCF12F. (B) Показана экспрессия расщепленного PARP при обработке цисплатином. Цисплатин сам по себе вызывал расщепление каспазы-9, тогда как (C) амигдалин (10 мМ) снижал этот эффект. Значения интенсивности из денситометрического анализа вестерн-блотов показаны в верхней части каждого блота и были нормализованы по GAPDH с помощью программного обеспечения ImageJ. Результаты являются репрезентативными по крайней мере для трех независимых экспериментов.

Влияние амигдалина и цисплатина на экспрессию мРНК про- и антиапоптотических генов

После комбинированной обработки в течение 48 ч на клетках MCF12F уровни мРНК PUMA , p53 и Bax были значительно снижены на ∼83%, ∼66% и ∼44% соответственно по сравнению с обработкой только цисплатином. Напротив, уровни мРНК Bcl-2 и Bcl-xL были повышены на ∼44,5% и ∼51% соответственно при комбинированной обработке по сравнению с обработкой только цисплатином. Кроме того, уровни мРНК соотношения BAX/Bcl-2 были снижены на ∼81% при комбинированной обработке по сравнению с обработкой только цисплатином ( Рисунок 5 ). Более того, комбинированная обработка не показала никакого химиопротекторного эффекта на основе уровней экспрессии мРНК про- и антиапоптотических генов в клетках MCF7 и MDA-MB-231. ( Рисунок 5 ). Амигдалин сам по себе показал увеличение мРНК p53 в клетках MCF12F ( Рисунок 5 ), однако на уровне белка p53 ( Рисунок 4 ) он остался неизменным, и это может означать, что уровень мРНК не всегда коррелирует с уровнем белка. Аналогично, амигдалин не способствовал гибели клеток, как было оценено с помощью проточной цитометрии в клетках MCF12F ( Рисунок 3 ).

РИСУНОК 5

РИСУНОК 5. Влияние амигдалина и цисплатина на экспрессию мРНК проапоптотических и антиапоптотических генов. В MCF12F экспрессия мРНК проапоптотических генов PUMA, p53 и Bax , а также соотношение BAX/Bcl-2 были снижены при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), тогда как экспрессия мРНК антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-xL была повышена при комбинированном лечении. В MCF7 экспрессия мРНК проапоптотических генов PUMA, p53 и Bax , а также соотношение BAX/Bcl-2 были увеличены при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), в то время как экспрессия мРНК антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-xL была снижена при комбинированном лечении. В MDA-MB-231 экспрессия мРНК проапоптотического гена p 53 была увеличена при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), в то время как экспрессия мРНК антиапоптотического гена Bcl-2 была снижена. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM трех различных повторов и являются репрезентативными по крайней мере для трех различных экспериментов, ∗ значение p < 0,05, ∗∗ значение p < 0,01, ∗∗∗ значение p < 0,001.

Обсуждение

Наиболее широко используемыми методами лечения рака являются хирургия, радиотерапия и химиотерапия, однако их эффективный терапевтический результат остается ограниченным из-за их неблагоприятных побочных эффектов, которые часто могут быть серьезными, что подчеркивает необходимость альтернативных или адъювантных методов лечения. Следовательно, стратегии, включающие фитохимические вещества, могут помочь в снижении этих побочных эффектов и улучшении качества жизни. Химиопротекторное лечение является многообещающим подходом, направленным на смягчение химиотерапевтических побочных эффектов в организме ( Maier et al., 2010 ). Фитохимические вещества, по-видимому, участвуют в профилактике и лечении рака из-за их относительно безопасного профиля цитотоксичности ( Duthie, 2007 ; Jagtap et al., 2009 ). В последнее десятилетие исследования направлены на выявление потенциала комбинированных стратегий с использованием одного или нескольких натуральных продуктов вместе с эффективным химиотерапевтическим средством для улучшения традиционной терапии рака ( Krzyzanowska et al., 2010 ; Kaminski et al., 2011 ; Saldanha and Tollefsbol, 2012 ).

В этом исследовании мы исследовали химиопротекторное и терапевтическое действие амигдалина в сочетании с обычным химиотерапевтическим средством цисплатином. Чтобы определить дифференциальную цитотоксичность по отношению к нормальным и раковым клеткам молочной железы, а также к фибробластам, эффект различных концентраций цисплатина и амигдалина, по отдельности, оценивался на клеточных линиях MCF12F, MCF7, MDA-MB-231, а также на фибробластах. Цисплатин и амигдалин снижали жизнеспособность клеток всех клеточных линий в зависимости от дозы и времени. Важно отметить, что обработка амигдалином в концентрации 10 мМ как нормальных, так и раковых клеток не показала статистически значимой разницы в жизнеспособности клеток, и этот показатель составлял более 90% во всех временных точках. Это подтверждает предыдущие выводы, указывающие на то, что многие фитохимические вещества, включая амигдалин, куркумин и сульфорафан, малотоксичны для нераковых, нормальных клеток ( Ravindran et al., 2009 ; Sharma et al., 2011 ).

На основании результатов IC50 концентрация амигдалина была установлена ​​на уровне 10 мМ (не повлияла на жизнеспособность клеток ни в одной из клеточных линий в течение 24 ч). Концентрация цисплатина была установлена ​​на уровне 15 мкМ для всех клеточных линий, чтобы иметь более 50% жизнеспособности клеток (для лучшей оценки эффекта комбинированного лечения в нормальных клетках).

Цисплатин является хорошо известным химиотерапевтическим препаратом для лечения широкого спектра злокачественных новообразований человека, но он связан с серьезными побочными эффектами и неспецифической цитотоксичностью, которая приводит к повреждению нормальных клеток и развитию лекарственной устойчивости ( McWhinney et al., 2009 ; Gopal et al., 2012 ). Предыдущие исследования продемонстрировали цитотоксический синергизм цисплатина и других агентов, таких как пчелиный яд, производное тиазоло[5,4-b] хинолина D3CLP и препарат AT-101 по отношению к различным линиям раковых клеток ( Alizadehnohi et al., 2012 ; Gonzalez-Sanchez et al., 2012 ; Mazumder et al., 2012 ; Karaca et al., 2013 ). Другое исследование продемонстрировало синергетическую активность фитохимического эпигаллокатехин галлата (EGCG) в сочетании с цисплатином и опухолеактивными соединениями палладия при раке яичников, что позволяет предположить, что комбинации платиновых препаратов, включая цисплатин и разработанные транс-палладии вместе с выбранными фитохимическими веществами, могут опосредовать преодоление лекарственной устойчивости в будущем. В нашем исследовании мы использовали комбинированную обработку 15 мкМ цисплатина и 10 мМ амигдалина как в нормальных клетках MCF12F, так и в FBS, чтобы дополнительно оценить безопасность амигдалина на нормальных клетках, а также его цитопротекторные способности в присутствии противораковых методов лечения. Также изучалась способность амигдалина сенсибилизировать эффекты, вызывающие смерть, в раковых клетках.

Проточная цитометрия подтвердила химиопротекторный эффект амигдалина, снижающий процент поздних апоптотических клеток до 4,5 раз ( рисунок 3 ). Как показано, амигдалин способен снижать цитотоксическое действие цисплатина на нормальные клетки молочной железы. Это подтверждается индексом комбинации (CI), который показал антагонизм между амигдалином и цисплатином при использовании в нормальных клетках и синергизм против раковых клеток.

Амигдалин приобрел широкую популярность благодаря своей противораковой активности и другим полезным эффектам на различные системы организма, таким как подавление фиброза почек, противоастматическое действие и улучшение иммунной функции ( Syrigos et al., 1998 ). Однако химиопротекторный потенциал амигдалина на нормальных эпителиальных клетках молочной железы ранее не исследовался.

Как показали наши результаты ( Рисунок 5 ), уровень мРНК проапоптотических PUMA, p53, BAX был значительно снижен, в то время как мРНК антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-xL были повышены после комбинированного лечения по сравнению с лечением только цисплатином в нормальных клетках. Это конкретное наблюдение и открытие подтверждают основное обоснование механизма действия через апоптотический путь. Напротив, уровень мРНК проапоптотических PUMA, p53, BAX был повышен, в то время как мРНК антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-xL были снижены после комбинированного лечения по сравнению с лечением только цисплатином в раковых клетках. Результаты ОТ-ПЦР в клетках рака молочной железы (MCF7 и MDA-MB-231) предполагают возможный синергический эффект амигдалина с цисплатином и подчеркивают его противораковую активность. Из предварительных отчетов известно, что возможным механизмом этого токсического эффекта является наличие β -глюкозидазы в раковых клетках, но не в нормальных клетках, которая способна расщеплять и высвобождать цианит из основной молекулы амигдалина. С другой стороны, нормальные клетки содержат фермент роданезу, который не может приводить к расщеплению и высвобождению цианида ( Newmark et al., 1981 ).

Похожая картина про- и антиапоптотической экспрессии также наблюдалась на уровнях белков. Экспрессия белков PUMA, p53, фосфо-p53 и Bax ( Рисунок 4 ) также снижалась при использовании комбинированного лечения по сравнению с одним цисплатином. С другой стороны, проапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL демонстрировали повышенную тенденцию в присутствии амигдалина. Кроме того, при использовании комбинированного лечения были получены сниженные уровни расщепленной формы каспазы 9 и PARP, что указывает на ингибирование апоптотического пути. Мы поясняем, что даже несмотря на то, что можно наблюдать некоторую непоследовательность в отношении результата уровня GAPDH, учитывая полученный результат во всех других белках, запущенных для эксперимента по сравнению с GAPDH, непоследовательность нельзя считать проблемной. Более того, разница в расщеплении каспазы-9 между дорожкой 1 (контроль) и дорожкой 3 (15 мкМ цисплатин) очень слабая, но это обычное явление в ситуациях, когда наблюдается повышенный апоптотический результат.

Эти результаты могут указывать на то, что комбинированное лечение способно подавлять апоптоз по сравнению с лечением цисплатином.

Учитывая предыдущие изменения как в экспрессии мРНК, так и в экспрессии белка, мы можем сделать вывод, что комбинированное лечение цисплатином и амигдалином, возможно, может способствовать нормальному выживанию клеток выборочно, ингибируя апоптоз только в нормальных клетках. Эти наблюдения и выводы подтверждают нашу первичную и основную гипотезу и совместимы с другими исследованиями, которые указали на аналогичный механизм действия амигдалина в различных клеточных линиях или в моделях животных ( Kwon et al., 2003 ; Chang et al., 2006 ; Chen et al., 2013 ; Makarevic et al., 2014 ; Su et al., 2014 ).

В раковых клетках мы показали, что цисплатин способствует активации p53, что приводит к апоптозу посредством снижения уровня антиапоптотического белка Bcl-2 и повышения уровня проапоптотического белка Bax. Про- и антиапоптотические белки семейства Bcl-2 активируют процесс MOMP, который, в свою очередь, активирует апоптоз. MOMP приводит к высвобождению цитохрома c из митохондрий в цитозоль, вызывая активацию каспазы и последующий апоптоз ( Рисунок 6 ). С другой стороны, амигдалин оказывает цитопротекторное действие на нераковые клетки, способствуя эффективной экспрессии антиапоптотического гена.

РИСУНОК 6

РИСУНОК 6. Потенциальный механизм действия амигдалина и цисплатина в нормальных клетках молочной железы против рака молочной железы. При лечении цисплатином индуцируется повреждение ДНК с последующей активацией фосфо-p53, приводящей к апоптозу. Фосфо-p53 может индуцировать апоптоз посредством снижения регуляции Bcl-2 и повышения регуляции Bax, что приводит к MOMP и активации каспазы-9.

Рак груди известен как одно из самых смертельных злокачественных новообразований среди женщин во всем мире и является серьезной проблемой общественного здравоохранения. Более того, известно, что существующие методы химиотерапии рака связаны с серьезными побочными эффектами, влияющими на качество жизни пациентов и продолжительность жизни. Таким образом, существует острая необходимость в новых терапевтических подходах. Это делает наши нынешние результаты важными для открытия новых горизонтов и направлений в области лечения рака.

Это исследование может быть расширено в будущем за счет использования экспериментов in vivo с использованием животных для оценки эффективности амигдалина при лечении рака. Предыдущие исследования показали, что они лечили мышей амигдалином с использованием 200, 100 и 50 мг/кг веса тела ( Albogami et al., 2020 ). Это правда, что используемые дозы концентрации (10–100 мМ) можно считать очень высокими для будущих исследований на животных. Тем не менее, тот факт, что они не были токсичными, дает нам уверенность в том, что они не будут способствовать возникновению побочных или токсических эффектов при использовании на животных. Кроме того, мы уточняем, что будут проведены новые исследования по оптимизации дозы, включая исследования ФК для обнаружения амигдалина в плазме перед использованием на животных.

Понимание цитопротекторного действия амигдалина во время химиотерапии может позволить разработать новые методы лечения, позволяющие снизить неблагоприятные побочные эффекты и, следовательно, улучшить качество и продолжительность жизни онкологических больных.

Заявление о доступности данных

Исходные данные, подтверждающие выводы настоящей статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

Вклад автора

Задумал, разработал, контролировал и предоставил финансирование для исследования, IP, AS и PC; Обзор литературы и эксперименты, PC и PB; Проанализировал данные, PC, M-IC и CN; Сгенерировал и предоставил реагенты/материалы/инструменты анализа, CN и PP; Статистический анализ, PC и CN; Составил черновик рукописи: PC и IP; Отредактировал рукопись: AS и PP. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить благодарность доценту Панайотису Политису за его любезную поддержку и предоставление использованных учебников.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все заявления, высказанные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют заявления их аффилированных организаций или заявления издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не гарантируется и не одобряется издателем.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.1013692/full#supplementary-material

Совместное введение амигдалина и дезоксиниваленола нарушило регуляторные белки, связанные с пролиферацией клеток свиных яичников in vitro

Оригинал статьи: https://www.researchgate.net/publication/318430770_Co-administration_of_amygdalin_and_deoxynivalenol_disrupted_regulatory_proteins_linked_to_proliferation_of_porcine_ovarian_cells_in_vitro

Дезоксиниваленол (ДОН) представляет собой один из наиболее распространенных трихотеценовых микотоксинов, вырабатываемых видами Fusarium, вызывая экономические и медицинские последствия. С другой стороны, было показано, что амигдалин обладает как профилактическими, так и лечебными свойствами, поэтому он использовался в качестве традиционного лекарства из-за его широкого спектра медицинских преимуществ, включая лечение или профилактику рака, снятие лихорадки, подавление кашля и утоление жажды. Целью этого исследования in vitro была оценка потенциального воздействия натурального продукта амигдалина в сочетании с микотоксином дезоксиниваленолом (ДОН) на ключевые регуляторы пролиферации клеток и апоптоза в гранулезных клетках яичников свиней. Клетки гранулезы яичников инкубировали в течение 24 ч с амигдалином (1, 10, 100, 1000, 10 000 мкг.мл⁻¹) в сочетании с дезоксиниваленолом (1 мкг.мл⁻¹), в то время как контрольная группа оставалась необработанной. Наличие пролиферативных (циклин B1, PCNA) и апоптотических маркеров (каспаза-3) в клетках гранулезы яичников свиней после обработки амигдалином (1, 10, 100, 1000, 10 000 мкг.мл⁻¹) в сочетании с дезоксиниваленолом (1 мкг.мл⁻¹) было обнаружено с помощью иммуноцитохимии. Присутствие пролиферативных (циклин B1, PCNA) и апоптотических маркеров (каспаза-3) в гранулезных клетках яичников свиней было обнаружено с помощью иммуноцитохимии. Совместное введение амигдалина и ДОН значительно (p < 0,05) увеличило количество гранулезных клеток, содержащих циклин B1 и PCNA во всех протестированных концентрациях по сравнению с контролем. Однако процент гранулезных клеток, содержащих основной апоптотический маркер каспазу-3, не отличался после совместного введения амигдалина и ДОН. Подводя итог, результаты этого исследования in vitro указывают на то, что совместное воздействие амигдалина и дезоксиниваленола может стимулировать пептиды, связанные с пролиферацией, в гранулезных клетках яичников свиней и, таким образом, изменять пролиферацию клеток и нормальное развитие фолликулов.

Амигдалин блокирует рост клеток рака мочевого пузыря in vitro, уменьшая циклин А и cdk2

Оригинал статьи:

https://neue-krebstherapie.com/wp-content/uploads/2015/03/Amygdalin_PlosOne_Wachstum_Blase.pdf

Аннотация

Амигдалин, природное соединение, использовалось многими онкологическими больными в качестве альтернативного подхода к лечению их болезни. Однако, действительно ли это вещество оказывает противоопухолевое действие, так и не было установлено. Было начато исследование in vitro для изучения влияния амигдалина (1,25-10 мг/мл) на рост панели линий клеток рака мочевого пузыря (UMUC-3, RT112 и TCCSUP). Были исследованы рост опухоли, пролиферация, клональный рост и прогрессирование клеточного цикла. Были исследованы белки, регулирующие клеточный цикл cdk1, cdk2, cdk4, циклин A, циклин B, циклин D1, p19, p27, а также сигналы, связанные с мишенью рапамицина млекопитающих (mTOR), phosphoAkt, phosphoRaptor и phosphoRictor. Амигдалин дозозависимо снижал рост и пролиферацию во всех трех линиях клеток рака мочевого пузыря, что отражалось в значительной задержке прогрессирования клеточного цикла и остановке G0/G1. Молекулярная оценка выявила снижение phosphoAkt, phosphoRictor и потерю компонентов Cdk и циклина. Поскольку наиболее выдающиеся эффекты амигдалина наблюдались на оси cdk2-циклин A, были проведены исследования по снижению siRNA, выявившие положительную корреляцию между уровнем экспрессии cdk2/циклин A и ростом опухоли. Таким образом, амигдалин может блокировать рост опухоли путем снижения модуляции cdk2 и циклина A. Для оценки практической ценности амигдалина как противоопухолевого препарата необходимо провести исследование in vivo.

Долгосрочная стабилизация метастатической меланомы с помощью дихлорацетата натрия

Акбар Хан, Дуг Эндрюс, Джилл Шейнхаус, Аннеке С. Блэкберн

Акбар Хан, Дуглас Эндрюс, Medicor Cancer Centres Inc., Торонто, Онтарио M2N 6N4, Канада

Джилл Шейнхаус, Insight Naturopathic Clinic, Торонто, ON M4P 1N9, Канада

Аннеке С. Блэкберн, Школа медицинских исследований Джона Кертина, Австралийский национальный университет, Канберра, ACT 2601, Австралия 

Вклад авторов: Хан А. лечил пациента и написал большую часть отчета о случае; Эндрюс Д. помогал в разработке протокола натурального лечения для снижения побочных эффектов DCA и написал часть отчета о случае; Шейнхаус Дж. лечил пациента с помощью натуральной терапии; Блэкберн А.С. интерпретировал отчет о случае в контексте литературы по исследованиям DCA in vitro и in vivo, написал части введения и обсуждения, а также просмотрел рукопись в целом.

Заявление об информированном согласии: Пациентка, описанная в данной рукописи, дала согласие на публикацию своего случая анонимно. 

Заявление о конфликте интересов: Один из авторов (Хан) проводит терапию дихлорацетатом для онкологических больных через онкологические центры Medicor Cancer Centres за плату и без получения прибыли. Клиника принадлежит члену семьи этого автора. Другим авторам нечего раскрывать.

Открытый доступ: эта статья является статьей открытого доступа, которая была выбрана внутренним редактором и полностью проверена внешними рецензентами. Она распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), которая позволяет другим распространять, перерабатывать, адаптировать, строить на основе этой работы некоммерческие работы и лицензировать свои производные работы на других условиях, при условии, что оригинальная работа должным образом цитируется и использование является некоммерческим. См.: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Источник рукописи: приглашенная рукопись

Адрес для корреспонденции: Акбар Хан, доктор медицины, медицинский директор, 
Medicor Cancer Centres Inc., 4576 Yonge St., Suite 301, Toronto, 
ON M2N 6N4, Canada. akhan@medicorcancer.com
Телефон: +1-416-2270037
Факс: +1-416-2271915

  Получено:  30 января 2017 г.
  Начало рецензирования:  12 февраля 2017 г.
  Первое решение:  28 марта 2017 г.
  Исправлено:  5 мая 2017 г.
  Принято:  30 мая 2017 г.
  Статья в печати:  31 мая 2017 г.
  Опубликовано онлайн:  10 августа 2017 г.

Абстрактный

Дихлорацетат натрия (DCA) изучается как метаболическая терапия рака с 2007 года на основе публикации Bonnet et al, демонстрирующей, что DCA может вызывать апоптоз (запрограммированную гибель клеток) в клетках рака молочной железы, легких и мозга человека. Классически реакция рака на медикаментозную терапию в исследованиях на людях измеряется с помощью определений Критериев оценки ответа для солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации, однако стабилизация заболевания также является полезным клиническим результатом. Было показано, что DCA может функционировать как цитостатический агент in vitro и in vivo, не вызывая апоптоза. Представлен случай 32-летнего мужчины, у которого терапия DCA без сопутствующей традиционной терапии привела к регрессии и стабилизации рецидивирующей метастатической меланомы в течение более 4 лет с незначительными побочными эффектами. Этот случай демонстрирует, что DCA можно использовать для уменьшения объема заболевания и поддержания долгосрочной стабильности у пациентов с запущенной меланомой.

Ключевые слова: Дихлорацетат; Рак; BRAF; Меланома; Цитостатики

© Автор(ы) 2017. Опубликовано Baishideng Publishing Group Inc. Все права защищены.

Основная подсказка: Дихлорацетат натрия (DCA) изучается как метаболическая терапия рака с 2007 года. Было показано, что терапия DCA может привести к классическому ответу, который измеряется уменьшением или исчезновением опухолей при визуализации. Однако DCA может также остановить рост раковых клеток, не вызывая апоптоза (цитостатический эффект). Это может привести к долгосрочной стабилизации метастатического рака. Мы представляем случай пероральной терапии DCA, которая привела к уменьшению и стабилизации метастатической меланомы у 32-летнего мужчины в течение более 4 лет, с небольшими побочными эффектами.

Хан А., Эндрюс Д., Шейнхаус Дж., Блэкберн А.К. Долгосрочная стабилизация метастатической меланомы с помощью дихлорацетата натрия.
World J Clin Oncol 2017; 8(4): 371-377

Доступно по адресу: URL: http://www.wjgnet.com/2218-4333/full/v8/i4/371.htm
DOI: http://dx.doi.org/10.5306/wjco.v8.i4.371

ВВЕДЕНИЕ

Дихлорацетат натрия (DCA) привлек внимание медицинского сообщества в 2007 году, когда Боннет и др.  опубликовали первое исследование in vitro и in vivo, иллюстрирующее ценность DCA как метаболической терапии рака посредством его ингибирующего действия на митохондриальный фермент пируватдегидрогеназу киназу. Ранее Стакпул и др. опубликовали несколько исследований DCA для лечения врожденного лактатацидоза при митохондриальных заболеваниях. Эти исследования показали, что пероральный DCA является безопасным препаратом для использования человеком. Было отмечено, что DCA не оказывает почечной, легочной, костномозговой и сердечной токсичности . Большинство побочных эффектов DCA были умеренными, причем наиболее серьезным из них была обратимая периферическая невропатия . Также сообщалось об обратимом делирии. Повышение уровня печеночных ферментов (бессимптомное и обратимое) было отмечено у небольшого процента пациентов. Предшествующие исследования митохондриальных расстройств на людях позволили быстро перевести DCA на использование человеком в качестве не по назначению терапии рака. В настоящее время опубликовано несколько отчетов о клинических испытаниях с использованием DCA в качестве терапии рака, подтверждающих его профиль безопасности и указывающих на растущее признание потенциальной полезности DCA в онкологической клинике . Одним из ограничений этих исследований с участием пациентов на поздней стадии является то, что они сообщали только о лечении в течение коротких периодов времени.

В публикации Бонне 2007 года  было показано, что лечение DCA снижает потенциал митохондриальной мембраны, что селективно способствует апоптозу в раковых клетках человека. Ингибирование аэробного гликолиза (эффект Варбурга) и активация митохондриальных калиевых ионных каналов были идентифицированы как механизмы действия DCA. Дальнейшие исследования DCA in vitro подтвердили противораковую активность против широкого спектра типов рака, которые были недавно рассмотрены Канкотией и Стэкпулом . Кроме того, DCA также способен усиливать апоптоз в сочетании с другими агентами . Также были предложены другие противораковые действия DCA, включая ингибирование ангиогенеза  , изменение экспрессии HIF1-α , изменение регуляторов pH клеток V-АТФазы и MCT1, а также других регуляторов выживания клеток, таких как p53 и PUMA . Однако во многих исследованиях in vitro используются неоправданно высокие концентрации DCA, которые клинически недостижимы, в попытке продемонстрировать цитотоксическую активность.. В других исследованиях использовались более скромные концентрации DCA, что показало, что DCA может быть цитостатическим. Во втором отчете 2010 года о его противораковой активности in vivo было обнаружено, что DCA сам по себе является цитостатическим в метастатической модели рака молочной железы , ингибируя пролиферацию, не вызывая апоптоз. Это предполагает роль DCA как стабилизатора рака, аналогичного ингибиторам ангиогенеза.

В ответ на отчет 2007 года о противораковом действии DCA Хан начал использовать DCA для лечения онкологических больных с коротким прогнозом или тех, кто перестал реагировать на традиционные методы лечения рака. В сотрудничестве с врачом-натуропатом (Эндрюс) был разработан протокол натурального лечения для решения проблемы ограничивающей дозу неврологической токсичности DCA. Он состоял из 3 лекарств: ацетил L-карнитин , R-альфа-липоевая кислота и бенфотиамин для профилактики нейропатии и энцефалопатии. У более чем 300 пациентов с поздней стадией рака наблюдательные данные показали, что терапия DCA принесла пользу в 60% -70% случаев. Риск нейропатии при сочетании натуральных нейропротекторных лекарств с DCA составлял приблизительно 20% при дозировке 20-25 мг/кг в день в течение 2 недель приема/1 недели перерыва (клинические наблюдательные данные опубликованы онлайн на сайте www.medicorcancer.com). Здесь представлен отчет о случае пациента, иллюстрирующий как апоптотический, так и антипролиферативный эффект хронического лечения DCA в течение более четырех лет.

ОТЧЕТ О ДЕЛЕ

32-летний ранее здоровый светлокожий мужчина изначально заметил, что родинка на его левой икре начала меняться в 2006 году. Он обратился к врачу, и родинка была удалена. Был поставлен патологический диагноз меланомы. Была проведена диссекция сторожевого узла, которая оказалась отрицательной на метастатическое заболевание. В 2007 году пациент отметил увеличение левых паховых лимфатических узлов и небольшие меланоцитарные поражения на коже левой ноги. Он прошел лечение интерфероном альфа в рамках клинического испытания в региональной онкологической больнице, что привело к уменьшению узлов и разрешению кожных метастазов. Интерферон был отменен через 9 месяцев из-за побочных эффектов.
Пациент оставался в хорошем состоянии до 2010 года, когда появился новый кожный метастаз левой ноги. Он был хирургически удален. В конце 2011 года был обнаружен еще один новый кожный метастаз на левой ноге в рубце от первоначальной операции по удалению меланомы. Была проведена биопсия, и был подтвержден диагноз рецидивирующей меланомы. Затем ему сделали широкое иссечение и пересадку кожи.
В марте 2012 года у пациента диагностировали рецидив в кожном лоскуте левой ноги. Он был иссечен, и была проведена новая процедура пересадки кожи. Патология выявила положительные края иссеченного метастаза, поэтому была проведена повторная резекция, снова с положительными краями. В то же время игольчатая биопсия левого пахового лимфатического узла подтвердила наличие BRAF-положительной метастатической меланомы. Компьютерная томография (КТ), проведенная в марте 2012 года, не выявила никаких признаков отдаленных метастазов. Самый большой левый паховый узел имел диаметр 8 мм, что было сообщено как «незначительный по критериям размера» (рисунок 1).
В апреле 2012 года пациент обратился к врачу-натуропату (Shainhouse) и начал терапию следующими пероральными натуральными противораковыми средствами: активное гексозо-коррелированное соединение или AHCC (экстракт гриба) , корень одуванчика  , куркумин и корень астрагала  . Также была начата парентеральная терапия, которая состояла из внутривенного витамина С два раза в неделю и подкожного экстракта омелы европейской. Пациент также перешел на веганскую диету.
В мае 2012 года пациент посетил клинику автора (Khan), желая получить дополнительные нетрадиционные методы лечения. Обсуждалась терапия DCA, но пациент решил сначала провести адекватную пробу натуральных противораковых методов лечения (прописанных Shainhouse). В мае 2012 года была проведена повторная КТ (всего через 1 месяц естественной терапии), которая выявила умеренное увеличение множественных паховых и наружных подвздошных узлов размерами от 10 мм × 11 мм до 14 мм × 15 мм.
В июле 2012 года КТ-сканирование было повторено для оценки естественной противораковой терапии пациента. В то время левые паховые и наружные подвздошные узлы снова увеличились и имели размер от 13 мм × 16 мм до 22 мм × 20 мм (рисунок 2). ПЭТ-сканирование также было проведено в рамках подготовки к участию в клиническом исследовании в Бостоне, штат Массачусетс (США), и подтвердило повышенное поглощение глюкозы в левых паховых узлах. Появилась новая слабая (2/10) ноющая боль в левой паховой области. Обследование выявило 20-миллиметровый безболезненный левый паховый лимфатический узел и два небольших кожные метастаза в пределах кожного трансплантата левой голени.

Рисунок 1. Компьютерная томография от марта 2012 г. до естественной терапии и до терапии дихлорацетатом. Самый большой узел имел диаметр 8 мм.Рисунок 2. Компьютерная томография от июля 2012 г. после 3 месяцев только естественной терапии, непосредственно перед началом терапии дихлорацетатом. Самый большой узел имел размеры 22 мм × 20 мм.

Таким образом, у пациента диагностировали прогрессирование заболевания. В этот момент он решил начать терапию DCA. Он начал принимать DCA перорально по 500 мг 3 раза в день, что было эквивалентно 17 мг/кг в день (производитель: Tokyo Chemical Industry, США) в дополнение к поддержанию других натуральных методов лечения. Цикл лечения DCA составлял 2 недели приема и 1 неделю перерыва. Чтобы свести к минимуму возникновение побочных эффектов DCA, были назначены 3 дополнительных натуральных препарата: пероральный ацетил L-карнитин по 500 мг 3 раза в день, пероральный бенфотиамин по 80 мг два раза в день и пероральная R-альфа-липоевая кислота по 150 мг 3 раза в день. Эти добавки принимались ежедневно (без цикла). Были проведены рутинные базовые анализы крови (таблица 1). Все они были в норме, за исключением низкого уровня креатинина, который считался незначительным.
В ноябре 2012 года, через 4 месяца после добавления DCA к его первоначальной естественной противораковой терапии, пациент прошел повторную оценку. Он чувствовал себя в целом хорошо. Было сообщено, что два новых симптома начались только после начала терапии DCA: слегка сниженная чувствительность кончиков пальцев рук и ног и слегка сниженная способность концентрироваться в течение 2 недель, в течение которых он принимал DCA. Легкая потеря чувствительности не ухудшалась и ощущалась как легкая невропатия, связанная с DCA. Сообщалось, что как онемение, так и снижение концентрации прошли в течение недель, когда пациент не принимал DCA. Анализ крови от октября 2012 года не показал существенных изменений (таблица 1). КТ в августе 2012 года и ноябре 2012 года выявили значительную регрессию всех ранее увеличенных лимфатических узлов. Самый большой узел был 10 мм, и не было никаких признаков внутригрудного или внутрибрюшного заболевания, а также никаких метастазов в кости (рисунок 3).
Пациент продолжал чувствовать себя хорошо на терапии DCA и не заметил никаких новых метастазов в коже или нового увеличения паховых узлов. Он продолжал проходить частый клинический мониторинг у своего врача-натуропата (Шейнхаус) и ежегодное последующее наблюдение у своего лечащего врача (Хан). Перечисленные натуральные противораковые терапии (назначенные Шейнхаусом) и терапия DCA продолжались до 2016 года. Результаты анализа крови в июне 2016 года продолжали быть нормальными (таблица 1). КТ была повторена в августе 2016 года, не показав никаких признаков метастатической меланомы, после полных 4 лет непрерывной терапии DCA в сочетании с натуральной противораковой терапией (рисунок 4). К декабрю 2016 года пациент сообщил об увеличении стресса, связанного с работой, и снижении соблюдения режима приема лекарств. В то время он заметил новую паховую массу слева. Была получена ультразвуковая визуализация, которая выявила новый конгломерат увеличенных лимфатических узлов размером 40 мм × 25 мм × 23 мм, с цветным допплером, показывающим кровоток внутри массы. Это было интерпретировано как повторный рост меланомы, примерно после четырех с половиной лет непрерывной терапии DCA. Было проведено дальнейшее обследование, включая ПЭТ/КТ, которое подтвердило рецидив заболевания в 3 левых паховых узлах (SUV max в диапазоне от 13 до 17,8).

Рисунок 3. Компьютерная томография от ноября 2012 г. после 4 месяцев терапии дихлорацетатом. Самый большой узел размером 10 мм.Рисунок 4. Компьютерная томография после 4 лет терапии дихлорацетатом без сопутствующих традиционных методов лечения рака. Сканирование показывает отсутствие повторного роста рака. Все узлы имеют размер менее 10 мм.

Вкратце, пациент получал традиционную терапию рецидивирующей меланомы 3 стадии в течение 6 лет, состоящую из первичной хирургической резекции с лимфодиссекцией, интерферона альфа и хирургической резекции рецидивирующих кожных метастазов 5 раз. Затем пациент получал только естественную противораковую терапию (назначенную Шейнхаусом) в течение 3 месяцев без ответа, о чем свидетельствовало устойчивое прогрессирование заболевания на серийных КТ-сканированиях. Наконец, пациент добавил пероральную терапию DCA к естественной противораковой терапии с 3 сопутствующими нейропротекторными препаратами (липоевая кислота, ацетил L-карнитин и бенфотиамин) и без сопутствующих традиционных методов лечения рака. Результатом стала полная радиологическая ремиссия, продолжавшаяся более 4 лет, за которой последовал рецидив. Во время курса терапии DCA у пациента наблюдались незначительные побочные эффекты, состоящие из легкой невропатии и небольшого снижения концентрации. У пациента сохранялась функция ECOG уровня 0, и он мог работать полный рабочий день.

Таблица 1 Анализ крови до терапии дихлорацетатом натрия

1 Указывает на аномальное значение. DCA: Дихлорацетат; LDH: Лактатдегидрогеназа; GGT: Гамма-глутамилтрансфераза; AST: Аспартатаминотрансфераза; ALT: Аланинаминотрансфераза.

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование перорального DCA у пациента с метастатической меланомой, описанное здесь, демонстрирует уменьшение опухоли и долгосрочную стабильность заболевания в соответствии с клиническим статусом и КТ-визуализацией. Стабильность заболевания сохранялась более 4 лет при приеме DCA в отсутствие какой-либо сопутствующей традиционной терапии, с выживаемостью с момента первоначальной постановки диагноза 10 лет. Согласно статистике рака SEER Национального института рака, выживаемость этого пациента, у которого не было признаков отдаленных метастазов, не является примечательной (62,9% 5-летняя выживаемость при меланоме с распространением на региональные лимфатические узлы, https://seer.cancer.gov/statfacts/html/melan.html). Примечательно то, что в ситуации, когда вовлеченные лимфатические узлы явно увеличивались, добавление пероральной терапии DCA было эффективным для уменьшения увеличивающихся узлов (рисунки 2 и 3) и достижения ремиссии, продолжавшейся более 4 лет. Возможно, что естественные противораковые терапии, которые получал пациент, синергизировались с DCA, но также очевидно, что эти естественные терапии сами по себе не могут объяснить регрессию заболевания. Сообщалось, что DCA оказывает как апоптотический, так и цитостатический эффект, что согласуется с клиническим течением регрессии (апоптотический) и длительной ремиссией (цитостатический) у этого пациента. Рецидив через 4 года совпал с уменьшением соблюдения режима лечения, что предполагает, что этот метод лечения рака с помощью DCA требует постоянного поддержания метаболического давления. Несмотря на рецидив, пациент оставался клинически здоровым и планировал начать прием новых иммунотерапевтических препаратов. Еще предстоит выяснить, сможет ли изменение терапии снова достичь регрессии или стабильности заболевания.
Помимо поддержания ремиссии в течение более 4 лет, этот случай иллюстрирует, что DCA может хорошо переноситься онкологическим пациентом в течение длительного периода времени по сравнению со всеми опубликованными клиническими испытаниями DCA по раку. Примечательно, что этот пациент смог переносить 17 мг/кг в день в режиме 2 недели приема/1 неделя перерыва в течение 4 лет с минимальными побочными эффектами. Это похоже на наш предыдущий отчет о случае хронического использования DCA при раке толстой кишки , где пациент смог переносить 16 мг/кг в день (но не 25 мг/кг в день) в том же режиме, но контрастирует с клиническими испытаниями DCA, которые рекомендуют более низкую дозу 10-12,5 мг/кг в день, вводимую непрерывно. Перерыв в 1 неделю или нейропротекторные добавки могут способствовать способности пациентов в отчетах о случаях переносить более высокую дозу. Генетические полиморфизмы в GSTZ1, ферменте печени, который метаболизирует DCA, также могут способствовать дозе DCA, которая может быть переносима. В испытаниях сообщалось о различных уровнях препарата, но не все из них рассматривали этот фармакогенетический аспект терапии DCA , и необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, является ли это существенным фактором переносимости DCA. На момент написания этой статьи продолжается исследование DCA с множественной миеломой у людей, в котором изучаются как генотипы GSTZ1, так и уровни препарата, чтобы внести свой вклад в наше понимание этих проблем (Реестр клинических испытаний Австралии и Новой Зеландии #ACTRN12615000226505, http://www.anzctr.org.au).
Этот отчет о случае показывает, что хроническая терапия DCA может использоваться без снижения качества жизни по сравнению с традиционными методами лечения меланомы, такими как интерферон. Чтобы определить оптимальный протокол для максимально переносимого острого или хронического лечения с помощью DCA, необходимы испытания на людях. Но что еще важнее, все еще остается выяснить, какая доза требуется для целевых эффектов, которые будут эффективны против рака. Эта информация необходима перед инвестированием в более крупные долгосрочные исследования результатов для пациентов. DCA заслуживает дальнейшего изучения в клинических испытаниях как нетоксичная терапия рака из-за своей скромной стоимости и низкой токсичности, а также заслуживает рассмотрения в качестве терапии рака не по назначению.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентку за ее поддержку и согласие опубликовать ее случай.

КОММЕНТАРИИ 

Характеристика случая
У 32-летнего мужчины на ноге обнаружилось пигментное пятно.

Клинический диагноз
У пациентки диагностирована меланома.

Лабораторный диагноз:
Меланома подтверждена эксцизионной биопсией.

Диагностика с помощью визуализации:
подтверждено наличие увеличенного пахового узла в меланоме (биопсия иглой).

Патологический диагноз:
Меланома, BRAF-положительный.

Лечение
Иссечение первичного очага с пересадкой кожи, иссечение сторожевого узла, множественные иссечение рецидивирующих кожных метастазов. Традиционная терапия прекращена и начаты натуральные противораковые терапии (AHCC, корень одуванчика, куркумин, корень астрагала, внутривенно витамин С, подкожно европейская омела). Прогрессирование через 3 месяца, добавлен дихлорацетат (DCA). Регресс и ремиссия после добавления DCA, продолжающиеся более 4 лет.

Сопутствующие отчеты
Отчеты компьютерной томографии демонстрируют течение заболевания и реакцию на терапию.

Объяснение термина 
DCA: Дихлорацетат натрия; RECIST: Критерии оценки ответа на солидные опухоли; ECOG: Восточная кооперативная онкологическая группа; SEER: Наблюдение, эпидемиология и конечные результаты.

Опыт и уроки
DCA может действовать как проапоптотический и цитостатический препарат и, таким образом, может достигать регрессии, а также долгосрочной стабилизации метастатического рака без серьезных побочных эффектов, как показано на примере этого случая меланомы.

Рецензирование
Доктор Хан описал 32-летнего мужчину, который получал терапию DCA с другими препаратами от натуропатов и поддерживался в состоянии стабилизации (метастатическая меланома) более 4 лет. Это интересный случай.

ССЫЛКИ

1 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED. Ось митохондриального канала K+ подавляется при раке, а ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака. Cancer Cell 2007; 11: 37-51 [PMID: 17222789 DOI: 10.1016/ j.ccr.2006.10.020]
2 Stacpoole PW, Kurtz TL, Han Z, Langaee T. Роль дихлорацетата в лечении генетических митохондриальных заболеваний. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60: 1478-1487 [PMID: 18647626 DOI: 10.1016/ j.addr.2008.02.014]
3 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE, Carney PR, Valenstein E, Theriaque DW, Shuster JJ. Оценка длительного лечения детей с врожденным лактоацидозом дихлорацетатом. Педиатрия 2008; 121: e1223-e1228 [PMID: 18411236 DOI: 10.1542/ peds.2007-2062]
4 Stacpoole PW, Kerr DS, Barnes C, Bunch ST, Carney PR, Fennell EM, Felitsyn NM, Gilmore RL, Greer M, Henderson GN, Hutson AD, Neiberger RE, O'Brien RG, Perkins LA, Quisling RG, Shroads AL, Shuster JJ, Silverstein JH, Theriaque DW, Valenstein E. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактоацидоза у детей. Педиатрия 2006; 117: 1519-1531 [PMID: 16651305 DOI: 10.1542/peds.2005-1226]
5 Berendzen K, Theriaque DW, Shuster J, Stacpoole PW. Терапевтический потенциал дихлорацетата при дефиците пируватдегидрогеназного комплекса. Mitochondrion 2006; 6: 126-135 [PMID: 16725381 DOI: 10.1016/j.mito.2006.04.001]
6 Kaufmann P, Engelstad K, Wei Y, Jhung S, Sano MC, Shungu DC, Millar WS, Hong X, Gooch CL, Mao X, Pascual JM, Hirano M, Stacpoole PW, DiMauro S, De Vivo DC. Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование. Neurology 2006; 66: 324-330 [PMID: 16476929 DOI: 10.1212/01. wnl.0000196641.05913.27]
7 Brandsma D, Dorlo TP, Haanen JH, Beijnen JH, Boogerd W. Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом. J Neurol 2010; 257: 2099-2100 [PMID: 20632025 DOI: 10.1007/ s00415-010-5654-9]
8 Микелакис Э.Д., Сутендра Г., Дромпарис П., Вебстер Л., Хароми А., Нивен Э., Магуайр К., Гаммер Т.Л., Макки Дж.Р., Фултон Д., Абдулкарим Б., Макмертри М.С., Петрук К.С. Метаболическая модуляция глиобластомы дихлорацетатом. Sci Transl Med 2010; 2: 31ra34 [PMID: 20463368 DOI: 10.1126/scitranslmed.3000677]
9 Данбар EM, Коутс BS, Шроудс AL, Лангаи T, Лью A, Фордер JR, Шустер JJ, Вагнер DA, Стэкпул PW. Фаза 1 испытания дихлорацетата (DCA) у взрослых с рецидивирующими злокачественными опухолями мозга. Invest New Drugs2014; 32: 452-464 [PMID: 24297161 DOI: 10.1007/ s10637-013-0047-4]
10Garon EB, Christofk HR, Hosmer W, Britten CD, Bahng A, Crabtree MJ, Hong CS, Kamranpour N, Pitts S, Kabbinavar F, Patel C, von Euw E, Black A, Michelakis ED, Dubinett SM, Slamon DJ. Дихлорацетат следует рассматривать с химиотерапией на основе платины при гипоксических опухолях, а не как единственный агент при распространенном немелкоклеточном раке легких. J Cancer Res Clin Oncol 2014; 140: 443-452 [PMID: 24442098 DOI: 10.1007/s00432-014-1583-9]
11 Chu QS, Sangha R, Spratlin J, Vos LJ, Mackey JR, McEwan AJ, Venner P, Michelakis ED. Открытое исследование фазы I с однокомпонентным методом и повышением дозы дихлорацетата (DCA) у пациентов с запущенными солидными опухолями. Invest New Drugs 2015; 33: 603-610 [PMID: 25762000 DOI: 10.1007/s10637-015-0221-y]
12 Канкотия С., Стэкпул П. У. Дихлорацетат и рак: новый дом для орфанного препарата? Biochim Biophys Acta 2014; 1846: 617-629 [PMID: 25157892 DOI: 10.1016/j.bbcan.2014.08.005]
13 Сан Р. К., Борд П. Г., Блэкберн А. К. Нацеливание метаболизма с помощью триоксида мышьяка и дихлорацетата в клетках рака молочной железы. Mol Cancer 2011; 10: 142 [PMID: 22093145 DOI: 10.1186/1476-4598-10-142]
14 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, Phillips LR, Hollingshead MG, Newton DL. Дихлорацетат натрия селективно воздействует на клетки с дефектами в митохондриальной ЭТЦ. Int J Cancer 2010; 127: 2510-2519 [PMID: 20533281 DOI: 10.1002/ijc.25499]
15 Gang BP, Dilda PJ, Hogg PJ, Blackburn AC. Нацеливание на два аспекта метаболизма при лечении рака молочной железы. Cancer Biol Ther 2014; 15: 1533-1541 [PMID: 25482950 DOI: 10.4161/15384047.2014.955992]
16 Sutendra G, Dromparis P, Kinnaird A, Stenson TH, Haromy A, Parker JM, McMurtry MS, Michelakis ED. Активация митохондрий путем ингибирования PDKII подавляет сигнализацию HIF1a и ангиогенез при раке. Oncogene 2013; 32: 1638-1650 [PMID: 22614004 DOI: 10.1038/onc.2012.198]
17 Cairns RA, Bennewith KL, Graves EE, Giaccia AJ, Chang DT, Denko NC. Фармакологически повышенная гипоксия опухоли может быть измерена с помощью позитронно-эмиссионной томографии с 18F-фторазомицин арабинозидом и усиливает реакцию опухоли на гипоксический цитотоксин PR-104. Clin Cancer Res 2009; 15: 7170-7174 [PMID: 19920111 DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-09-1676]
18 Anderson KM, Jajeh J, Guinan P, Rubenstein M. In vitro эффекты дихлорацетата и CO2 на гипоксические клетки HeLa. Anticancer Res 2009; 29: 4579-4588 [PMID: 20032407]
19 Sun RC, Fadia M, Dahlstrom JE, Parish CR, Board PG, Blackburn AC. Изменение гликолитического фенотипа дихлорацетатом подавляет рост метастатических клеток рака молочной железы in vitro и in vivo. Breast Cancer Res Treat 2010; 120: 253-260 [PMID: 19543830 DOI: 10.1007/ s10549-009-0435-9]
20De Grandis D. Ацетил-L-карнитин для лечения периферической нейропатии, вызванной химиотерапией: краткий обзор. CNS Drugs 2007; 21 Suppl 1: 39-43; обсуждение 45-46 [PMID: 17696592]
21 Maestri A, De Pasquale Ceratti A, Cundari S, Zanna C, Cortesi E, Crinò L. Пилотное исследование эффекта ацетил-L-карнитина при периферической нейропатии, вызванной паклитакселом и цисплатином. Tumori 2005; 91: 135-138 [PMID: 15948540]
22 Evans JD, Jacobs TF, Evans EW. Роль ацетил-L-карнитина в лечении диабетической периферической нейропатии. Ann Pharmacother 2008; 42: 1686-1691 [PMID: 18940920 DOI: 10.1345/aph.1L201]
23 Mijnhout GS, Kollen BJ, Alkhalaf A, Kleefstra N, Bilo HJ. Альфа-липоевая кислота при симптоматической периферической нейропатии у пациентов с диабетом: метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. Int J Endocrinol 2012; 2012: 456279 [PMID: 22331979 DOI: 10.1155/2012/456279]
24 Liu F, Zhang Y, Yang M, Liu B, Shen YD, Jia WP, Xiang KS. [Лечебный эффект альфа-липоевой кислоты на периферическую нейропатию при диабете 2 типа: клиническое исследование]. Zhonghua Yixue Zazhi 2007; 87: 2706-2709 [PMID: 18167250]
25 Ziegler D, Hanefeld M, Ruhnau KJ, Meissner HP, Lobisch M, Schütte K, Gries FA. Лечение симптоматической диабетической периферической нейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой. 3-недельное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN). Diabetologia 1995; 38: 1425-1433 [PMID: 8786016]
26 Winkler G, Kempler P. [Патомеханизм диабетической нейропатии: предпосылки патогенез-ориентированной терапии]. Orv Hetil 2010; 151: 971-981 [PMID: 20519180 DOI: 10.1556/OH.2010.28898]
27 Ang CD, Alviar MJ, Dans AL, Bautista-Velez GG, Villaruz-Sulit MV, Tan JJ, Co HU, Bautista MR, Roxas AA. Витамин B для лечения периферической нейропатии. Cochrane Database Syst Rev 2008; (3): CD004573 [PMID: 18646107 DOI: 10.1002/14651858.CD004573. pub3]
28 Winkler G, Pál B, Nagybéganyi E, Ory I, Porochnavec M, Kempler P. Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии. Arzneimittelforschung 1999; 49: 220-224 [PMID: 10219465 DOI: 10.1055/s-0031-1300405]
29 Ignacio RM, Kim CS, Kim YD, Lee HM, Qi XF, Kim SK. Терапевтический эффект активного гексозо-коррелированного соединения (AHCC) в сочетании с CpG-ODN (олигодезоксинуклеотидом) в мышиной модели меланомы B16. Cytokine 2015; 76: 131-137 [PMID: 26082022 DOI: 10.1016/j.cyto.2015.06.002]
30 Chatterjee SJ, Ovadje P, Mousa M, Hamm C, Pandey S. Эффективность экстракта корня одуванчика в индукции апоптоза в клетках меланомы человека, устойчивых к лекарственным препаратам. Evid Based Complement Alternat Med 2011; 2011: 129045 [PMID: 21234313 DOI: 10.1155/2011/129045]
31Mirzaei H, Naseri G, Rezaee R, Mohammadi M, Banikazemi Z, Mirzaei HR, Salehi H, Peyvandi M, Pawelek JM, Sahebkar A. Куркумин: новый кандидат для терапии меланомы? Int J Cancer 2016; 139: 1683-1695 [PMID: 27280688 DOI: 10.1002/ijc.30224]
32 Huang XY, Zhang SZ, Wang WX. Повышение противоопухолевой эффективности при комбинированном применении астрагала и птеростильбена при меланоме. Asian Pac J Cancer Prev 2014; 15: 1163-1169 [PMID: 24606435]
33 Wagner SC, Markosian B, Ajili N, Dolan BR, Kim AJ, Alexandrescu DT, Dasanu CA, Minev B, Koropatnick J, Marincola FM, Riordan NH. Внутривенная аскорбиновая кислота как адъювант иммунотерапии интерлейкином-2. J Transl Med 2014; 12: 127 [PMID: 24884532 DOI:10.1186/1479-5876-12-127]
34 Horneber MA, Bueschel G, Huber R, Linde K, Rostock M. Терапия омелой в онкологии. Cochrane Database Syst Rev 2008; (2): CD003297 [PMID: 18425885 DOI: 10.1002/14651858.CD003297.pub2]
35 Delaney LM, Ho N, Morrison J, Farias NR, Mosser DD, Coomber BL. Дихлорацетат влияет на пролиферацию, но не на выживаемость клеток колоректального рака человека. Apoptosis 2015; 20: 63-74 [PMID: 25344893 DOI: 10.1007/s10495-014-1046-4]
36 Abildgaard C, Dahl C, Basse AL, Ma T, Guldberg P. Биоэнергетическая модуляция с помощью дихлорацетата снижает рост клеток меланомы и усиливает их ответ на ингибирование BRAFV600E. J Transl Med 2014; 12: 247 [PMID: 25182332 DOI: 10.1186/s12967-014-0247-5]
37 Хан А., Эндрюс Д., Блэкберн А. С. Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии дихлорацетатом натрия. World J Clin Cases 2016; 4: 336-343 [PMID: 27803917]
38 Ценг Х. Ф., Блэкберн А. С., Борд П. Г., Андерс М. В. Полиморфизм и зависящая от вида инактивация дзета-глутатионтрансферазы дихлорацетатом. Chem Res Toxicol 2000; 13: 231-236 [PMID: 10775321]

Дихлорацетат (ДХА) и рак: обзор клинического применения

Лаборатория доклинических и трансляционных исследований, IRCCS-CROB, Реферальный онкологический центр Базиликаты, Рионеро-ин-Вультуре (Pz), 85028, Италия
2 Кафедра клинической и экспериментальной медицины, Университет Фоджи, Фоджа 71121, Италия

Корреспонденцию следует направлять Тициане Татарани; tiziana.tataranni@crob.it

Приглашенный редактор: Канхайя Сингх

Авторские права © 2019 Тициана Татаранни и Клаудия Пикколи. Это статья открытого доступа, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.

Получено:  24 июля 2019 г.
Изменено:  12 сентября 2019 г.
Принято:  11 октября 2019 г.
Опубликовано онлайн:  14 ноября 2019 г.

Обширный объем литературы описывает противораковые свойства дихлорацетата (DCA), но его эффективное клиническое применение в терапии рака по-прежнему ограничивается клиническими испытаниями. Возникновение побочных эффектов, таких как нейротоксичность, а также подозрение на канцерогенность DCA по-прежнему ограничивают клиническое применение DCA. Однако в последние годы число отчетов, поддерживающих использование DCA против рака, возросло также из-за большого интереса к нацеливанию на метаболизм опухолевых клеток. Анализ механизма действия DCA помог понять основы его селективной эффективности против раковых клеток. Успешное совместное введение DCA с традиционной химиотерапией, радиотерапией, другими препаратами или природными соединениями было протестировано на нескольких моделях рака. Новые системы доставки лекарств и многофункциональные соединения, содержащие DCA и другие препараты, по-видимому, улучшают биодоступность и кажутся более эффективными благодаря синергетическому действию нескольких агентов. Распространение отчетов, поддерживающих эффективность DCA в терапии рака, побудило провести дополнительные исследования, которые позволили найти другие потенциальные молекулярные мишени DCA. Интересно, что DCA может существенно влиять на фракцию стволовых клеток рака и способствовать искоренению рака. В совокупности эти результаты дают весомое обоснование для новых клинических трансляционных исследований DCA в терапии рака.

ВВЕДЕНИЕ

Рак является одной из основных причин смерти во всем мире. Несмотря на значительный прогресс в диагностических и терапевтических подходах, его искоренение по-прежнему представляет собой проблему. Слишком много факторов ответственны за неудачу терапии или рецидив, поэтому существует острая необходимость в поиске новых подходов к его лечению. Помимо типичных известных свойств, характерных для злокачественных клеток, включая аномальную пролиферацию, дерегуляцию апоптоза и клеточного цикла [1, 2] , раковые клетки также демонстрируют особую метаболическую машину, которая предлагает еще один многообещающий подход к терапии рака [3–5] . Наша группа уже предположила важность метаболической характеристики раковых клеток для прогнозирования эффективности метаболического лечения [6] . Лекарства, способные влиять на метаболизм рака, уже рассматриваются, показывая обнадеживающие результаты с точки зрения эффективности и переносимости [7] . В последнее десятилетие малая молекула DCA, уже используемая для лечения острого и хронического лактоацидоза, врожденных ошибок митохондриального метаболизма и диабета [8] , в основном предназначалась в качестве противоракового препарата. DCA представляет собой водорастворимую молекулу кислоты массой 150 Да, аналог уксусной кислоты, в которой два из трех атомов водорода метильной группы заменены атомами хлора (рисунок 1(a)) [9] . Введение DCA в дозах от 50 до 200 мг/кг/умер связано с уменьшением объема опухолевой массы, скорости пролиферации и распространения метастазов в нескольких доклинических моделях [10] . Наша группа уже наблюдала обратную корреляцию между способностью DCA убивать раковые клетки и их митохондриальной дыхательной способностью в карциномах ротовых клеток [11] . Более того, недавно мы описали способность DCA влиять на митохондриальную функцию и замедлять прогрессирование рака в модели рака поджелудочной железы [12] . На сегодняшний день доступны последовательные данные клинических испытаний и отчеты о случаях, описывающие введение DCA у онкологических больных [13–16] , но, несмотря на растущий объем литературы, подтверждающей эффективность DCA против рака, он пока не используется в клинической практике. Целью этого обзора является обобщение последних отчетов, предполагающих использование DCA в терапии рака в сочетании с химиотерапевтическими агентами, радиотерапией и другими химическими или природными соединениями, демонстрирующими противораковые свойства. Кроме того, мы описали данные о новых целевых фармакологических формулах DCA, способных избегать побочных эффектов и улучшать биодоступность и эффективность препарата, что еще больше поощряет его возможное клиническое применение. Наконец, мы рассмотрели последние результаты, предполагающие другие потенциальные механизмы действия DCA, включая новые данные о его способности влиять на фракцию стволовых клеток рака.

Рисунок 1: (a) Химическая структура DCA. (b) Механизм действия DCA: PDK: пируватдегидрогеназная киназа; PDH: пируватдегидрогеназа. Черные пунктирные линии — биохимические процессы, ингибируемые DCA; Красные стрелки — метаболические пути, активируемые DCA.

DCA и рак: механизм действия

Потенциальная эффективность DCA в терапии рака обусловлена ​​метаболическими свойствами раковых клеток, которые обычно характеризуются повышенной гликолитической активностью и сниженным митохондриальным окислением независимо от доступности кислорода, хорошо известный эффект Варбурга [17] . Чрезмерный гликолиз и возникающее в результате перепроизводство лактата вызывают состояние метаболического ацидоза в микроокружении опухоли [ 18] . Лактат, образующийся в результате гликолиза, поглощается окружающими клетками для поддержки роста опухоли и ингибирует механизмы апоптотической гибели клеток [19, 20] . Несколько ферментов, участвующих в гликолизе, регулируют апоптоз, и их сверхэкспрессия в раковых клетках способствует подавлению апоптоза [21] . В этой ситуации соли DCA избирательно воздействуют на раковые клетки, переключая их метаболизм с гликолиза на окислительное фосфорилирование путем ингибирования киназы пируватдегидрогеназы (PDK), ингибитора пируватдегидрогеназы (PDH) [10] . Активация PDH способствует митохондриальному окислению пирувата и нарушает метаболическое преимущество раковых клеток. Мутации митохондриальной ДНК, часто возникающие при опухолеобразовании и приводящие к дисфункции дыхательной цепи [22, 23] , делают злокачественные клетки неспособными поддерживать клеточную потребность в энергии. Кроме того, снижая выработку лактата, DCA противодействует ацидозному состоянию микроокружения опухоли, способствуя ингибированию роста опухоли и ее распространению [24] . Доставка пирувата в митохондрии вызывает ремоделирование органелл, что приводит к увеличению оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, и повышению уровня ROS с последующим снижением жизнеспособности раковых клеток [9] (рисунок 1(b)).

Побочные эффекты и ограничения при использовании DCA

Клиническое применение DCA доступно как в пероральных, так и в парентеральных формулах, а дозы варьируются от 10 до 50 мг/кг/смерть [25] . Никакие доказательства тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности не подтверждают безопасность DCA [26] . Распространенные желудочно-кишечные побочные эффекты часто возникают у определенного процента пациентов, получавших лечение DCA [15] . Наиболее известным ограничением для введения DCA, наблюдавшимся как в доклинических, так и в клинических исследованиях, является периферическая невропатия [27] . Избирательность повреждения нервной системы, вызванного DCA, может быть связана с отсутствием хорошо оснащенного аппарата, способного справиться с более устойчивым окислительным фосфорилированием в клетках, продуцирующих АТФ в основном посредством гликолиза [28] . Возникающая в результате перегрузка митохондрий ставит под угрозу эффективность антиоксидантных систем, неспособных противостоять чрезмерному количеству ROS. В этой ситуации современное введение антиоксидантов должно представлять собой дополнительную стратегию для минимизации невропатии, вызванной DCA [27] . Экспрессия и активность глутатионтрансферазы zeta1 (GSTZ1), первого фермента, ответственного за клиренс DCA, могут влиять на сущность повреждения. Несинонимичные функциональные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в гене человека GSTZ1 приводят к появлению различных гаплотипов, которые отвечают за различную кинетику и динамику DCA. Была продемонстрирована четкая связь между гаплотипом GSTZ1 и клиренсом DCA. На этой основе персонализированная дозировка DCA, основанная не только на массе тела, может минимизировать или предотвратить побочные эффекты у пациентов, хронически принимающих этот препарат [29] . Возникновение нейропатии связано с хроническим пероральным приемом DCA и является обратимым эффектом, ограниченным временем лечения [30] . Внутривенный путь снижает, OH Cl Cl O (a) Раковые клетки Раковые клетки Смерть раковых клеток Лактат Опухоль Микросреда Лактат Пируват Гликолиз PDK DCA PDH Окислительное фосфорилирование Апоптоз восстановление Цитохром c Глюкоза (b) Рисунок 1: (a) Химическая структура DCA. (b) Механизм действия DCA: PDK: пируватдегидрогеназная киназа; PDH: пируватдегидрогеназа. Черные пунктирные линии, биохимические процессы, ингибируемые DCA; Красные стрелки, метаболические пути, активируемые DCA. 2 Окислительная медицина и клеточная продолжительность жизни, следовательно, потенциал нейротоксичности и позволяют достижению более высоких концентраций препарата обойти пищеварительную систему [13] .
Поскольку DCA входит в число побочных продуктов дезинфекции воды, обнаруженных в низких концентрациях в питьевой воде, его потенциальная канцерогенность находится на стадии оценки. Исследования, проведенные на мышах, связывают воздействие DCA в раннем возрасте с увеличением частоты возникновения гепатоцеллюлярных опухолей [31]. Вполне возможно, что постоянные изменения в метаболизме клеток, вызванные DCA, могут вызывать эпигенетические эффекты. Длительная индукция PDH и других окислительных путей, связанных с метаболизмом глюкозы, может способствовать увеличению активных форм кислорода и митохондриального стресса [27] . Однако в клинических исследованиях не сообщается о каких-либо доказательствах канцерогенного эффекта при введении DCA в терапии рака.

Синергетический эффект DCA и химиотерапевтических агентов

Комбинирование различных препаратов является общепринятой стратегией для получения синергического полезного эффекта в терапии рака, снижения дозировки препаратов, минимизации рисков токсичности и преодоления лекарственной устойчивости. Совместное введение DCA и традиционных химиотерапевтических агентов было предназначено и протестировано на нескольких моделях рака (таблица 1). Лечение DCA, по-видимому, повышает эффективность химиотерапии, вызывая биохимические и метаболические изменения, что приводит к значительным изменениям энергетического баланса раковых клеток. Исследование, проведенное при немелкоклеточном раке легких (НМРЛ), показало как in vitro, так и in vivo, что совместное введение DCA с паклитакселом повышает эффективность гибели клеток за счет ингибирования аутофагии [32] . Эффективная комбинация DCA и доксорубицина (DOX) была протестирована на клетках HepG2, продемонстрировав способность DCA нарушать клеточную антиоксидантную защиту, тем самым способствуя окислительному повреждению, в свою очередь, вызванному лечением DOX [33] . Существует сильная связь между сверхэкспрессией PDK и химиорезистентностью; таким образом, можно предположить, что ингибирование PDK может помочь повторно сенсибилизировать раковые клетки к препаратам. Сверхэкспрессия изоформы PDK2 была связана с резистентностью к паклитакселу при НМРЛ. Интересно, что комбинация DCA с паклитакселом была более эффективна в уничтожении резистентных клеток, чем лечение паклитакселом или DCA по отдельности [34] . Подобно НМРЛ, интересное исследование in vivo, проведенное при распространенном раке мочевого пузыря, показало повышенную экспрессию изоформы PDK4 при высокой степени злокачественности по сравнению с раком низкой степени злокачественности, а совместное лечение DCA и цисплатином значительно уменьшило объемы опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [35]. Недавнее исследование подтвердило способность DCA устранять химиорезистентность, связанную с PDK4, также при гепатоцеллюлярной карциноме человека (ГЦК) [36] .

Таблица 1: Список отчетов, предполагающих положительный эффект совместного применения DCA и химиотерапии при нескольких типах рака.

Синергетический эффект DCA и других потенциальных противораковых препаратов

Последовательный объем литературы предполагает положительные эффекты совместного введения DCA с соединениями, которые в настоящее время используются для лечения других заболеваний, но демонстрируют противораковые свойства в нескольких моделях рака (таблица 2). Современное введение DCA и антибиотика салиномицина, недавно заново открытого за его цитотоксические свойства как потенциального противоракового препарата, было протестировано на линиях клеток колоректального рака. Их лечение, по-видимому, оказывает синергический цитотоксический эффект, ингибируя экспрессию белков, связанных с множественной лекарственной устойчивостью [37] . Раковые клетки, лишенные метаболических ферментов, участвующих в метаболизме аргинина, могут привести к чувствительности к лечению аргиназой. Интересно, что совместное введение рекомбинантной аргиназы и DCA оказывает антипролиферативный эффект при тройном негативном раке молочной железы из-за активации p53 и индукции остановки клеточного цикла [38] . Ингибиторы COX2, в основном используемые в качестве противовоспалительных препаратов, недавно были предложены в качестве противоопухолевых препаратов из-за их антипролиферативной активности. Интригующее исследование, проведенное на клетках рака шейки матки, показало неспособность DCA убивать клетки рака шейки матки, сверхэкспрессирующие COX2, и продемонстрировало, что ингибирование COX2 целекоксибом делает клетки рака шейки матки более чувствительными к DCA как в экспериментах in vitro, так и in vivo [39] . Поскольку DCA способствует окислительному фосфорилированию за счет снижения гликолитической активности, сочетание DCA с другими препаратами, усиливающими состояние зависимости от глюкозы, может быть многообещающей стратегией. Такой подход был опробован при раке головы и шеи, при котором введение пропранолола, неселективного бета-блокатора, способного влиять на митохондриальный метаболизм опухолевых клеток, вызывало гликолитическую зависимость и энергетический стресс, делая клетки более уязвимыми для лечения DCA [40] . Аналогичные результаты были получены в клетках меланомы, в которых введение ингибиторов рецептора ретиноевой кислоты β (RARβ) вызывало сенсибилизацию к DCA [41] . Положительный эффект совместного введения DCA с метформином, гипогликемическим препаратом, широко используемым для лечения диабета, был продемонстрирован в доклинической модели глиомы [42] , а также в низкометастатическом варианте карциномы легких Льюис (LLC) [43] . Цзян и его коллеги исследовали эффекты фенформина, аналога метформина, и DCA в глиобластоме, продемонстрировав, что одновременное ингибирование комплекса I и PDK фенформином и DCA, соответственно, снижало самообновление и жизнеспособность стволовых клеток глиомы (GSC), что предполагает их возможное использование для воздействия на фракцию стволовых клеток рака [44] .

Таблица 2: Список препаратов, основная функция которых была протестирована в сочетании с DCA на нескольких моделях рака.

Совместное использование DCA и натуральных соединений

Клиническое применение природных соединений представляет собой многообещающий новый подход к лечению ряда заболеваний [45] . Все больше литературы подтверждает обнаружение среди природных соединений биологически активных веществ, выделенных растениями, грибами, бактериями или морскими организмами, которые оказывают благотворное воздействие на здоровье человека [46–48] . Предположение о природных соединениях или их производных, по-видимому, представляет собой обнадеживающий подход к предотвращению возникновения или рецидива рака, и это обычно называется химиопрофилактикой [49] . Более того, природные вещества оказывают благотворное воздействие при терапии рака при совместном введении с другими препаратами, демонстрируя их способность преодолевать лекарственную устойчивость, увеличивать противораковый потенциал и снижать дозы лекарств и токсичность [50, 51] . Интересно, что недавно было предложено совместное введение DCA и природных соединений. В исследовании изучалось комбинированное действие DCA с куркумином, смешанным с эфирным маслом, соединением с полезными свойствами как для профилактики, так и для лечения рака [52] , демонстрирующим противораковый потенциал против HCC [53] . В частности, сочетание обоих соединений синергически снижало выживаемость клеток, способствуя апоптозу клеток и вызывая внутриклеточную генерацию ROS. Бетулин, природное соединение, выделенное из бересты, уже известно своим антипролиферативным и цитотоксическим действием против нескольких линий раковых клеток [54–56] . Исследование противоопухолевой активности производных бетулина in vitro при НМРЛ подтвердило его способность ингибировать in vivo и in vitro рост клеток рака легких, блокируя фазу G2/M клеточного цикла и вызывая активацию каспазы и фрагментацию ДНК. Интересно, что производное бетулина Bi-L-RhamBet было способно нарушать митохондриальную электрон-транспортную цепь (ETC), вызывая выработку ROS. Учитывая свойство DCA увеличивать общее окисление глюкозы в митохондриях через цикл Кребса и ETC, авторы объединили Bi-L-RhamBet с DCA, продемонстрировав его значительную потенцированную цитотоксичность [57] .

DCA и радиосенсибилизация

Радиотерапия представляет собой еще одну стратегию лечения рака и обеспечивает локальный подход путем введения высокоэнергетических лучей [58] . Основным эффектом облучения является индукция ROS с последующим повреждением ДНК, хромосомной нестабильностью и гибелью клеток путем апоптоза [59] . Однако некоторые опухоли демонстрируют или развивают радиорезистентность, которая является причиной неудачи радиотерапии и высокого риска рецидива опухоли или метастазирования [60] . Несколько факторов могут быть ответственны за радиорезистентность [61] . Среди них гипоксия, распространенное состояние микросреды опухоли, характеризующееся низким уровнем кислорода и сниженной генерацией видов ROS, может блокировать эффективность ионизирующего излучения [62] . Поэтому увеличение оксигенации опухоли таким образом, чтобы способствовать значительному количеству ROS [63] или напрямую индуцировать выработку ROS, может представлять собой стратегию повышения радиосенсибилизации [64 , 65] . В этой ситуации введение DCA, которое, как известно, индуцирует выработку ROS [11, 66] , может представлять собой стратегию преодоления радиорезистентности опухоли. Более того, известно, что метаболические изменения, характерные для развития рака, влияют на радиочувствительность [67, 68] . Следовательно, нацеливание на промежуточные продукты метаболизма рака может представлять собой стратегию улучшения селективного ответа рака на облучение [69] . Эффективность DCA для повышения радиочувствительности уже была продемонстрирована как на клетках глиобластомы [70] , так и на плоскоклеточной карциноме пищевода [71] . Совсем недавно было продемонстрировано, что DCA повышает радиочувствительность в клеточной модели медуллобластомы, смертельной опухоли мозга у детей, вызывая изменения метаболизма ROS и функции митохондрий и подавляя способность к восстановлению ДНК [72] . Поскольку роль иммунотерапии в восстановлении иммунной защиты против прогрессирования опухоли и метастазирования привлекает большое внимание в последние годы [73] , Гупта и Двараканат представили современное состояние возможных эффектов гликолитических ингибиторов, включая DCA, на радиосенсибилизацию опухоли, сосредоточив свое внимание на взаимодействии между метаболическими модификаторами и иммунной модуляцией в процессах радиосенсибилизации [74] . Интересно, что они сообщили о способности DCA способствовать иммунной стимуляции посредством ингибирования накопления лактата, что еще больше поддерживает его использование в качестве адъюванта радиотерапии.

DCA и новые лекарственные формы

Растет интерес к разработке новых лекарственных форм для улучшения доставки лекарств, повышения эффективности и снижения доз и, следовательно, нежелательных эффектов. В этой ситуации системы доставки лекарств (СДЛ) представляют собой новый рубеж в современной медицине [75] . СДЛ предлагают возможность создания гибрида металлоорганических каркасов (МОФ), сочетающего биосовместимость органической системы с высокими нагрузками неорганической фракции [76] . Несколько линий доказательств предполагают эффективную функционализацию наночастиц с помощью ДКА. Лазаро и коллеги [77] исследовали различные протоколы для функционализации ДКА наночастиц терефталата циркония (Zr) (UiO-66). Они продемонстрировали цитотоксичность и селективность тех же СДЛ против различных линий раковых клеток. Более того, они исключили возможную реакцию иммунной системы на ДКА-МОФ in vitro. Та же группа позже показала возможность загрузки Zr MOF вторым противораковым препаратом, таким как 5-фторурацил (5-FU), чтобы воспроизвести синергический эффект двух препаратов [78] . MOF на основе циркония, загруженный DCA, также был предназначен в качестве привлекательной альтернативы UiO-66, показывая селективную цитотоксичность in vitro по отношению к нескольким линиям раковых клеток и хорошую переносимость иммунной системой нескольких видов [79] . Недавно Štarha et al. [80] впервые синтезировали и охарактеризовали полусэндвич-комплексы, содержащие рутений или осмий и DCA (рисунок 2(a)). Оба комплекса Ru-dca и Os-DCA были проверены на линиях клеток карциномы яичников, продемонстрировав большую цитотоксичность, чем цисплатин в отдельности. Оба комплекса были способны индуцировать высвобождение цитохрома c (Cytc) из митохондрий, косвенный показатель активации апоптосомы, и, по-видимому, были менее токсичными по отношению к здоровым первичным гепатоцитам человека, что указывает на селективность в отношении рака по сравнению с нераковыми клетками. Многообещающие результаты были также получены в клетках рака молочной железы с тройным негативом [81] . Конъюгат рения (I)-DCA продемонстрировал эффективное проникновение в раковые клетки и селективное накопление в митохондриях, вызывая митохондриальную дисфункцию и метаболические нарушения [82] . В последние годы было разработано несколько многоактивных препаратов для современного нацеливания на различные внутриклеточные пути с использованием одной формулы. Безопасная, простая, воспроизводимая наноформула комплекса доксорубицинDCA (рисунок 2(b)) была успешно испытана на модели меланомы у мышей, показав увеличение способности к загрузке препарата, снижение побочных эффектов и усиление терапевтического эффекта [83] . Были синтезированы противоопухолевые пролекарства Pt (IV) двойного действия китеплатина с аксиальными лигандами DCA (рисунок 2(c)), охарактеризованы и протестированы на различных линиях опухолевых клеток и in vivo [84]. Для преодоления резистентности рака были предложены тройные производные Pt (IV) цисплатина в качестве новых мощных противораковых агентов, способных конъюгировать действие цисплатина, ингибиторов циклооксигеназы и DCA (рисунок 2(d)) [85] . Новый комплекс, содержащий DCA, платину и биотин (DPB), был успешно испытан, демонстрируя многогранные противоопухолевые свойства (рисунок 2(e)). Авторы продемонстрировали способность такого пролекарства влиять на энергетический метаболизм, способствовать апоптозу и взаимодействовать с ДНК. Высокая селективность биотина в отношении раковых клеток сводит к минимуму пагубное воздействие на нормальные клетки и улучшает лечебный эффект на опухоли [86] . Характеристики и экспериментальные доказательства основных классов соединений обобщены в таблице 3.

Таблица 3: Свойства основных классов лекарственных форм DCA, протестированные на линиях раковых клеток и моделях in vivo с соответствующими экспериментальными доказательствами.

Рисунок 2: Новые лекарственные формы, содержащие DCA. (a) Схематическое изображение комплексов Os-DCA и Ru-DCA [81]. (b) Комплекс доксорубицин (DOX)-DCA [83]. (c) Пролекарства Pt двойного действия китеплатина и DCA [84]. (d) Примеры производных Pt(IV) тройного действия цисплатина, содержащих DCA (красный), производные цисплатина (черный) и ингибиторы COX (зеленый) [85]. (e) Химическая структура DPB, содержащего DCA (красный), биотин (синий) и комплекс платины (Pt) (черный) [86].

Другие предлагаемые механизмы действия DCA

Метаболический сдвиг от гликолиза к окислению глюкозы из-за ингибирования PDK и последующей активации PDH является наиболее известным и общепринятым молекулярным эффектом введения DCA. Последующие биохимические изменения, включая увеличение ROS и изменение потенциала митохондриальной мембраны, могут быть ответственны за остановку пролиферации и гибель раковых клеток, тем самым объясняя полезный потенциал DCA в лечении рака [9] . Однако молекулярные промежуточные продукты, активируемые после введения DCA, до сих пор неизвестны. Вполне возможно, что такая малая молекула может напрямую или косвенно влиять на другие клеточные и молекулярные мишени (рисунок 3), демонстрируя другие механизмы действия, чтобы объяснить ее эффективность также в клеточных моделях, где она не производит ожидаемого метаболического сдвига [12] . Протеомный подход, примененный к клеткам рака легких, продемонстрировал способность DCA увеличивать концентрацию каждого промежуточного продукта TCA, при этом он не влиял на поглощение глюкозы или гликолитический процесс от глюкозы до пирувата [87] . В попытке пролить свет на механизм действия DCA, Дюбуа и коллеги использовали подход, основанный на метаболомике, на нескольких линиях клеток рака яичников, обработанных DCA, и обнаружили общее заметное истощение внутриклеточного пантотената, предшественника CoA, а также сопутствующее увеличение CoA, что предполагает способность DCA увеличивать биосинтез CoA de novo. Поскольку высокие концентрации CoA оказались токсичными для клеток, этот метаболический эффект может быть ответственен за токсичность раковых клеток, опосредованную DCA [88] . Совсем недавно работа Эль Сайеда и соавторов представила новую основанную на доказательствах гипотезу, предполагающую, что эффективность DCA против рака может быть обусловлена ​​его способностью противодействовать ацетату [89] , который, как известно, является энергетическим субстратом для глиобластомы и метастазов в мозг, способным усиливать синтез ДНК, РНК и белка, а также посттрансляционные модификации, тем самым способствуя пролиферации клеток и прогрессированию рака. Более того, высокие уровни ацетата связаны с устойчивостью к противораковым препаратам [90] . Было показано, что DCA способен обращать вспять метаболические изменения, вызванные ацетатом, восстанавливая физиологические уровни сывороточного лактата и свободных жирных кислот, а также концентрацию калия и фосфора. По мнению авторов, благодаря структурному сходству с ацетатом, DCA может ингибировать метаболические эффекты, вызванные ацетатом, ответственные за рост раковых клеток и химиорезистентность [89] . Другим возможным дополнительным эффектом DCA может быть модуляция pH. Известно, что модуляция уровня pH влияет на процессы пролиферации и апоптоза [91] , а также на чувствительность к химиотерапии [92].Обработка DCA может как увеличивать, так и уменьшать внутриклеточный pH. Вторичным эффектом перенаправления пирувата в митохондрии с помощью DCA будет снижение лактата и последующее увеличение внутриклеточного pH. С другой стороны, DCA способен уменьшать экспрессию монокарбоксилатных транспортеров и V-АТФазы с последующим снижением pH, и это особенно происходит в опухолевых клетках, экспрессирующих большее количество этих переносчиков по сравнению с нормальными аналогами [93] . Учитывая способность вызывать быстрое внутриклеточное закисление опухоли, Albatany et al. [94] предположили о возможном использовании DCA в качестве трекера при визуализации in vivo мышиной модели глиобластомы и поддержали терапевтическое использование DCA, поскольку известно, что внутриклеточное закисление вызывает активацию каспазы и фрагментацию ДНК раковых клеток [95] . Животные модели позволяют идентифицировать возможную дополнительную молекулярную мишень DCA. Эксперименты, проведенные на крысах, подчеркнули способность DCA ингибировать экспрессию почечного котранспортера Na-K-2Cl (NKCC) в почках крыс [96] . Поскольку NKCC является важным биомаркером регуляции внеклеточного и внутриклеточного ионного гомеостаза и участвует в прогрессировании клеточного цикла, он играет важную роль в пролиферации раковых клеток, апоптозе и инвазии. Белкахла и др. [97] исследовали взаимодействие между таргетингом метаболизма и экспрессией транспортеров ABC, ответственных за экспорт лекарств из клеток и последующую множественную лекарственную устойчивость, и обнаружили, что лечение DCA способно снизить экспрессию генов и белков транспортеров ABC в нескольких опухолевых клетках, экспрессирующих дикий тип p53, как in vitro, так и in vivo [98] . Уже была продемонстрирована способность DCA вызывать дифференциацию посредством модуляции взаимодействия PKM2/Oct4 в клетках глиомы [99] . Полученное снижение уровней транскрипции Oct4 было связано с уменьшением фенотипа стволовости и значительным повышением чувствительности к клеточному стрессу. Это наблюдение позволяет предположить потенциальную роль DCA против раковых стволовых клеток (CSC).

Рисунок 3: Другие предлагаемые механизмы действия DCA. Основной механизм действия DCA заключается в ингибировании пируватдегидрогеназной киназы (PDK), что приводит к активации пируватдегидрогеназы (PDH) и содействует окислительному фосфорилированию (1). DCA также увеличивает концентрацию промежуточных продуктов каждого цикла Кребса (2) [87]. DCA вызывает токсичность клеток посредством синтеза CoA de novo (3) [88]. DCA может противодействовать ацетату (4) [90]. DCA модулирует внутриклеточное закисление (5) [93, 94]. DCA ингибирует котранспортер Na-K-2Cl (6) [96]. DCA подавляет экспрессию генов и белков транспортеров ABC (7) [97]. DCA снижает экспрессию генов, связанных с самообновлением, и влияет на фракцию стволовых клеток рака (8) [99].

DCA и раковые стволовые клетки

Растет интерес к таргетированию раковых стволовых клеток (CSC), которые, по-видимому, являются основной причиной рецидива опухоли [100] . CSC обладают способностью к самообновлению с нормальными стволовыми клетками и могут давать начало дифференцирующимся клеткам, ответственным за возникновение опухоли, а также злокачественную прогрессию [101] . Низкая скорость пролиферации и специфический метаболический профиль способствуют тому, что CSC становятся устойчивыми к традиционной химиотерапии [102] . Возникла острая необходимость в разработке новых терапевтических средств, способных влиять на жизнеспособность раковых стволовых клеток [103] с целью полного уничтожения опухолевой массы. Обширный объем литературы фокусирует внимание на метаболическом фенотипе CSC, которые, по-видимому, отличаются от дифференцированных раковых клеток и могут представлять собой терапевтическую мишень [104–108] . В этой ситуации была выдвинута гипотеза о возможной чувствительности фракции CSC к DCA, которая была протестирована на различных моделях рака. Эмбриональные стволовые клетки карциномы представляют собой одну из наиболее подходящих моделей для изучения поддержания и дифференциации CSC, а также идентификации препаратов и молекул, способных модулировать эти процессы [109] . Исследования, проведенные на эмбриональных стволовых клетках (ESC), представляют собой предварительные важные доказательства, подтверждающие возможную эффективность DCA [110] . Интересно, что обработка ESC DCA способствует потере плюрипотентности и сдвигает их в сторону более активного окислительного метаболизма, что сопровождается значительным снижением экспрессии HIF1a и p53 [111] . Вега-Наредо и др. [112] описали важность митохондриального метаболизма в управлении стволовостью и дифференциацией в такой модели. Они охарактеризовали метаболический профиль фракции стволовых клеток и предположили меньшую восприимчивость фенотипа ствола к митохондриально-направленной терапии. Принуждение CSC к окислительному метаболизму путем обработки DCA позволило перейти от стволовости к дифференциации. Несколько отчетов подтверждают существование CSC в глиоме [113, 114] , и эффективность DCA для поражения CSC была широко оценена при таком типе рака, который так трудно лечить обычными методами и который характеризуется низкими показателями выживаемости. Еще в 2010 году Микелакис и коллеги предположили, как in vitro, так и in vivo, способность DCA вызывать апоптоз фракции стволовых клеток рака [26] . Модель глиомы на крысах, повторяющая несколько особенностей человеческой глиобластомы, подтвердила эффективность DCA для потенцирования апоптоза CSC глиомы, характеризующегося значительной сверхстимуляцией гликолитического пути по сравнению с нормальными стволовыми клетками [115]. Кроме того, Цзян и др. исследовали влияние DCA на небольшую популяцию стволовых клеток глиомы (GSC), выделенных из глиобластомы, продемонстрировав снижение свойств самообновления и увеличение процента гибели клеток [44] . Более того, тест in vivo на мышах с ксенотрансплантатами, полученными из GSC, обработанных DCA, показал значительное увеличение общей выживаемости. Лечение DCA также было протестировано на фракции стволовых клеток меланомы, и полученная биоэнергетическая модуляция смогла противодействовать протуморогенному действию ингибитора c-Met [116] . Совсем недавно проведенная работа на гепатоцеллюлярной карциноме человека выявила сверхэкспрессию PDK4 в сферах, происходящих из раковых клеток, с определенным фенотипом, подобным стволовому. Интересно, что лечение DCA смогло снизить жизнеспособность как раковых дифференцированных клеток, так и раковых стволовых клеток и обратить вспять химиорезистентность к традиционной терапии [36] . Наша группа недавно испытала способность DCA снижать экспрессию маркеров стволовых клеток рака CD24/CD44/EPCAM в клеточной линии рака поджелудочной железы, а также нарушать образование и жизнеспособность сфероидов [12] , что дополнительно подтверждает данные, полученные в других моделях рака. Наряду с химиорезистентностью, радиорезистентность также представляет собой ограничение эффективного лечения рака, и CSC, по-видимому, ответственны за такую ​​рефрактерность [117] . Сан и др. продемонстрировали способность DCA повышать радиочувствительность клеток медуллобластомы, влияя на стволоподобные клоны, снижая процент экспрессии CD133-позитивных клеток и уменьшая образование сфер [72] . Более того, в той же клеточной модели они показали измененный механизм репарации ДНК, вызванный DCA, способный объяснить повышенную эффективность радиотерапии.

Выводы

Нацеливание на метаболизм раковых клеток представляет собой новый фармакологический подход к лечению рака. Способность DCA переключать метаболизм с гликолиза на окислительное фосфорилирование увеличила интерес к этому препарату, уже известному своими противораковыми свойствами. Накопленные за последние годы доказательства подтверждают способность DCA преодолевать химио- и радиорезистентность при нескольких типах рака и позволяют выдвинуть гипотезу о дополнительных клеточных мишенях, способных объяснить его способность убивать раковые клетки. Необходимо разработать дальнейшие клинические исследования, которые в настоящее время ограничены пациентами с плохим прогнозом и запущенными рецидивирующими новообразованиями, уже не поддающимися другим традиционным методам лечения. Его потенциальная эффективность против раковых стволовых клеток, а также разработка новых лекарственных форм приближают нас к достижению эффективного клинического применения DCA.

Конфликты интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана Текущими исследовательскими фондами Министерства здравоохранения Италии в IRCCS-CROB, Рионеро-ин-Вультуре, Потенца, Италия.

Амигдалин блокирует in vitro адгезию и инвазию клеток

почечно-клеточной карциномы с помощью интегрин-зависимого механизма

• Автор: 
  • Ева Юнгель
   
  • Масуд Афшар
   
  • Ясмина Макаревич
  
  

Аннотация

Информация о природном соединении амигдалине, которое используется в качестве противоопухолевого средства, скудна, и поэтому его эффективность остается спорной. В этом исследовании, чтобы определить, оказывает ли амигдалин противоопухолевое действие на клетки почечно-клеточной карциномы (ПКР), было изучено его влияние на метастатическую активность ПКР. Клеточные линии ПКР, Caki-1, KTC-26 и A498, были подвергнуты воздействию амигдалина из абрикосовых косточек, и была исследована адгезия к эндотелию сосудов человека, иммобилизованному коллагену или фибронектину. Было также определено влияние амигдалина на хемотаксическую и инвазивную активность, а также влияние амигдалина на поверхностную и общую клеточную экспрессию α и β интегринов, которые участвуют в метастазировании. Мы отметили, что амигдалин вызвал значительное снижение хемотаксической активности, инвазии и адгезии к эндотелию, коллагену и фибронектину. Используя анализ FACScan, мы отметили, что амигдалин также индуцировал снижение, особенно в интегринах α5 и α6, во всех трех клеточных линиях. Функциональное блокирование α5 привело к значительному снижению адгезии KTC-26 и A498 к коллагену, а также к снижению хемотаксического поведения во всех трех клеточных линиях. Блокирование интегрина α6 значительно снизило хемотаксическую активность во всех трех клеточных линиях. Таким образом, мы предполагаем, что воздействие амигдалина на клетки почечно-клеточного рака ингибирует метастатическое распространение и связано с подавлением интегринов α5 и α6. Поэтому мы предполагаем, что амигдалин оказывает противоопухолевую активность in vitro, и это может быть связано с регуляцией интегрина.

Введение

Почечно-клеточная карцинома (ПКР) является наиболее распространенной опухолью почки. Примерно у трети пациентов есть метастазы на момент постановки диагноза, и до 30% пациентов развивают метастазы во время терапии. После метастазирования прогноз для пациентов неутешительный. Лучшее понимание молекулярных механизмов действия, лежащих в основе развития и прогрессирования ПКР, способствовало разработке таргетной терапии, тем самым улучшая прогноз для пациентов на поздних стадиях этого заболевания. Однако, несмотря на эти терапевтические достижения, прогноз для пациентов с ПКР остается неблагоприятным, 5-летняя выживаемость составляет от 5 до 12%. Неудовлетворенность традиционной терапией и желание уменьшить побочные эффекты привели многих пациентов к комплементарной и альтернативной медицине (КАМ). До 80% онкологических больных в Соединенных Штатах и ​​более 50% онкологических больных в Европе используют КАМ наряду с традиционной терапией или вместо нее.

Информация об эффективности природных соединений скудна, и некоторые из этих соединений, такие как цианогенный дигликозид амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид), остаются спорными. Амигдалин получают из плодовых косточек семейства розоцветных, которое включает Prunus persica (персик), Prunus armeniaca (абрикос) и Prunus amygdalus var. amara (горький миндаль). Амигдалин, в основном в Соединенных Штатах, назначают онкологическим больным с 1920-х годов. В 1950-х годах была синтезирована и запатентована внутривенная, химически иная форма амигдалина как лаэтрил. Хотя лаэтрил отличается от амигдалина, эти термины часто используются взаимозаменяемо, что затрудняет интерпретацию данных. К 1978 году около 70 000 онкологических больных в США прошли лечение амигдалином. Однако исследования амигдалина, основанные на фактических данных, остаются ограниченными. Клиническое исследование, спонсируемое Национальным институтом рака более 30 лет назад, не выявило никаких признаков регрессии опухоли ( 1 ), тогда как ретроспективный анализ 67 пациентов с опухолями, получавших амигдалин, сообщил о двух полных и четырех частичных ответах ( 2 ). Амбивалентность также отражена в отчетах о случаях: амигдалин был неэффективен в пяти случаях и эффективен в четырех. Насколько нам известно, рандомизированные клинические испытания и последующие исследования не проводились. Сторонники считают амигдалин эффективным натуральным вариантом лечения рака, тогда как противники предупреждают о токсичности из-за метаболизма цианистого водорода.

Метастазы являются основной причиной смертности, связанной с ПКР. Трансэндотелиальная миграция и подвижное распространение являются критическими этапами в распространении и прогрессировании опухоли ( 3 ), а распространение раковых клеток в отдаленные органы представляет собой основную клиническую проблему при лечении рака. В настоящем исследовании изучалось противоопухолевое действие амигдалина на адгезию и миграционные свойства клеток ПКР. Поскольку интегрины активируют ряд внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в пролиферации, дифференцировке и подвижности клеток, был определен паттерн экспрессии рецепторов адгезии интегрина α и β между обработанными амигдалином клетками и необработанными контрольными клетками. Интегрины важны как для здоровья, так и для болезни ( 4 ) и играют ключевую роль в канцерогенезе и прогрессировании рака ( 4 ).

Настоящее исследование основано на предыдущем исследовании, посвященном влиянию амигдалина на метастатические свойства трех линий клеток рака мочевого пузыря ( 5 ). Поскольку были обнаружены некоторые различия в действии амигдалина на метастатические свойства различных линий клеток рака мочевого пузыря, возник вопрос о том, ограничиваются ли различные эффекты амигдалина определенными опухолевыми образованиями или возникают в других. Таким образом, были выбраны три линии клеток RCC, поскольку опухоли RCC являются наиболее агрессивной урологической опухолью.

Материалы и методы

Культура клеток

Клетки карциномы почки, Caki-1, KTC-26 и A498, были приобретены у LGC Promochem GmbH (Wesel, Германия). Клетки выращивали и субкультивировали в среде RPMI-1640 (Seromed, Берлин, Германия) с добавлением 10% сыворотки плода теленка (FCS), 20 мМ буфера HEPES, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 . Субкультуры из пассажей 5–24 были отобраны для экспериментального использования. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были выделены из пупочных вен человека и собраны путем ферментативной обработки диспазой (1 МЕ/мл; Gibco-Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). HUVEC выращивали в среде 199 (M199; Biozol, Мюнхен, Германия), дополненной 10% FCS, 10% объединенной человеческой сыворотки, 20 мкг /мл фактора роста эндотелиальных клеток (Boehringer, Мангейм, Германия), 0,1% гепарина, 100 нг/мл гентамицина и 20 мМ буфера HEPES (pH 7,4). Субкультуры из пассажей 1–5 были отобраны для экспериментального использования. Институциональный этический комитет больницы университета Гете, Франкфурт, Германия, отказался от необходимости получения согласия, поскольку HUVEC использовались анонимно для анализов in vitro и не имели связи с данными пациентов.

Лечение амигдалиномы

Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток, а затем добавлен к опухолевым клеткам в концентрации 10 мг/мл [ранее оцененной как оптимальная концентрация ( 6 )] либо на 24 часа, либо на 2 недели (лечение применялось три раза в неделю) для оценки острого и хронического лечения. Контрольные группы оставались необработанными. Во всех экспериментах сравнивались обработанные и необработанные культуры опухолевых клеток. Для изучения токсического действия амигдалина жизнеспособность клеток определялась трипановым синим (Gibco-Invitrogen).

Адгезия опухолевых клеток

Для анализа адгезии опухолевых клеток HUVEC переносили в 6-луночные мультипланшеты (Sarstedt, Nümbrecht, Германия) в полной среде HUVEC. Когда они достигали слияния, клетки Caki-1, KTC-26 и A498 отсоединяли от культуральных колб обработкой аккутазой (PAA Laboratories, Cölbe, Германия), а затем добавляли 0,5×10 6 клеток и оставляли на монослое HUVEC на 1, 2 или 4 часа. Затем неприкрепившиеся опухолевые клетки смывали с помощью подогретого (37°C) PBS (Ca 2+ и Mg 2+ ). Оставшиеся клетки фиксировали 1% глутаральдегидом. Подсчет адгезивных опухолевых клеток производился в пяти различных полях определенного размера (5×0,25 мм2 ) с использованием фазово-контрастного микроскопа (ID03, 471202-9903; Carl Zeiss Microscopy GmbH, Геттинген, Германия), после чего рассчитывалась средняя скорость клеточной адгезии.

Присоединение к иммобилизованным белкам внеклеточного матрикса

24-луночные планшеты покрывали коллагеном G (извлеченным из телячьей кожи, состоящим из 90% коллагена типа I и 10% коллагена типа III, и разведенным до 400 мкг /мл в PBS; Biochrom, Берлин, Германия) или фибронектином (извлеченным из мышей и разведенным до 100 мкг /мл в PBS; Becton-Dickinson, Гейдельберг, Германия) на ночь. Пластиковые чашки служили фоновым контролем. Планшеты промывали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS для блокирования неспецифической клеточной адгезии. Затем в каждую лунку добавляли опухолевые клетки (0,1×10 6 ) и оставляли на 30 минут для инкубации. Затем не прилипшие опухолевые клетки смывали, оставшиеся прилипшие клетки фиксировали 2% глутаральдегидом и подсчитывали микроскопически. Средний показатель клеточной адгезии, определяемый соотношением адгезивных клеток, хорошо покрытых слоем, и адгезивных клеток, фон, был рассчитан по пяти различным полям наблюдения.

Хемотаксическая активность

Сывороточно-индуцированное хемотаксическое движение исследовали с использованием 6-луночных камер Transwell (Greiner, Frickenhausen, Германия) с порами 8 мкм . Клетки (0,5×10 6 клеток Caki-1, KTC-26 или A498/мл) помещали в верхнюю камеру в бессывороточной среде, либо без амигдалина (контроль), либо содержащей амигдалин. Нижняя камера содержала 10% сыворотки. После ночной инкубации верхнюю поверхность мембраны transwell осторожно протирали ватным тампоном, чтобы удалить клетки, которые не мигрировали. Клетки, перемещающиеся на нижнюю поверхность мембраны, окрашивали гематоксилином и подсчитывали микроскопически. Средняя скорость миграции рассчитывалась из пяти различных полей наблюдения.

Вторжение

Вторжение исследовали с помощью хемотаксического движения, вызванного сывороткой, через мембрану (Greiner) с порами 8 мкм , предварительно покрытую коллагеном G (извлеченным из телячьей кожи, состоящим из 90% коллагена типа I и 10% коллагена типа III; разбавленным до 400 мкг /мл в PBS; Biochrom) и HUVEC, выращенными до слияния. Клетки Caki-1, KTC-26 или A498 (0,5×10 6 /мл) помещали в верхнюю камеру в бессывороточной среде, либо без амигдалина (контроль), либо содержащей амигдалин. Нижняя камера содержала 10% сыворотки. После инкубации в течение ночи верхнюю поверхность мембраны transwell осторожно протирали ватным тампоном, чтобы удалить клетки, которые не мигрировали. Клетки, которые переместились на нижнюю поверхность мембраны, окрашивали гематоксилином и подсчитывали микроскопически. Средний показатель миграции рассчитывался в пяти различных полях наблюдения.

Экспрессия поверхности интегрина

Опухолевые клетки промывали в блокирующем растворе (PBS, 0,5% BSA), а затем инкубировали в течение 60 мин при 4°C с конъюгированными с фикоэритрином (PE) моноклональными антителами, направленными против следующих подтипов интегринов: анти-α1 (мышиный IgG1; клон SR84; #559596), анти-α2 (мышиный IgG2a; клон 12F1-H6; #555669), анти-α3 (мышиный IgG1; клон C3II.1; #556025), анти-α4 (мышиный IgG1; клон 9F10; #555503), анти-α5 (мышиный IgG1; клон IIA1; #555617), анти-α6 (мышиный IgG2a; клон GoH3; #555736), анти-β1 (мышиный IgG1; клон MAR4; #555443), анти-β3 (мышиный IgG1; клон VI-PL2; #555754) или анти-β4 (крысиный IgG2b; клон 439-9B; #555720) (все от BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия). Экспрессия интегрина опухолевых клеток затем измерялась с помощью FACScan (BD Biosciences, Гейдельберг; анализ гистограммы канала FL-2H (log); 1×10 4 клеток/сканирование) и выражалась как средняя относительная интенсивность флуоресценции (RFI). В качестве изотипических контролей использовали мышиный IgG1-PE (MOPC-21; #555749), IgG2a-PE (G155-178; #555574) и крысиный IgG2b-PE (R35-38; #555848; все от BD Biosciences).

вестерн-блоттинг

Для исследования содержания интегрина лизаты опухолевых клеток наносили на 7–12% полиакриламидный гель (в зависимости от размера белка) и подвергали электрофорезу в течение 90 мин при 100 В. Затем белок переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования обезжиренным сухим молоком в течение 1 часа мембраны инкубировали в течение ночи со следующими антителами: интегрин α1 (кроличий, поликлональный, 1:1000; #AB1934; Chemicon/Millipore GmbH, Швальбах, Германия), интегрин α2 (мышиный IgG1, 1:250, клон 2; #611017; BD Biosciences), интегрин α3 (кроличий, поликлональный, 1:1000; #AB1920; Chemicon/Millipore GmbH), интегрин α4 (мышиный, 1:200, клон: C-20; #sc-6589; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта-Крус, Калифорния, США)], интегрин α5 (мышиный IgG2a, 1:5000, клон 1; #610634; BD Biosciences), интегрин α6 (кролик, 1:200, клон H-87; #sc-10730; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) и интегрин β1 (мышиный IgG1, 1:2500, клон 18; #610468), интегрин β3 (мышиный IgG1, 1:2500, клон 1; #611141) и интегрин β4 (мышиный IgG1, 1:250, клон 7; #611233) (все от BD Biosciences). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG и конъюгированные с HRP козьи антикроличьи IgG (оба 1:5000; Upstate Biotechnology, Лейк-Плэсид, штат Нью-Йорк, США) служили в качестве вторичных антител. Кроме того, сигнализация, связанная с интегрином, была исследована с помощью антител к антиинтегрин-связанной киназе (ILK) (клон 3, разведение 1:1000; № 611803), антифокальной адгезионной киназе (FAK) (клон 77, разведение 1:1000; № 610088) и анти-p-специфической FAK (pY397; клон 18, разведение 1:1000; № 611807) (все от BD Biosciences). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG (разведение 1:5000; Upstate Biotechnology) служили в качестве вторичных антител. Мембраны были кратковременно инкубированы с реагентом для обнаружения ECL (ECL™; Amersham, GE Healthcare, Мюнхен, Германия) для визуализации белков, а затем проанализированы с помощью системы Fusion FX7 (Peqlab, Эрланген, Германия). β-актин (1:1000; Sigma-Aldrich) служил в качестве внутреннего контроля.

Для анализа плотности пикселей белковых полос использовалось программное обеспечение Gimp 2.8. Было рассчитано соотношение интенсивности белка/интенсивности β-актина, выраженное в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%.

Блокировка экспериментов

Чтобы определить, влияют ли интегрины α5 и α6 на метастатическое распространение независимо от амигдалина в клеточных линиях Caki-1, KTC-26 и A498, клетки инкубировали в течение 60 мин с 10 мкг /мл мышиных моноклональных антител против интегрина α5 (клон P1D6) или крысиных моноклональных антител против интегрина α6 (клон NKI-GoH3) (оба от Millipore). Контрольные образцы инкубировали только с клеточной культуральной средой. Затем адгезию опухолевых клеток к иммобилизованному коллагену, а также хемотаксис анализировали, как описано выше.

Статистический анализ

В настоящем исследовании все эксперименты проводились 3–6 раз. Статистическая значимость определялась с помощью U-критерия Вилкоксона, Манна-Уитни. Значение p < 0,05 считалось указывающим на статистически значимое различие.

Результаты

Амигдалин блокирует взаимодействие между эндотелием опухолевых клеток и матриксом опухолевых клеток

После 24 часов обработки амигдалином адгезия опухолевых клеток A498 к HUVEC значительно снизилась, но адгезия клеток Caki-1 и KTC-26 не снизилась (по сравнению с необработанными контролями, принятыми за 100%) ( рис. 1 ). Увеличение времени воздействия амигдалина до 2 недель значительно снизило адгезию к HUVEC во всех трех линиях опухолевых клеток ( рис. 1 ).

Рисунок 1 Адгезия Caki-1, KTC-26 и A498 к эндотелию (эндотелиальные клетки пуповины человека; HUVEC). Опухолевые клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные образцы оставались необработанными. Опухолевые клетки (0,5×106 клеток/лунку) добавляли и оставляли на монослое HUVEC в течение 1, 2 или 4 ч. Оценивалось среднее количество адгезированных опухолевых клеток из пяти полей, а также рассчитывался процент обработанных клеток почечно-клеточной карциномы (RCC) по сравнению с необработанными контрольными клетками (принято за 100%, пунктирная линия). *Значительное различие с контрольными образцами. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). n=5 экспериментов, p≤0,05.

Амигдалин вызвал значительное снижение связывающей способности всех трех линий клеток RCC с иммобилизованным коллагеном и фибронектином по сравнению с контрольной группой ( рис. 2 ). Прикрепление всех трех линий клеток к матричным белкам было снижено через 24 часа, а также через 2 недели. В клеточной линии KTC-26 кратковременное применение амигдалина (24 часа) вызвало большее снижение адгезии, чем долгосрочное применение амигдалина (2 недели).

Рисунок 2 (A) Адгезия Caki-1, KTC-26 и A498 к иммобилизованному коллагену (слева) и (B) фибронектину (справа). Опухолевые клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалином в течение 24 ч или 2 недель. Необработанные клетки почечно-клеточной карциномы (ПКР) служили в качестве контроля. Клетки (0,1×106 клеток/лунка) добавляли к иммобилизованному коллагену или фибронектину. Среднее количество адгезированных опухолевых клеток из пяти полей рассчитывали через 30 мин. *Значительное различие с контролем. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). n=6 экспериментов, p≤0,05.

Амигдалин изменяет подвижность опухолевых клеток почечно-клеточного рака

Хемотаксическая активность клеток Caki-1, KTC-26 и A498 значительно снизилась после 24 ч и 2 недель применения амигдалина по сравнению с необработанными контрольными клетками ( рис. 3A ). Инвазия опухолевых клеток через покрытые коллагеном мембраны transwell также значительно снизилась в клетках Caki-1 и A498 после 24 ч и 2 недель применения амигдалина ( рис. 3B ). Однако 2 недели применения амигдалина не снизили инвазивную способность клеток KTC-26.

Рисунок 3 Влияние амигдалина на клетки почечно-клеточной карциномы (ПКР): хемотаксис (A) и инвазия (B). Клетки ПКР, обработанные амигдалином в течение 24 ч или 2 недель, высевали в верхнюю камеру с хемоаттрактантом в лунке ниже. Подсчитывали клетки, мигрирующие через мембрану через 20 ч. Контрольные клетки не получали амигдалин и были установлены на 100% (пунктирная линия). *Значительное различие с контрольными клетками. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). n=5 экспериментов, p≤0,05.

Амигдалин модулирует поверхностную экспрессию интегрина α и β

Клетки Caki-1, KTC-26 и A498 характеризовались различными базальными поверхностными паттернами экспрессии интегринов α и β ( рис. 4A ). Caki-1 заметно экспрессировал α3 и β1, умеренно экспрессировал α5 и β3, тогда как α1, α2, α4, α6 и β4 были лишь незначительно обнаружены. KTC-26 сильно экспрессировал α3 и β1. Члены подтипа α1, α2, α5, α6, β3 и β4 были умеренно экспрессированы, а α4 не был обнаружен. Профиль экспрессии интегринов A498 был похож на профиль KTC-26, за исключением α4, который был обнаружен для A498. Мы также отметили, что β4 присутствовал в клетках KTC-26, но не в клетках A498.

Рисунок 4 (A) Базальная поверхностная экспрессия подтипов интегрина почечно-клеточной карциномы (RCC) и (B) разница (%) с необработанным контролем через 24 часа или 2 недели воздействия амигдалина. RFI, относительная интенсивность флуоресценции. nd, не обнаруживается. *Значительная разница с контролем. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD), p≤0,05.

Применение амигдалина в течение двадцати четырех часов и в течение двух недель изменило профиль поверхности интегрина, который является специфическим для типа клеток ( рис. 4B ). Мы отметили, что α5 и α6 были значительно подавлены во всех клеточных линиях после двух недель воздействия амигдалина. β1, который был сильно выражен во всех трех клеточных линиях, также был значительно снижен после двух недель применения амигдалина. Высокая базальная экспрессия рецептора α3 была снижена в Caki-1 и KTC-26, но не в A498, под действием амигдалина. Различия также были отмечены в отношении α2 и β3, оба из которых были снижены в клетках Caki-1, но повышены в клетках KTC-26 и A498 через две недели. Сниженные уровни экспрессии β4 были обнаружены в клетках Caki-1 и KTC-26 после воздействия амигдалина.

Амигдалин влияет на общее содержание клеточных интегринов

Оценка содержания белка интегрина после 24 ч воздействия амигдалина выявила значительную положительную регуляцию α2 и отрицательную регуляцию α3 и p-FAK ( рис. 5 ). β1 был значительно повышен в Caki-1 и KTC-26, тогда как α6 был значительно снижен в Caki-1 и A498, а общее содержание α5 было снижено в клетках A498 через 24 ч. В клетках Caki-1 α4 и β4 увеличились, а β3 уменьшился.

Рисунок 5 (A) Вестерн-блот-анализ общего содержания интегрина в клетках Caki-1, KTC-26 и A498, подвергнутых воздействию амигдалина в течение 24 ч или 2 недель, и необработанных контролях. В качестве внутреннего контроля использовался β-актин. (B) Анализ плотности пикселей белковых полос вестерн-блоттинга. Соотношение интенсивности белка/интенсивности β-актина было рассчитано и выражено в процентах по отношению к контролям, установленным на 100% (0) после того, как клетки подвергались воздействию амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов. nd, не обнаружено. *Значительное различие с контролями, p≤0,05.

После 2 недель воздействия амигдалина интегрин α2 значительно увеличился, даже больше, чем после воздействия в течение 24 часов. В клетках A498 α3 и β3 увеличились после 2 недель воздействия амигдалина. Снижение β1 и p-FAK произошло в клетках KTC-26, а β4 был подавлен как в Caki-1, так и в KTC-26 после 2 недель воздействия амигдалина ( рис. 5 ).

Блокировка экспериментов

Профили экспрессии интегрина всех трех линий клеток были изменены амигдалином. Поскольку поверхностный интегрин α5 и интегрин α6 были сильно снижены во всех трех линиях клеток после применения амигдалина, эти интегрины были выбраны для исследований функциональной блокировки, чтобы выяснить, коррелируют ли эти снижения с изменениями адгезии и миграции опухолевых клеток. Блокирование α5 привело к значительному ингибированию адгезии клеток KTC-26 и A498 к коллагену ( рис. 6A ). Однако адгезия клеток Caki-1 к коллагену не была существенно затронута. Блокирование интегрина α5 привело к снижению хемотаксической активности во всех трех линиях клеток ( рис. 6B ). Блокирование рецептора α6 не оказало существенного влияния на адгезию к коллагену ни в одной из линий клеток ( рис. 6A ), но значительно снизило хемотаксис во всех трех линиях клеток ( рис. 6B ).

Рисунок 6 Влияние функциональной блокировки интегрина α5 и α6 на (A) адгезию клеток к коллагену и (B) хемотаксис. Неблокированные клетки служили в качестве контроля (100%, пунктирная линия). Оценивалось среднее количество адгезированных или хемотаксически активных клеток из пяти полей (0,25 мм2). Полосы указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). *Значительное различие с контролем. n=3 эксперимента, p≤0,05.

Обсуждение

Было отмечено, что взаимодействие между опухолевыми клетками и эндотелием играет решающую роль в метастатической прогрессии; адгезия клеток немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) к эндотелию стенки сосудов была связана с трансмиграцией опухолевых клеток, что приводит к метастазам в мозг и лимфатические узлы ( 7 ). Более агрессивный, метастазирующий фенотип рака также был связан с повышенной адгезией ( 7 ). В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что воздействие амигдалина привело к значительному ингибированию связывающего взаимодействия между клетками RCC и монослоем HUVEC, коллагеном и фибронектином. Таким образом, была ингибирована хемотаксическая и инвазивная активность клеток RCC. Такое ингибирование является клинически значимым, поскольку трансэндотелиальная миграция и подвижное распространение являются критическими этапами в распространении и прогрессировании опухоли ( 3 ) и коррелируют с плохой выживаемостью. Снижение миграционного потенциала было связано с успешной терапией опухолей и менее злокачественным фенотипом опухоли ( 8 ). Таким образом, мы предполагаем, что ингибирование адгезии и подвижности клеток почечно-клеточного рака амигдалином снижает распространение метастазов.

Эффект амигдалина на блокирование адгезии и миграции не ограничивается клетками почечно-клеточного рака. Недавно было показано, что амигдалин также подавляет адгезивное поведение клеток рака мочевого пузыря ( 5 ). Хотя амигдалин оказывал схожее подавляющее действие на адгезионные свойства клеток рака мочевого пузыря и почечно-клеточного рака, миграция клеток рака мочевого пузыря была затронута амигдалином по-разному. Хемотаксис был подавлен в двух, но повышен в одной линии клеток рака мочевого пузыря после воздействия амигдалина, что указывает на то, что влияние амигдалина, вероятно, зависит от сущности опухоли. Таким образом, важно исследовать влияние амигдалина на различные сущности опухоли.

Семейство интегринов вовлечено во все этапы метастатической прогрессии опухоли ( 4 , 7 ). Интегрин α5 повышается в опухолевых клетках эпителиального происхождения, и была установлена ​​положительная корреляция между экспрессией интегрина α5 и адгезией клеток почечно-клеточного рака ( 9 ). В настоящем исследовании введение амигдалина значительно снизило поверхностный интегрин α5 во всех трех клеточных линиях. Кроме того, общее клеточное содержание интегрина α5 в зависимости от времени снижалось в присутствии амигдалина. Блокирование функции интегрина α5 вызвало значительное ингибирование адгезии клеток KTC-26 и A498 к коллагену и снижение хемотаксической активности всех используемых клеточных линий. В соответствии с настоящими данными, снижение регуляции интегрина α5 ранее было связано со снижением адгезивного и инвазивного поведения нескольких типов раковых клеток ( 10–12 ) .

В настоящем исследовании мы отметили, что адгезия коллагена клеток Caki-1 не снизилась после блокирования интегрина α5, в отличие от вызванного амигдалином снижения в клетках A498 и KTC-26. Подобное различие в функции интегрина между типами опухолевых клеток наблюдалось ранее. Было показано, что блокирование интегрина α5 ингибирует взаимодействие клеток с матриксом клеток рака мочевого пузыря HCV29 и BC3726, но усиливает связывание линий клеток рака мочевого пузыря T24 и Hu456 (оснащенных другим набором интегринов) ( 13 ). Аналогичным образом, было показано, что блокирование интегрина β1 ингибирует прикрепление клеток рака мочевого пузыря UMUC-3 к коллагену, но оказывает противоположный адгезивный эффект на клетки TCCSUP, которые характеризуются другим профилем экспрессии интегринов ( 5 ). В настоящем исследовании воздействие амигдалина вызвало увеличение поверхностного β3 интегрина в клетках KTC-26 и A498, но уменьшение в клетках Caki-1. Контррегуляция с участием другого подтипа интегрина, в данном случае β3, может объяснить, почему блокирование α5 не остановило адгезию в клетках Caki-1. Потеря интегрина α5 вызвала снижение хемотаксиса во всех трех клеточных линиях. Поэтому мы предполагаем, что потеря поверхностного интегрина α5 является механизмом, посредством которого амигдалин действует на миграцию клеток RCC, а тонкая настройка производительности интегрина зависит от конкретного профиля интегрина в конкретной клеточной линии.

Было показано, что интегрин α6 облегчает миграцию эпителиальных клеток и коррелирует с риском прогрессирования, метастазирования и смерти в клинических испытаниях ( 14 ). Другие исследования показали, что интегрин α6 способствует миграции и инвазии при колоректальном раке ( 15 ), а также карциномах поджелудочной железы ( 16 ) и молочной железы ( 17 ). Было отмечено, что интегрин α6 активирует FAK ( 18 ) и связанную с FAK нисходящую сигнализацию, которая имеет отношение к контролю подвижности клеток, выживаемости и пролиферации ( 4 ). В настоящем исследовании поверхностная экспрессия интегрина α6 была значительно снижена, а FAK был дезактивирован амигдалином во всех трех клеточных линиях. Блокирование поверхностного интегрина α6 показало, что α6 не мешает адгезии опухолевых клеток, но регулирует подвижность клеток. Поэтому вполне вероятно, что снижение α6 представляет собой механизм, с помощью которого амигдалин замедляет распространение клеток.

Было показано, что интегрин β1 способствует инвазии клеток при раке молочной железы, легких, поджелудочной железы и колоректальном раке, а также при глиоме, меланоме ( 4 ) и нейробластоме ( 19 ). В клетках рака предстательной железы было показано, что повышение уровня интегрина β1 сопровождается повышенным подвижным поведением, тогда как блокада интегрина β1 способствует снижению хемотаксиса, миграции и адгезии клеток ( 10 ). Ингибирование интегрина β1 было связано с уменьшением инвазии и метастазирования рака яичников ( 12 ), а ингибитор пептида интегрина α5β1, как было показано, блокирует метастазирование рака молочной железы in vivo ( 20 ). В настоящем исследовании поверхностный интегрин β1 был снижен во всех трех линиях опухолевых клеток после 2 недель воздействия амигдалина. Таким образом, амигдалин может воздействовать на интегрин β1, замедляя подвижное распространение клеток почечно-клеточного рака.

Исследования in vitro и in vivo показывают, что α3 является еще одним интегрином, участвующим в инвазии глиомы, меланомы, гепатоцеллюлярной и молочной карциномы, а также способствует метастазированию клеток молочной железы в легкие ( 4 ). Блокирование интегрина α3 привело к ингибированию адгезии клеток рака простаты ( 21 ). В настоящем исследовании поверхностный интегрин α3 был снижен в клетках Caki-1 и KTC-26, но не в клетках A498. Это неоднородное снижение указывает на специфичный для клеточной линии эффект, вызванный амигдалином.

Применение амигдалина, помимо модуляции экспрессии поверхностного интегрина, также изменило общее содержание клеточного интегрина. В настоящем исследовании общая экспрессия клеточного интегрина α2 была повышена во всех трех линиях опухолевых клеток после воздействия амидалина. Предыдущие исследования показали, что снижение уровня интегрина α2 в опухолевых клетках потенциально увеличивает распространение опухолевых клеток, а повторная экспрессия интегрина α2, как было показано, обращает вспять злокачественные свойства клеток рака молочной железы ( 22 ). Следовательно, мы предполагаем, что индуцированное амигдалином ингибирование адгезии и миграции опухолевых клеток, наблюдаемое здесь, связано с повышением регуляции интегрина α2.

Общий клеточный интегрин α3 снизился через 24 ч после нанесения амигдалина во всех трех клеточных линиях. Это согласуется с вызванным амигдалином снижением поверхностного α3 в клетках Caki-1 и KTC-26. Поскольку поверхностный α3 не был изменен в клетках A498, возможно, что амигдалин в этой клеточной линии действует через внутриклеточные сигнальные пути α3. p-FAK, который был сильно снижен в клетках A498 через 24 ч после нанесения амигдалина, подтверждает эту гипотезу, поскольку ось α3-FAK участвует в инициации и прогрессировании рака ( 23 ). Ли и др. продемонстрировали, что FAK является критическим медиатором опухолеобразования и метастазирования, которые частично зависят от интегрина α3 ( 24 ). Поэтому мы предполагаем, что снижение как интегрина α3, так и FAK дезактивирует двигательный аппарат клеток A498.

Общий клеточный интегрин β1 был повышен в клетках Caki-1 после применения амигдалина, в то время как поверхностная экспрессия была снижена. Этот тип сдвига не является необычным и указывает на транслокацию рецептора с поверхности во внутриклеточный компартмент. Хотя значимость этого процесса не полностью понята, было показано, что перемещение интегрина β1 к плазматической мембране увеличивает метастатический потенциал клеток RCC, тогда как остановка рециркуляции β1 путем поддержания высокого содержания цитоплазматической и низкого содержания плазматической мембраны снижает метастазирование ( 25 ). Было показано, что повышение внутриклеточного β1 связано с дезактивацией FAK ( 25 ), что коррелирует с настоящими результатами.

Эффекты амигдалина на экспрессию подтипа интегрина зависели от клеточной линии, от того, было ли время применения острым (24 ч) или хроническим (2 недели) и от того, находился ли интегрин на поверхности клетки или в цитоплазме. Таким образом, молекулярный способ действия амигдалина в отношении экспрессии подтипа интегрина не является однородным и может влиять как на механическое межклеточное сцепление, запускаемое интегрином, так и на активацию биохимического пути, контролируемого интегрином.

В трех исследованных линиях клеток RCC применение амигдалина значительно снизило инвазивное и подвижное поведение. Однако 2 недели применения амигдалина не снизили инвазивную способность клеток KTC-26. Снижение было преимущественно связано с уменьшением поверхностных интегринов α5 и α6. Однако этот механизм не следует обобщать. Хотя было показано, что амигдалин также ингибирует адгезию и миграцию в клетках рака мочевого пузыря, интегрины изменяются по-разному. Интегрины α5 и α6, по-видимому, являются важной мишенью амигдалина в клетках RCC, тогда как модуляция интегринов β1 или β4 была наиболее очевидна в клетках рака мочевого пузыря ( 5 ). Были начаты дальнейшие исследования in vitro , чтобы оценить, влияет ли амигдалин также на рост клеток RCC, как это наблюдалось для клеток рака мочевого пузыря ( 6 ).

В заключение, воздействие амигдалина на клетки RCC подавляет метастатическое распространение и связано с подавлением α5 и α6 интегринов. Таким образом, амигдалин проявляет противоопухолевую активность in vitro в RCC. Эта активность in vitro должна быть оценена на модели животных.

Благодарности

Настоящее исследование было поддержано «Фондом Бригитты и Норберта Мут» и «Друзья и сторонники Франкфуртского университета Гете».

ВЛИЯНИЕ ДИХЛОРАЦЕТАТА НАТРИЯ НА РОСТ И МЕТАСТАЗИРОВАНИЕ КАРЦИНОМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИСА

Д.Л. Колесник1, О.Н. Пясковская1, И.В. Бойчук1, О.И. Дасюкевич1, О.Р. Мельников1, А.С. Тарасов1, Г.И. Соляник1

1Институтэкспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии имени

Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев 03022, Украина.

Корреспонденция: Д.Л. Колесник, E-mail: deniskol@mail.ru

Поступила в редакцию: 20 марта 2015 г

Аннотация

Отличительной чертой злокачественных опухолей является чрезмерный гликолиз опухоли, даже в присутствии кислорода, что вызывает лактацидоз в микроокружении опухоли и способствует пролиферации и выживанию опухолевых клеток. По этой причине антиметаболические агенты, направленные на метаболизм опухолевых клеток, активно исследуются как перспективные противораковые препараты. Цель: изучить влияние лактацидоза на выживание клеток карциномы легких Льюиса (LLC) в условиях дефицита питательных субстратов in vitro и оценить противоопухолевую и антиметастатическую активность против LLC/R9 in vivo. Материалы и методы: В качестве экспериментальной опухолевой модели использовали вариант LLC/R9. Жизнеспособность опухолевых клеток определяли с помощью окрашивания трипановым синим. Уровень апоптоза подсчитывали с помощью красителя Hoechst 33258. Содержание лактата в опухолевой ткани оценивали ферментным методом с использованием лактатдегидрогеназы. Реактивные виды кислорода определяли с помощью 2,7-дихлорфлуоресцеин диацетата. Влияние дихлорацетата (ДХА) на рост и метастазирование LLC/R9 анализировали с помощью рутинных процедур. Оценка влияния ДХА на компоненты электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) проводилась с помощью ЭПР. Результаты: Показано, что в условиях лактацидоза и дефицита глюкозы жизнеспособность клеток LLC/R9 in vitro была выше на 30% (р < 0,05), а уровень апоптоза был в три раза ниже (р < 0,05), чем эти показатели в условиях только дефицита глюкозы. У мышей с пересаженными опухолями LLC/R9, которых в течение 3 недель per os лечили DCA в общей дозе 1,5 г/кг массы тела, начиная со следующего дня после пересадки опухоли, объем первичной опухоли был всего на 30% меньше, чем в контрольной группе. В то же время количество и объем метастазов в легких у животных, получавших DCA, были на 59% (р < 0,05) и 94% (р < 0,05) ниже, соответственно, чем эти показатели в контрольной группе. Лечение DCA привело к увеличению содержания лактата в опухолевой ткани почти на 30% (р < 0,05) по сравнению с контролем, но не оказало существенного влияния на уровни комплексов гемового железа с NO (при gmed = 2,007) в белках митохондриального ЭТЦ и белков Fe-S кластера (при g = 1,94) в опухолевых клетках. Выводы: Показано, что лактацидоз значительно способствовал выживанию клеток LLC/R9 в условиях дефицита глюкозы in vitro. При развитии LLC/R9 in vivo DCA, как соединение с антилактацидозной активностью, не подавлял существенно рост первичной опухоли, но обладал значительной антиметастатической активностью.

Ключевые слова: дихлорацетат; гипоксическая радиочувствительность; рак молочной железы; реактивные виды кислорода
Сокращения: DCA — дихлорацетат, ETC — электронно-транспортная цепь; LLC/R9 — вариант карциномы легких Льюиса; PDH — пируватдегидрогеназа; PDK — киназа пируватдегидрогеназы.

ВВЕДЕНИЕ

Хорошо известно, что лактацидоз, большое накопление лактата и снижение рН, является основной характеристикой метаболического микроокружения опухолевых клеток in vitro и in vivo. Ранее лактацидоз рассматривался как балластный продукт метаболизма опухолевых клеток. Однако недавно было показано, что он может использоваться опухолевыми клетками в качестве эффективного энергетического топлива и быть одним из факторов, ответственных за устойчивость опухоли к дефициту глюкозы [1-3]. Как мы показали на примере клеток карциномы легких Льюиса (LLC)/R9, варианта LLC, чувствительного к антиангиогенной терапии рака [4,5], лактацидоз может способствовать выживанию опухолевых клеток в условиях дефицита питания. Такие условия были созданы путем длительной инкубации опухолевых клеток без замены культуральной среды (модель «непитательной культуры») [6]. Изучение кинетики роста опухолевых клеток в условиях «непитательной культуры» показало, что на фоне полного отсутствия глюкозы в инкубационной среде на 7-8 день роста клеток количество жизнеспособных клеток не падало ниже третьей части от максимума, зарегистрированного на 3-4 день, и оставалось практически на этом уровне до10 дня. Высокая выживаемость клеток LLC/R9 в условиях «некормленой культуры» была связана, в частности, со способностью этих клеток к макроавтофагии. Однако нельзя исключить, что способность клеток LLC/R9 к адаптации к дефициту питательных субстратов определялась лактацидозом, развившимся вследствие длительного культивирования опухолевых клеток без замены инкубационной среды.

Если лактацидоз способен повышать выживаемость опухолевых клеток, то соединения, подавляющие образование лактацидоза в опухолевом микроокружении, в частности, дихлорацетат (ДХА) как соединение с антилактацидозной активностью, должны проявлять противоопухолевую активность. Настоящее исследование было направлено на проверку этого предположения.

Известно, что DCA является ингибитором киназы пируватдегидрогеназы (PDK), поэтому его рассматривают как негативный регулятор ферментов митохондриального комплекса пируватдегидрогеназы (PDH), который играет ключевую роль в регуляции трикарбоновых кислот и окислительного фосфорилирования [7]. Если комплекс PDH фосфорилирован, вход пирувата в цикл Кребса ингибируется, поэтому активируется гликолиз. Благодаря ингибированию PDK, DCA способен привести к непрямой активации ферментов комплекса PDH и, соответственно, вызвать сдвиг энергетического баланса клетки от гликолиза в сторону активации окислительного фосфорилирования. Поэтому DCA широко используется для коррекции лактации, вызванной высокой интенсивностью гликолиза или дефектом клеточного дыхания.

Согласно литературным данным, способность ДКА активировать окислительное фосфорилирование лежит в основе его противоопухолевой активности и реализуется, в частности, через снижение лактацидоза и индукцию реактивных форм кислорода (ROS) [8-12]. Целью нашего исследования был анализ влияния лактацидоза на выживаемость клеток LLC/R9 в условиях дефицита питательных веществ in vitro и оценка противоопухолевой и антиметастатической активности DCA против LLC/R9 in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальные животные, опухолевые клетки
В исследовании использовали 2,0-2,5-месячных мышей линии C57Bl/6 весом 18-23 г, выращенных на базе Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии имени Р.Е. Кавецкого НАН Украины. Протоколы исследований и процедуры работы с животными проводились в соответствии с основными требованиями к содержанию и работе с лабораторными животными и правилами местного комитета по биоэтике.

В исследовании использовали вариант LLC LLC/R9, полученный из штамма LLC дикого типа путем 9 последовательных сеансов химиотерапии in vivo на основе цис-диамминдихлороплатина (цис-ДДП) [13]. Клетки LLC/R9 поддерживали в культуральной среде RPMI (Sigma, США), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS) (Sigma, США), и 40 мг/мл гентамицина при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5%CO2.

Эксперименты in vitro
Количество клеток в суспензии и их жизнеспособность регулярно анализировали на гемоцитометре с использованием теста исключения трипанового синего.

Для оценки влияния лактацидоза на жизнеспособность клеток LLC/R9, 1,5-105 клеток/лунку высевали в 24-луночный планшет в среду RPMI 1640 (Sigma, США) со стандартным содержанием глюкозы. После ночной инкубации клеток инкубационную среду заменяли свежей средой с различным содержанием глюкозы, лактата и с различным pH для моделирования условий дефицита глюкозы, лактацидоза на фоне дефицита глюкозы, а также стандартной (табл. 1). Глюкозодефицитную среду готовили на основе среды RPMI 1640 без глюкозы (Sigma, США). Лактацидоз генерировали путем добавления чистой молочной кислоты (Sigma, США) в среду с дефицитом глюкозы до конечной концентрации 14 ± 0,7 мМ и рН 6,7.

Таблица 1. Содержание глюкозы, лактата и рН культуральных сред, использованных в исследовании

Влияние различных условий инкубации на выживаемость опухолевых клеток, производство ROS, потребление глюкозы и производство лактата оценивали на2-й день инкубации опухолевых клеток.

Содержание глюкозы в культуральной среде и в гомогенатах опухолевой ткани определяли ферментным глюкозооксидантным методом с использованием набора для анализа глюкозы в биологических жидкостях (Sigma, США) согласно инструкции производителя. Содержание лактата в инкубационной среде и в гомогенатах опухолевой ткани определяли методом ферментной спектрофотометрии с использованием лактатдегидрогеназы (Sigma, США) [14]. Образцы среды и опухолевых тканей собирали и хранили при -20 °С или в жидком азоте, соответственно, до проведения измерений.

Уровень апоптоза в опухолевых клетках анализировали с использованием красителя Hoechst 33258 (Sigma, США) и флуоресцентной микроскопии по стандартной методике.

Продукцию ROS в опухолевых клетках определяли с использованием 2,7-дихлорфлуоресцеин диацетата (Sigma, США) методом спектрофлуорометрии (возбуждение при 495 нм, эмиссия при 530 нм) согласно [15].

Все измерения были повторены.

Эксперименты in vivo
Для экспериментов in vivo клетки LLC/R9 размножали in vitro в стандартных условиях и инокулировали i.m. мышам (1,0-106 клеток/животное в 0,1 мл раствора Хенкса).

После инокуляции клеток LLC/R9 животных распределили на 2 группы: группа 1 — мыши, обработанные DCA (Sigma, США) в общей дозе 1,5 г/кг (LD50/3) (n = 13); группа 2 — мыши, обработанные водой в том же режиме и в том же объеме (контроль, n = 12).

Лечение было начато на следующий день после трансплантации опухолевых клеток по метрономическому режиму, 5 раз в неделю в течение 3 недель. DCA готовили ex tempore в воде и вводили per os в объеме 0,4 мл/животное.

Объем первичной опухоли рассчитывали на основании ее диаметра, измеряемого штангенциркулем каждый3-й день, начиная с10-го дня после инокуляции опухолевых клеток, по формуле:

V = π (d)3/6,

где d — диаметр опухоли (мм).

Уровень метастазирования у мышей, несущих опухоль, оценивали на 21-й день после инокуляции опухолевых клеток по количеству и объему метастазов в легких с помощью бинокулярного микроскопа и миллиметровой шкалы.

Общий объем метастазов рассчитывали по формуле:

V = Σ niπ(di)3/6,

где V — общий объем метастазов (мм3), ni — количество метастазов с диаметромdi (мм).

Анализ функциональной активности компонентов дыхательной цепи митохондрий в опухолевых клетках проводили с использованием ЭПР на21-е сутки после инокуляции опухолевых клеток. Опухолевую ткань нарезали на образцы специального размера (d = 4,0 мм, l = 25-35 мм), замораживали и хранили при температуре -70 °С. ЭПР-анализ образцов проводили при 77 К на спектрофотометре Е-109 Varian (США) при скорости развертки потенциала 500 Е/мин, амплитуде модуляции 1,25×10 Е, мощности СВЧ-облучения 10.0 мВт, постоянном сеансе работы аппарата 1,0 с. По данным спектров ЭПР определяли уровни комплексов гемового железа с NO (при gmed = 2,007) в белках ЭТЦ митохондрий и белков Fe-S кластера (при g = 1,94) в опухолевых клетках.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью описательных методов, нелинейного регрессионного анализа и t-теста Стьюдента с использованием программ Microsoft Excel и Microcal Origin.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Было показано, что лактацидоз в условиях дефицита глюкозы значительно способствовал выживанию клеток LLC/R9. Действительно, кинетика роста опухолевых клеток, инкубированных в условиях лактацидоза на фоне дефицита глюкозы, существенно не отличалась от таковой у клеток, инкубированных в среде со стандартным содержанием глюкозы, по крайней мере, в период их экспоненциального роста. В частности, количество жизнеспособных клеток на2-е сутки инкубации в условиях лактацидоза на фоне дефицита глюкозы было практически таким же, как и в случае инкубации клеток в среде со стандартным содержанием глюкозы. В то же время в обоих случаях (лактацидоз и стандарт) количество жизнеспособных клеток было почти на 30% (р < 0,05) выше, чем при инкубации клеток в условиях дефицита глюкозы (рис. 1, а).

Кроме того, количество апоптотических клеток в условиях лактацидоза также статистически не отличалось от показателя в случае инкубации клеток в среде со стандартным содержанием глюкозы и на2-е сутки было равно 8,5 ± 0,9%, тогда как в условиях дефицита глюкозы количество апоптотических клеток было почти в три раза выше (р < 0,05), чем в случае лактацидоза (рис. 1, б).

Рис. 1. Выживаемость клеток LLC/R9 на2-й день инкубации в стандартной (1), глюкозодефицитной (2) и лактацидозной (3) средах; а — количество жизнеспособных клеток; б — уровень апоптоза. *p < 0,05 по сравнению с контролем

Интересно, что в условиях лактацидоза в клетках LLC/R9 потребление глюкозы было значительно ниже. Низкая скорость потребления глюкозы опухолевыми клетками при лактацидозе, зарегистрированная только на1-е сутки инкубации, восстанавливалась на2-е сутки и была на 70% ниже (p < 0,05), чем в случае среды со стандартным содержанием глюкозы (табл. 2). В случае дефицита глюкозы в противоположность лактацидозу на2-е сутки уровень глюкозы в инкубационной среде падал до нуля, что дополнительно свидетельствовало о снижении потребления глюкозы клетками LLC/R9 в условиях лактацидоза.

В то время как лактацидоз приводил к снижению скорости потребления глюкозы клетками LLC/R9, уровень внутриклеточных ROS в клетках, выживших в таких условиях, значительно возрастал. Эти данные представлены в таблице 2 и показывают, что уровень ROS в клетках, инкубированных в условиях лактацидоза, был почти на 150% (p < 0,05) и 230% (p < 0,05) выше соответствующих показателей для клеток, инкубированных в стандартной и глюкозодефицитной среде, соответственно.

Таким образом, полученные данные показали, что лактацидоз значительно способствовал выживанию клеток LLC/R9 в условиях дефицита глюкозы in vitro, что подтверждается высоким числом выживших в таких неблагоприятных условиях клеток и низким уровнем апоптоза. Выживание клеток было связано с неожиданным повышением уровня внутриклеточного ROS и снижением потребления глюкозы в LLC/R9.

Таблица 2. Влияние лактацидоза в условиях дефицита глюкозы на потребление глюкозы и продукцию ROS опухолевыми клетками in vitro.

Примечание: *p < 0,05.

Данные закономерности выживания клеток LLC/R9 в условиях лактацидоза на фоне дефицита глюкозы in vitro свидетельствовали о том, что снижение содержания лактата в опухолевом микроокружении может препятствовать выживанию опухолевых клеток в условиях метаболического стресса, оказывая противоопухолевый эффект. Эта гипотеза была проверена нами с использованием DCA как соединения, способного уменьшать лактацидоз.

Данные о влиянии DCA на кинетику роста и метастазирование LLC/R9 представлены на рис. 2 и в табл. 3. Согласно этим данным, DCA не оказывал существенного влияния на рост первичных опухолей, но вызывал выраженное подавление метастазирования. Кинетика роста первичных опухолей у мышей с LLC/R9, обработанных ДКА, практически не отличалась от таковой у контрольных мышей, и на21-й день после пересадки опухоли объем первичных опухолей в опытной группе был всего на 39% меньше, чем в контрольной (см. рис. 2, табл. 3). Несмотря на то, что DCA не подавлял рост первичной опухоли, его антиметастатическая активность в отношении LLC/R9 оказалась поразительной. Количество и объем метастазов в легких у мышей с опухолью, получавших DCA, были на 59% (р < 0,05) и 94% (р < 0,05) ниже, чем эти показатели в контрольной группе, соответственно (см. табл. 3).

Рис. 2. Влияние DCA на кинетику роста LLC/R9 in vivo

Таблица 3. Влияние DCA на рост и метастазирование LLC/R9.
Примечание: *р < 0,05, различия значительны по сравнению со значением для контроля.

Анализ содержания лактата в образцах опухолевой ткани показал, что неожиданно DCA вызвал значительное увеличение содержания лактата в опухолевой ткани, по крайней мере, на21-й день после пересадки опухоли. Как видно из таблицы 4, содержание лактата в опухолевой ткани мышей, получавших DCA, было почти на 30% выше (р < 0,05), чем в контроле. Учитывая способность DCA как ингибитора PDH-киназы реорганизовывать энергетический метаболизм злокачественной опухоли в сторону окислительного фосфорилирования, мы рассматривали продукцию лактата опухолевыми клетками как суррогатный маркер ингибирования гликолиза при воздействии DCA. Повышение уровня лактата в опухоли под действием DCA показало, что его введение мышам с LLC/R9 в общей дозе 1,5 г/кг массы тела животного может быть недостаточным для активации окислительного фосфорилирования в опухолевых клетках, что отчасти объясняет его низкую эффективность против первичных опухолей.

Таблица 4. Влияние DCA на уровень лактата в опухолевой ткани мышей-носителей LLC/R9.
Примечание: р < 0,05, различия значительны по сравнению со значением для контроля.

Анализ спектров ЭПР опухолевых образцов показал, что ДКА не оказывал существенного влияния на функциональное состояние компонентов ЭТЦ в митохондриях опухолевых клеток (табл. 5). Например, у мышей с LLC/R9, леченных ДКА, интенсивность сигналов ЭПР, соответствующих белковым комплексам нитрозил-гемовое железо (gсер = 2,007) в белках ЭТК митохондрий опухолевых клеток, не была существенно выше, чем у контрольных мышей. Известно, что накопление NO-комплексов гемового железа может свидетельствовать, с одной стороны, о редокс-дисбалансе в сторону доминирования свободнорадикальных процессов, в частности, гиперпродукции NO, а с другой — о возможном ингибировании клеточного дыхания через нитрозилирование гемовых белков. Однако DCA, основной механизм противоопухолевого действия которого, как считается, связан с индукцией продукции ROS митохондриями [8, 10, 11], не вызывал повышения уровня комплексов железа гема с NO в опухолевой ткани. Последнее наблюдение, возможно, связано с особенностями клеток LLC/R9, а именно с чрезвычайно высоким содержанием этих комплексов, характерным для этой опухоли, прогрессивное накопление которых в процессе развития опухоли in vivo было зарегистрировано нами даже в отсутствие лечения [16].

Таблица 5. Влияние DCA на активность митохондриального ЭТЦ опухолевых клеток

Отсутствие существенного влияния ДКА на функциональную активность компонентов митохондриального ЭТЦ в опухолевых клетках подтверждается также данными об интенсивности сигналов ЭПР, соответствующих белкам Fe-S-кластера (g = 1,94) (комплексы І, ІІ, ІІІ), которая была практически одинаковой в обеих группах животных (см. табл. 5).

В заключение, результаты нашего исследования показали, что лактацидоз значительно способствовал выживанию варианта LLC LLC/R9 в условиях дефицита глюкозы. В то же время при развитии LLC/R9 in vivo DCA не оказывал противоопухолевой активности против первичных опухолей. Отсутствие противоопухолевого действия DCA против роста LLC/R9 согласуется с отсутствием ингибирующего эффекта DCA на содержание лактата в опухоли, а также с отсутствием заметного влияния DCA на продукцию ROS опухолевыми клетками. Хотя DCA не влиял на рост LLC/R9, но резко подавлял метастазирование, это наблюдение не может быть объяснено действием DCA в первичной опухоли, и требуются дальнейшие дополнительные исследования его антиметастатического действия.

ССЫЛКИ

1 Feron O. Пируват в лактат и обратно: от эффекта Варбурга до симбиотического обмена энергетического топлива в раковых клетках. Radiother Oncol 2009; 92: 329-33. doi: 10.1016/j.radonc.2009.06.025.
2 Wu H, Ding Z, Hu D, et al. Центральная роль молочнокислого ацидоза в устойчивости раковых клеток к вызванной недостатком глюкозы клеточной гибели. J Pathol 2012; 227: 189-99. doi: 10.1002/path.3978.
3 Fiaschi T, Marini A, Giannoni E, et al. Reciprocal metabolic reprogramming through lactate shuttle coordinately influences tumor-stroma interplay. Cancer Res 2012; 72: 5130-40.
4 Соляник Г.И., Федорчук А.Г., Пясковская О.Н., и др. Противораковая активность аконитинсодержащего растительного экстракта BC1. Exp Oncol 2004; 26: 307-11.
5 Пясковская О.Н. Антиангиогенное действие циклофосфамида на экспериментальные метастатические опухоли. J Med Chem 2012; 2: 25-9 (на украинском языке).
6 Колесник Д. Л., Пясковская О. Н., Трегубова Н. В., Соляник Г. И. Вариант карциномы легких Льюиса с высокой чувствительностью к противоопухолевой антиангиогенной терапии проявляет высокую способность к аутофагии. Cytol Genet 2012; 46: 155-60. doi: 10.3103/S009545271203005X.
7 Stacpoole PW. Фармакология дихлорацетата. Metabolism 1989; 38: 1124-44.
8 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, et al. A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell 2007; 11: 37-51.
9 Wong JY, Huggins GS, Debidda M, et al. Dichloroacetate induces apoptosis in endometrial cancer cells. Gynecol Oncol 2008; 109: 394-402. doi: 10.1016/j.ygyno.2008.01.038.
10 Michelakis ED, Sutendra G, Dromparis P, et al. Metabolic modulation of glioblastoma with dichloroacetate. Sci Transl Med 2010; 2: 31-4. doi: 10.1126/scitranslmed.3000677.
11 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, et al. Sodium dichloroacetate selectively target cells with defects in the mitochondrial ETC Int J Cancer 2010; 127; 2510-19.
12 Kumar A, Kant S, Singh SM. Novel molecular mechanisms of antitumor action of dichloroacetate against T cell lymphoma: Влияние измененного метаболизма глюкозы, гомеостаза рН и регуляции выживания клеток. Chem Biol Interact 2012; 199: 29-37.
13 Pyaskovskaya ON, Dasyukevich OI, Kolesnik DL, et al. Changes in VEGF level and tumor growth characteristics during Lewis lung carcinoma progression towards cis-DDP resistance. Exp Oncol 2007; 29: 197-202.
14 Биохимические методы (липидный и энергетический обмен). М.И. Прохорова, ред. Л.: Ленинградский университет, 1982. 272 p.
15 Wang H, Joseph JA. Количественная оценка клеточного окислительного стресса с помощью анализа на дихлорфлуоресцеин с использованием микропланшетного ридера. Free Radic Biol Med 1999; 27: 612-6.
16 Пясковская О.Н., Сорокина Л.В., Колесник Д.Л., и др. Динамика изменений показателей антиоксидантной системы в процессе роста двух вариантов карциномы легких Льюиса. Exp Oncol 2014; 36: 29-33.

Амигдалин подавляет рост клеток почечно-клеточной карциномы in vitro

• Авторы: 
  • Ева Юнгель
   
  • Анита Томас
  
  

Аннотация

Хотя амигдалин используется многими онкологическими больными в качестве противоопухолевого средства, отсутствует информация об эффективности и токсичности этого природного соединения. В настоящем исследовании изучалось ингибирующее действие амигдалина на рост клеток почечно-клеточной карциномы (ПКР). Амигдалн (10 мг/мл) применялся к линиям клеток ПКР, Caki-1, KTC-26 и A498, в течение 24 часов или 2 недель. Необработанные клетки служили в качестве контроля. Рост и пролиферацию опухолевых клеток определяли с помощью тестов MTT и BrdU, а также оценивали фазы клеточного цикла. Экспрессия активирующих клеточный цикл белков cdk1, cdk2, cdk4, циклина A, циклина B, циклина D1 и D3, а также ингибирующих клеточный цикл белков p19 и p27 изучалась с помощью вестерн-блоттинга. Также исследовалась поверхностная экспрессия маркеров дифференциации E- и N-кадгерина. Функциональная блокада siRNA использовалась для определения влияния нескольких белков на рост опухолевых клеток. Лечение амигдалином вызвало значительное снижение роста и пролиферации клеток RCC. Этот эффект коррелировал с уменьшением процента клеток RCC в фазе G2/M и увеличением процента клеток в фазе G0/1 (Caki-1 и A498) или остановкой клеточного цикла в S-фазе (KTC-26). Кроме того, амигдалин вызвал заметное снижение белков, активирующих клеточный цикл, в частности cdk1 и циклина B. Функциональное блокирование cdk1 и циклина B привело к значительному снижению роста опухолевых клеток во всех трех линиях клеток RCC. Помимо ингибирующего воздействия на рост, амигдалин также модулировал маркеры дифференциации, E- и N-кадгерин. Следовательно, воздействие амигдалина на клетки RCC подавляло прогрессирование клеточного цикла и рост опухолевых клеток за счет нарушения экспрессии cdk1 и циклина B. Более того, мы отметили, что амигдалин влияет на маркеры дифференциации. Таким образом, мы предполагаем, что амигдалин оказывает противоопухолевое действие на ПКР in vitro.

Введение

Почечно-клеточная карцинома (ПКР) является наиболее распространенным раком почки и самой агрессивной урологической опухолью, и ее заболеваемость растет ( 1 ). Примерно у 15-20% пациентов с ПКР уже есть метастазы на момент постановки диагноза, в то время как у 30% пациентов метастазы развиваются во время терапии. После метастазирования прогноз для пациентов неблагоприятный. Расширение знаний о молекулярных механизмах действия ПКР способствовало разработке таргетной терапии в течение последнего десятилетия, тем самым улучшая прогноз для пациентов на поздних стадиях заболевания. Однако, несмотря на терапевтические достижения, прогноз для пациентов с ПКР остается неблагоприятным, 5-летняя выживаемость остается между 5 и 12% ( 2 , 3 ).

Большинство пациентов с прогрессирующим раком почки хотят активно участвовать в борьбе с раком и/или избегать неблагоприятных побочных эффектов, которые часто возникают при традиционной терапии. Поэтому многие пациенты обращаются к комплементарной и альтернативной медицине (КАМ). Более 50% онкологических больных в Европе ( 4 ) и до 80% онкологических больных в Соединенных Штатах ( 5 ) используют КАМ вместе с традиционной терапией или вместо нее.

Амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид) — это природное соединение, которое часто используют онкологические больные. Он содержится в косточках абрикосов, персиков, яблок и горького миндаля ( 6–8 ). Первые исследования по использованию амигдалина онкологическими больными были проведены в России в 1840-х годах ( 9 ). В 1920-х годах амигдалин также назначали онкологическим больным в Соединенных Штатах ( 10 ). В 1950-х годах был представлен полусинтетический , химически иной производный амигдалина, лаэтрил. После появления лаэтрила термины амигдалин и лаэтрил часто использовались как синонимы, что затрудняло выводы из исследований, в которых не делалось различий между этими двумя соединениями ( 11 ) . В 1970-х годах амигдалин/леатрил стал одним из самых популярных нетрадиционных методов лечения рака. К 1978 году около 70 000 онкологических больных в США использовали амигдалин ( 12 ) . Национальный институт рака (NCI) инициировал несколько исследований ( 13–16 ) с отрезвляющими результатами. В резюме единственного испытания фазы II не было приписано существенной пользы амигдалину, в то время как было описано несколько пациентов с симптомами отравления цианидом (HCN) ( 13 ) . Однако качество этого исследования сомнительно, поскольку использовалась гетерогенная когорта пациентов, не были включены контрольные группы, а для внутривенной терапии использовался рацемат вместо чистого амигдалина. Все официальные суждения относительно амигдалина были основаны на этом испытании, поскольку никаких других клинических испытаний с амигдалином не доступно. Немецкий федеральный институт лекарственных средств и медицинских приборов (BfArM) ( http://www.bfarm.de/DE/Home/home_node.html ) также классифицировал амигдалин как сомнительный препарат, как и коллеги в других странах. Несмотря на противоречия и отсутствие научно обоснованных данных о пользе и рисках амигдалина, многие онкологические пациенты используют амигдалин ( 11 , 17 ). Таким образом, чтобы прояснить многие вопросы, на которые еще предстоит ответить относительно влияния амигдалина на рост и пролиферацию опухоли, в настоящем исследовании были определены прогрессия клеточного цикла и основные молекулярные режимы действия в клетках почечно-клеточного рака.

Материалы и методы

Клеточные культуры и лечение амигдалином

Линии клеток карциномы почки Caki-1, KTC-26 и A498 были приобретены у LGC Promochem (Wesel, Германия). Клетки выращивали и субкультивировали в среде RPMI-1640 (полученной у Seromed, Берлин, Германия) с добавлением 10% FCS, 20 мМ HEPES-буфера, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в инкубаторе. Субкультуры из пассажей 5–24 были отобраны для использования в экспериментах. Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток и затем добавлен к опухолевым клеткам в концентрации 10 мг/мл [ранее оцененной как оптимальная концентрация ( 18 )] на 24 часа или 2 недели (три раза в неделю) для оценки острого и хронического лечения. Контрольные группы оставались необработанными. Во всех экспериментах в настоящем исследовании обработанные культуры опухолевых клеток сравнивались с необработанными культурами опухолевых клеток. Для изучения токсического действия амигдалина жизнеспособность клеток определялась с помощью трипанового синего (Gibco/Invitrogen, Дармштадт, Германия).

Измерение роста, пролиферации и апоптоза опухолевых клеток

Рост клеток оценивали с помощью анализа восстановления красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) (Roche Diagnostics, Пенцберг, Германия). Клетки Caki-1 (50 мкл , 1×10 5 клеток/мл) высевали на 96-луночные планшеты для культивирования тканей. Через 24, 48 и 72 часа добавляли 10 мкл МТТ (0,5 мг/мл) еще на 4 часа. После этого клетки лизировали в буфере, содержащем 10% SDS в 0,01 М HCl. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO 2 . Поглощение при 550 нм определяли для каждой лунки с помощью микропланшетного иммуноферментного анализа (ELISA). После вычитания фонового поглощения результаты выражались как среднее количество клеток.

Пролиферацию клеток измеряли с помощью набора для определения пролиферации клеток BrdU ELISA (Calbiochem/Merck Biosciences, Дармштадт, Германия). Опухолевые клетки, посеянные на 96-луночных планшетах, инкубировали с 20 мкл раствора для маркировки BrdU на лунку в течение 8 ч, фиксировали и детектировали с помощью анти-BrdU mAb в соответствии с инструкциями производителя. Поглощение измеряли при 450 нм с помощью ридера для микропланшетов ELISA.

Для оценки того, был ли рост опухолевых клеток нарушен или уменьшен из-за апоптоза, экспрессия аннексина V/пропидиум йодида (PI) была оценена с помощью набора Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия). Опухолевые клетки были дважды промыты PBS и затем инкубированы с 5 мкл Annexin V-FITC и 5 мкл PI в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки были проанализированы методом проточной цитометрии с использованием FACSCalibur (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия). Процент апоптотических клеток (ранних и поздних) в каждом квадранте был рассчитан с помощью программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences).

Процент клеток в разных фазах клеточного цикла

Анализ клеточного цикла проводился на субконфлюэнтных клеточных культурах. Популяции опухолевых клеток окрашивались PI с использованием набора реагентов CycleTEST PLUS DNA, а затем подвергались проточной цитометрии с использованием FACScan (оба от Becton-Dickinson, Гейдельберг, Германия). Из каждого образца было собрано 10 000 событий. Сбор данных проводился с использованием программного обеспечения CellQuest, а распределение клеточного цикла рассчитывалось с использованием программного обеспечения ModFit (Becton-Dickinson). Количество клеток с гейтированием в фазах G1, G2/M или S выражается в процентах.

Экспрессия белков, регулирующих клеточный цикл

Белки, регулирующие клеточный цикл, исследовали с помощью вестерн-блоттинга. Лизаты опухолевых клеток наносили на 7-15% полиакриламидный гель (в зависимости от размера белка) и подвергали электрофорезу в течение 90 мин при 100 В. Затем белок переносили на нитроцеллюлозные мембраны (1 ч, 100 В). После блокирования обезжиренным сухим молоком в течение 1 часа мембраны инкубировали в течение ночи с моноклональными антителами, направленными против следующих белков клеточного цикла, которые все были от BD Biosciences: cdk1 (IgG1, клон 1, разведение 1:2500; #610038), cdk2 (IgG2a, клон 55, разведение 1:2500; #610146), cdk4 (IgG1, клон 97, разведение 1:250; #610148), циклин A (IgG1, клон 25, разведение 1:250; #611269), циклин B (IgG1, клон 18, разведение 1:1000; #610220), циклин D1 (IgG1, клон G124-326, разведение 1:250; #554181), циклин D3 (IgG2b, клон 1, разведение 1:1000; #610280), p19 (IgG1, клон 52/p19, разведение 1:5000; #610530), p27 (IgG1, клон 57, разведение 1:500; #610244). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG (разведение 1:5000; #12-349; Merck Millipore, Темекула, Калифорния, США) служили в качестве вторичных антител. Мембраны ненадолго инкубировали с реагентом для обнаружения ECL (ECL™; Amersham/GE Healthcare, Мюнхен, Германия) для визуализации белков, а затем анализировали с помощью системы Fusion FX7 (Peqlab, Эрланген, Германия). В качестве внутреннего контроля служил β-актин (разведение 1:1000; #A5441; Sigma, Тауфенкирхен, Германия).

Поверхностная экспрессия E- и N-кадгерина

Опухолевые клетки промывали в блокирующем растворе (PBS, 0,5% BSA), а затем инкубировали в течение 60 мин при 4°C с моноклональными антителами (mAB), конъюгированными с фикоэритрином (PE), направленными против следующих антител: анти-человеческий E-кадгерин-PE (мышиный IgG2b, клон 180224; #FAB18381P) и анти-человеческий N-кадгерин-PE (крысиный IgG2a, клон 401408; #IC1388P) (оба от R&D Systems, Висбаден, Германия). Затем поверхностную экспрессию E- и N-кадгерина клеток RCC измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием FACscan [анализ гистограммы канала FL-2H (log); 1×10 4 клеток/сканирование; BD Biosciences] и выражали в виде средних единиц флуоресценции. В качестве изотипического контроля служили крысиный IgG2a-PE (клон RG7/1.30; № 558067) или мышиный IgG2b-PE (клон 27-35; № 555743) (оба от BD Biosciences).

Блокировка экспериментов

Чтобы определить, влияют ли cdk1 и циклин B на рост опухолевых клеток в клеточных линиях Caki-1, KTC-26 и A498, клетки были трансфицированы. Опухолевые клетки (3×10 5 /6-луночные) были трансфицированы малой интерферирующей РНК (siRNA), направленной против cdk1 (Hs_CDC2_10, идентификатор гена: 983, целевая последовательность: AAGGGGTTCCTAGTACTGCAA) или циклина B (Hs_CCNB1_6, идентификатор гена: 891, целевая последовательность: AATGTAGTCATGGTAAATCAA) (оба от Qiagen, Хильден, Германия), с реагентом siRNA/трансфекции (реагент трансфекции HiPerFect; Qiagen) в соотношении 1:6. Необработанные клетки и клетки, обработанные 5 нМ контрольной siRNA (AllStars Negative Control siRNA; Qiagen), служили в качестве контролей. Затем рост опухолевых клеток определяли, как указано выше.

Статистический анализ

Все эксперименты проводились 3–6 раз. Статистическая значимость определялась с помощью U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Значение p < 0,05 считалось указывающим на статистически значимую разницу.

Результаты

Рост и пролиферация опухолевых клеток блокируются амигдалином

Воздействие амигдалина (10 мг/мл) в течение 24 ч или 2 недель привело к значительной и схожей степени ингибирования роста в течение 72 ч во всех трех линиях клеток почечно-клеточного рака, Caki-1, KTC-26 и A498, по сравнению с необработанными контрольными клетками ( рис. 1 ). Пролиферация клеток Caki-1, KTC-26 и A498 также была значительно снижена после 24 ч или 2 недель воздействия амигдалина по сравнению с контрольными клетками ( рис. 2 ). Противоопухолевые эффекты в клетках почечно-клеточного рака были сопоставимы после 24 ч и 2 недель лечения амигдалином ( рис. 2 ).

Рисунок 1 Рост клеток почечно-клеточной карциномы (RCC), (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498. Клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные клетки оставались необработанными. Количество клеток было установлено на уровне 100% после 24 ч инкубации. Полоски указывают на среднее значение ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значительное отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Рисунок 2 Пролиферация клеток почечно-клеточной карциномы (RCC). Клетки (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498 обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные группы оставались без обработки. Полоски указывают средние значения ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значимое отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Ни апоптоз, ни некроз не индуцируются амигдалином.

После введения амигдалина не было выявлено ни значительного раннего или позднего апоптоза, ни индукции некроза (данные не представлены).

Амигдалин изменяет процент клеток почечно-клеточного рака в фазах G0/1, S и G2/M

Амигдалин значительно увеличил процент клеток Caki-1 и A498 в фазе G0/G1 и уменьшил количество клеток в фазе S и G2/M через 24 ч и 2 недели ( рис. 3 ) воздействия по сравнению с необработанными контролями. В клетках KTC-26 амигдалин вызвал значительное снижение процента клеток в фазе G2/M, в то время как клетки в фазе S увеличились (24 ч, <2 недель). Не было измерено значительного увеличения процента клеток в фазе G0/G1 после 24-часовой обработки амигдалином в клетках KTC-26. Через 2 недели обработки амидалином в клетках KTC-26, сопровождавшейся увеличением S-фазы, количество клеток в фазе G0/G1 значительно снизилось ( рис. 3 ) по сравнению с контролем.

Рисунок 3 Влияние амигдалина на распределение клеток почечно-клеточной карциномы (ПКР) в различных фазах клеточного цикла. Указан процент клеток Caki-1 (Caki), KTC-26 (KTC) и A498 в фазах G01/1, S и G2/M. Клетки ПКР, обработанные амигдалином в течение 24 ч или 2 недель, сравнивались с необработанными контрольными клетками. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Амигдалин вызывает снижение экспрессии белка, активирующего клеточный цикл

Мы отметили, что изменения в прогрессии клеточного цикла сопровождались модуляцией белков, регулирующих клеточный цикл ( рис. 4 ). Во всех трех клеточных линиях, Caki-1, KTC-26 и A498, обработка амигдалином в течение 24 ч и 2 недель способствовала снижению регуляции активирующих клеточный цикл белков cdk1, cdk2 и cdk4, а также циклинов A и B, причем самые сильные эффекты были отмечены в отношении экспрессии cdk1 и циклина B. Циклин D1 также был снижен в Caki-1 и KTC-26 через 24 ч ( рис. 4 , левая панель) и в Caki-1 и A498 после 2 недель применения амигдалина ( рис. 4 , правая панель). Не было обнаружено выраженных изменений для циклина D3 ни в одной клеточной линии. В отличие от белков, активирующих клеточный цикл, экспрессия белка p19, ингибирующего клеточный цикл, была усилена после воздействия амигдалина в клеточных линиях Caki-1 (24 ч и 2 недели) и A498 (24 ч). p27 также был повышен в клетках A498 (24 ч) ( рис. 4 , левая панель). Однако p19 и p27 были снижены в клетках KTC-26, а снижение p27 было отмечено в клетках Caki-1 через 24 ч.

Рисунок 4 Профиль экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл, в клетках почечно-клеточной карциномы (RCC). Клетки Caki-1, KTC-26 и A498 после 24 ч (левая панель) или 2 недель (правая панель) воздействия амигдалина и необработанные контроли. −, контроль; +, амигдалин. β-актин служил внутренним контролем. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Снижение уровня cdk1 и циклина B связано с ингибированием роста, вызванным амигдалином.

В связи с тем, что в настоящем исследовании наиболее яркое ингибирующее действие амигдалина было отмечено в отношении экспрессии cdk1 и циклина B, влияние этих двух белков на рост опухолевых клеток оценивалось путем блокирования их функции с помощью siRNA. Нокдаун cdk1 и циклина B привел к значительному ингибированию роста клеток во всех трех клеточных линиях по сравнению с необработанным и имитированным контролем ( рис. 5A–C ). Во всех трех клеточных линиях RCC блокирование экспрессии белков cdk1 и циклина B было подтверждено с помощью вестерн-блоттинга ( рис. 5D ).

Рисунок 5 Рост опухолевых клеток почечно-клеточного рака (RCC). (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498 после функциональной блокировки с помощью siRNA, нацеленной на cdk1 и циклин B. AllStars отрицательный контроль siRNA служил в качестве контроля трансфекции (макет). Контроли оставались необработанными. Полоски указывают стандартное отклонение (SD). * p≤0,05, значимое различие с контролем. n=5 экспериментов. (D) Профиль экспрессии белка регулирующих клеточный цикл белков клеток Caki-1, KTC-26 и A498 после функциональной блокировки с помощью siRNA, нацеленной на cdk1 и циклин B. AllStars отрицательный контроль siRNA служил в качестве контроля трансфекции (макет). Контроли оставались необработанными. β-актин служил в качестве внутреннего контроля. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Маркеры дифференциации модулируются обработкой амигдалином

Дедифференцировка опухолевых клеток сопровождается потерей E-кадгерина и повышенной экспрессией N-кадгерина. Экспрессия этих двух маркеров дифференцировки была определена для того, чтобы оценить, влияет ли амигдалин на дифференцировку опухолевых клеток. После 24 ч обработки амигдалином мы отметили значительное снижение поверхностного N-кадгерина в трех клеточных линиях ( рис. 6 ). После 2 недель обработки амигдалином было отмечено заметное увеличение экспрессии E-кадгерина на поверхности клеток Caki-1 и KTC-26 ( рис. 6A и B ). В клетках KTC-26 повышение E-кадгерина было связано со значительным снижением поверхностного N-кадгерина ( рис. 6B ). Однако экспрессия N-кадгерина в клетках Caki-1 значительно увеличилась после 2 недель воздействия амигдалина, хотя MFU все еще была ниже, чем для E-кадгерина ( рис. 6A ). Никакого существенного влияния на Е-кадгерин в клетках А498 после 2 недель применения амигдалина отмечено не было.

Рисунок 6 Поверхностная экспрессия маркеров дифференциации E- и N-кадгерина на клетках почечно-клеточной карциномы (RCC). (A) Клетки Caki-1, (B) KTC-26 и (C) Клетки A498 через 24 часа и 2 недели применения амигдалина. Поверхностная экспрессия указана как средние относительные единицы флуоресценции [MFU (%)]. Контрольные значения были установлены на уровне 100% (пунктирная линия). Полоски указывают средние значения ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значимое отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы отметили, что обработка линий клеток почечно-клеточного рака Caki-1, KTC-26 и A498 амигдалином вызвала значительное ингибирование роста и пролиферации клеток. Подобное снижение роста после применения амигдалина было отмечено в клетках немелкоклеточного рака легких ( 19 ) и рака мочевого пузыря ( 18 ) in vitro , а также в клетках рака шейки матки in vivo ( 20 ). На основании наших данных мы приходим к выводу, что ингибирование роста, вызванное амигдалином, не связано с апоптозом или некрозом. Другие раковые клетки, такие как клетки рака шейки матки, мочевого пузыря и простаты, реагируют на амигдалин апоптозом, что приводит к ингибированию роста ( 18 , 20 , 21 ). Таким образом, способ действия амигдалина, по-видимому, зависит от типа рака.

Хотя ингибирование роста во всех трех линиях клеток RCC сопровождалось изменениями в процентном содержании клеток в различных фазах клеточного цикла, изменения не были однородными. Обработка клеток Caki-1 и A498 амигдалином вызвала увеличение клеток в фазе G0/G1 за счет снижения S- (Caki-1 и A498) и G2/M-фаз (Caki-1). Обработка амигдалином вызвала увеличение клеток в фазе S в клетках KTC-26, в то время как фазы G2/M и G0/G1 были снижены через 2 недели. Повышение количества клеток в фазе S в KTC-26 после применения амигдалина, вероятно, свидетельствует об остановке клеточного цикла в S-фазе. В различных линиях клеток рака мочевого пузыря также была отмечена блокада роста, вызванная амигдалином, которая осуществлялась путем различного влияния на прогрессирование клеточного цикла, увеличивая процент клеток в фазе G0/G1 в одной линии клеток и повышая количество клеток в фазе S в другой ( 18 ).

Изменение процентного содержания фаз клеточного цикла коррелировало с модуляцией экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл. Во всех трех линиях клеток RCC большинство белков, активирующих клеточный цикл, были снижены после лечения амигдалином, в частности cdk1 и циклин B. Известно, что Cdk1 является ключевой киназой для митотического входа ( 22 ). Было показано, что ось cdk1-циклин B в опухолевых клетках участвует в продвижении митоза и преодолении остановки клеточного цикла, зависящей от химиотерапии ( 23 ). Во всех трех линиях клеток RCC снижение cdk1 и циклина B было связано с ингибирующим эффектом, оказываемым амигдалином, что доказано с помощью нокдауна siRNA. Наряду с осью cdk1-циклин B, ось cdk2-циклин A также была отчетливо изменена в клетках RCC. Cdk2/циклин A способствует переходу из фазы G1 в фазу S и, как было показано, важен для ингибирования клеток рака мочевого пузыря, вызванного амигдалином ( 18 ). Мы предполагаем, что накопление клеток G0/G1 было обусловлено ингибирующим эффектом, который амигдалин оказывал на cdk2 и циклин B. Однако обработка клеточной линии KTC-26 амигдалином не привела к остановке фазы G0/G1, а скорее к остановке фазы S. Предположительно, это связано с ингибирующим клеточный цикл белком p19, уровень которого был повышен в клетках Caki-1 и A498 после применения амигдалина, но снижен в клетках KTC-26. p19 участвует в активности контрольной точки G1, останавливая вход клеток в фазу S ( 24 ). Ингибирование p19 увеличивает фракцию клеток в фазе S ( 25 ). Таким образом, это, вероятно, объясняет, почему мы отметили увеличение в фазе G0/G1 клеток Caki-1 и A498, в то время как клетки KTC-26 накапливались в фазе S. Следовательно, мы предполагаем, что вызванные амигдалином изменения в экспрессии регулирующего клеточный цикл белка ответственны за различные эффекты на прогрессирование клеточного цикла в разных клеточных линиях.

Во время возникновения и прогрессирования опухоли RCC происходит дедифференциация, сопровождаемая эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT) ( 26 , 27 ). Во время перехода опухолевые клетки теряют эпителиальный (E)-кадгерин и приобретают нейральный (N)-кадгерин ( 26 , 28 ). Во всех трех линиях клеток RCC, использованных в этом исследовании, применение амигдалина в течение 24 часов вызвало значительное снижение экспрессии N-кадгерина, что указывает на повторную дифференциацию. Ранее N-кадгерин был связан с агрессивностью и злокачественным потенциалом RCC ( 29 ). Следовательно, мы предполагаем, что нарушение экспрессии N-кадгерина при 24-часовом применении амигдалина приводит к менее злокачественному типу опухоли. После 2 недель воздействия амигдалина стало очевидным переключение способа действия амигдалина, в основном затрагивающее экспрессию E-кадгерина. Экспрессия поверхности E-кадгерина Caki-1 и KTC-26 значительно увеличилась. В различных клетках RCC in vitro эпителиально-мезенхимальный переход, рост опухоли и агрессивный фенотип, как было показано, обратно связаны с низким уровнем E-кадгерина ( 30 , 31 ). Плохой прогноз и опухоли RCC высокой степени злокачественности были связаны с недостатком E-кадгерина ( 32 ). В опухолевой ткани RCC человека наблюдалось 3-кратное снижение E-кадгерина ( 33 ), и было постулировано, что экспрессия E-кадгерина в RCC является важным предиктором рецидива заболевания ( 34 ). Таким образом, мы предполагаем, что вызванное амигдалином увеличение E-кадгерина в клетках Caki-1 и KTC-26, которое мы отметили, указывает на повторную дифференцировку обратно к менее агрессивному фенотипу. Наблюдаемое переключение от снижения N-кадгерина к усилению E-кадгерина указывает на различные режимы действия амигдалина. Поскольку уровень N-кадгерина больше не снижался ни в одной из трех линий клеток после 2 недель воздействия амигдалина и даже повышался в клетках Caki-1, мы предполагаем, что соотношение между экспрессией E- и N-кадгерина имеет решающее значение для статуса дифференциации. Действительно, было показано, что эффект N-кадгерина зависит от экспрессии E-кадгерина ( 29 ).

В заключение, амигдалин ингибирует прогрессирование клеточного цикла и рост опухолевых клеток в клетках почечно-клеточного рака, по крайней мере частично, за счет нарушения экспрессии cdk1 и циклина B, тем самым оказывая противоопухолевое действие in vitro . Хотя in vitro не было обнаружено некротических эффектов , возможны токсические эффекты, вызванные деградацией амигдалина до HCN, и этот аспект требует оценки. Необходимы дальнейшие исследования с использованием животных для проверки эффектов амигдалина in vitro и оценки того, вызывает ли HCN цитотоксичность in vivo .

Благодарности

Это исследование было поддержано «Стифтунгом Бригитты и Норберта Мут» и «Проф. Доктор Фонд Карла и Герхарда Шиллеров