Тэг: рак почки

Отчет о клиническом случае длительной полной ремиссии метастатического плоскоклеточного рака почки после паллиативной лучевой терапии и адъювантной терапии дихлорацетатом

оригинал статьи: https://ibimapublishing.com/articles/ACRT/2012/441895/

Акбар Хан

Медицинский директор, Medicor Cancer Centres Inc., Торонто, Канада

Том 2012 (2012), идентификатор статьи 441895, Достижения в области исследований и лечения рака, 7 страниц, DOI: 10.5171/2012.441895Дата публикации: 19 июля 2012 г.

Авторские права © 2012 Akbar Khan. Это статья открытого доступа, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License unported 3.0, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.

Плоскоклеточный рак почек — редкая форма рака почек, которая считается неизлечимой после появления метастазов. Прогноз неблагоприятный, а средняя выживаемость на поздней стадии заболевания обычно составляет несколько месяцев, несмотря на все доступные традиционные методы лечения. Мы описываем случай 72-летней женщины с метастатическим плоскоклеточным раком почек, у которой была проведена радикальная нефрэктомия с положительными хирургическими краями, инвазией почечной вены и метастазами в несколько абдоминальных лимфатических узлов. Она получила курс паллиативной лучевой терапии брюшной полости с дозой 4500 сГр в 25 фракций в течение 5 недель. После лучевой терапии ее лечили циклическим режимом перорального дихлорацетата натрия («DCA»). Лечение было прекращено через 3 месяца из-за развития периферической нейропатии. Последующая визуализация после завершения лечения DCA не выявила признаков метастатического заболевания. Нейропатия постепенно улучшилась, и компьютерная томография через четыре года не выявила рецидива рака. Пациент продолжает чувствовать себя хорошо, клинических признаков рецидива не наблюдается спустя пять лет после завершения терапии, он ведет нормальную и активную жизнь.

Введение

Плоскоклеточный рак почек («RSCC») — редкая форма рака почек, которая возникает из почечной лоханки. RSCC составляет около 0,5–0,8% всех злокачественных опухолей почек (Bhaijee 2012). Хотя хирургическое вмешательство иногда излечивает локализованное заболевание, метастатический плоскоклеточный рак почек («mRSCC») считается неизлечимым (Holmang et al. 2007). Многочисленные публикации врачей, имеющих опыт лечения RSCC, установили, что этот тип рака является радиорезистентным, и что системная химиотерапия дает мало пользы. (Bhandari et al. 2010), (Di Battista et al. 2012), (Kimura et al. 2000), (Li and Cheung 1987). Средняя выживаемость при поздней стадии заболевания крайне низкая (в пределах нескольких месяцев), а пятилетняя выживаемость, как сообщается, составляет менее 10% (Holmang et al. 2007). В обзоре 15 случаев Ли и др. сообщили о медианной выживаемости в 3,5 месяца (Lee et al. 1998).

Был проведен поиск в Medline (Medline RSCC 2012) для определения того, были ли зарегистрированы какие-либо случаи длительной полной ремиссии mRSCC. Он выявил более 200 ссылок на RSCC, но только один опубликованный случай 5-летней полной ремиссии/излечения (Carlson 1960). В этом случае пациенту была проведена полная нефроуретерэктомия, включая резекцию околопочечного жира и манжеты мочевого пузыря. Патология не выявила какого-либо вовлечения хирургических краев, и не было зарегистрировано никаких метастазов.

Дихлорацетат натрия («DCA») — это препарат, который был тщательно изучен для лечения врожденного лактоацидоза, входящего в группу наследственных митохондриальных заболеваний (Stacpoole et al. 2006), (Stacpoole et al. 1992), (Stacpoole et al. 1988). Профиль безопасности использования DCA у людей был установлен в ходе этой работы. Было обнаружено, что это относительно безопасный препарат, не обладающий гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичностью. Основная токсичность — неврологическая (в первую очередь периферическая невропатия), и она обратима (Kaufmann et al. 2006). Наблюдался делирий, вызванный DCA, который также обратим после отмены препарата (Brandsma et al. 2010). У небольшого процента пациентов может наблюдаться незначительное обратимое повышение уровня печеночных ферментов (Stacpoole et al., 2008).

В январе 2007 года была опубликована знаменательная статья, в которой было показано, что DCA эффективен при лечении рака груди, легких и мозга человека in vitro и in vivo (крысы) с помощью новых метаболических путей (Bonnet et al. 2007). Было показано, что DCA ингибирует митохондриальную пируватдегидрогеназную киназу, что приводит к ингибированию аэробного гликолиза, обычного пути производства энергии в раковых клетках человека (известного как эффект Варбурга). Поскольку раковые клетки обычно не способны переходить к окислению глюкозы при ингибировании гликолиза, обработанные DCA клетки будут истощены в своем энергоснабжении АТФ (Xu et al. 2005). Также было показано, что DCA селективно запускает апоптоз в раковых клетках за счет снижения мембранного потенциала гиперполяризованных митохондрий и активации потенциалзависимых калиевых каналов Kv1.5 (Bonnet et al. 2007).

С 2007 года исследования DCA продолжались, и было показано, что DCA имеет эффективность in vitro против нескольких линий клеток рака человека, включая яичники (Saed et al. 2011), нейробластому (Vella et al. 2012), толстую кишку (Tong et al. 2011), карциноид легких (Fiebiger et al. 2011), шейку матки (Xie et al. 2011) и эндометрий (Wong et al. 2008). Синергизм с радиотерапией также был продемонстрирован на линиях клеток рака простаты (Cao et al. 2008). Механизм синергизма, предложенный Cao et al., заключается в повышенной экспрессии связанного с BCL-2 белка X (проапоптотического внутриклеточного белка), что приводит к повышению скорости апоптоза. DCA также показал эффективность in vivo у людей против глиобластомы (Michelakis et al. 2010).

Автор начал использовать терапию DCA «не по назначению» с 2007 года для лечения онкологических больных с плохим прогнозом или не поддающихся лечению традиционными методами лечения рака. Наблюдение за пациентами, получавшими лечение DCA, показало, что значительное число пациентов, по всей видимости, извлекло пользу из использования этого препарата либо по субъективным критериям, таким как уменьшение боли, либо по объективным критериям, таким как уменьшение опухоли (Medicor DCA Data 2009). Презентация случая
 

Женщина 72 лет первоначально обратилась к своему семейному врачу с болью в правом бедре, гематурией и потерей веса. Масса в правой почке была диагностирована с помощью ультразвука. Была проведена компьютерная томография («КТ»), которая показала опухоль, поражающую правую почечную лоханку, верхний и нижний полюса почки и распространяющуюся на проксимальный правый мочеточник (рисунок 1). Были обнаружены множественные увеличенные лимфатические узлы в брюшной полости (рисунок 2). Было проведено сканирование костей, которое было отрицательным для метастазов в кости.

Рисунок 1 – КТ брюшной полости, показывающая опухоль правой почки до начала лечения.

Рисунок 2 – КТ брюшной полости, показывающая патологический забрюшинный лимфатический узел размером 2 см до начала лечения.

Пациентке была проведена правосторонняя радикальная нефрэктомия в мае 2007 года. В отчете об операции было отмечено, что полное иссечение невозможно. Была затронута почечная вена, и ее не удалось полностью очистить от опухоли. Во время операции были визуализированы множественные патологические лимфатические узлы, простирающиеся вверх по нижней полой вене, но они не были удалены. Была проведена интраоперационная биопсия одного из лимфатических узлов. Окончательная гистопатология подтвердила диагноз плоскоклеточного рака почки с положительным хирургическим краем и метастазами в лимфатические узлы. После операции пациентку направили на консультацию к радиоонкологу. Она получила курс внешней лучевой терапии с паллиативной целью на парааортальную область живота с дозой 4500 сГр в 25 фракциях в течение 5 недель с августа по сентябрь 2007 года. Была проведена консультация терапевтического онколога, и ей не было предложено лечение химиотерапией.

Пациентка узнала об исследовании рака DCA из местных СМИ и решила изучить возможность DCA в качестве постоянного лечения, учитывая ее плохой прогноз. Она посетила клинику автора для консультации по терапии DCA.

При первом посещении клиники была изучена ее полная история болезни. Обследование показало, что это здоровая на вид женщина с нормальными жизненными показателями и без существенных физических данных. Первоначальные анализы крови были в целом хорошими. Единственными отклонениями были небольшое повышение мочевины до 7,4 (норма 3,0–7,1 ммоль/л) и низкое количество лимфоцитов до 0,6 (норма 1,2–3,4 x 10 9 /л). Это не было тревожным, так как небольшое повышение мочевины или креатинина было бы ожидаемым у пациента после нефрэктомии. Лечение DCA
 

Были обсуждены риски и преимущества DCA, и пациентка согласилась на лечение DCA, которое было начато в течение 3 недель после последней фракции паллиативной лучевой терапии. Пациентке был назначен DCA по 500 мг перорально два раза в день (18 мг/кг/день) циклом 2 недели приема / 1 неделя перерыва. Циклическое лечение было выбрано из-за предыдущего опыта автора с неприемлемым уровнем побочных эффектов у взрослых пациентов, использующих непрерывную дозировку DCA. Ей был назначен бенфотиамин (жирорастворимая форма витамина B1) по 80 мг перорально два раза в день и R-альфа-липоевая кислота по 150 мг перорально 3 раза в день для снижения риска невропатии DCA, поскольку оба этих природных соединения доказали свою эффективность в лечении невропатии другой этиологии (Ziegler et al. 1999), (Winkler et al. 1999). Ей также назначили пантопразол 40 мг перорально один раз в день для профилактики расстройства желудка от DCA. После первого 3-недельного цикла DCA увеличили до 500 мг перорально три раза в день (27 мг/кг/день). Дозу увеличивали постепенно, чтобы обеспечить переносимость из-за сниженного метаболизма DCA с возрастом пациента (Shroads et al. 2008).

Пациент в целом чувствовал себя хорошо в течение первого месяца лечения DCA, за исключением легкой усталости, которая также могла быть побочным эффектом радиотерапии. Даже при увеличении дозы DCA через 3 недели никаких проблем не возникло в течение второго месяца терапии. DCA была остановлена ​​к концу третьего месяца из-за новых симптомов, указывающих на периферическую невропатию.

На момент остановки DCA пациенту сделали трехфазную КТ, которая не показала никаких признаков остаточного рака. Еще через 6 месяцев пациенту сделали КТ, которая снова не показала никаких признаков рака (рисунок 3).

Рисунок 3 – КТ брюшной полости, показывающее отсутствие рецидива заболевания через 6 месяцев после завершения лечения DCA. Стрелки указывают на хирургические клипсы в правом почечном ложе после нефрэктомии.

Пациентка продолжала регулярно наблюдаться в онкологической клинике своей местной больницы с плановыми КТ-сканированиями примерно каждые 6 месяцев. Последнее КТ-сканирование в октябре 2011 года не показало никаких признаков рецидива mRSCC. Последующий визит к онкологу-радиологу в декабре 2011 года подтвердил отсутствие рецидива. Физическое обследование было нормальным, а ее статус работоспособности был на уровне ECOG 0. Сентябрь 2011 года ознаменовал 4-летнюю точку с момента лучевой терапии и начала лечения DCA, а декабрь 2011 года ознаменовал 4-летнюю точку с момента завершения 3-месячной терапии DCA. По состоянию на сентябрь 2012 года, через 5 лет с даты начала терапии DCA, у пациентки не было никаких симптомов. Она не получала никакого другого лечения рака в течение этого времени (включая DCA), поскольку не было никаких признаков рецидива заболевания.

Обсуждение

Мы считаем, что это первый опубликованный случай длительной полной ремиссии (и вероятного излечения) mRSCC. В литературе, проиндексированной в Medline, за последние 50 лет описан только один похожий случай 5-летней полной ремиссии RSCC, однако у этого пациента не было метастатического заболевания. Наш случай требует пристального внимания, поскольку mRSCC очень агрессивен, медиана выживаемости составляет несколько месяцев при использовании всех доступных традиционных методов лечения.

Радиотерапия сама по себе обеспечивает незначительный эффект на выживаемость при mRSCC (Holmang et al. 2007). Увеличенное до 5 недель время лечения паллиативной радиотерапией в этом случае еще больше снижает вероятность излечения (маловероятную, поскольку она изначально основана на типе рака) в силу снижения гибели клеток посредством процесса, называемого «ускоренной репопуляцией». Репопуляция определяется как способность клеток в ткани восстанавливаться после дозы радиации. Репопуляция увеличивается по мере увеличения общего времени лечения для доставки дозы радиации во время курса фракционированной радиотерапии. Этот эффект снижает вред для здоровой ткани, но также снижает гибель раковых клеток — что соответствует цели паллиативной терапии. Репопуляция наиболее выражена при общем времени лучевой терапии 4-6 недель и более, и эта пациентка получила свою фракционированную радиотерапию в течение 5 недель (Abeloff 21 мая 2008 г.).

Как отмечалось ранее, DCA имеет синергизм с радиотерапией при раке простаты. Опыт автора в лечении пациентов с помощью DCA предполагает, что синергизм с радиотерапией может иметь место при различных типах рака, отличных от рака простаты. Примеры включают: 53-летнюю женщину с 3-летней полной ремиссией карциномы бартолиновой железы, леченной с помощью лучевой терапии и адъювантной DCA, и 32-летнюю женщину с 3-летней полной ремиссией анапластической астроцитомы после химиолучевой терапии с адъювантной DCA (случаи готовятся к публикации).

В этом случае mRSCC адъювантное использование DCA после курса лучевой терапии привело к удивительно полной ремиссии без каких-либо вредных побочных эффектов, кроме обратимой периферической невропатии. У этого пациента профилактический бенфотиамин и R-альфа-липоевая кислота не остановили развитие периферической невропатии от DCA. Теперь автор добавляет ацетил L-карнитин к режиму профилактики невропатии DCA, поскольку он также доказал свою эффективность при лечении невропатии другой этиологии, такой как диабетическая, химио- и антиретровирусная невропатия (Herzmann et al. 2005), (Quatraro et al. 1995), (De Grandis and Minardi 2002), (Bianchi et al. 2005).

В настоящее время нет активных клинических испытаний, изучающих роль DCA в сочетании с радиотерапией. В настоящее время проводится одно испытание, изучающее DCA в сочетании с химиотерапией и облучением при карциноме головы и шеи (Clinicaltrials.gov 2012). Из-за непатентованного статуса DCA исследователям было сложно собрать средства для проведения дорогостоящих испытаний на людях. Мы надеемся, что публикация ясных случаев, иллюстрирующих преимущества DCA в качестве адъюванта к традиционным методам лечения рака, побудит исследователей найти новые креативные механизмы сбора средств, чтобы DCA можно было официально исследовать в дальнейших испытаниях на людях. Мы надеемся, что DCA таким образом станет более широко принятой в онкологическом сообществе и будет использоваться на благо пациентов с неизлечимыми злокачественными новообразованиями.

Поскольку завершение клинических испытаний на людях может занять много лет, в промежуточный период мы считаем этичным осторожно назначать DCA «не по назначению» в сочетании с паллиативной радиотерапией или после нее для пациентов, которые полностью понимают и принимают риски и преимущества. DCA может сыграть еще одну роль в качестве нового терапевтического подхода в сочетании с радиотерапией для радиорезистентных неметастатических видов рака, но это еще предстоит прояснить. Подтверждение
 

Автор хотел бы поблагодарить доктора Хумайру Хан и доктора Айзека Элиаза за их помощь в подготовке этого отчета о случае, а также пациентку за согласие опубликовать ее случай.

Заявление автора о раскрытии информации

Автор назначает лекарства для лечения рака (включая дихлорацетат), которые предоставляются через онкологические центры Medicor за плату. Эта клиника принадлежит члену семьи автора.
 

(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Ссылки

Abeloff, MD, Armitage, JO, Niederhuber, JE, Kastan, MB & McKenna, WG (21 мая 2008 г.). Клиническая онкология Абелоффа , 4-е издание, Глава: Биологические эффекты радиации.
Издатель – Google Scholar

Бхайджи, Ф. (2012). « Плоскоклеточная карцинома почечной лоханки », Энн Диагн Патол, 16(2), 124-7.
Издатель – Google Scholar

Бхандари, А., Аласси, О., Роджерс, К. и Макленнан, Г. Т. (2010). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки », J Urol, 183(5), 2023-4.
Издатель – Google Scholar

Bianchi, G., Vitali, G., Caraceni, A., Ravaglia, S., Capri, G., Cundari, S., Zanna, C. и Gianni, L. (2005). « Симптоматические и нейрофизиологические ответы невропатии, вызванной паклитакселом или цисплатином, на пероральный ацетил-L-карнитин », Eur J Cancer, 41(12), 1746-50.
Издатель – Google Scholar

Bonnet, S., Archer, SL, Allalunis-Turner, J., Haromy, A., Beaulieu, C., Thompson, R., Lee, CT, Lopaschuk, GD, Puttagunta, L., Bonnet, S., Harry, G., Hashimoto, K., Porter, CJ, Andrade, MA, Thebaud, B. и Michelakis, ED (2007). « Ось митохондриального канала K+ подавляется при раке, а ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака », Cancer Cell, 11(1), 37-51.
Издатель – Google Scholar

Брандсма, Д., Дорло, ТПК, Хаанен, Дж. Х., Бейнен, Дж. Х. и Бугерд, В. (2010). « Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом », J Neurol, 257 (12), 2099–100.
Издатель – Google Академия

Cao, W., Yacoub, S., Shiverick, KT, Namiki, K., Sakai, Y., Porvasnik, S., Urbanek, C. и Rosser, CJ (2008). « Дихлорацетат (DCA) сенсибилизирует как дикие, так и сверхэкспрессирующие Bcl-2 клетки рака простаты in vitro к радиации », Prostate, 68(11), 1223-31.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Карлсон, Х. Э. (1960). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки: пятилетнее лечение », J Urol, 83, 813-4.
Издатель – Google Scholar

Clinicaltrials.Gov (2012). [Онлайн], Доступно: http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=dichloroacetate+radiotherapy [доступ 1 сентября 2012 г.].
Издатель

De Grandis, D. & Minardi, C. (2002). « Ацетил-L-карнитин (левацекарнин) в лечении диабетической невропатии. Долгосрочное, рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование », Drugs RD, 3(4), 223-31.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Ди Баттиста Л., Стио Ф., Гуарино С., Галани А., Матуро А., Димко М., Манчини М. и Галло П. (2012). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки с камнями и инфильтрацией нижней полой вены. Отчет о случае », Дж. Чир, 33 (5), 182–5.
Издатель – Google Академия

Fiebiger, W., Olszewski, U., Ulsperger, E., Geissler, K. & Hamilton, G. (2011). « Цитотоксичность in vitro новых препаратов на основе платины и дихлорацетата против линий клеток карциноида легких », Clin Transl Oncol, 13(1), 43-9.
Издатель – Google Scholar

Herzmann, C., Johnson, MA и Youle, M. (2005). « Долгосрочный эффект ацетил-L-карнитина при антиретровирусной токсической нейропатии », HIV Clin Trials, 6(6), 344-50.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Холманг, С., Леле, СМ и Йоханссон, СЛ (2007). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки и мочеточника: заболеваемость, симптомы, лечение и исход », J Urol, 178(1), 51-6.
Издатель – Google Scholar

Kaufmann, P., Engelstad, K., Wei, Y., Jhung, S., Sano, MC, Shungu, DC, Millar, WS, Hong, X., Gooch, CL, Mao, X., Pascual, JM, Hirano, M., Stacpoole, PW, Dimauro, S. и De Vivo, DC (2006). « Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование », Neurology, 66(3), 324-30.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Kimura, T., Kiyota, H., Asano, K., Madarame, J., Yoshino, Y., Miki, K., Abe, K., Hasegawa, T. и Ohishi, Y. (2000). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки с расширением нижней полой вены », Int J Urol, 7(8), 316-9; Обсуждение 320.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Lee, TY, Ko, SF, Wan, YL, Cheng, YF, Yang, BY, Huang, DL, Hsieh, HH, Yu, TJ и Chen, WJ (1998). « Плоскоклеточный рак почек: результаты КТ и клиническое значение », Abdom Imaging, 23(2), 203-8.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Ли, МК и Чунг, ВЛ (1987). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки », J Urol, 138(2), 269-71.
Издатель – Google Scholar

Medicor (данные DCA 2009) [онлайн], доступно: www.medicorcancer.com/DCAdata.html [дата обращения: 1 октября 2012 г.].

Medline (RSCC 2012) [онлайн], доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed , критерии поиска: почки [название] или почки [название] и («плоскоклеточная карцинома» [название]) [доступ 1 октября 2012 г.].
Издатель

Michelakis, ED, Sutendra, G., Dromparis, P., Webster, L., Haromy, A., Niven, E., Maguire, C., Gammer, TL, Mackey, JR, Fulton, D., Abdulkarim, B., McMurtry, MS и Petruk, KC (2010). « Метаболическая модуляция глиобластомы с помощью дихлорацетата », Sci Transl Med, 2(31), 31ra34.
Издатель – Google Scholar 

Кватраро А., Рока П., Донцелла К., Акампора Р., Марфелла Р. и Джулиано Д. (1995). « Ацетил-L-карнитин при симптоматической диабетической нейропатии », Diabetologia, 38(1), 123.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Saed, GM, Fletcher, NM, Jiang, ZL, Abu-Soud, HM и Diamond, MP (2011). « Дихлорацетат индуцирует апоптоз эпителиальных клеток рака яичников посредством механизма, включающего модуляцию окислительного стресса », Reprod Sci, 18(12), 1253-61.
Издатель – Google Scholar 

Shroads, AL, Guo, X., Dixit, V., Liu, HP, James, MO и Stacpoole, PW (2008). « Кинетика и метаболизм дихлорацетата, зависящие от возраста: возможная связь с токсичностью », J Pharmacol Exp Ther, 324(3), 1163-71.
Издатель – Google Scholar

Stacpoole, PW, Gilbert, LR, Neiberger, RE, Carney, PR, Valenstein, E., Theriaque, DW и Shuster, JJ (2008). « Оценка долгосрочного лечения детей с врожденным лактатацидозом с помощью дихлорацетата », Pediatrics, 121(5), E1223-8.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Stacpoole, PW, Kerr, DS, Barnes, C., Bunch, ST, Carney, PR, Fennell, EM, Felitsyn, NM, Gilmore, RL, Greer, M., Henderson, GN, Hutson, AD, Neiberger, RE, O'Brien, RG, Perkins, LA, Quisling, RG, Shroads, AL, Shuster, JJ, Silverstein, JH, Theriaque, DW и Valenstein, E. (2006). « Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактатацидоза у детей », Pediatrics, 117(5), 1519-31.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Stacpoole, PW, Lorenz, AC, Thomas, RG и Harman, EM (1988). « Дихлорацетат в лечении лактоацидоза », Ann Intern Med, 108(1), 58-63.
Издатель – Google Scholar

Stacpoole, PW, Wright, EC, Baumgartner, TG, Bersin, RM, Buchalter, S., Curry, SH, Duncan, CA, Harman, EM, Henderson, GN, Jenkinson, S. & Et Al. (1992). « Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения лактатацидоза у взрослых. Группа по изучению дихлорацетата и лактатацидоза », N Engl J Med, 327(22), 1564-9.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Tong, J., Xie, G., He, J., Li, J., Pan, F. и Liang, H. (2011). « Синергический противоопухолевый эффект дихлорацетата в сочетании с 5-фторурацилом при колоректальном раке », J Biomed Biotechnol, 2011, 740564.
Издатель – Google Scholar

Велла, С., Конти, М., Тассо, Р., Канседда, Р. и Пагано, А. (2012). « Дихлорацетат подавляет рост нейробластомы, действуя специфически против злокачественных недифференцированных клеток », Int J Cancer, 130(7), 1484-93.
Издатель – Google Scholar 

Winkler, G., Pal, B., Nagybeganyi, E., Ory, I., Porochnavec, M. & Kempler, P. (1999). « Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии », Arzneimittelforschung, 49(3), 220-4.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Wong, JYY, Huggins, GS, Debidda, M., Munshi, NC и De Vivo, I. (2008). « Дихлорацетат индуцирует апоптоз в клетках рака эндометрия », Gynecol Oncol, 109(3), 394-402.
Издатель – Google Scholar

Xie, J., Wang, BS, Yu, DH, Lu, Q., Ma, J., Qi, H., Fang, C. и Chen, HZ (2011). « Дихлорацетат переключает метаболизм с гликолиза на окисление глюкозы и проявляет синергическое ингибирование роста с цисплатином в клетках Hela », Int J Oncol, 38(2), 409-17.
Издатель – Google Scholar

Xu, RH, Pelicano, H., Zhou, Y., Carew, JS, Feng, L., Bhalla, KN, Keating, MJ и Huang, P. (2005). « Ингибирование гликолиза в раковых клетках: новая стратегия преодоления лекарственной устойчивости, связанной с митохондриальным респираторным дефектом и гипоксией », Cancer Res, 65(2), 613-21.
Издатель – Google Scholar 

Ziegler, D., Hanefeld, M., Ruhnau, KJ, Hasche, H., Lobisch, M., Schutte, K., Kerum, G. и Malessa, R. (1999). « Лечение симптоматической диабетической полинейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой: 7-месячное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN III). Группа исследования ALADIN III. Альфа-липоевая кислота при диабетической нейропатии », Diabetes Care, 22(8), 1296-301.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct

Амигдалин подавляет рост клеток почечно-клеточной карциномы in vitro

• Авторы: 
  • Ева Юнгель
   
  • Анита Томас
  
  

Аннотация

Хотя амигдалин используется многими онкологическими больными в качестве противоопухолевого средства, отсутствует информация об эффективности и токсичности этого природного соединения. В настоящем исследовании изучалось ингибирующее действие амигдалина на рост клеток почечно-клеточной карциномы (ПКР). Амигдалн (10 мг/мл) применялся к линиям клеток ПКР, Caki-1, KTC-26 и A498, в течение 24 часов или 2 недель. Необработанные клетки служили в качестве контроля. Рост и пролиферацию опухолевых клеток определяли с помощью тестов MTT и BrdU, а также оценивали фазы клеточного цикла. Экспрессия активирующих клеточный цикл белков cdk1, cdk2, cdk4, циклина A, циклина B, циклина D1 и D3, а также ингибирующих клеточный цикл белков p19 и p27 изучалась с помощью вестерн-блоттинга. Также исследовалась поверхностная экспрессия маркеров дифференциации E- и N-кадгерина. Функциональная блокада siRNA использовалась для определения влияния нескольких белков на рост опухолевых клеток. Лечение амигдалином вызвало значительное снижение роста и пролиферации клеток RCC. Этот эффект коррелировал с уменьшением процента клеток RCC в фазе G2/M и увеличением процента клеток в фазе G0/1 (Caki-1 и A498) или остановкой клеточного цикла в S-фазе (KTC-26). Кроме того, амигдалин вызвал заметное снижение белков, активирующих клеточный цикл, в частности cdk1 и циклина B. Функциональное блокирование cdk1 и циклина B привело к значительному снижению роста опухолевых клеток во всех трех линиях клеток RCC. Помимо ингибирующего воздействия на рост, амигдалин также модулировал маркеры дифференциации, E- и N-кадгерин. Следовательно, воздействие амигдалина на клетки RCC подавляло прогрессирование клеточного цикла и рост опухолевых клеток за счет нарушения экспрессии cdk1 и циклина B. Более того, мы отметили, что амигдалин влияет на маркеры дифференциации. Таким образом, мы предполагаем, что амигдалин оказывает противоопухолевое действие на ПКР in vitro.

Введение

Почечно-клеточная карцинома (ПКР) является наиболее распространенным раком почки и самой агрессивной урологической опухолью, и ее заболеваемость растет ( 1 ). Примерно у 15-20% пациентов с ПКР уже есть метастазы на момент постановки диагноза, в то время как у 30% пациентов метастазы развиваются во время терапии. После метастазирования прогноз для пациентов неблагоприятный. Расширение знаний о молекулярных механизмах действия ПКР способствовало разработке таргетной терапии в течение последнего десятилетия, тем самым улучшая прогноз для пациентов на поздних стадиях заболевания. Однако, несмотря на терапевтические достижения, прогноз для пациентов с ПКР остается неблагоприятным, 5-летняя выживаемость остается между 5 и 12% ( 2 , 3 ).

Большинство пациентов с прогрессирующим раком почки хотят активно участвовать в борьбе с раком и/или избегать неблагоприятных побочных эффектов, которые часто возникают при традиционной терапии. Поэтому многие пациенты обращаются к комплементарной и альтернативной медицине (КАМ). Более 50% онкологических больных в Европе ( 4 ) и до 80% онкологических больных в Соединенных Штатах ( 5 ) используют КАМ вместе с традиционной терапией или вместо нее.

Амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид) — это природное соединение, которое часто используют онкологические больные. Он содержится в косточках абрикосов, персиков, яблок и горького миндаля ( 6–8 ). Первые исследования по использованию амигдалина онкологическими больными были проведены в России в 1840-х годах ( 9 ). В 1920-х годах амигдалин также назначали онкологическим больным в Соединенных Штатах ( 10 ). В 1950-х годах был представлен полусинтетический , химически иной производный амигдалина, лаэтрил. После появления лаэтрила термины амигдалин и лаэтрил часто использовались как синонимы, что затрудняло выводы из исследований, в которых не делалось различий между этими двумя соединениями ( 11 ) . В 1970-х годах амигдалин/леатрил стал одним из самых популярных нетрадиционных методов лечения рака. К 1978 году около 70 000 онкологических больных в США использовали амигдалин ( 12 ) . Национальный институт рака (NCI) инициировал несколько исследований ( 13–16 ) с отрезвляющими результатами. В резюме единственного испытания фазы II не было приписано существенной пользы амигдалину, в то время как было описано несколько пациентов с симптомами отравления цианидом (HCN) ( 13 ) . Однако качество этого исследования сомнительно, поскольку использовалась гетерогенная когорта пациентов, не были включены контрольные группы, а для внутривенной терапии использовался рацемат вместо чистого амигдалина. Все официальные суждения относительно амигдалина были основаны на этом испытании, поскольку никаких других клинических испытаний с амигдалином не доступно. Немецкий федеральный институт лекарственных средств и медицинских приборов (BfArM) ( http://www.bfarm.de/DE/Home/home_node.html ) также классифицировал амигдалин как сомнительный препарат, как и коллеги в других странах. Несмотря на противоречия и отсутствие научно обоснованных данных о пользе и рисках амигдалина, многие онкологические пациенты используют амигдалин ( 11 , 17 ). Таким образом, чтобы прояснить многие вопросы, на которые еще предстоит ответить относительно влияния амигдалина на рост и пролиферацию опухоли, в настоящем исследовании были определены прогрессия клеточного цикла и основные молекулярные режимы действия в клетках почечно-клеточного рака.

Материалы и методы

Клеточные культуры и лечение амигдалином

Линии клеток карциномы почки Caki-1, KTC-26 и A498 были приобретены у LGC Promochem (Wesel, Германия). Клетки выращивали и субкультивировали в среде RPMI-1640 (полученной у Seromed, Берлин, Германия) с добавлением 10% FCS, 20 мМ HEPES-буфера, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в инкубаторе. Субкультуры из пассажей 5–24 были отобраны для использования в экспериментах. Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток и затем добавлен к опухолевым клеткам в концентрации 10 мг/мл [ранее оцененной как оптимальная концентрация ( 18 )] на 24 часа или 2 недели (три раза в неделю) для оценки острого и хронического лечения. Контрольные группы оставались необработанными. Во всех экспериментах в настоящем исследовании обработанные культуры опухолевых клеток сравнивались с необработанными культурами опухолевых клеток. Для изучения токсического действия амигдалина жизнеспособность клеток определялась с помощью трипанового синего (Gibco/Invitrogen, Дармштадт, Германия).

Измерение роста, пролиферации и апоптоза опухолевых клеток

Рост клеток оценивали с помощью анализа восстановления красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) (Roche Diagnostics, Пенцберг, Германия). Клетки Caki-1 (50 мкл , 1×10 5 клеток/мл) высевали на 96-луночные планшеты для культивирования тканей. Через 24, 48 и 72 часа добавляли 10 мкл МТТ (0,5 мг/мл) еще на 4 часа. После этого клетки лизировали в буфере, содержащем 10% SDS в 0,01 М HCl. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO 2 . Поглощение при 550 нм определяли для каждой лунки с помощью микропланшетного иммуноферментного анализа (ELISA). После вычитания фонового поглощения результаты выражались как среднее количество клеток.

Пролиферацию клеток измеряли с помощью набора для определения пролиферации клеток BrdU ELISA (Calbiochem/Merck Biosciences, Дармштадт, Германия). Опухолевые клетки, посеянные на 96-луночных планшетах, инкубировали с 20 мкл раствора для маркировки BrdU на лунку в течение 8 ч, фиксировали и детектировали с помощью анти-BrdU mAb в соответствии с инструкциями производителя. Поглощение измеряли при 450 нм с помощью ридера для микропланшетов ELISA.

Для оценки того, был ли рост опухолевых клеток нарушен или уменьшен из-за апоптоза, экспрессия аннексина V/пропидиум йодида (PI) была оценена с помощью набора Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия). Опухолевые клетки были дважды промыты PBS и затем инкубированы с 5 мкл Annexin V-FITC и 5 мкл PI в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки были проанализированы методом проточной цитометрии с использованием FACSCalibur (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия). Процент апоптотических клеток (ранних и поздних) в каждом квадранте был рассчитан с помощью программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences).

Процент клеток в разных фазах клеточного цикла

Анализ клеточного цикла проводился на субконфлюэнтных клеточных культурах. Популяции опухолевых клеток окрашивались PI с использованием набора реагентов CycleTEST PLUS DNA, а затем подвергались проточной цитометрии с использованием FACScan (оба от Becton-Dickinson, Гейдельберг, Германия). Из каждого образца было собрано 10 000 событий. Сбор данных проводился с использованием программного обеспечения CellQuest, а распределение клеточного цикла рассчитывалось с использованием программного обеспечения ModFit (Becton-Dickinson). Количество клеток с гейтированием в фазах G1, G2/M или S выражается в процентах.

Экспрессия белков, регулирующих клеточный цикл

Белки, регулирующие клеточный цикл, исследовали с помощью вестерн-блоттинга. Лизаты опухолевых клеток наносили на 7-15% полиакриламидный гель (в зависимости от размера белка) и подвергали электрофорезу в течение 90 мин при 100 В. Затем белок переносили на нитроцеллюлозные мембраны (1 ч, 100 В). После блокирования обезжиренным сухим молоком в течение 1 часа мембраны инкубировали в течение ночи с моноклональными антителами, направленными против следующих белков клеточного цикла, которые все были от BD Biosciences: cdk1 (IgG1, клон 1, разведение 1:2500; #610038), cdk2 (IgG2a, клон 55, разведение 1:2500; #610146), cdk4 (IgG1, клон 97, разведение 1:250; #610148), циклин A (IgG1, клон 25, разведение 1:250; #611269), циклин B (IgG1, клон 18, разведение 1:1000; #610220), циклин D1 (IgG1, клон G124-326, разведение 1:250; #554181), циклин D3 (IgG2b, клон 1, разведение 1:1000; #610280), p19 (IgG1, клон 52/p19, разведение 1:5000; #610530), p27 (IgG1, клон 57, разведение 1:500; #610244). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG (разведение 1:5000; #12-349; Merck Millipore, Темекула, Калифорния, США) служили в качестве вторичных антител. Мембраны ненадолго инкубировали с реагентом для обнаружения ECL (ECL™; Amersham/GE Healthcare, Мюнхен, Германия) для визуализации белков, а затем анализировали с помощью системы Fusion FX7 (Peqlab, Эрланген, Германия). В качестве внутреннего контроля служил β-актин (разведение 1:1000; #A5441; Sigma, Тауфенкирхен, Германия).

Поверхностная экспрессия E- и N-кадгерина

Опухолевые клетки промывали в блокирующем растворе (PBS, 0,5% BSA), а затем инкубировали в течение 60 мин при 4°C с моноклональными антителами (mAB), конъюгированными с фикоэритрином (PE), направленными против следующих антител: анти-человеческий E-кадгерин-PE (мышиный IgG2b, клон 180224; #FAB18381P) и анти-человеческий N-кадгерин-PE (крысиный IgG2a, клон 401408; #IC1388P) (оба от R&D Systems, Висбаден, Германия). Затем поверхностную экспрессию E- и N-кадгерина клеток RCC измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием FACscan [анализ гистограммы канала FL-2H (log); 1×10 4 клеток/сканирование; BD Biosciences] и выражали в виде средних единиц флуоресценции. В качестве изотипического контроля служили крысиный IgG2a-PE (клон RG7/1.30; № 558067) или мышиный IgG2b-PE (клон 27-35; № 555743) (оба от BD Biosciences).

Блокировка экспериментов

Чтобы определить, влияют ли cdk1 и циклин B на рост опухолевых клеток в клеточных линиях Caki-1, KTC-26 и A498, клетки были трансфицированы. Опухолевые клетки (3×10 5 /6-луночные) были трансфицированы малой интерферирующей РНК (siRNA), направленной против cdk1 (Hs_CDC2_10, идентификатор гена: 983, целевая последовательность: AAGGGGTTCCTAGTACTGCAA) или циклина B (Hs_CCNB1_6, идентификатор гена: 891, целевая последовательность: AATGTAGTCATGGTAAATCAA) (оба от Qiagen, Хильден, Германия), с реагентом siRNA/трансфекции (реагент трансфекции HiPerFect; Qiagen) в соотношении 1:6. Необработанные клетки и клетки, обработанные 5 нМ контрольной siRNA (AllStars Negative Control siRNA; Qiagen), служили в качестве контролей. Затем рост опухолевых клеток определяли, как указано выше.

Статистический анализ

Все эксперименты проводились 3–6 раз. Статистическая значимость определялась с помощью U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Значение p < 0,05 считалось указывающим на статистически значимую разницу.

Результаты

Рост и пролиферация опухолевых клеток блокируются амигдалином

Воздействие амигдалина (10 мг/мл) в течение 24 ч или 2 недель привело к значительной и схожей степени ингибирования роста в течение 72 ч во всех трех линиях клеток почечно-клеточного рака, Caki-1, KTC-26 и A498, по сравнению с необработанными контрольными клетками ( рис. 1 ). Пролиферация клеток Caki-1, KTC-26 и A498 также была значительно снижена после 24 ч или 2 недель воздействия амигдалина по сравнению с контрольными клетками ( рис. 2 ). Противоопухолевые эффекты в клетках почечно-клеточного рака были сопоставимы после 24 ч и 2 недель лечения амигдалином ( рис. 2 ).

Рисунок 1 Рост клеток почечно-клеточной карциномы (RCC), (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498. Клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные клетки оставались необработанными. Количество клеток было установлено на уровне 100% после 24 ч инкубации. Полоски указывают на среднее значение ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значительное отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Рисунок 2 Пролиферация клеток почечно-клеточной карциномы (RCC). Клетки (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498 обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные группы оставались без обработки. Полоски указывают средние значения ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значимое отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Ни апоптоз, ни некроз не индуцируются амигдалином.

После введения амигдалина не было выявлено ни значительного раннего или позднего апоптоза, ни индукции некроза (данные не представлены).

Амигдалин изменяет процент клеток почечно-клеточного рака в фазах G0/1, S и G2/M

Амигдалин значительно увеличил процент клеток Caki-1 и A498 в фазе G0/G1 и уменьшил количество клеток в фазе S и G2/M через 24 ч и 2 недели ( рис. 3 ) воздействия по сравнению с необработанными контролями. В клетках KTC-26 амигдалин вызвал значительное снижение процента клеток в фазе G2/M, в то время как клетки в фазе S увеличились (24 ч, <2 недель). Не было измерено значительного увеличения процента клеток в фазе G0/G1 после 24-часовой обработки амигдалином в клетках KTC-26. Через 2 недели обработки амидалином в клетках KTC-26, сопровождавшейся увеличением S-фазы, количество клеток в фазе G0/G1 значительно снизилось ( рис. 3 ) по сравнению с контролем.

Рисунок 3 Влияние амигдалина на распределение клеток почечно-клеточной карциномы (ПКР) в различных фазах клеточного цикла. Указан процент клеток Caki-1 (Caki), KTC-26 (KTC) и A498 в фазах G01/1, S и G2/M. Клетки ПКР, обработанные амигдалином в течение 24 ч или 2 недель, сравнивались с необработанными контрольными клетками. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Амигдалин вызывает снижение экспрессии белка, активирующего клеточный цикл

Мы отметили, что изменения в прогрессии клеточного цикла сопровождались модуляцией белков, регулирующих клеточный цикл ( рис. 4 ). Во всех трех клеточных линиях, Caki-1, KTC-26 и A498, обработка амигдалином в течение 24 ч и 2 недель способствовала снижению регуляции активирующих клеточный цикл белков cdk1, cdk2 и cdk4, а также циклинов A и B, причем самые сильные эффекты были отмечены в отношении экспрессии cdk1 и циклина B. Циклин D1 также был снижен в Caki-1 и KTC-26 через 24 ч ( рис. 4 , левая панель) и в Caki-1 и A498 после 2 недель применения амигдалина ( рис. 4 , правая панель). Не было обнаружено выраженных изменений для циклина D3 ни в одной клеточной линии. В отличие от белков, активирующих клеточный цикл, экспрессия белка p19, ингибирующего клеточный цикл, была усилена после воздействия амигдалина в клеточных линиях Caki-1 (24 ч и 2 недели) и A498 (24 ч). p27 также был повышен в клетках A498 (24 ч) ( рис. 4 , левая панель). Однако p19 и p27 были снижены в клетках KTC-26, а снижение p27 было отмечено в клетках Caki-1 через 24 ч.

Рисунок 4 Профиль экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл, в клетках почечно-клеточной карциномы (RCC). Клетки Caki-1, KTC-26 и A498 после 24 ч (левая панель) или 2 недель (правая панель) воздействия амигдалина и необработанные контроли. −, контроль; +, амигдалин. β-актин служил внутренним контролем. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Снижение уровня cdk1 и циклина B связано с ингибированием роста, вызванным амигдалином.

В связи с тем, что в настоящем исследовании наиболее яркое ингибирующее действие амигдалина было отмечено в отношении экспрессии cdk1 и циклина B, влияние этих двух белков на рост опухолевых клеток оценивалось путем блокирования их функции с помощью siRNA. Нокдаун cdk1 и циклина B привел к значительному ингибированию роста клеток во всех трех клеточных линиях по сравнению с необработанным и имитированным контролем ( рис. 5A–C ). Во всех трех клеточных линиях RCC блокирование экспрессии белков cdk1 и циклина B было подтверждено с помощью вестерн-блоттинга ( рис. 5D ).

Рисунок 5 Рост опухолевых клеток почечно-клеточного рака (RCC). (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498 после функциональной блокировки с помощью siRNA, нацеленной на cdk1 и циклин B. AllStars отрицательный контроль siRNA служил в качестве контроля трансфекции (макет). Контроли оставались необработанными. Полоски указывают стандартное отклонение (SD). * p≤0,05, значимое различие с контролем. n=5 экспериментов. (D) Профиль экспрессии белка регулирующих клеточный цикл белков клеток Caki-1, KTC-26 и A498 после функциональной блокировки с помощью siRNA, нацеленной на cdk1 и циклин B. AllStars отрицательный контроль siRNA служил в качестве контроля трансфекции (макет). Контроли оставались необработанными. β-актин служил в качестве внутреннего контроля. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Маркеры дифференциации модулируются обработкой амигдалином

Дедифференцировка опухолевых клеток сопровождается потерей E-кадгерина и повышенной экспрессией N-кадгерина. Экспрессия этих двух маркеров дифференцировки была определена для того, чтобы оценить, влияет ли амигдалин на дифференцировку опухолевых клеток. После 24 ч обработки амигдалином мы отметили значительное снижение поверхностного N-кадгерина в трех клеточных линиях ( рис. 6 ). После 2 недель обработки амигдалином было отмечено заметное увеличение экспрессии E-кадгерина на поверхности клеток Caki-1 и KTC-26 ( рис. 6A и B ). В клетках KTC-26 повышение E-кадгерина было связано со значительным снижением поверхностного N-кадгерина ( рис. 6B ). Однако экспрессия N-кадгерина в клетках Caki-1 значительно увеличилась после 2 недель воздействия амигдалина, хотя MFU все еще была ниже, чем для E-кадгерина ( рис. 6A ). Никакого существенного влияния на Е-кадгерин в клетках А498 после 2 недель применения амигдалина отмечено не было.

Рисунок 6 Поверхностная экспрессия маркеров дифференциации E- и N-кадгерина на клетках почечно-клеточной карциномы (RCC). (A) Клетки Caki-1, (B) KTC-26 и (C) Клетки A498 через 24 часа и 2 недели применения амигдалина. Поверхностная экспрессия указана как средние относительные единицы флуоресценции [MFU (%)]. Контрольные значения были установлены на уровне 100% (пунктирная линия). Полоски указывают средние значения ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значимое отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы отметили, что обработка линий клеток почечно-клеточного рака Caki-1, KTC-26 и A498 амигдалином вызвала значительное ингибирование роста и пролиферации клеток. Подобное снижение роста после применения амигдалина было отмечено в клетках немелкоклеточного рака легких ( 19 ) и рака мочевого пузыря ( 18 ) in vitro , а также в клетках рака шейки матки in vivo ( 20 ). На основании наших данных мы приходим к выводу, что ингибирование роста, вызванное амигдалином, не связано с апоптозом или некрозом. Другие раковые клетки, такие как клетки рака шейки матки, мочевого пузыря и простаты, реагируют на амигдалин апоптозом, что приводит к ингибированию роста ( 18 , 20 , 21 ). Таким образом, способ действия амигдалина, по-видимому, зависит от типа рака.

Хотя ингибирование роста во всех трех линиях клеток RCC сопровождалось изменениями в процентном содержании клеток в различных фазах клеточного цикла, изменения не были однородными. Обработка клеток Caki-1 и A498 амигдалином вызвала увеличение клеток в фазе G0/G1 за счет снижения S- (Caki-1 и A498) и G2/M-фаз (Caki-1). Обработка амигдалином вызвала увеличение клеток в фазе S в клетках KTC-26, в то время как фазы G2/M и G0/G1 были снижены через 2 недели. Повышение количества клеток в фазе S в KTC-26 после применения амигдалина, вероятно, свидетельствует об остановке клеточного цикла в S-фазе. В различных линиях клеток рака мочевого пузыря также была отмечена блокада роста, вызванная амигдалином, которая осуществлялась путем различного влияния на прогрессирование клеточного цикла, увеличивая процент клеток в фазе G0/G1 в одной линии клеток и повышая количество клеток в фазе S в другой ( 18 ).

Изменение процентного содержания фаз клеточного цикла коррелировало с модуляцией экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл. Во всех трех линиях клеток RCC большинство белков, активирующих клеточный цикл, были снижены после лечения амигдалином, в частности cdk1 и циклин B. Известно, что Cdk1 является ключевой киназой для митотического входа ( 22 ). Было показано, что ось cdk1-циклин B в опухолевых клетках участвует в продвижении митоза и преодолении остановки клеточного цикла, зависящей от химиотерапии ( 23 ). Во всех трех линиях клеток RCC снижение cdk1 и циклина B было связано с ингибирующим эффектом, оказываемым амигдалином, что доказано с помощью нокдауна siRNA. Наряду с осью cdk1-циклин B, ось cdk2-циклин A также была отчетливо изменена в клетках RCC. Cdk2/циклин A способствует переходу из фазы G1 в фазу S и, как было показано, важен для ингибирования клеток рака мочевого пузыря, вызванного амигдалином ( 18 ). Мы предполагаем, что накопление клеток G0/G1 было обусловлено ингибирующим эффектом, который амигдалин оказывал на cdk2 и циклин B. Однако обработка клеточной линии KTC-26 амигдалином не привела к остановке фазы G0/G1, а скорее к остановке фазы S. Предположительно, это связано с ингибирующим клеточный цикл белком p19, уровень которого был повышен в клетках Caki-1 и A498 после применения амигдалина, но снижен в клетках KTC-26. p19 участвует в активности контрольной точки G1, останавливая вход клеток в фазу S ( 24 ). Ингибирование p19 увеличивает фракцию клеток в фазе S ( 25 ). Таким образом, это, вероятно, объясняет, почему мы отметили увеличение в фазе G0/G1 клеток Caki-1 и A498, в то время как клетки KTC-26 накапливались в фазе S. Следовательно, мы предполагаем, что вызванные амигдалином изменения в экспрессии регулирующего клеточный цикл белка ответственны за различные эффекты на прогрессирование клеточного цикла в разных клеточных линиях.

Во время возникновения и прогрессирования опухоли RCC происходит дедифференциация, сопровождаемая эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT) ( 26 , 27 ). Во время перехода опухолевые клетки теряют эпителиальный (E)-кадгерин и приобретают нейральный (N)-кадгерин ( 26 , 28 ). Во всех трех линиях клеток RCC, использованных в этом исследовании, применение амигдалина в течение 24 часов вызвало значительное снижение экспрессии N-кадгерина, что указывает на повторную дифференциацию. Ранее N-кадгерин был связан с агрессивностью и злокачественным потенциалом RCC ( 29 ). Следовательно, мы предполагаем, что нарушение экспрессии N-кадгерина при 24-часовом применении амигдалина приводит к менее злокачественному типу опухоли. После 2 недель воздействия амигдалина стало очевидным переключение способа действия амигдалина, в основном затрагивающее экспрессию E-кадгерина. Экспрессия поверхности E-кадгерина Caki-1 и KTC-26 значительно увеличилась. В различных клетках RCC in vitro эпителиально-мезенхимальный переход, рост опухоли и агрессивный фенотип, как было показано, обратно связаны с низким уровнем E-кадгерина ( 30 , 31 ). Плохой прогноз и опухоли RCC высокой степени злокачественности были связаны с недостатком E-кадгерина ( 32 ). В опухолевой ткани RCC человека наблюдалось 3-кратное снижение E-кадгерина ( 33 ), и было постулировано, что экспрессия E-кадгерина в RCC является важным предиктором рецидива заболевания ( 34 ). Таким образом, мы предполагаем, что вызванное амигдалином увеличение E-кадгерина в клетках Caki-1 и KTC-26, которое мы отметили, указывает на повторную дифференцировку обратно к менее агрессивному фенотипу. Наблюдаемое переключение от снижения N-кадгерина к усилению E-кадгерина указывает на различные режимы действия амигдалина. Поскольку уровень N-кадгерина больше не снижался ни в одной из трех линий клеток после 2 недель воздействия амигдалина и даже повышался в клетках Caki-1, мы предполагаем, что соотношение между экспрессией E- и N-кадгерина имеет решающее значение для статуса дифференциации. Действительно, было показано, что эффект N-кадгерина зависит от экспрессии E-кадгерина ( 29 ).

В заключение, амигдалин ингибирует прогрессирование клеточного цикла и рост опухолевых клеток в клетках почечно-клеточного рака, по крайней мере частично, за счет нарушения экспрессии cdk1 и циклина B, тем самым оказывая противоопухолевое действие in vitro . Хотя in vitro не было обнаружено некротических эффектов , возможны токсические эффекты, вызванные деградацией амигдалина до HCN, и этот аспект требует оценки. Необходимы дальнейшие исследования с использованием животных для проверки эффектов амигдалина in vitro и оценки того, вызывает ли HCN цитотоксичность in vivo .

Благодарности

Это исследование было поддержано «Стифтунгом Бригитты и Норберта Мут» и «Проф. Доктор Фонд Карла и Герхарда Шиллеров