Тэг: опухоль почки

Амигдалин блокирует in vitro адгезию и инвазию клеток

почечно-клеточной карциномы с помощью интегрин-зависимого механизма

• Автор: 
  • Ева Юнгель
   
  • Масуд Афшар
   
  • Ясмина Макаревич
  
  

Аннотация

Информация о природном соединении амигдалине, которое используется в качестве противоопухолевого средства, скудна, и поэтому его эффективность остается спорной. В этом исследовании, чтобы определить, оказывает ли амигдалин противоопухолевое действие на клетки почечно-клеточной карциномы (ПКР), было изучено его влияние на метастатическую активность ПКР. Клеточные линии ПКР, Caki-1, KTC-26 и A498, были подвергнуты воздействию амигдалина из абрикосовых косточек, и была исследована адгезия к эндотелию сосудов человека, иммобилизованному коллагену или фибронектину. Было также определено влияние амигдалина на хемотаксическую и инвазивную активность, а также влияние амигдалина на поверхностную и общую клеточную экспрессию α и β интегринов, которые участвуют в метастазировании. Мы отметили, что амигдалин вызвал значительное снижение хемотаксической активности, инвазии и адгезии к эндотелию, коллагену и фибронектину. Используя анализ FACScan, мы отметили, что амигдалин также индуцировал снижение, особенно в интегринах α5 и α6, во всех трех клеточных линиях. Функциональное блокирование α5 привело к значительному снижению адгезии KTC-26 и A498 к коллагену, а также к снижению хемотаксического поведения во всех трех клеточных линиях. Блокирование интегрина α6 значительно снизило хемотаксическую активность во всех трех клеточных линиях. Таким образом, мы предполагаем, что воздействие амигдалина на клетки почечно-клеточного рака ингибирует метастатическое распространение и связано с подавлением интегринов α5 и α6. Поэтому мы предполагаем, что амигдалин оказывает противоопухолевую активность in vitro, и это может быть связано с регуляцией интегрина.

Введение

Почечно-клеточная карцинома (ПКР) является наиболее распространенной опухолью почки. Примерно у трети пациентов есть метастазы на момент постановки диагноза, и до 30% пациентов развивают метастазы во время терапии. После метастазирования прогноз для пациентов неутешительный. Лучшее понимание молекулярных механизмов действия, лежащих в основе развития и прогрессирования ПКР, способствовало разработке таргетной терапии, тем самым улучшая прогноз для пациентов на поздних стадиях этого заболевания. Однако, несмотря на эти терапевтические достижения, прогноз для пациентов с ПКР остается неблагоприятным, 5-летняя выживаемость составляет от 5 до 12%. Неудовлетворенность традиционной терапией и желание уменьшить побочные эффекты привели многих пациентов к комплементарной и альтернативной медицине (КАМ). До 80% онкологических больных в Соединенных Штатах и ​​более 50% онкологических больных в Европе используют КАМ наряду с традиционной терапией или вместо нее.

Информация об эффективности природных соединений скудна, и некоторые из этих соединений, такие как цианогенный дигликозид амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид), остаются спорными. Амигдалин получают из плодовых косточек семейства розоцветных, которое включает Prunus persica (персик), Prunus armeniaca (абрикос) и Prunus amygdalus var. amara (горький миндаль). Амигдалин, в основном в Соединенных Штатах, назначают онкологическим больным с 1920-х годов. В 1950-х годах была синтезирована и запатентована внутривенная, химически иная форма амигдалина как лаэтрил. Хотя лаэтрил отличается от амигдалина, эти термины часто используются взаимозаменяемо, что затрудняет интерпретацию данных. К 1978 году около 70 000 онкологических больных в США прошли лечение амигдалином. Однако исследования амигдалина, основанные на фактических данных, остаются ограниченными. Клиническое исследование, спонсируемое Национальным институтом рака более 30 лет назад, не выявило никаких признаков регрессии опухоли ( 1 ), тогда как ретроспективный анализ 67 пациентов с опухолями, получавших амигдалин, сообщил о двух полных и четырех частичных ответах ( 2 ). Амбивалентность также отражена в отчетах о случаях: амигдалин был неэффективен в пяти случаях и эффективен в четырех. Насколько нам известно, рандомизированные клинические испытания и последующие исследования не проводились. Сторонники считают амигдалин эффективным натуральным вариантом лечения рака, тогда как противники предупреждают о токсичности из-за метаболизма цианистого водорода.

Метастазы являются основной причиной смертности, связанной с ПКР. Трансэндотелиальная миграция и подвижное распространение являются критическими этапами в распространении и прогрессировании опухоли ( 3 ), а распространение раковых клеток в отдаленные органы представляет собой основную клиническую проблему при лечении рака. В настоящем исследовании изучалось противоопухолевое действие амигдалина на адгезию и миграционные свойства клеток ПКР. Поскольку интегрины активируют ряд внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в пролиферации, дифференцировке и подвижности клеток, был определен паттерн экспрессии рецепторов адгезии интегрина α и β между обработанными амигдалином клетками и необработанными контрольными клетками. Интегрины важны как для здоровья, так и для болезни ( 4 ) и играют ключевую роль в канцерогенезе и прогрессировании рака ( 4 ).

Настоящее исследование основано на предыдущем исследовании, посвященном влиянию амигдалина на метастатические свойства трех линий клеток рака мочевого пузыря ( 5 ). Поскольку были обнаружены некоторые различия в действии амигдалина на метастатические свойства различных линий клеток рака мочевого пузыря, возник вопрос о том, ограничиваются ли различные эффекты амигдалина определенными опухолевыми образованиями или возникают в других. Таким образом, были выбраны три линии клеток RCC, поскольку опухоли RCC являются наиболее агрессивной урологической опухолью.

Материалы и методы

Культура клеток

Клетки карциномы почки, Caki-1, KTC-26 и A498, были приобретены у LGC Promochem GmbH (Wesel, Германия). Клетки выращивали и субкультивировали в среде RPMI-1640 (Seromed, Берлин, Германия) с добавлением 10% сыворотки плода теленка (FCS), 20 мМ буфера HEPES, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2 . Субкультуры из пассажей 5–24 были отобраны для экспериментального использования. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были выделены из пупочных вен человека и собраны путем ферментативной обработки диспазой (1 МЕ/мл; Gibco-Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). HUVEC выращивали в среде 199 (M199; Biozol, Мюнхен, Германия), дополненной 10% FCS, 10% объединенной человеческой сыворотки, 20 мкг /мл фактора роста эндотелиальных клеток (Boehringer, Мангейм, Германия), 0,1% гепарина, 100 нг/мл гентамицина и 20 мМ буфера HEPES (pH 7,4). Субкультуры из пассажей 1–5 были отобраны для экспериментального использования. Институциональный этический комитет больницы университета Гете, Франкфурт, Германия, отказался от необходимости получения согласия, поскольку HUVEC использовались анонимно для анализов in vitro и не имели связи с данными пациентов.

Лечение амигдалиномы

Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток, а затем добавлен к опухолевым клеткам в концентрации 10 мг/мл [ранее оцененной как оптимальная концентрация ( 6 )] либо на 24 часа, либо на 2 недели (лечение применялось три раза в неделю) для оценки острого и хронического лечения. Контрольные группы оставались необработанными. Во всех экспериментах сравнивались обработанные и необработанные культуры опухолевых клеток. Для изучения токсического действия амигдалина жизнеспособность клеток определялась трипановым синим (Gibco-Invitrogen).

Адгезия опухолевых клеток

Для анализа адгезии опухолевых клеток HUVEC переносили в 6-луночные мультипланшеты (Sarstedt, Nümbrecht, Германия) в полной среде HUVEC. Когда они достигали слияния, клетки Caki-1, KTC-26 и A498 отсоединяли от культуральных колб обработкой аккутазой (PAA Laboratories, Cölbe, Германия), а затем добавляли 0,5×10 6 клеток и оставляли на монослое HUVEC на 1, 2 или 4 часа. Затем неприкрепившиеся опухолевые клетки смывали с помощью подогретого (37°C) PBS (Ca 2+ и Mg 2+ ). Оставшиеся клетки фиксировали 1% глутаральдегидом. Подсчет адгезивных опухолевых клеток производился в пяти различных полях определенного размера (5×0,25 мм2 ) с использованием фазово-контрастного микроскопа (ID03, 471202-9903; Carl Zeiss Microscopy GmbH, Геттинген, Германия), после чего рассчитывалась средняя скорость клеточной адгезии.

Присоединение к иммобилизованным белкам внеклеточного матрикса

24-луночные планшеты покрывали коллагеном G (извлеченным из телячьей кожи, состоящим из 90% коллагена типа I и 10% коллагена типа III, и разведенным до 400 мкг /мл в PBS; Biochrom, Берлин, Германия) или фибронектином (извлеченным из мышей и разведенным до 100 мкг /мл в PBS; Becton-Dickinson, Гейдельберг, Германия) на ночь. Пластиковые чашки служили фоновым контролем. Планшеты промывали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS для блокирования неспецифической клеточной адгезии. Затем в каждую лунку добавляли опухолевые клетки (0,1×10 6 ) и оставляли на 30 минут для инкубации. Затем не прилипшие опухолевые клетки смывали, оставшиеся прилипшие клетки фиксировали 2% глутаральдегидом и подсчитывали микроскопически. Средний показатель клеточной адгезии, определяемый соотношением адгезивных клеток, хорошо покрытых слоем, и адгезивных клеток, фон, был рассчитан по пяти различным полям наблюдения.

Хемотаксическая активность

Сывороточно-индуцированное хемотаксическое движение исследовали с использованием 6-луночных камер Transwell (Greiner, Frickenhausen, Германия) с порами 8 мкм . Клетки (0,5×10 6 клеток Caki-1, KTC-26 или A498/мл) помещали в верхнюю камеру в бессывороточной среде, либо без амигдалина (контроль), либо содержащей амигдалин. Нижняя камера содержала 10% сыворотки. После ночной инкубации верхнюю поверхность мембраны transwell осторожно протирали ватным тампоном, чтобы удалить клетки, которые не мигрировали. Клетки, перемещающиеся на нижнюю поверхность мембраны, окрашивали гематоксилином и подсчитывали микроскопически. Средняя скорость миграции рассчитывалась из пяти различных полей наблюдения.

Вторжение

Вторжение исследовали с помощью хемотаксического движения, вызванного сывороткой, через мембрану (Greiner) с порами 8 мкм , предварительно покрытую коллагеном G (извлеченным из телячьей кожи, состоящим из 90% коллагена типа I и 10% коллагена типа III; разбавленным до 400 мкг /мл в PBS; Biochrom) и HUVEC, выращенными до слияния. Клетки Caki-1, KTC-26 или A498 (0,5×10 6 /мл) помещали в верхнюю камеру в бессывороточной среде, либо без амигдалина (контроль), либо содержащей амигдалин. Нижняя камера содержала 10% сыворотки. После инкубации в течение ночи верхнюю поверхность мембраны transwell осторожно протирали ватным тампоном, чтобы удалить клетки, которые не мигрировали. Клетки, которые переместились на нижнюю поверхность мембраны, окрашивали гематоксилином и подсчитывали микроскопически. Средний показатель миграции рассчитывался в пяти различных полях наблюдения.

Экспрессия поверхности интегрина

Опухолевые клетки промывали в блокирующем растворе (PBS, 0,5% BSA), а затем инкубировали в течение 60 мин при 4°C с конъюгированными с фикоэритрином (PE) моноклональными антителами, направленными против следующих подтипов интегринов: анти-α1 (мышиный IgG1; клон SR84; #559596), анти-α2 (мышиный IgG2a; клон 12F1-H6; #555669), анти-α3 (мышиный IgG1; клон C3II.1; #556025), анти-α4 (мышиный IgG1; клон 9F10; #555503), анти-α5 (мышиный IgG1; клон IIA1; #555617), анти-α6 (мышиный IgG2a; клон GoH3; #555736), анти-β1 (мышиный IgG1; клон MAR4; #555443), анти-β3 (мышиный IgG1; клон VI-PL2; #555754) или анти-β4 (крысиный IgG2b; клон 439-9B; #555720) (все от BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия). Экспрессия интегрина опухолевых клеток затем измерялась с помощью FACScan (BD Biosciences, Гейдельберг; анализ гистограммы канала FL-2H (log); 1×10 4 клеток/сканирование) и выражалась как средняя относительная интенсивность флуоресценции (RFI). В качестве изотипических контролей использовали мышиный IgG1-PE (MOPC-21; #555749), IgG2a-PE (G155-178; #555574) и крысиный IgG2b-PE (R35-38; #555848; все от BD Biosciences).

вестерн-блоттинг

Для исследования содержания интегрина лизаты опухолевых клеток наносили на 7–12% полиакриламидный гель (в зависимости от размера белка) и подвергали электрофорезу в течение 90 мин при 100 В. Затем белок переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования обезжиренным сухим молоком в течение 1 часа мембраны инкубировали в течение ночи со следующими антителами: интегрин α1 (кроличий, поликлональный, 1:1000; #AB1934; Chemicon/Millipore GmbH, Швальбах, Германия), интегрин α2 (мышиный IgG1, 1:250, клон 2; #611017; BD Biosciences), интегрин α3 (кроличий, поликлональный, 1:1000; #AB1920; Chemicon/Millipore GmbH), интегрин α4 (мышиный, 1:200, клон: C-20; #sc-6589; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта-Крус, Калифорния, США)], интегрин α5 (мышиный IgG2a, 1:5000, клон 1; #610634; BD Biosciences), интегрин α6 (кролик, 1:200, клон H-87; #sc-10730; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) и интегрин β1 (мышиный IgG1, 1:2500, клон 18; #610468), интегрин β3 (мышиный IgG1, 1:2500, клон 1; #611141) и интегрин β4 (мышиный IgG1, 1:250, клон 7; #611233) (все от BD Biosciences). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG и конъюгированные с HRP козьи антикроличьи IgG (оба 1:5000; Upstate Biotechnology, Лейк-Плэсид, штат Нью-Йорк, США) служили в качестве вторичных антител. Кроме того, сигнализация, связанная с интегрином, была исследована с помощью антител к антиинтегрин-связанной киназе (ILK) (клон 3, разведение 1:1000; № 611803), антифокальной адгезионной киназе (FAK) (клон 77, разведение 1:1000; № 610088) и анти-p-специфической FAK (pY397; клон 18, разведение 1:1000; № 611807) (все от BD Biosciences). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG (разведение 1:5000; Upstate Biotechnology) служили в качестве вторичных антител. Мембраны были кратковременно инкубированы с реагентом для обнаружения ECL (ECL™; Amersham, GE Healthcare, Мюнхен, Германия) для визуализации белков, а затем проанализированы с помощью системы Fusion FX7 (Peqlab, Эрланген, Германия). β-актин (1:1000; Sigma-Aldrich) служил в качестве внутреннего контроля.

Для анализа плотности пикселей белковых полос использовалось программное обеспечение Gimp 2.8. Было рассчитано соотношение интенсивности белка/интенсивности β-актина, выраженное в процентах по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%.

Блокировка экспериментов

Чтобы определить, влияют ли интегрины α5 и α6 на метастатическое распространение независимо от амигдалина в клеточных линиях Caki-1, KTC-26 и A498, клетки инкубировали в течение 60 мин с 10 мкг /мл мышиных моноклональных антител против интегрина α5 (клон P1D6) или крысиных моноклональных антител против интегрина α6 (клон NKI-GoH3) (оба от Millipore). Контрольные образцы инкубировали только с клеточной культуральной средой. Затем адгезию опухолевых клеток к иммобилизованному коллагену, а также хемотаксис анализировали, как описано выше.

Статистический анализ

В настоящем исследовании все эксперименты проводились 3–6 раз. Статистическая значимость определялась с помощью U-критерия Вилкоксона, Манна-Уитни. Значение p < 0,05 считалось указывающим на статистически значимое различие.

Результаты

Амигдалин блокирует взаимодействие между эндотелием опухолевых клеток и матриксом опухолевых клеток

После 24 часов обработки амигдалином адгезия опухолевых клеток A498 к HUVEC значительно снизилась, но адгезия клеток Caki-1 и KTC-26 не снизилась (по сравнению с необработанными контролями, принятыми за 100%) ( рис. 1 ). Увеличение времени воздействия амигдалина до 2 недель значительно снизило адгезию к HUVEC во всех трех линиях опухолевых клеток ( рис. 1 ).

Рисунок 1 Адгезия Caki-1, KTC-26 и A498 к эндотелию (эндотелиальные клетки пуповины человека; HUVEC). Опухолевые клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные образцы оставались необработанными. Опухолевые клетки (0,5×106 клеток/лунку) добавляли и оставляли на монослое HUVEC в течение 1, 2 или 4 ч. Оценивалось среднее количество адгезированных опухолевых клеток из пяти полей, а также рассчитывался процент обработанных клеток почечно-клеточной карциномы (RCC) по сравнению с необработанными контрольными клетками (принято за 100%, пунктирная линия). *Значительное различие с контрольными образцами. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). n=5 экспериментов, p≤0,05.

Амигдалин вызвал значительное снижение связывающей способности всех трех линий клеток RCC с иммобилизованным коллагеном и фибронектином по сравнению с контрольной группой ( рис. 2 ). Прикрепление всех трех линий клеток к матричным белкам было снижено через 24 часа, а также через 2 недели. В клеточной линии KTC-26 кратковременное применение амигдалина (24 часа) вызвало большее снижение адгезии, чем долгосрочное применение амигдалина (2 недели).

Рисунок 2 (A) Адгезия Caki-1, KTC-26 и A498 к иммобилизованному коллагену (слева) и (B) фибронектину (справа). Опухолевые клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалином в течение 24 ч или 2 недель. Необработанные клетки почечно-клеточной карциномы (ПКР) служили в качестве контроля. Клетки (0,1×106 клеток/лунка) добавляли к иммобилизованному коллагену или фибронектину. Среднее количество адгезированных опухолевых клеток из пяти полей рассчитывали через 30 мин. *Значительное различие с контролем. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). n=6 экспериментов, p≤0,05.

Амигдалин изменяет подвижность опухолевых клеток почечно-клеточного рака

Хемотаксическая активность клеток Caki-1, KTC-26 и A498 значительно снизилась после 24 ч и 2 недель применения амигдалина по сравнению с необработанными контрольными клетками ( рис. 3A ). Инвазия опухолевых клеток через покрытые коллагеном мембраны transwell также значительно снизилась в клетках Caki-1 и A498 после 24 ч и 2 недель применения амигдалина ( рис. 3B ). Однако 2 недели применения амигдалина не снизили инвазивную способность клеток KTC-26.

Рисунок 3 Влияние амигдалина на клетки почечно-клеточной карциномы (ПКР): хемотаксис (A) и инвазия (B). Клетки ПКР, обработанные амигдалином в течение 24 ч или 2 недель, высевали в верхнюю камеру с хемоаттрактантом в лунке ниже. Подсчитывали клетки, мигрирующие через мембрану через 20 ч. Контрольные клетки не получали амигдалин и были установлены на 100% (пунктирная линия). *Значительное различие с контрольными клетками. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). n=5 экспериментов, p≤0,05.

Амигдалин модулирует поверхностную экспрессию интегрина α и β

Клетки Caki-1, KTC-26 и A498 характеризовались различными базальными поверхностными паттернами экспрессии интегринов α и β ( рис. 4A ). Caki-1 заметно экспрессировал α3 и β1, умеренно экспрессировал α5 и β3, тогда как α1, α2, α4, α6 и β4 были лишь незначительно обнаружены. KTC-26 сильно экспрессировал α3 и β1. Члены подтипа α1, α2, α5, α6, β3 и β4 были умеренно экспрессированы, а α4 не был обнаружен. Профиль экспрессии интегринов A498 был похож на профиль KTC-26, за исключением α4, который был обнаружен для A498. Мы также отметили, что β4 присутствовал в клетках KTC-26, но не в клетках A498.

Рисунок 4 (A) Базальная поверхностная экспрессия подтипов интегрина почечно-клеточной карциномы (RCC) и (B) разница (%) с необработанным контролем через 24 часа или 2 недели воздействия амигдалина. RFI, относительная интенсивность флуоресценции. nd, не обнаруживается. *Значительная разница с контролем. Полоски указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD), p≤0,05.

Применение амигдалина в течение двадцати четырех часов и в течение двух недель изменило профиль поверхности интегрина, который является специфическим для типа клеток ( рис. 4B ). Мы отметили, что α5 и α6 были значительно подавлены во всех клеточных линиях после двух недель воздействия амигдалина. β1, который был сильно выражен во всех трех клеточных линиях, также был значительно снижен после двух недель применения амигдалина. Высокая базальная экспрессия рецептора α3 была снижена в Caki-1 и KTC-26, но не в A498, под действием амигдалина. Различия также были отмечены в отношении α2 и β3, оба из которых были снижены в клетках Caki-1, но повышены в клетках KTC-26 и A498 через две недели. Сниженные уровни экспрессии β4 были обнаружены в клетках Caki-1 и KTC-26 после воздействия амигдалина.

Амигдалин влияет на общее содержание клеточных интегринов

Оценка содержания белка интегрина после 24 ч воздействия амигдалина выявила значительную положительную регуляцию α2 и отрицательную регуляцию α3 и p-FAK ( рис. 5 ). β1 был значительно повышен в Caki-1 и KTC-26, тогда как α6 был значительно снижен в Caki-1 и A498, а общее содержание α5 было снижено в клетках A498 через 24 ч. В клетках Caki-1 α4 и β4 увеличились, а β3 уменьшился.

Рисунок 5 (A) Вестерн-блот-анализ общего содержания интегрина в клетках Caki-1, KTC-26 и A498, подвергнутых воздействию амигдалина в течение 24 ч или 2 недель, и необработанных контролях. В качестве внутреннего контроля использовался β-актин. (B) Анализ плотности пикселей белковых полос вестерн-блоттинга. Соотношение интенсивности белка/интенсивности β-актина было рассчитано и выражено в процентах по отношению к контролям, установленным на 100% (0) после того, как клетки подвергались воздействию амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов. nd, не обнаружено. *Значительное различие с контролями, p≤0,05.

После 2 недель воздействия амигдалина интегрин α2 значительно увеличился, даже больше, чем после воздействия в течение 24 часов. В клетках A498 α3 и β3 увеличились после 2 недель воздействия амигдалина. Снижение β1 и p-FAK произошло в клетках KTC-26, а β4 был подавлен как в Caki-1, так и в KTC-26 после 2 недель воздействия амигдалина ( рис. 5 ).

Блокировка экспериментов

Профили экспрессии интегрина всех трех линий клеток были изменены амигдалином. Поскольку поверхностный интегрин α5 и интегрин α6 были сильно снижены во всех трех линиях клеток после применения амигдалина, эти интегрины были выбраны для исследований функциональной блокировки, чтобы выяснить, коррелируют ли эти снижения с изменениями адгезии и миграции опухолевых клеток. Блокирование α5 привело к значительному ингибированию адгезии клеток KTC-26 и A498 к коллагену ( рис. 6A ). Однако адгезия клеток Caki-1 к коллагену не была существенно затронута. Блокирование интегрина α5 привело к снижению хемотаксической активности во всех трех линиях клеток ( рис. 6B ). Блокирование рецептора α6 не оказало существенного влияния на адгезию к коллагену ни в одной из линий клеток ( рис. 6A ), но значительно снизило хемотаксис во всех трех линиях клеток ( рис. 6B ).

Рисунок 6 Влияние функциональной блокировки интегрина α5 и α6 на (A) адгезию клеток к коллагену и (B) хемотаксис. Неблокированные клетки служили в качестве контроля (100%, пунктирная линия). Оценивалось среднее количество адгезированных или хемотаксически активных клеток из пяти полей (0,25 мм2). Полосы указывают среднее значение ± стандартное отклонение (SD). *Значительное различие с контролем. n=3 эксперимента, p≤0,05.

Обсуждение

Было отмечено, что взаимодействие между опухолевыми клетками и эндотелием играет решающую роль в метастатической прогрессии; адгезия клеток немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) к эндотелию стенки сосудов была связана с трансмиграцией опухолевых клеток, что приводит к метастазам в мозг и лимфатические узлы ( 7 ). Более агрессивный, метастазирующий фенотип рака также был связан с повышенной адгезией ( 7 ). В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что воздействие амигдалина привело к значительному ингибированию связывающего взаимодействия между клетками RCC и монослоем HUVEC, коллагеном и фибронектином. Таким образом, была ингибирована хемотаксическая и инвазивная активность клеток RCC. Такое ингибирование является клинически значимым, поскольку трансэндотелиальная миграция и подвижное распространение являются критическими этапами в распространении и прогрессировании опухоли ( 3 ) и коррелируют с плохой выживаемостью. Снижение миграционного потенциала было связано с успешной терапией опухолей и менее злокачественным фенотипом опухоли ( 8 ). Таким образом, мы предполагаем, что ингибирование адгезии и подвижности клеток почечно-клеточного рака амигдалином снижает распространение метастазов.

Эффект амигдалина на блокирование адгезии и миграции не ограничивается клетками почечно-клеточного рака. Недавно было показано, что амигдалин также подавляет адгезивное поведение клеток рака мочевого пузыря ( 5 ). Хотя амигдалин оказывал схожее подавляющее действие на адгезионные свойства клеток рака мочевого пузыря и почечно-клеточного рака, миграция клеток рака мочевого пузыря была затронута амигдалином по-разному. Хемотаксис был подавлен в двух, но повышен в одной линии клеток рака мочевого пузыря после воздействия амигдалина, что указывает на то, что влияние амигдалина, вероятно, зависит от сущности опухоли. Таким образом, важно исследовать влияние амигдалина на различные сущности опухоли.

Семейство интегринов вовлечено во все этапы метастатической прогрессии опухоли ( 4 , 7 ). Интегрин α5 повышается в опухолевых клетках эпителиального происхождения, и была установлена ​​положительная корреляция между экспрессией интегрина α5 и адгезией клеток почечно-клеточного рака ( 9 ). В настоящем исследовании введение амигдалина значительно снизило поверхностный интегрин α5 во всех трех клеточных линиях. Кроме того, общее клеточное содержание интегрина α5 в зависимости от времени снижалось в присутствии амигдалина. Блокирование функции интегрина α5 вызвало значительное ингибирование адгезии клеток KTC-26 и A498 к коллагену и снижение хемотаксической активности всех используемых клеточных линий. В соответствии с настоящими данными, снижение регуляции интегрина α5 ранее было связано со снижением адгезивного и инвазивного поведения нескольких типов раковых клеток ( 10–12 ) .

В настоящем исследовании мы отметили, что адгезия коллагена клеток Caki-1 не снизилась после блокирования интегрина α5, в отличие от вызванного амигдалином снижения в клетках A498 и KTC-26. Подобное различие в функции интегрина между типами опухолевых клеток наблюдалось ранее. Было показано, что блокирование интегрина α5 ингибирует взаимодействие клеток с матриксом клеток рака мочевого пузыря HCV29 и BC3726, но усиливает связывание линий клеток рака мочевого пузыря T24 и Hu456 (оснащенных другим набором интегринов) ( 13 ). Аналогичным образом, было показано, что блокирование интегрина β1 ингибирует прикрепление клеток рака мочевого пузыря UMUC-3 к коллагену, но оказывает противоположный адгезивный эффект на клетки TCCSUP, которые характеризуются другим профилем экспрессии интегринов ( 5 ). В настоящем исследовании воздействие амигдалина вызвало увеличение поверхностного β3 интегрина в клетках KTC-26 и A498, но уменьшение в клетках Caki-1. Контррегуляция с участием другого подтипа интегрина, в данном случае β3, может объяснить, почему блокирование α5 не остановило адгезию в клетках Caki-1. Потеря интегрина α5 вызвала снижение хемотаксиса во всех трех клеточных линиях. Поэтому мы предполагаем, что потеря поверхностного интегрина α5 является механизмом, посредством которого амигдалин действует на миграцию клеток RCC, а тонкая настройка производительности интегрина зависит от конкретного профиля интегрина в конкретной клеточной линии.

Было показано, что интегрин α6 облегчает миграцию эпителиальных клеток и коррелирует с риском прогрессирования, метастазирования и смерти в клинических испытаниях ( 14 ). Другие исследования показали, что интегрин α6 способствует миграции и инвазии при колоректальном раке ( 15 ), а также карциномах поджелудочной железы ( 16 ) и молочной железы ( 17 ). Было отмечено, что интегрин α6 активирует FAK ( 18 ) и связанную с FAK нисходящую сигнализацию, которая имеет отношение к контролю подвижности клеток, выживаемости и пролиферации ( 4 ). В настоящем исследовании поверхностная экспрессия интегрина α6 была значительно снижена, а FAK был дезактивирован амигдалином во всех трех клеточных линиях. Блокирование поверхностного интегрина α6 показало, что α6 не мешает адгезии опухолевых клеток, но регулирует подвижность клеток. Поэтому вполне вероятно, что снижение α6 представляет собой механизм, с помощью которого амигдалин замедляет распространение клеток.

Было показано, что интегрин β1 способствует инвазии клеток при раке молочной железы, легких, поджелудочной железы и колоректальном раке, а также при глиоме, меланоме ( 4 ) и нейробластоме ( 19 ). В клетках рака предстательной железы было показано, что повышение уровня интегрина β1 сопровождается повышенным подвижным поведением, тогда как блокада интегрина β1 способствует снижению хемотаксиса, миграции и адгезии клеток ( 10 ). Ингибирование интегрина β1 было связано с уменьшением инвазии и метастазирования рака яичников ( 12 ), а ингибитор пептида интегрина α5β1, как было показано, блокирует метастазирование рака молочной железы in vivo ( 20 ). В настоящем исследовании поверхностный интегрин β1 был снижен во всех трех линиях опухолевых клеток после 2 недель воздействия амигдалина. Таким образом, амигдалин может воздействовать на интегрин β1, замедляя подвижное распространение клеток почечно-клеточного рака.

Исследования in vitro и in vivo показывают, что α3 является еще одним интегрином, участвующим в инвазии глиомы, меланомы, гепатоцеллюлярной и молочной карциномы, а также способствует метастазированию клеток молочной железы в легкие ( 4 ). Блокирование интегрина α3 привело к ингибированию адгезии клеток рака простаты ( 21 ). В настоящем исследовании поверхностный интегрин α3 был снижен в клетках Caki-1 и KTC-26, но не в клетках A498. Это неоднородное снижение указывает на специфичный для клеточной линии эффект, вызванный амигдалином.

Применение амигдалина, помимо модуляции экспрессии поверхностного интегрина, также изменило общее содержание клеточного интегрина. В настоящем исследовании общая экспрессия клеточного интегрина α2 была повышена во всех трех линиях опухолевых клеток после воздействия амидалина. Предыдущие исследования показали, что снижение уровня интегрина α2 в опухолевых клетках потенциально увеличивает распространение опухолевых клеток, а повторная экспрессия интегрина α2, как было показано, обращает вспять злокачественные свойства клеток рака молочной железы ( 22 ). Следовательно, мы предполагаем, что индуцированное амигдалином ингибирование адгезии и миграции опухолевых клеток, наблюдаемое здесь, связано с повышением регуляции интегрина α2.

Общий клеточный интегрин α3 снизился через 24 ч после нанесения амигдалина во всех трех клеточных линиях. Это согласуется с вызванным амигдалином снижением поверхностного α3 в клетках Caki-1 и KTC-26. Поскольку поверхностный α3 не был изменен в клетках A498, возможно, что амигдалин в этой клеточной линии действует через внутриклеточные сигнальные пути α3. p-FAK, который был сильно снижен в клетках A498 через 24 ч после нанесения амигдалина, подтверждает эту гипотезу, поскольку ось α3-FAK участвует в инициации и прогрессировании рака ( 23 ). Ли и др. продемонстрировали, что FAK является критическим медиатором опухолеобразования и метастазирования, которые частично зависят от интегрина α3 ( 24 ). Поэтому мы предполагаем, что снижение как интегрина α3, так и FAK дезактивирует двигательный аппарат клеток A498.

Общий клеточный интегрин β1 был повышен в клетках Caki-1 после применения амигдалина, в то время как поверхностная экспрессия была снижена. Этот тип сдвига не является необычным и указывает на транслокацию рецептора с поверхности во внутриклеточный компартмент. Хотя значимость этого процесса не полностью понята, было показано, что перемещение интегрина β1 к плазматической мембране увеличивает метастатический потенциал клеток RCC, тогда как остановка рециркуляции β1 путем поддержания высокого содержания цитоплазматической и низкого содержания плазматической мембраны снижает метастазирование ( 25 ). Было показано, что повышение внутриклеточного β1 связано с дезактивацией FAK ( 25 ), что коррелирует с настоящими результатами.

Эффекты амигдалина на экспрессию подтипа интегрина зависели от клеточной линии, от того, было ли время применения острым (24 ч) или хроническим (2 недели) и от того, находился ли интегрин на поверхности клетки или в цитоплазме. Таким образом, молекулярный способ действия амигдалина в отношении экспрессии подтипа интегрина не является однородным и может влиять как на механическое межклеточное сцепление, запускаемое интегрином, так и на активацию биохимического пути, контролируемого интегрином.

В трех исследованных линиях клеток RCC применение амигдалина значительно снизило инвазивное и подвижное поведение. Однако 2 недели применения амигдалина не снизили инвазивную способность клеток KTC-26. Снижение было преимущественно связано с уменьшением поверхностных интегринов α5 и α6. Однако этот механизм не следует обобщать. Хотя было показано, что амигдалин также ингибирует адгезию и миграцию в клетках рака мочевого пузыря, интегрины изменяются по-разному. Интегрины α5 и α6, по-видимому, являются важной мишенью амигдалина в клетках RCC, тогда как модуляция интегринов β1 или β4 была наиболее очевидна в клетках рака мочевого пузыря ( 5 ). Были начаты дальнейшие исследования in vitro , чтобы оценить, влияет ли амигдалин также на рост клеток RCC, как это наблюдалось для клеток рака мочевого пузыря ( 6 ).

В заключение, воздействие амигдалина на клетки RCC подавляет метастатическое распространение и связано с подавлением α5 и α6 интегринов. Таким образом, амигдалин проявляет противоопухолевую активность in vitro в RCC. Эта активность in vitro должна быть оценена на модели животных.

Благодарности

Настоящее исследование было поддержано «Фондом Бригитты и Норберта Мут» и «Друзья и сторонники Франкфуртского университета Гете».

Амигдалин подавляет рост клеток почечно-клеточной карциномы in vitro

• Авторы: 
  • Ева Юнгель
   
  • Анита Томас
  
  

Аннотация

Хотя амигдалин используется многими онкологическими больными в качестве противоопухолевого средства, отсутствует информация об эффективности и токсичности этого природного соединения. В настоящем исследовании изучалось ингибирующее действие амигдалина на рост клеток почечно-клеточной карциномы (ПКР). Амигдалн (10 мг/мл) применялся к линиям клеток ПКР, Caki-1, KTC-26 и A498, в течение 24 часов или 2 недель. Необработанные клетки служили в качестве контроля. Рост и пролиферацию опухолевых клеток определяли с помощью тестов MTT и BrdU, а также оценивали фазы клеточного цикла. Экспрессия активирующих клеточный цикл белков cdk1, cdk2, cdk4, циклина A, циклина B, циклина D1 и D3, а также ингибирующих клеточный цикл белков p19 и p27 изучалась с помощью вестерн-блоттинга. Также исследовалась поверхностная экспрессия маркеров дифференциации E- и N-кадгерина. Функциональная блокада siRNA использовалась для определения влияния нескольких белков на рост опухолевых клеток. Лечение амигдалином вызвало значительное снижение роста и пролиферации клеток RCC. Этот эффект коррелировал с уменьшением процента клеток RCC в фазе G2/M и увеличением процента клеток в фазе G0/1 (Caki-1 и A498) или остановкой клеточного цикла в S-фазе (KTC-26). Кроме того, амигдалин вызвал заметное снижение белков, активирующих клеточный цикл, в частности cdk1 и циклина B. Функциональное блокирование cdk1 и циклина B привело к значительному снижению роста опухолевых клеток во всех трех линиях клеток RCC. Помимо ингибирующего воздействия на рост, амигдалин также модулировал маркеры дифференциации, E- и N-кадгерин. Следовательно, воздействие амигдалина на клетки RCC подавляло прогрессирование клеточного цикла и рост опухолевых клеток за счет нарушения экспрессии cdk1 и циклина B. Более того, мы отметили, что амигдалин влияет на маркеры дифференциации. Таким образом, мы предполагаем, что амигдалин оказывает противоопухолевое действие на ПКР in vitro.

Введение

Почечно-клеточная карцинома (ПКР) является наиболее распространенным раком почки и самой агрессивной урологической опухолью, и ее заболеваемость растет ( 1 ). Примерно у 15-20% пациентов с ПКР уже есть метастазы на момент постановки диагноза, в то время как у 30% пациентов метастазы развиваются во время терапии. После метастазирования прогноз для пациентов неблагоприятный. Расширение знаний о молекулярных механизмах действия ПКР способствовало разработке таргетной терапии в течение последнего десятилетия, тем самым улучшая прогноз для пациентов на поздних стадиях заболевания. Однако, несмотря на терапевтические достижения, прогноз для пациентов с ПКР остается неблагоприятным, 5-летняя выживаемость остается между 5 и 12% ( 2 , 3 ).

Большинство пациентов с прогрессирующим раком почки хотят активно участвовать в борьбе с раком и/или избегать неблагоприятных побочных эффектов, которые часто возникают при традиционной терапии. Поэтому многие пациенты обращаются к комплементарной и альтернативной медицине (КАМ). Более 50% онкологических больных в Европе ( 4 ) и до 80% онкологических больных в Соединенных Штатах ( 5 ) используют КАМ вместе с традиционной терапией или вместо нее.

Амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид) — это природное соединение, которое часто используют онкологические больные. Он содержится в косточках абрикосов, персиков, яблок и горького миндаля ( 6–8 ). Первые исследования по использованию амигдалина онкологическими больными были проведены в России в 1840-х годах ( 9 ). В 1920-х годах амигдалин также назначали онкологическим больным в Соединенных Штатах ( 10 ). В 1950-х годах был представлен полусинтетический , химически иной производный амигдалина, лаэтрил. После появления лаэтрила термины амигдалин и лаэтрил часто использовались как синонимы, что затрудняло выводы из исследований, в которых не делалось различий между этими двумя соединениями ( 11 ) . В 1970-х годах амигдалин/леатрил стал одним из самых популярных нетрадиционных методов лечения рака. К 1978 году около 70 000 онкологических больных в США использовали амигдалин ( 12 ) . Национальный институт рака (NCI) инициировал несколько исследований ( 13–16 ) с отрезвляющими результатами. В резюме единственного испытания фазы II не было приписано существенной пользы амигдалину, в то время как было описано несколько пациентов с симптомами отравления цианидом (HCN) ( 13 ) . Однако качество этого исследования сомнительно, поскольку использовалась гетерогенная когорта пациентов, не были включены контрольные группы, а для внутривенной терапии использовался рацемат вместо чистого амигдалина. Все официальные суждения относительно амигдалина были основаны на этом испытании, поскольку никаких других клинических испытаний с амигдалином не доступно. Немецкий федеральный институт лекарственных средств и медицинских приборов (BfArM) ( http://www.bfarm.de/DE/Home/home_node.html ) также классифицировал амигдалин как сомнительный препарат, как и коллеги в других странах. Несмотря на противоречия и отсутствие научно обоснованных данных о пользе и рисках амигдалина, многие онкологические пациенты используют амигдалин ( 11 , 17 ). Таким образом, чтобы прояснить многие вопросы, на которые еще предстоит ответить относительно влияния амигдалина на рост и пролиферацию опухоли, в настоящем исследовании были определены прогрессия клеточного цикла и основные молекулярные режимы действия в клетках почечно-клеточного рака.

Материалы и методы

Клеточные культуры и лечение амигдалином

Линии клеток карциномы почки Caki-1, KTC-26 и A498 были приобретены у LGC Promochem (Wesel, Германия). Клетки выращивали и субкультивировали в среде RPMI-1640 (полученной у Seromed, Берлин, Германия) с добавлением 10% FCS, 20 мМ HEPES-буфера, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в инкубаторе. Субкультуры из пассажей 5–24 были отобраны для использования в экспериментах. Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток и затем добавлен к опухолевым клеткам в концентрации 10 мг/мл [ранее оцененной как оптимальная концентрация ( 18 )] на 24 часа или 2 недели (три раза в неделю) для оценки острого и хронического лечения. Контрольные группы оставались необработанными. Во всех экспериментах в настоящем исследовании обработанные культуры опухолевых клеток сравнивались с необработанными культурами опухолевых клеток. Для изучения токсического действия амигдалина жизнеспособность клеток определялась с помощью трипанового синего (Gibco/Invitrogen, Дармштадт, Германия).

Измерение роста, пролиферации и апоптоза опухолевых клеток

Рост клеток оценивали с помощью анализа восстановления красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) (Roche Diagnostics, Пенцберг, Германия). Клетки Caki-1 (50 мкл , 1×10 5 клеток/мл) высевали на 96-луночные планшеты для культивирования тканей. Через 24, 48 и 72 часа добавляли 10 мкл МТТ (0,5 мг/мл) еще на 4 часа. После этого клетки лизировали в буфере, содержащем 10% SDS в 0,01 М HCl. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO 2 . Поглощение при 550 нм определяли для каждой лунки с помощью микропланшетного иммуноферментного анализа (ELISA). После вычитания фонового поглощения результаты выражались как среднее количество клеток.

Пролиферацию клеток измеряли с помощью набора для определения пролиферации клеток BrdU ELISA (Calbiochem/Merck Biosciences, Дармштадт, Германия). Опухолевые клетки, посеянные на 96-луночных планшетах, инкубировали с 20 мкл раствора для маркировки BrdU на лунку в течение 8 ч, фиксировали и детектировали с помощью анти-BrdU mAb в соответствии с инструкциями производителя. Поглощение измеряли при 450 нм с помощью ридера для микропланшетов ELISA.

Для оценки того, был ли рост опухолевых клеток нарушен или уменьшен из-за апоптоза, экспрессия аннексина V/пропидиум йодида (PI) была оценена с помощью набора Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия). Опухолевые клетки были дважды промыты PBS и затем инкубированы с 5 мкл Annexin V-FITC и 5 мкл PI в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки были проанализированы методом проточной цитометрии с использованием FACSCalibur (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия). Процент апоптотических клеток (ранних и поздних) в каждом квадранте был рассчитан с помощью программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences).

Процент клеток в разных фазах клеточного цикла

Анализ клеточного цикла проводился на субконфлюэнтных клеточных культурах. Популяции опухолевых клеток окрашивались PI с использованием набора реагентов CycleTEST PLUS DNA, а затем подвергались проточной цитометрии с использованием FACScan (оба от Becton-Dickinson, Гейдельберг, Германия). Из каждого образца было собрано 10 000 событий. Сбор данных проводился с использованием программного обеспечения CellQuest, а распределение клеточного цикла рассчитывалось с использованием программного обеспечения ModFit (Becton-Dickinson). Количество клеток с гейтированием в фазах G1, G2/M или S выражается в процентах.

Экспрессия белков, регулирующих клеточный цикл

Белки, регулирующие клеточный цикл, исследовали с помощью вестерн-блоттинга. Лизаты опухолевых клеток наносили на 7-15% полиакриламидный гель (в зависимости от размера белка) и подвергали электрофорезу в течение 90 мин при 100 В. Затем белок переносили на нитроцеллюлозные мембраны (1 ч, 100 В). После блокирования обезжиренным сухим молоком в течение 1 часа мембраны инкубировали в течение ночи с моноклональными антителами, направленными против следующих белков клеточного цикла, которые все были от BD Biosciences: cdk1 (IgG1, клон 1, разведение 1:2500; #610038), cdk2 (IgG2a, клон 55, разведение 1:2500; #610146), cdk4 (IgG1, клон 97, разведение 1:250; #610148), циклин A (IgG1, клон 25, разведение 1:250; #611269), циклин B (IgG1, клон 18, разведение 1:1000; #610220), циклин D1 (IgG1, клон G124-326, разведение 1:250; #554181), циклин D3 (IgG2b, клон 1, разведение 1:1000; #610280), p19 (IgG1, клон 52/p19, разведение 1:5000; #610530), p27 (IgG1, клон 57, разведение 1:500; #610244). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG (разведение 1:5000; #12-349; Merck Millipore, Темекула, Калифорния, США) служили в качестве вторичных антител. Мембраны ненадолго инкубировали с реагентом для обнаружения ECL (ECL™; Amersham/GE Healthcare, Мюнхен, Германия) для визуализации белков, а затем анализировали с помощью системы Fusion FX7 (Peqlab, Эрланген, Германия). В качестве внутреннего контроля служил β-актин (разведение 1:1000; #A5441; Sigma, Тауфенкирхен, Германия).

Поверхностная экспрессия E- и N-кадгерина

Опухолевые клетки промывали в блокирующем растворе (PBS, 0,5% BSA), а затем инкубировали в течение 60 мин при 4°C с моноклональными антителами (mAB), конъюгированными с фикоэритрином (PE), направленными против следующих антител: анти-человеческий E-кадгерин-PE (мышиный IgG2b, клон 180224; #FAB18381P) и анти-человеческий N-кадгерин-PE (крысиный IgG2a, клон 401408; #IC1388P) (оба от R&D Systems, Висбаден, Германия). Затем поверхностную экспрессию E- и N-кадгерина клеток RCC измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием FACscan [анализ гистограммы канала FL-2H (log); 1×10 4 клеток/сканирование; BD Biosciences] и выражали в виде средних единиц флуоресценции. В качестве изотипического контроля служили крысиный IgG2a-PE (клон RG7/1.30; № 558067) или мышиный IgG2b-PE (клон 27-35; № 555743) (оба от BD Biosciences).

Блокировка экспериментов

Чтобы определить, влияют ли cdk1 и циклин B на рост опухолевых клеток в клеточных линиях Caki-1, KTC-26 и A498, клетки были трансфицированы. Опухолевые клетки (3×10 5 /6-луночные) были трансфицированы малой интерферирующей РНК (siRNA), направленной против cdk1 (Hs_CDC2_10, идентификатор гена: 983, целевая последовательность: AAGGGGTTCCTAGTACTGCAA) или циклина B (Hs_CCNB1_6, идентификатор гена: 891, целевая последовательность: AATGTAGTCATGGTAAATCAA) (оба от Qiagen, Хильден, Германия), с реагентом siRNA/трансфекции (реагент трансфекции HiPerFect; Qiagen) в соотношении 1:6. Необработанные клетки и клетки, обработанные 5 нМ контрольной siRNA (AllStars Negative Control siRNA; Qiagen), служили в качестве контролей. Затем рост опухолевых клеток определяли, как указано выше.

Статистический анализ

Все эксперименты проводились 3–6 раз. Статистическая значимость определялась с помощью U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Значение p < 0,05 считалось указывающим на статистически значимую разницу.

Результаты

Рост и пролиферация опухолевых клеток блокируются амигдалином

Воздействие амигдалина (10 мг/мл) в течение 24 ч или 2 недель привело к значительной и схожей степени ингибирования роста в течение 72 ч во всех трех линиях клеток почечно-клеточного рака, Caki-1, KTC-26 и A498, по сравнению с необработанными контрольными клетками ( рис. 1 ). Пролиферация клеток Caki-1, KTC-26 и A498 также была значительно снижена после 24 ч или 2 недель воздействия амигдалина по сравнению с контрольными клетками ( рис. 2 ). Противоопухолевые эффекты в клетках почечно-клеточного рака были сопоставимы после 24 ч и 2 недель лечения амигдалином ( рис. 2 ).

Рисунок 1 Рост клеток почечно-клеточной карциномы (RCC), (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498. Клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные клетки оставались необработанными. Количество клеток было установлено на уровне 100% после 24 ч инкубации. Полоски указывают на среднее значение ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значительное отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Рисунок 2 Пролиферация клеток почечно-клеточной карциномы (RCC). Клетки (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498 обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные группы оставались без обработки. Полоски указывают средние значения ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значимое отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Ни апоптоз, ни некроз не индуцируются амигдалином.

После введения амигдалина не было выявлено ни значительного раннего или позднего апоптоза, ни индукции некроза (данные не представлены).

Амигдалин изменяет процент клеток почечно-клеточного рака в фазах G0/1, S и G2/M

Амигдалин значительно увеличил процент клеток Caki-1 и A498 в фазе G0/G1 и уменьшил количество клеток в фазе S и G2/M через 24 ч и 2 недели ( рис. 3 ) воздействия по сравнению с необработанными контролями. В клетках KTC-26 амигдалин вызвал значительное снижение процента клеток в фазе G2/M, в то время как клетки в фазе S увеличились (24 ч, <2 недель). Не было измерено значительного увеличения процента клеток в фазе G0/G1 после 24-часовой обработки амигдалином в клетках KTC-26. Через 2 недели обработки амидалином в клетках KTC-26, сопровождавшейся увеличением S-фазы, количество клеток в фазе G0/G1 значительно снизилось ( рис. 3 ) по сравнению с контролем.

Рисунок 3 Влияние амигдалина на распределение клеток почечно-клеточной карциномы (ПКР) в различных фазах клеточного цикла. Указан процент клеток Caki-1 (Caki), KTC-26 (KTC) и A498 в фазах G01/1, S и G2/M. Клетки ПКР, обработанные амигдалином в течение 24 ч или 2 недель, сравнивались с необработанными контрольными клетками. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Амигдалин вызывает снижение экспрессии белка, активирующего клеточный цикл

Мы отметили, что изменения в прогрессии клеточного цикла сопровождались модуляцией белков, регулирующих клеточный цикл ( рис. 4 ). Во всех трех клеточных линиях, Caki-1, KTC-26 и A498, обработка амигдалином в течение 24 ч и 2 недель способствовала снижению регуляции активирующих клеточный цикл белков cdk1, cdk2 и cdk4, а также циклинов A и B, причем самые сильные эффекты были отмечены в отношении экспрессии cdk1 и циклина B. Циклин D1 также был снижен в Caki-1 и KTC-26 через 24 ч ( рис. 4 , левая панель) и в Caki-1 и A498 после 2 недель применения амигдалина ( рис. 4 , правая панель). Не было обнаружено выраженных изменений для циклина D3 ни в одной клеточной линии. В отличие от белков, активирующих клеточный цикл, экспрессия белка p19, ингибирующего клеточный цикл, была усилена после воздействия амигдалина в клеточных линиях Caki-1 (24 ч и 2 недели) и A498 (24 ч). p27 также был повышен в клетках A498 (24 ч) ( рис. 4 , левая панель). Однако p19 и p27 были снижены в клетках KTC-26, а снижение p27 было отмечено в клетках Caki-1 через 24 ч.

Рисунок 4 Профиль экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл, в клетках почечно-клеточной карциномы (RCC). Клетки Caki-1, KTC-26 и A498 после 24 ч (левая панель) или 2 недель (правая панель) воздействия амигдалина и необработанные контроли. −, контроль; +, амигдалин. β-актин служил внутренним контролем. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Снижение уровня cdk1 и циклина B связано с ингибированием роста, вызванным амигдалином.

В связи с тем, что в настоящем исследовании наиболее яркое ингибирующее действие амигдалина было отмечено в отношении экспрессии cdk1 и циклина B, влияние этих двух белков на рост опухолевых клеток оценивалось путем блокирования их функции с помощью siRNA. Нокдаун cdk1 и циклина B привел к значительному ингибированию роста клеток во всех трех клеточных линиях по сравнению с необработанным и имитированным контролем ( рис. 5A–C ). Во всех трех клеточных линиях RCC блокирование экспрессии белков cdk1 и циклина B было подтверждено с помощью вестерн-блоттинга ( рис. 5D ).

Рисунок 5 Рост опухолевых клеток почечно-клеточного рака (RCC). (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498 после функциональной блокировки с помощью siRNA, нацеленной на cdk1 и циклин B. AllStars отрицательный контроль siRNA служил в качестве контроля трансфекции (макет). Контроли оставались необработанными. Полоски указывают стандартное отклонение (SD). * p≤0,05, значимое различие с контролем. n=5 экспериментов. (D) Профиль экспрессии белка регулирующих клеточный цикл белков клеток Caki-1, KTC-26 и A498 после функциональной блокировки с помощью siRNA, нацеленной на cdk1 и циклин B. AllStars отрицательный контроль siRNA служил в качестве контроля трансфекции (макет). Контроли оставались необработанными. β-актин служил в качестве внутреннего контроля. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Маркеры дифференциации модулируются обработкой амигдалином

Дедифференцировка опухолевых клеток сопровождается потерей E-кадгерина и повышенной экспрессией N-кадгерина. Экспрессия этих двух маркеров дифференцировки была определена для того, чтобы оценить, влияет ли амигдалин на дифференцировку опухолевых клеток. После 24 ч обработки амигдалином мы отметили значительное снижение поверхностного N-кадгерина в трех клеточных линиях ( рис. 6 ). После 2 недель обработки амигдалином было отмечено заметное увеличение экспрессии E-кадгерина на поверхности клеток Caki-1 и KTC-26 ( рис. 6A и B ). В клетках KTC-26 повышение E-кадгерина было связано со значительным снижением поверхностного N-кадгерина ( рис. 6B ). Однако экспрессия N-кадгерина в клетках Caki-1 значительно увеличилась после 2 недель воздействия амигдалина, хотя MFU все еще была ниже, чем для E-кадгерина ( рис. 6A ). Никакого существенного влияния на Е-кадгерин в клетках А498 после 2 недель применения амигдалина отмечено не было.

Рисунок 6 Поверхностная экспрессия маркеров дифференциации E- и N-кадгерина на клетках почечно-клеточной карциномы (RCC). (A) Клетки Caki-1, (B) KTC-26 и (C) Клетки A498 через 24 часа и 2 недели применения амигдалина. Поверхностная экспрессия указана как средние относительные единицы флуоресценции [MFU (%)]. Контрольные значения были установлены на уровне 100% (пунктирная линия). Полоски указывают средние значения ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значимое отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы отметили, что обработка линий клеток почечно-клеточного рака Caki-1, KTC-26 и A498 амигдалином вызвала значительное ингибирование роста и пролиферации клеток. Подобное снижение роста после применения амигдалина было отмечено в клетках немелкоклеточного рака легких ( 19 ) и рака мочевого пузыря ( 18 ) in vitro , а также в клетках рака шейки матки in vivo ( 20 ). На основании наших данных мы приходим к выводу, что ингибирование роста, вызванное амигдалином, не связано с апоптозом или некрозом. Другие раковые клетки, такие как клетки рака шейки матки, мочевого пузыря и простаты, реагируют на амигдалин апоптозом, что приводит к ингибированию роста ( 18 , 20 , 21 ). Таким образом, способ действия амигдалина, по-видимому, зависит от типа рака.

Хотя ингибирование роста во всех трех линиях клеток RCC сопровождалось изменениями в процентном содержании клеток в различных фазах клеточного цикла, изменения не были однородными. Обработка клеток Caki-1 и A498 амигдалином вызвала увеличение клеток в фазе G0/G1 за счет снижения S- (Caki-1 и A498) и G2/M-фаз (Caki-1). Обработка амигдалином вызвала увеличение клеток в фазе S в клетках KTC-26, в то время как фазы G2/M и G0/G1 были снижены через 2 недели. Повышение количества клеток в фазе S в KTC-26 после применения амигдалина, вероятно, свидетельствует об остановке клеточного цикла в S-фазе. В различных линиях клеток рака мочевого пузыря также была отмечена блокада роста, вызванная амигдалином, которая осуществлялась путем различного влияния на прогрессирование клеточного цикла, увеличивая процент клеток в фазе G0/G1 в одной линии клеток и повышая количество клеток в фазе S в другой ( 18 ).

Изменение процентного содержания фаз клеточного цикла коррелировало с модуляцией экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл. Во всех трех линиях клеток RCC большинство белков, активирующих клеточный цикл, были снижены после лечения амигдалином, в частности cdk1 и циклин B. Известно, что Cdk1 является ключевой киназой для митотического входа ( 22 ). Было показано, что ось cdk1-циклин B в опухолевых клетках участвует в продвижении митоза и преодолении остановки клеточного цикла, зависящей от химиотерапии ( 23 ). Во всех трех линиях клеток RCC снижение cdk1 и циклина B было связано с ингибирующим эффектом, оказываемым амигдалином, что доказано с помощью нокдауна siRNA. Наряду с осью cdk1-циклин B, ось cdk2-циклин A также была отчетливо изменена в клетках RCC. Cdk2/циклин A способствует переходу из фазы G1 в фазу S и, как было показано, важен для ингибирования клеток рака мочевого пузыря, вызванного амигдалином ( 18 ). Мы предполагаем, что накопление клеток G0/G1 было обусловлено ингибирующим эффектом, который амигдалин оказывал на cdk2 и циклин B. Однако обработка клеточной линии KTC-26 амигдалином не привела к остановке фазы G0/G1, а скорее к остановке фазы S. Предположительно, это связано с ингибирующим клеточный цикл белком p19, уровень которого был повышен в клетках Caki-1 и A498 после применения амигдалина, но снижен в клетках KTC-26. p19 участвует в активности контрольной точки G1, останавливая вход клеток в фазу S ( 24 ). Ингибирование p19 увеличивает фракцию клеток в фазе S ( 25 ). Таким образом, это, вероятно, объясняет, почему мы отметили увеличение в фазе G0/G1 клеток Caki-1 и A498, в то время как клетки KTC-26 накапливались в фазе S. Следовательно, мы предполагаем, что вызванные амигдалином изменения в экспрессии регулирующего клеточный цикл белка ответственны за различные эффекты на прогрессирование клеточного цикла в разных клеточных линиях.

Во время возникновения и прогрессирования опухоли RCC происходит дедифференциация, сопровождаемая эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT) ( 26 , 27 ). Во время перехода опухолевые клетки теряют эпителиальный (E)-кадгерин и приобретают нейральный (N)-кадгерин ( 26 , 28 ). Во всех трех линиях клеток RCC, использованных в этом исследовании, применение амигдалина в течение 24 часов вызвало значительное снижение экспрессии N-кадгерина, что указывает на повторную дифференциацию. Ранее N-кадгерин был связан с агрессивностью и злокачественным потенциалом RCC ( 29 ). Следовательно, мы предполагаем, что нарушение экспрессии N-кадгерина при 24-часовом применении амигдалина приводит к менее злокачественному типу опухоли. После 2 недель воздействия амигдалина стало очевидным переключение способа действия амигдалина, в основном затрагивающее экспрессию E-кадгерина. Экспрессия поверхности E-кадгерина Caki-1 и KTC-26 значительно увеличилась. В различных клетках RCC in vitro эпителиально-мезенхимальный переход, рост опухоли и агрессивный фенотип, как было показано, обратно связаны с низким уровнем E-кадгерина ( 30 , 31 ). Плохой прогноз и опухоли RCC высокой степени злокачественности были связаны с недостатком E-кадгерина ( 32 ). В опухолевой ткани RCC человека наблюдалось 3-кратное снижение E-кадгерина ( 33 ), и было постулировано, что экспрессия E-кадгерина в RCC является важным предиктором рецидива заболевания ( 34 ). Таким образом, мы предполагаем, что вызванное амигдалином увеличение E-кадгерина в клетках Caki-1 и KTC-26, которое мы отметили, указывает на повторную дифференцировку обратно к менее агрессивному фенотипу. Наблюдаемое переключение от снижения N-кадгерина к усилению E-кадгерина указывает на различные режимы действия амигдалина. Поскольку уровень N-кадгерина больше не снижался ни в одной из трех линий клеток после 2 недель воздействия амигдалина и даже повышался в клетках Caki-1, мы предполагаем, что соотношение между экспрессией E- и N-кадгерина имеет решающее значение для статуса дифференциации. Действительно, было показано, что эффект N-кадгерина зависит от экспрессии E-кадгерина ( 29 ).

В заключение, амигдалин ингибирует прогрессирование клеточного цикла и рост опухолевых клеток в клетках почечно-клеточного рака, по крайней мере частично, за счет нарушения экспрессии cdk1 и циклина B, тем самым оказывая противоопухолевое действие in vitro . Хотя in vitro не было обнаружено некротических эффектов , возможны токсические эффекты, вызванные деградацией амигдалина до HCN, и этот аспект требует оценки. Необходимы дальнейшие исследования с использованием животных для проверки эффектов амигдалина in vitro и оценки того, вызывает ли HCN цитотоксичность in vivo .

Благодарности

Это исследование было поддержано «Стифтунгом Бригитты и Норберта Мут» и «Проф. Доктор Фонд Карла и Герхарда Шиллеров