Тэг: колоректальный рак

Дихлорацетат вызывает апоптоз и остановку клеточного цикла в клетках колоректального рака

оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1038/sj.bjc.6605701

.М. Мадхок*, 1 , С. Йелури 1 , С.Л. Перри 1 , Т.А. Хьюз 2 и Д.Г. Джейн 1

1 Секция трансляционной анестезии и хирургии, Университет Лидса, 7 этаж здания клинических наук, Университетская больница Св. Джеймса, Лидс, Великобритания
2 Институт молекулярной медицины Лидса, Университет Лидса, Университетская больница Св. Джеймса, Лидс, Великобритания

Адрес для переписки: д-р Б. М. Мадхок; Электронная почта: umbm@leeds.ac.uk

Исправлено: 23 марта 2010 г.
Принято: 26 апреля 2010 г.
Опубликовано: 18 мая 2010 г.

Абстрактный

Фон
Раковые клетки сильно зависят от гликолиза. Нашей целью было определить, приведет ли переключение метаболизма с гликолиза на митохондриальное дыхание к снижению роста преимущественно колоректальных раковых клеток по сравнению с нормальными клетками, и изучить лежащие в основе этого механизмы.

Методы.
Репрезентативные линии клеток колоректального рака и нераковых клеток обрабатывались дихлорацетатом (ДХА), ингибитором киназы пируватдегидрогеназы.

Результаты
Дихлорацетат (20 мМ) не снижал рост нераковых клеток, но вызывал значительное снижение пролиферации раковых клеток ( P = 0,009), что было связано с апоптозом и остановкой клеточного цикла в фазе G 2.  Наибольший апоптотический эффект был очевиден в метастатических клетках LoVo, в которых DCA индуцировал до десятикратного увеличения количества апоптотических клеток через 48 ч. Наиболее выраженный арест в фазе G 2  был очевиден в хорошо дифференцированных клетках HT29, в которых DCA вызывал восьмикратное увеличение количества клеток в фазе G 2  через 48 ч. Дихлорацетат снижал уровень лактата в ростовой среде и индуцировал дефосфорилирование субъединицы E1 α  пируватдегидрогеназного комплекса во всех клеточных линиях, но внутренний митохондриальный мембранный потенциал был снижен только в раковых клетках ( P = 0,04).

Выводы
Ингибирование киназы пируватдегидрогеназы ослабляет гликолиз и облегчает митохондриальное окислительное фосфорилирование, что приводит к снижению роста клеток колоректального рака, но не нераковых клеток.

Ключевые слова: дихлорацетат, колоректальный рак, пируватдегидрогеназа, киназа пируватдегидрогеназы
British Journal of Cancer (2010) 102, 1746 – 1752, www.bjcancer.com
doi: 10.1038/sj.bjc.6605701

© 2010 Cancer Research UK

ВВЕДЕНИЕ

Колоректальный рак является третьим по распространенности видом рака в мире и четвертой по значимости причиной смерти от рака (Shike et al, 1990). В 2007 году колоректальный рак стал причиной 17,1 смертей на 100 000 человек в Соединенном Королевстве (UK Bowel Cancer Statistics, 2009). Несмотря на недавние достижения, прогноз для пациентов с запущенным и метастатическим колоректальным раком остается неблагоприятным. Нацеливание на метаболизм опухоли для терапии рака является быстро развивающейся областью (Pan and Mak, 2007). Ранние наблюдения относительно метаболических различий между раковыми и нормальными клетками были сделаны Отто Варбургом, который показал, что раковые клетки по своей природе зависят от гликолиза для производства химической энергии (Warburg, 1956). В настоящее время появляется все больше доказательств того, что этот повышенный гликолиз является результатом влияния множественных молекулярных путей, включая адаптивные ответы на гипоксическую микросреду опухоли, онкогенную сигнализацию и митохондриальную дисфункцию (Gatenby и Gillies, 2004; Gillies и Gatenby, 2007; Wu et al, 2007). Гликолитический фенотип дает раковым клеткам преимущества в росте, противодействуя апоптозу и способствуя распространению опухоли и метастазированию (Yeluri et al, 2009).

Ключевым регулятором клеточного метаболизма является пируватдегидрогеназа (ПДГ). Пируватдегидрогеназа преобразует пируват, полученный в результате гликолиза, в ацетил-КоА, который окисляется в цикле трикарбоновых кислот в митохондриях. Активность пируватдегидрогеназы строго регулируется ингибирующим фосфорилированием киназой пируватдегидрогеназы (ПДК). Фосфорилирование происходит на субъединице E1  α ПДГ (ПДГЭ1 α ) в трех местах: Ser 232 , Ser 293 и Ser 300  (Rardin et al, 2009). Дихлорацетат (DCA) является ингибитором всех четырех изоферментов PDK(1–4) (Stacpoole, 1989), и недавно было показано, что он снижает рост линий клеток рака легких, эндометрия и молочной железы (Bonnet et al, 2007; Wong et al, 2008; Sun et al, 2009). Сообщалось, что он снижает рост этих раковых клеток в основном за счет снижения ингибирующего фосфорилирования PDH, тем самым способствуя окислительному фосфорилированию митохондрий и вызывая апоптоз через митохондриальные, NFAT-Kv 1.5 и p53-активируемый модулятор апоптоза (PUMA)-опосредованные пути.

Было обнаружено, что клетки колоректального рака подвергаются повышенному гликолизу (Bi et al, 2006), а микроокружение опухоли является гипоксическим и ацидотическим, в основном из-за плохо развитого кровоснабжения (Dewhirst et al, 1989; Milosevic et al, 2004). Ранее мы показали, что это особенно верно для более агрессивного фенотипа (Thorn et al, 2009), и экспрессия важных маркеров гипоксии увеличивается при колоректальном раке, особенно на инвазивном крае (Rajaganeshan et al, 2008, 2009). Целью данного исследования было изучение влияния DCA на рост клеток колоректального рака в попытке изучить ингибирование PDK как новую терапевтическую стратегию против колоректального рака.

Материалы и методы

Клеточные культуры
Все клеточные линии были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США) или Европейской коллекции клеточных культур (Солсбери, Уилтшир, Великобритания): HB2 (клетки эпителия молочной железы неракового происхождения), 293 (клетки эпителия из почки эмбриона человека), HT29 (высокодифференцированная первичная колоректальная аденокарцинома), SW480 (низкодифференцированная первичная колоректальная аденокарцинома) и LoVo (метастатический левый надключичный лимфатический узел из колоректальной аденокарциномы). Клетки 293 и HB2 содержались в среде DMEM, HT29 и SW480 — в среде RPMI 1640, а LoVo — в среде F12 (все от Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки, в инкубаторе с влажностью 37°C и 5% CO2  . Для экспериментов в гипоксических условиях мы инкубировали клетки в увлажненном гипоксическом инкубаторе (1% O2 , 5% CO2 , 94% N2 , 37°C). Дихлорацетат натрия (Specials Lab, Prudhoe, Великобритания) был предоставлен фармацевтическим отделением больницы St. James's University Hospital, Лидс, Великобритания.

Анализы МТТ
Клетки (1 × 10 4 ) на лунку высевали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей. После ночной инкубации мы заменили среду на свежую среду, содержащую возрастающие дозы DCA (0, 10, 15, 20, 30, 50 и 100 мМ). Через 24 и 48 ч инкубации мы провели анализ МТТ, заменив среду на 50  мкл 1 мг мл -1  раствора МТТ, и планшеты инкубировали в темноте в течение 3 ч. Затем раствор МТТ удаляли, а темно-синие осадки формазана растворяли в 100  мкл пропан-1-ола. Оптическую плотность измеряли с помощью микропланшетного ридера (Opsys MR; Dynex Technologies Ltd, Worthing, West Sussex, UK) при 570 нм.

Анализы аннексина V и 7-AAD
Клетки высевали в колбы для культивирования тканей площадью 25 см2 и  инкубировали в течение ночи в стандартных условиях. Среду заменяли свежей средой, содержащей ряд доз DCA (0, 10, 20 и 50 мМ). Анализ проточной цитометрии проводили после 24 и 48 ч инкубации. Клетки дважды промывали холодным PBS и ресуспендировали в 1 × связывающем буфере (BD Bioscience, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) при концентрации 5 × 106 клеток  на мл. 100  мкл раствора (5 × 105 клеток  ) переносили в культуральные пробирки объемом 5 мл. Эти клетки окрашивали 5  мкл аннексина V-FITC и 10  мкл 7-AAD (BD Bioscience), осторожно встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. После этого в каждую пробирку добавляли 400  мкл однократного связывающего буфера и анализировали в течение часа на проточном цитофлуориметре LSR II (BD Bioscience).

Анализы с йодидом пропидия
Клетки размножали, как указано для анализа апоптоза. Использовали дихлорацетат (50 мМ) и сравнивали с контролем-носителем. После сбора мы ресуспендировали клетки в 350  мкл PBS в концентрации 0,5–1,0 × 10 6  клеток на мл. К суспензии клеток добавляли 100  мкл 0,25 мг мл -1  йодида пропидия (PI)/5% Triton (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Затем добавляли 50  мкл 1 мг мл -1  рибонуклеазы A (Sigma). Пробирки с образцами тщательно встряхивали и инкубировали в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре. Проточную цитометрию проводили на проточном цитометре LSR II (BD Bioscience), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (FlowJo, Эшленд, штат Орегон, США).

Измерения лактата
Измерения лактата в питательных средах проводились отделением химической патологии в General Infirmary, Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. Клетки инкубировали в колбах площадью 25 см2 в  течение ночи в нормоксии. На следующий день среду заменяли на ряд доз DCA (0, 10, 20 и 50 мМ). Через 48 часов инкубации мы собрали 2 мл среды во фторидные пробирки и немедленно перенесли в лабораторию химической патологии. Во время переноса пробирки хранились на льду. Уровни лактата измеряли с помощью автоматического анализатора (система Advia 1200 Chemistry; Siemens Healthcare Diagnostics, Кэмберли, Суррей, Великобритания).

Анализы TMRM
Клетки обрабатывали DCA, как описано для анализа апоптоза. После 24 и 48 ч инкубации мы промывали клетки в PBS и суспендировали 1 × 10 6  клеток на мл в буферном солевом растворе Хэнкса с 50 нМ метиловым эфиром тетраметилродамина (TMRM) (Invitrogen). 100  мкл клеточной суспензии (1 × 10 5  клеток на лунку) переносили в непрозрачные 96-луночные планшеты, инкубировали в течение 30 мин и измеряли флуоресценцию при 530/620 нм при 37 °C с помощью планшетного ридера (Mithras LB 40; Berthold Technologies, Bad, Wildbad, Германия).

Вестерн-блоттинг
Клетки обрабатывали DCA, как описано выше. Через 8 ч обработки мы извлекали белки из клеток в буфере Лэммли (2% SDS, 10% глицерина, 0,7% 2-меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего и 0,5 M Tris-HCl). Лизаты разделяли электрофорезом на гелях NuPAGE Novex 12% Bis-Tris (Invitrogen) в буфере MOPS-SDS (Invitrogen). Белки переносили на поливинилиденфторидную мембрану (GE Healthcare, Chalford St Giles, Bucks, UK). Мембрану блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 5% обезжиренном молоке в TBS-T (трис-буферный физиологический раствор с 0,1% Tween). Затем мембрану зондировали первичными антителами в 1% обезжиренном молоке в TBS-T в течение 90 мин, промывали в TBS-T, а затем зондировали соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), в течение 60 мин. Первичные антитела: кроличьи поликлональные фосфодетектные анти-PDH-E1 α  (pSer 293 ), 1 : 500 (AP1062; EMD Chemicals, Дармштадт, Германия), и мышиные моноклональные анти-PDHE1 α , 1 : 500 (459400; Invitrogen). Вторичные антитела антикроличьи или антимышиные конъюгаты HRP, 1 : 1000 (Dako, Glostrup, Дания). Белки визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата Supersignal West Pico или Femto (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США) и системы Chemidoc XRS (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).  В качестве контроля нагрузки использовали β -актин.

Статистический анализ
Данные проточной цитометрии были получены с использованием специального программного обеспечения, BD FACSDiva 6.0 и программного обеспечения FlowJo. Статистический анализ был выполнен с использованием SPSS для Windows (SPSS версии 15.0, Чикаго, Иллинойс, США). Различия между группами, получавшими DCA, и контрольными группами, получавшими плацебо, оценивались с использованием  U -критерия Манна-Уитни и 95% доверительных интервалов разницы средних значений между двумя группами.  Значение P менее 0,05 считалось статистически значимым. Данные представлены как среднее значение по меньшей мере из трех независимых экспериментов, а планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего значения.

Результаты

DCA снижает пролиферацию раковых клеток, и эффект схож при нормоксии и гипоксии
Во-первых, мы хотели определить, ингибирует ли лечение DCA клеточную пролиферацию и будет ли дифференциальный ответ в раковых и нераковых клетках в нормоксических и гипоксических условиях. Что касается гипоксии, наша гипотеза заключалась в том, что влияние DCA будет особенно сильным при уровнях кислорода, которые недостаточны для поддержки дополнительного окислительного фосфорилирования. Все клеточные линии (HB2, 293, HT29, SW480 и LoVo) обрабатывали диапазоном доз DCA в течение 24–48 ч в нормоксических и гипоксических условиях. Относительное количество клеток оценивали с помощью анализов MTT.

Обработка возрастающими дозами DCA снижала клеточную пролиферацию дозозависимым образом (рисунок 1A-D). Вопреки нашим ожиданиям, профили снижения роста клеток были схожи при гипоксии и нормоксии. Через 24 и 48 ч до 20 мМ DCA не влияли на рост культур нераковых клеток, HB2 и 293. Однако 20 мМ DCA значительно снижали рост культур всех трех линий клеток колоректального рака ( P ⩽ 0,009). Эффект DCA был сильнее на слабодифференцированных клетках SW480 и метастатических клетках LoVo, чем на хорошо дифференцированных клетках HT29. Рост культур клеток LoVo, обработанных 20 мМ DCA, снижался до 40% по сравнению с клетками, обработанными контрольным раствором. Поскольку наблюдалась сравнительно небольшая разница в снижении роста культур, обработанных ДХА в условиях гипоксии и нормоксии, дальнейшие эксперименты проводились только в условиях нормоксии.

Рисунок 1. Дихлорацетат (20 мМ) не оказал значительного снижения роста культур нераковых клеток 293 и HB2, но вызвал значительное снижение роста культур всех клеток колоректального рака ( * P ⩽ 0,009). Клетки обрабатывали различными дозами DCA или контрольным раствором в условиях нормоксии ( A  и  C ) или гипоксии ( B  и  D ), а относительное количество жизнеспособных клеток оценивали через 24 ч ( A  и  B ) и 48 ч ( C  и  D ) с помощью анализа МТТ. Данные выражены в процентах от контроля (доза 0 мМ) ( *  – значительное различие относительно контроля – белый столбец (0 мМ)).

DCA способствует апоптозу в раковых клетках, щадя нераковые клетки
Далее мы хотели исследовать, было ли связано снижение роста культур при обработке DCA с индукцией апоптоза. Клетки обрабатывали диапазоном доз DCA (0, 10, 20 и 50 мМ) в течение 24 и 48 ч, и доля клеток, подвергающихся апоптозу, оценивалась путем обнаружения мембранного фосфатидилсерина с аннексином V-FITC. Клетки окрашивали аннексином V-FITC и витальным красителем 7-AAD и анализировали с помощью проточной цитометрии. Была дозозависимая индукция апоптоза в линиях раковых клеток через 24 и 48 ч обработки, с небольшим, если вообще, апоптозом, вызванным в нераковых клетках (рис. 2A и B). Наибольший эффект наблюдался в метастатических клетках LoVo; 50 мМ DCA вызвал десятикратное увеличение доли апоптотических клеток через 48 ч, тогда как наблюдалось семи- и пятикратное увеличение клеток HT29 и SW480 соответственно. Увеличение среднего процента от общего числа апоптотических клеток при 50 мМ DCA составило: 2,8 (95% ДИ: 2–3) в клетках HT29, 3,5 (95% ДИ: 2–5) в клетках SW480 и 21 (95% ДИ: 8–34) в клетках LoVo. Был минимальный апоптоз, индуцированный в 293 клетках даже при 50 мМ DCA, 0,2 (95% ДИ: −0,2 до 0,6). В клетках HB2 наблюдалось незначительное снижение процента апоптотических клеток при обработке 50 мМ DCA, −0,9 (95% ДИ: −2,2 до 0,4).

Рисунок 2. Дихлорацетат индуцировал дозозависимое увеличение процента апоптотической популяции в раковых клетках с минимальным апоптозом в нераковых клетках. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 ч ( A ) и 48 ч ( B ), окрашивали аннексином V-FITC и 7-AAD и анализировали с помощью проточной цитометрии. Точки данных представляют собой среднее значение (±sd) трех независимых экспериментов для 0 и 50 мМ DCA ( *  – значимое различие относительно контроля).

DCA вызывает остановку фазы G 2  в клетках колоректального рака, но не влияет на профиль клеточного цикла нераковых клеток 293
Мы также хотели изучить, было ли снижение роста культур при обработке DCA связано с индукцией остановки роста. Клетки обрабатывали 50 мМ DCA в течение 24 или 48 ч, а профили клеточного цикла анализировали с помощью проточной цитометрической оценки содержания ДНК после окрашивания PI. Обработка дихлорацетатом вызвала изменения в профилях клеточного цикла всех раковых клеток, но не повлияла на нераковые клетки. Изменения в профиле клеточного цикла были обнаружены через 24 ч обработки и сохранялись через 48 ч (рисунок 3A и B).

Рисунок 3. Дихлорацетат вызвал остановку фазы G 2  в клетках колоректального рака без влияния на профили клеточного цикла нераковых клеток; 293 и HB2. Клетки обрабатывали 50 мМ DCA или контрольным раствором в течение 24 ч ( A ) и 48 ч ( B ), окрашивали PI и анализировали с помощью проточной цитометрии. Для анализа статистической значимости мы сравнили среднюю долю клеток в каждой фазе клеточного цикла (G 1 , S и G 2 ) в клетках, обработанных DCA, со средней долей клеток в соответствующих фазах в необработанных клетках ( *  – значимое различие по сравнению с контролем).

После 48 ч обработки 50 мМ DCA наблюдалось восьмикратное увеличение клеток в фазе G 2  в клетках HT29 и SW480 и трехкратное увеличение клеток LoVo. Увеличение среднего процента всех раковых клеток в фазе G 2  составило: 21 (95% ДИ: 13–30) для клеток HT29, 19 (95% ДИ: 13–24) для клеток SW480 и 14 (95% ДИ: 10–21) для клеток LoVo; тогда как не было никакой разницы в клетках 293, 1 (95% ДИ: −4 до 7), и клетках HB2, −0,3 (95% ДИ: −9 до 9). Было соответствующее уменьшение клеток в фазе G 0 /G 1  во всех линиях раковых клеток. Интересно, что в клетках HT29 наблюдалось небольшое снижение, но в клетках SW480 и LoVo наблюдалось значительное увеличение доли клеток, считающихся находящимися в фазе S (см. раздел «Обсуждение»). Профиль клеточного цикла клеток 293 и HB2 изменился минимально при обработке DCA.

DCA снижает внеклеточный уровень лактата в питательной среде

Чтобы установить, коррелируют ли изменения в росте и апоптозе, вызванные DCA, со снижением гликолиза, мы измерили уровни лактата в ростовой среде. Молочная кислота является конечным продуктом гликолиза. Если бы DCA вызывал митохондриальное окислительное фосфорилирование, пируват декарбоксилировался бы до ацетил-КоА и не восстанавливался бы до лактата, следовательно, уровни лактата в ростовой среде снизились бы. Уровни лактата в ростовой среде всех клеточных линий измеряли через 48 ч обработки диапазоном доз DCA (рисунок 4). Уровни лактата определяли с помощью автоматического анализатора, который обычно используется для биохимического измерения уровней лактата; анализы основаны на колориметрической реакции, катализируемой лактатоксидазой. Обработка DCA снижала внеклеточные уровни лактата в ростовой среде дозозависимым образом во всех раковых и нераковых клеточных линиях.

Рисунок 4. Дихлорацетат снижал уровень лактата в питательной среде в зависимости от дозы как в раковых, так и в нераковых клетках. Клетки обрабатывались различными дозами DCA в течение 48 часов, а внеклеточные уровни лактата измерялись в питательной среде с помощью автоматического анализатора. Результаты выражены как относительные к контролю.

DCA деполяризует внутреннюю митохондриальную мембрану в клетках колоректального рака, но не в нераковых клетках
Чтобы проверить, была ли индукция апоптоза в раковых клетках при лечении DCA связана с усилением митохондриального окислительного фосфорилирования, мы измерили внутренний митохондриальный мембранный потенциал (ΔΨm). Эскалация митохондриального дыхания реактивировала бы цепь переноса электронов и снизила бы гиперполяризованный ΔΨm в раковых клетках. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 и 48 часов и окрашивали красителем TMRM, который позволяет проводить флуоресцентное измерение ΔΨm.

Как и в предыдущих экспериментах, эффект DCA был очевиден через 24 часа обработки и сохранялся через 48 часов (рисунок 5A и B). Обработка дихлорацетатом снизила гиперполяризованный ΔΨm во всех раковых клетках дозозависимым образом. Дихлорацетат не оказал никакого влияния на ΔΨm нераковых клеток HB2, тогда как, что удивительно, ΔΨm нераковых клеток 293 увеличился дозозависимым образом. Через 24 часа обработки 50 мМ DCA значительно снизили ΔΨm во всех раковых клетках; однако в клетках LoVo наблюдалось значительное снижение даже при 20 мМ DCA (рисунок 5A,  P = 0,02). В нераковых клетках 293 наблюдалась тенденция к увеличению ΔΨm при обработке DCA, хотя это не было статистически значимым ( P = 0,08). Через 48 ч лечения наблюдалось значительное снижение ΔΨm во всех раковых клетках и увеличение в 293 клетках при 20–50 мМ DCA (рисунок 5B,  P ⩽ 0,04).

Рисунок 5. Обработка дихлорацетатом снизила внутренний митохондриальный мембранный потенциал (ΔΨm) во всех раковых клетках, увеличила ΔΨm в нераковых клетках 293 и не оказала никакого влияния на ΔΨm в нераковых клетках HB2. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 ч ( A ) и 48 ч ( B ), окрашивали TMRM, а флуоресценцию измеряли при 530/620 нм при 37°C ( *  – значительная разница по сравнению с контролем).

Обработка DCA приводит к дефосфорилированию  субъединицы PDHE1 α
. Считается, что DCA ингибирует все четыре изофермента PDK и, следовательно, снижает фосфорилирование субъединицы PDHE1 α  , что, в свою очередь, приводит к активации комплекса PDH. Чтобы проверить, происходило ли дефосфорилирование PDHE1 α  при обработке DCA в используемых клеточных линиях, мы использовали вестерн-блот-анализы лизатов обработанных и необработанных клеток DCA. Во всех клеточных линиях обработка 20 мМ DCA в течение 8 ч вызвала резкое снижение сигнала фосфорилирования на сайте pSer 293  , но никаких изменений в уровнях общего PDHE1 α обнаружено не было  (рисунок 6). Фосфо-специфические антитела для двух других сайтов фосфорилирования, Ser 232  и Ser 300 , пока не доступны в продаже.

Рисунок 6. Обработка дихлорацетатом снизила фосфорилирование PDHE1 α  на сайте pSer 293  , не оказав влияния на уровни общего PDHE1 α  во всех исследованных клеточных линиях. Лизаты цельных клеток были приготовлены после обработки клеток 20 мМ DCA в течение 8 ч и из необработанных клеток, и были проведены анализы вестерн-блоттинга.

Обсуждение

Мы показали, что DCA вызывает дозозависимое снижение роста  in vitro  культур колоректальных раковых клеток и нераковых клеток. Однако раковые клетки были более чувствительны к DCA, при этом доза 20 мМ вызывала значительное ингибирование роста раковых клеток, но оказывала незначительное влияние на нераковые клетки. Мы показали, что компоненты этого дифференциального эффекта следующие: мощная индукция апоптоза и остановка клеточного цикла в раковых клетках, но не в нераковых клетках.

Эти выводы подтверждают простую модель дифференциальной чувствительности к DCA. Однако некоторые данные требуют дальнейшего обсуждения. Во-первых, 50 мМ DCA снизили рост культур нераковых клеток 293 и HB2, однако не наблюдалось увеличения апоптотических клеток или изменения профиля клеточного цикла этих клеток. Возможным объяснением этих результатов может быть то, что эта доза DCA привела к более медленному прохождению этих нераковых клеток через все стадии клеточного цикла, не изменяя относительных пропорций в пределах каждой стадии. Во-вторых, наши результаты указывают на то, что DCA вызвал остановку G 2  в клетках колоректального рака. Это контрастирует с предыдущими исследованиями, которые показали остановку G 1  или отсутствие изменений в профиле клеточного цикла при лечении DCA (Cao et al, 2008; Wong et al, 2008). Wong et al (2008) показали повышенную экспрессию PUMA во всех линиях клеток эндометриального рака, которые имели апоптотический ответ на DCA, и пришли к выводу, что эта активация p53 привела к остановке G 1.  Однако клетки колоректального рака в нашем исследовании остановились в фазе G 2  при лечении DCA, и мы не обнаружили никакой индукции p53 DCA в наших линиях клеток колоректального рака (данные не показаны). Интересно, что Cao et al (2008) обнаружили, что сочетание DCA и радиотерапии остановило клетки рака простаты в фазе G 2  , хотя DCA сам по себе не влиял на профиль клеточного цикла. В-третьих, в клетках SW480 и LoVo лечение DCA привело к увеличению доли клеток, которые, как считается, находятся в фазе S. Это предполагает увеличение пролиферации, а также индукцию апоптоза. Аналогичное открытие было сообщено Wong et al (2008) в одной из нескольких протестированных клеток эндометриального рака. Альтернативное объяснение заключается в том, что часть клеток, находящихся в «S-фазе» после обработки линий раковых клеток DCA, на самом деле представляют собой апоптотические клетки в области «sub-G2 » , как это было ранее описано для клеток лимфомы (Klucar и Al-Rubeai, 1997).

Изменения в клеточном метаболизме при лечении DCA
DCA, по-видимому, подавлял выработку молочной кислоты из пирувата как в раковых, так и в нераковых клетках. Кроме того, лечение DCA приводило к дефосфорилированию PDHE1 α и, следовательно, активации PDH во всех исследованных клеточных линиях. Следовательно, основа дифференциального эффекта DCA на раковые и нераковые клетки может заключаться в его влиянии на митохондриальную функцию. Лечение DCA снижало высокий ΔΨm всех раковых клеток, но не нераковых клеток. Это говорит о том, что DCA, ингибируя PDK и, следовательно, активируя PDH, стимулирует митохондриальное дыхание, что приводит к деполяризации внутренней митохондриальной мембраны, и индуцирует апоптоз по проксимальному митохондриальному пути, как описано в предыдущих исследованиях (Bonnet et al, 2007; Cao et al, 2008; Wong et al, 2008). Индукция апоптоза и изменения в митохондриальной функции были наиболее выражены в высокоинвазивных и метастатических клетках LoVo, чем в менее инвазивных клетках HT29 и SW480. Это может иметь клинические последствия для лечения метастатического колоректального рака, поскольку обычно именно высокоинвазивные метастатические раковые опухоли наиболее устойчивы к традиционной химиотерапии и могут быть наиболее чувствительны к ингибированию PDK. В поддержку этого недавнее исследование показало, что колоректальные опухоли, устойчивые к 5-фторурацилу, с большей вероятностью имеют повышенный гликолиз и, следовательно, более поддаются терапии, направленной на метаболизм рака (Шин и др., 2009). В этом отношении наши результаты противоречат выводам Вонга и др. (2008), которые обнаружили, что высокоинвазивные клетки рака эндометрия наиболее устойчивы к лечению DCA.

Ингибирование PDK в качестве терапии рака против колоректального рака
Мы обнаружили, что дозы 20–50 мМ DCA давали дифференциальные ответы между раковыми и нераковыми клетками. Таким образом, потенциальные терапевтические дозы DCA будут находиться в диапазоне от 20 до 50 мМ. Кроме того, недавнее исследование показало, что IC 50  DCA для клеток рака молочной железы составляет от 20 до 30 мМ (Ko и Allalunis-Turner, 2009). Это контрастирует с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что DCA снижает пролиферацию и вызывает апоптоз в раковых клетках при дозах всего 0,5–10 мМ (Bonnet et al, 2007; Wong et al, 2008; Sun et al, 2009). Было обнаружено, что дихлорацетат относительно безопасен для людей при использовании для лечения лактоацидоза (Stacpoole et al, 2003). Основные побочные эффекты при дозе до 100 мг/кг DCA  оказываются на нервную систему и печень, вызывая легкую седацию или сонливость, обратимую периферическую невропатию и легкое бессимптомное повышение уровня сывороточных трансаминаз, отражающее повреждение гепатоцеллюлярной ткани (Stacpoole et al, 1998). Кроме того, недавние исследования показали, что DCA эффективно снижает рост опухоли в клинически достижимых дозах как  in vitro  , так и  in vivo  (Bonnet et al, 2007; Sun et al, 2009). Было высказано предположение, что DCA может быстро перейти на раннюю фазу клинических испытаний рака (Michelakis et al, 2008). Однако доза DCA, необходимая для ингибирования роста клеток колоректального рака в нашем исследовании, вряд ли будет достигнута клинически без возникновения значительных побочных эффектов. Доза DCA, необходимая для достижения эквивалентных концентраций в плазме  in vivo,  будет примерно в пять-десять раз больше, чем та, которая используется в клинических испытаниях против лактатацидоза. Похоже, что клетки колоректального рака, использованные в нашем исследовании, более устойчивы к DCA, чем клетки рака легких, эндометрия и молочной железы. Интересно, что Сан и др. (2009) в своем исследовании клеток рака молочной железы обнаружили, что DCA подавляет пролиферацию раковых клеток, но не вызывает апоптоз или гибель клеток. Эти результаты заметно отличались от эффектов DCA, наблюдаемых на клетках рака легких (Бонне и др., 2007), эндометрия (Вонг и др., 2008) и колоректального рака в нашем исследовании. Таким образом, хотя DCA подавляет рост различных раковых клеток, эффект и основные механизмы, по-видимому, зависят от типа клеток. Вероятным объяснением этих дифференциальных эффектов может быть разница в экспрессии изоферментов PDK в исследованных раковых клетках. Дихлорацетат является неспецифическим ингибитором PDK (Whitehouse и Randle, 1973) и имеет различную  Ki для  каждого из четырех изоферментов PDK (Bowker-Kinley et al ,1998). Кроме того, известно, что четыре изофермента PDK по-разному экспрессируются в различных тканях. Таким образом, необходимо разработать ингибиторы для отдельных изоферментов PDK, которые должны позволять проводить специфичные для типа раковых клеток метаболические манипуляции.

Дихлорацетат восстанавливает химиочувствительность колоректального рака через p53/miR-149-3p/PDK2-опосредованный путь метаболизма глюкозы

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1038/s41388-019-1035-8

Yu Liang1, Lidan Hou1, Linjing Li1, Lei Li1, Liming Zhu1, Yu Wang1, Xin Huang1, Yichao Hou1, Danxi Zhu1, Huimin Zou1, Yan Gu2, Xiaoling Weng3,4, Yingying Wang5, Yue Li6, Tianqi Wu3, Mengfei Yao3, Isabelle Gross7,8, Christian Gaiddon9,10, Meng Luo2, Jianhua Wang3, Xiangjun Meng1

1 Отделение гастроэнтерологии, Девятая народная больница Шанхая, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай
2 Отделение общей хирургии, Девятая народная больница Шанхая, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай

3

Онкологический институт, Шанхайский онкологический центр Университета Фудань, Университет Фудань, Шанхай, Китай

4

Ningbo Aitagene Technology Co. LTD, Шанхай, Китай
5 Кафедра биохимии и молекулярной и Клеточная биология, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай
6 Центр патологии, Первая народная больница Шанхая, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай

7

INSERM UMR_S1113, Страсбург F-67200, Франция

8

FMTS, Страсбургский университет, Страсбург F-67000, Франция
9Universite de Strasbourg, Inserm IRFAC UMR_S1113, Laboratory Stress Response and Innovative Therapy «Streinth», Strasbourg 67200, France
10 CLCC Paul Strauss, Strasbourg, France

Meng Luo luotysy@sina.com
Jianhua Wang jianhuaw2007@qq.com
Xiangjun Meng meng_xiangjun@yahoo.com
Эти авторы внесли равный вклад: Yu Liang, Lidan Hou

Received: 16 марта 2019 г.
Пересмотрено: 17 сентября 2019 г.
Принято: 19 сентября 2019 г.
Опубликовано: 9 октября 20199 октября 2019 г

Аннотация

Развитие химиорезистентности остается одной из основных проблем, объясняющих летальность при колоректальном раке (КРР). Дихлорацетат (ДХА) первоначально использовался как регулятор метаболизма при лечении метаболических заболеваний; здесь ДХА был исследован для выявления механизмов, лежащих в основе химиорезистентности CRC. Мы обнаружили, что DCA заметно повышает химиочувствительность клеток CRC к флуороурацилу (5-FU) и снижает образование колоний из-за высокого уровня апоптоза. Используя анализ микрочипов, мы отметили, что miR-149-3p участвует в химиорезистентности CRC, которая была модулирована p53 дикого типа после лечения DCA. Кроме того, PDK2 был идентифицирован как прямая мишень miR-149-3p. Механический анализ показал, что сверхэкспрессия miR-149-3p усиливала 5-FU-индуцированный апоптоз и снижала метаболизм глюкозы, аналогично эффектам нокдауна PDK2. Кроме того, сверхэкспрессия PDK2 частично отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на метаболизм глюкозы. Наконец, было установлено, что лечение DCA и сверхэкспрессия miR-149-3p в клетках CRC, устойчивых к 5-FU, заметно повышают чувствительность к химиотерапевтическому эффекту 5-FU in vivo, и этот эффект также был подтвержден в небольшой ретроспективной когорте пациентов CRC. В целом, мы определили, что сигнальный путь p53/miR-149-3p/PDK2 потенциально может быть направлен на лечение DCA для преодоления химиорезистентности CRC.

Дополнительная информация: Онлайн-версия этой статьи (https:// doi.org/10.1038/s41388-019-1035-8) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Введение

Колоректальный рак (КРР) является четвертой ведущей причиной смертности от рака в Китае [1] и второй ведущей причиной смертности от рака в США [2], что в основном объясняется метастазированием и неудачей химиотерапии из-за устойчивости к лекарствам, что приводит к ~50 000 смертей ежегодно [3].

В последнее время, хотя появившаяся звезда PD1/PDL1 привлекла большой интерес, и все больше биотерапевтических агентов показывают обнадеживающие результаты в лечении рака, ограниченный уровень эффективности и неизбежные побочные эффекты сдерживают их использование в клинике [4,5]. В настоящее время химиотерапия по-прежнему является основным методом выбора в клинике, особенно для пациентов с неоперабельными поздними стадиями и метастатическим раком [6], но развитие лекарственной устойчивости остается самым большим ограничением в химиотерапии [7]. Следовательно, изучение механизмов лекарственной устойчивости и поиск новых комбинаций классических противораковых препаратов для оптимизации эффективности может принести пользу в лечении КРР. Поскольку фторурацил (5-FU) является наиболее часто используемым химиотерапевтическим препаратом при РПК, в данном исследовании использовались 5-FUрезистентные клеточные линии РПК [8,9].

Нарушение метаболизма глюкозы представляет собой один из основных аспектов отличительных признаков рака [10]. Известно, что развитие неконтролируемой клеточной массы приводит к плохой васкуляризации опухоли, что вызывает снижение поступления кислорода. Следовательно, раковые клетки адаптируются к изменениям в микроэнвироменте, переключая свой метаболизм с окислительного обмена на гликолитический, который основан на снабжении глюкозой и производит лактат. Этот сдвиг называется «эффектом Варбурга» и обычно наблюдается в различных раковых клетках как одна из замечательных отличительных черт [11- 13]. Накопление данных последних исследований привело к необходимости уточнения теории Варбурга [14]; например, было показано, что метаболический сдвиг вовлечен в химиорезистентность [15]; следовательно, для преодоления химиорезистентности потенциально может быть использовано воздействие на метаболизм раковых клеток [16,17].

В частности, сообщалось о многочисленных механизмах контроля метаболического сдвига в раковых клетках, включая микроРНК (миРНК) [18-20]. МиРНК представляют собой класс малых эндогенных некодирующих РНК, которые регулируют трансляцию и деградацию мРНК [21] и вовлечены во многие другие биологические процессы, включая клеточную пролиферацию, миграцию, апоптоз, самообновление, инициацию, развитие рака и химиорезистентность [22-24].

Полученные данные свидетельствуют о том, что воздействие на аномальный метаболизм раковых клеток стало интенсивным направлением исследований, нацеленных на «удушение опухоли», стратегии которых заключаются в ингибировании ключевых ферментов, участвующих в гликолитическом метаболизме [15]. В данной рукописи дихлорацетат (ДХА) первоначально использовался для лечения молочнокислого ацидоза и наследственной митохондриальной болезни [25]. ДХА ингибирует ферментативную активность киназ пируватдегидрогеназы (PDK1-4), которая необходима для превращения пирувата в ацетил-КоА, связывая гликолитический метаболизм с циклом лимонной кислоты [26,27]; недавно сообщалось, что ДХА обладает противораковым действием [28-31]. Однако механизм, лежащий в основе влияния ДКА на лечение CRC, остается неустановленным.

Настоящее исследование было посвящено изучению молекулярного механизма, участвующего в регуляции метаболизма глюкозы и устойчивости к химиотерапии в CRC. Используя DCA в клетках CRC, мы изучили роль соответствующих миРНК и тем самым раскрыли сигнальный путь, объясняющий устойчивость к лечению 5-ФУ.

Результаты

DCA восстанавливает химиочувствительность клеток CRC, устойчивых к 5-FU
Сообщалось, что DCA является эффективным противоопухолевым препаратом, который действует на энергетические пути в некоторых видах рака [32]; однако влияние DCA на химиорезистентные клетки CRC не было изучено. Используя анализ CCK8, мы обнаружили, что по сравнению с родительскими клеточными линиями HCT-8 и HCT116, устойчивые к 5-ФУ клетки HCT-8/F и HCT116/F были нечувствительны к 5-ФУ (Дополнительный рис. 1A), а полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC50) DCA в клетках HCT-8/F и HCT116/F составляли ~15 и 20 мМ, соответственно, что согласуется с предыдущими сообщениями [33, 34] (Дополнительный рис. 1B). Далее мы отметили, что DCA значительно подавлял синтез ДНК (дополнительная рис. 1С, верхняя панель) и индуцировал генерацию ROS (дополнительная рис. 1С, нижняя панель) в устойчивых к 5-FU клетках CRC. Маркеры энергетического метаболизма, включая потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз, были заметно повышены в клетках CRC, устойчивых к 5-FU, по сравнению с клетками CRC, чувствительными к 5-FU, в то время как добавление DCA заметно снижало экспрессию этих маркеров (рис. 1a). Учитывая 6 ч предварительной обработки без сыворотки при измерении гликолиза, использовали набор для определения гликолитической скорости Seahorse XF, чтобы устранить эффект предварительной обработки и измерить гликолитическую скорость в реальном времени. Скорость гликолитического оттока протонов (glycoPER) отражает скорость внеклеточного закисления в результате гликолиза. Добавление DCA значительно снижало индуцированный гликолиз по сравнению с соответствующим контролем (рис. 1b и дополнительный рис. 1D).

Рисунок S1. DCA оказывает противоопухолевое действие
(A) Клетки CRC обрабатывали различными концентрациями 5-ФУ в течение 24 часов. Рассчитывали IC50 5-ФУ в каждой клетке. (B) Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали различными концентрациями DCA в течение 24 часов. Рассчитывали IC50 DCA в каждой клетке. (C) Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 часов. Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания Edu (верхняя панель) и репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания ROS (нижняя панель), масштабная линейка: 200 мкм. (D) Определение скорости гликолиза, включая базальный гликопер, индуцированный гликопер и компенсаторный гликопер, рассчитывали с помощью Seahorse Glycolytic Rate Assay Report Generator. (E) Рост клеток определяли с помощью анализа CCK8 после обработки 5-FU и DCA. Диапазон доз 5-ФУ составлял от 100 мкг/мл до 500 мкг/мл для клеток HCT-8/F и от 25 мкг/мл до 150 мкг/мл для клеток HCT116/F. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент проводился в 3-6 биологических репликах. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

DCA значительно преодолевал резистентность к 5-ФУ в клетках HCT-8/F и HCT116/F, что проявлялось в измерении роста клеток (Дополнительный рис. 1E). Способность к образованию колоний была значительно подавлена (рис. 1c), а апоптоз был заметно индуцирован при комбинированном лечении (рис. 1d), все из которых были дополнительно оценены количественно. Эти результаты свидетельствуют о том, что DCA может восстанавливать химиочувствительность клеток CRC, устойчивых к 5-FU.

Рисунок 1. DCA восстанавливает хемочувствительность устойчивых к 5-FU клеток CRC путем изменения метаболизма глюкозы. a Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. Измеряли потребление глюкозы, продукцию лактата и гликолиз клеток CRC. b Гликопер измеряли в режиме реального времени при введении 15/20 мМ DCA, 0,5 мкМ Rot + AA и 50 мМ 2-DG с помощью прибора Seahorse XF. c, d Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали DCA (15 мМ)/5-FU (50 мкг/мл) и DCA (20 мМ)/5-FU (25 мкг/мл), соответственно. Образование колоний определяли с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым. Апоптоз клеток измеряли путем окрашивания Annexin V/PI. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент проводился в трех биологических репликах. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001

miR-149-3p играет решающую роль в химиочувствительности клеток CRC
миРНК считаются перспективным терапевтическим инструментом благодаря их влиянию на подавление опухоли [35]. В связи с этим мы сначала определили профили экспрессии миРНК с помощью массива миРНК, содержащего 2059 человеческих миРНК. В общей сложности 119 миРНК дифференциально экспрессировались в ответ на DCA в клетках HCT116 (рис. 2a и дополнительный рис. S2A). Среди них уровни экспрессии восьми миРНК были дополнительно подтверждены количественной ПЦР в реальном времени (рис. 2b), и было установлено, что miR-149-3p повышается под действием ДКА в дозозависимой манере (дополнительный рис. S2B).

Далее мы обнаружили, что клетки HCT116 с более высоким базальным уровнем miR-149-3p обладают большей чувствительностью к 5-FU и L-OHP, как показано на дополнительном рис. 2C. Более того, трансфекция клеток HCT116 анти-miR-149-3p значительно снижала химиотерапевтический эффект 5-FU (Дополнительный рис. 2D-E). Примечательно, что уровни miR-149-3p в химиочувствительных клетках CRC были значительно выше, чем в химиорезистентных клетках CRC (рис. 2c). Поэтому трансфекция мимиков miR-149-3p значительно увеличивала скорость ингибирования; способствовала апоптозу клеток, индуцированному 5-FU; снижала потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз в клетках HCT-8/F и HCT116/F (рис. 2d-f). Анализ гликолитической скорости Seahorse XF показал, что экспрессия miR-149-3p снижала базальный гликопер в устойчивых к 5-ФУ клетках CRC, что согласуется с вышеприведенными результатами (рис. 2g и дополнительный рис. 2F). Эти результаты позволяют предположить, что miR-149-3p благоприятствует преодолению химиорезистентности в клетках CRC.

Рисунок S2. Нокдаун miR-149-3p снижает химиорезистентность
(A) Тепловая карта профиля дифференциально экспрессированных микроРНК в клетках HCT116, обработанных контролем, 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ DCA в течение 24 часов. (B) Тотальная РНК была получена через 24 часа после обработки 10/7,5 мМ и 20/15 мМ DCA из клеток HCT116 и HCT-8. Уровень miR-149-3p анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. (C) Клетки HCT-8 и HCT116 обрабатывали различными концентрациями 5-FU и оксалиплатина (L-OHP) соответственно в течение 24 часов и рассчитывали половину максимальной ингибирующей концентрации (IC50) (левая панель). Базальные уровни miR-149-3p определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в клетках HCT-8 и HCT116 (правая панель). (D-E) Клетки HCT116 были трансфицированы Anti-NC или ингибитором miR-149-3p. После трансфекции клетки обрабатывали 25 мкг/мл 5-ФУ в течение 24 часов. Рост и апоптоз клеток определяли с помощью CCK8 и проточной цитометрии соответственно. (F) Определение скорости гликолиза, включая базальный гликопер и компенсаторный гликопер в 5-FU-резистентных CRC-клетках, трансфицированных NC или мимиком miR-149-3p, рассчитывали с помощью Seahorse Glycolytic Rate Assay Report Generator. Данные трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент проводился в 3-6 биологических репликах. *p < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ns, нет значимости.

Рисунок 2. miR-149-3p повышает химиочувствительность 5-FU в CRC. a Тепловая карта профиля дифференциально экспрессированных микроРНК в клетках HCT116, обработанных 20 мМ DCA в течение 24 ч. b Из клеток HCT116 готовили тотальную РНК через 24 ч после обработки DCA. Очевидные изменения микроРНК после обработки ДКА были определены с помощью количественной ПЦР в реальном времени. c Общая РНК была получена из клеток HCT116, HCT116 /F, HCT-8 и HCT-8/F. Базальные уровни miR-149-3p были измерены количественной ПЦР в реальном времени. d, e Клетки HCT-8/F и HCT116/F были трансфицированы NC и мимиком miR-149-3p в течение 24 ч, после чего клетки обрабатывались 5-ФУ (50 мкг/мл для HCT-8/F и 25 мкг/мл для HCT116/F) или без него. Измеряли скорость ингибирования и скорость апоптоза. f, g Измеряли потребление глюкозы, продукцию лактата, гликолиз и гликоПЭР клеток CRC, трансфицированных NC или мимиком miR-149-3p. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент содержал не менее трех биологических реплик. *P<0,05; **P<0,01

DCA индуцирует экспрессию miR-149-3p через p53 дикого типа (wt)
Учитывая, что несколько недавних исследований показали, что miR-149-3p регулируется несколькими препаратами [36,37], мы определили, как miR-149-3p регулируется DCA. Мы обнаружили, что DCA значительно увеличивает экспрессию wt p53 и его нижележащих сигналов, включая экспрессию p21, PUMA и MDM2, в клетках CRC (рис. 3a, b). Более того, мы отметили, что изменения в экспрессии wt p53 способны значительно модулировать экспрессию miR-149-3p, как показано на рис. 3c, d, что указывает на то, что miR-149-3p положительно регулируется wt p53. Поэтому, используя р53-нулевую клеточную линию HCT116 (TP53-/-), мы обнаружили, что miR-149-3p не повышалась при обработке DCA, но эктопическая экспрессия р53 отменяла этот эффект. Более того, мы использовали nutlin-3, мощный ингибитор, который подавляет взаимодействие MDM2-p53, что приводит к активации p53 в качестве положительного контроля, при этом экспрессия miR-149-3p была повышена в wt линии клеток HCT116 (TP53+/+) (рис. 3e-g). С помощью программного обеспечения для биоинформационного анализа (IGV) были предсказаны четыре предполагаемых сайта связывания р53 с фланкирующим участком геномной ДНК miR-149. Затем в клетках были проведены анализы ChIP с использованием антитела против wt p53. Вытянутая ДНК была амплифицирована с помощью обычной ПЦР с праймерами, которые были разработаны на основе этих сайтов. Наши результаты показали, что по сравнению с регионом 4, регион 3 был заметно обогащен после обработки DCA в хроматине HCT116, иммунопреципитированном wt p53 (рис. 3h), что указывает на то, что только регион 3 содержит специфический сайт связывания, активируемый DCA. Эти результаты показывают, что DCA модулирует miR-149-3p через wt p53.

Рисунок 3. DCA индуцирует экспрессию miR-149-3p через p53. a Клетки HCT116 и HCT-8 обрабатывали 20 мМ и 15 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. Экспрессию p53 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. b Уровни мРНК p21, puma и MDM2 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. c Клетки HCT116 и клетки HCT-8 были трансфицированы siRNA р53, плазмидой р53 и соответствующим отрицательным контролем в течение 48 ч. Экспрессия р53 определялась с помощью Вестерн-блот анализа. d Экспрессия miR-149-3p измерялась с помощью количественной ПЦР в реальном времени. e Клетки TP53-/- HCT116 обрабатывались DCA, а клетки TP53+/+ HCT116 обрабатывались нутлином-3. Экспрессию р53 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. f TP53-/- HCT116 клетки обрабатывали DCA в течение 24 ч или трансфецировали плазмидой р53 или контрольной плазмидой. g TP53+/+ HCT116 клетки обрабатывали DCA и nutlin-3 в течение 24 ч или трансфецировали р53 siRNA после обработки DCA. Экспрессия miR-149-3p измерялась с помощью количественной ПЦР в реальном времени. h Анализ связывания р53 с фланкирующим miR-149 участком геномной ДНК клеток HCT116, обработанных 20 мМ DCA или без него в течение 24 ч. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент содержал три биологические реплики. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ns нет значимости

PDK2 является прямой мишенью miR-149-3p
Для выяснения механизмов, посредством которых miR-149-3p регулирует химиочувствительность клеток CRC, мы проанализировали гены, связанные с энергетическим метаболизмом, которые регулируются miR-149-3p, используя две общедоступные платформы (TargetScan и miRDB). Наконец, мы определили, что киназа пируватдегидрогеназы 2 (PDK2) и гексокиназа 1 (HK1) являются потенциальными кандидатами (рис. 4a). Для подтверждения этих выводов мимикр или ингибитор miR-149-3p был трансфецирован в клетки CRC. Мы обнаружили, что уровни мРНК PDK2 негативно регулировались miR-149-3p, но не HK1 (рис. 4b и дополнительный рис. 3A). Было обнаружено два возможных сайта связывания miR-149-3p в 3′-UTR PDK2, а двойной люциферазный репортерный анализ показал, что miR-149-3p связывается с предсказанным сайтом (686-693) 3′-UTR PDK2 (рис. 4c, d). Затем мы подтвердили, что уровень белка PDK2 отрицательно регулируется miR-149-3p (рис. 4e).

PDK имеет четыре изофермента PDK1, 2, 3 и 4, все из которых, как сообщалось, регулируются DCA [26, 38, 39]. Затем мы проанализировали экспрессию мРНК PDK1-4 в клетках HCT8 и HCT116 после обработки ДКА. DCA значительно подавлял экспрессию мРНК PDK2, но не других изоферментов PDK (Дополнительный рис. S3B). Кроме того, трансфекция анти-149-3p частично отменяла снижение PDK2 под действием DCA (рис. 4f). Далее мы определили уровни белка PDK2 и его субъединицы пируватдегидрогеназы E1-альфа (PDHA1) в чувствительных к 5-ФУ и устойчивых к 5-ФУ клетках CRC. Базальные уровни PDK2 были повышены в химиорезистентных клетках CRC по сравнению с химиочувствительными клетками. В соответствии с этим повышением, фосфорилирование PDHA1 также было повышено (рис. 4g).

Рисунок 4. PDK2 является прямой мишенью miR-149-3p. a Схематическая диаграмма протокола, использованного для поиска генов-кандидатов, которые предсказуемо регулируются miR-149-3p. b Клетки HCT-8 и HCT116 были транзиторно трансфицированы мимиком или ингибитором miR-149-3p. Уровни мРНК PDK2 и HK1 анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. c Диаграмма предполагаемых сайтов связывания miR-149-3p в 3′-UTR PDK2. Мутантные последовательности, использованные в люциферазных репортерах, обозначены красным цветом. d Клетки эмбриональной почки человека 293 T и клетки HCT116 были котрансфицированы люциферазными репортерными конструкциями и мимикой miR-149-3p (50 нмоль/л) или контрольной миРНК в течение 48 ч. Данные относительной люциферазной активности нормированы на соответствующий контроль. e Клетки HCT-8 и HCT116 трансфицировали мимиком miR-149-3p или ингибитором в течение 48 ч, а экспрессию PDK2 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. f Клетки HCT116, трансфицированные ингибитором miR-149-3p или анти-НК, обрабатывали с или без DCA в течение 24 ч. Экспрессию PDK2 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. g Экспрессию PDK2 и p-PDHA1 в химиочувствительных и химиорезистентных клетках CRC анализировали с помощью Вестерн анализа. Приведенные данные являются репрезентативными снимками трех экспериментов. Результаты трех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах, представлены как среднее ± SEM. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001

Путь miR-149-3p/PDK2 регулирует химиочувствительность
Чтобы понять, как путь miR-149-3p/PDK2 регулирует ответ клеток CRC на 5-FU, клеточная линия HCT-8/F была выбрана в качестве репрезентативной клеточной линии для исследования того, влияют ли уровни экспрессии miR-149-3p и PDK2 на ответ клеток на 5-FU. Нокдаун PDK2 в клетках HCT-8/F подавлял фосфорилирование PDHA1 (рис. 5a) и снижал маркеры энергетического метаболизма, такие как потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз (рис. 5b). Более того, снижение PDK2 усиливало действие 5-ФУ на повышение уровней расщепленного PARP (c-PARP) и Bax, которые являются признанными биомаркерами апоптоза клеток HCT-8/F (рис. 5c). Кроме того, нокдаун PDK2 повышал химиочувствительность к 5-ФУ в клетках HCT-8/F, что определялось с помощью анализа CCK8 и колониеобразования (рис. 5d, e). Нокдаун PDK2 способствовал 5-ФУ-индуцированному апоптозу в клетках HCT-8/F и HCT116/F, что показано на дополнительном рис. S4A, тогда как сверхэкспрессия PDK2 способствовала фосфорилированию PDHA1 и смягчала апоптоз клеток, индуцированный 5-ФУ в клетках HCT-8 и HCT116 (дополнительные рис. S4B-S4C).

Кроме того, сверхэкспрессия PDK2 отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на PDK2 (рис. 5f) и частично отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз (рис. 5g). Эктопическая экспрессия PDK2 заметно отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на рост клеток и образование колоний в клетках HCT-8/F, обработанных 5-ФУ (рис. 5h, i). В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что путь miR-149-3p/PDK2 восстанавливает химиочувствительность, по крайней мере, частично регулируя метаболизм глюкозы в химиорезистентных клетках CRC.

Рисунок 5. Сигнализация miR-149-3p/PDK2 подавляет метаболизм глюкозы и повышает химиочувствительность. a PDK2 был нокаутирован путем транзиторной трансфекции с помощью siRNA в клетках HCT-8/F. Нокдаун привел к изменению p-PDHA1. b Были измерены потребление глюкозы, выработка лактата и гликолиз клеток CRC, трансфецированных PDK2 siRNA или NC. c Клетки HCT-8/F обрабатывали 50 мкг/мл 5-ФУ или без него в течение 24 ч после трансфекции PDK2 siRNA или NC. Признанные биомаркеры (c-PARP, Bax) для апоптоза клеток определяли с помощью Вестерн-блот анализа. d Клетки HCT-8/F, трансфецированные PDK2 siRNA или NC, обрабатывали 5-ФУ. Рост клеток определяли с помощью анализа CCK8. e Клетки HCT-8/F, инфицированные PDK2 shRNA или вирусом отрицательного контроля, обрабатывали 5-ФУ. Способность к образованию колоний определяли окрашиванием кристаллическим фиолетовым. f Клетки HCT-8/F трансфицировали NC или мимиком miR-149-3p в течение 24 ч, а затем инфицировали вирусом, сверхэкспрессирующим PDK2. Экспрессию PDK2 и p-PDHA1 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. g Измеряли потребление глюкозы, продукцию лактата и гликолиз. h, i После инфицирования клетки обрабатывали 5-ФУ и измеряли рост клеток и способность к образованию колоний. Репрезентативные результаты трех независимых экспериментов, проведенных как минимум в трех экземплярах, представлены как среднее ± SEM. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001

DCA повышает химиочувствительность 5-FU in vivo
Далее 5-FU, DCA или комбинацию 5-FU с DCA вводили внутрибрюшинно в модель подкожного ксенотрансплантата (отмечена как внутрибрюшинная группа). Учитывая недостаточное кровоснабжение центральной части подкожных опухолей, мы также интратуморально вводили DCA или PBS плюс интраперитонеальную инъекцию 5-ФУ (отмечена как интратуморальная группа). Комбинации DCA и 5-FU показали лучший ингибирующий эффект на рост опухоли, чем DCA или 5-FU по отдельности после четырех недель инъекций в группе внутрибрюшинного введения (рис. 6a, b). Экспрессия Ki-67 была снижена после комбинированного лечения в группе внутрибрюшинного введения (рис. 6c). DCA значительно подавлял рост опухоли в интратуморальной группе по сравнению с группой PBS (рис. 6d), а miR-149-3p был повышен в группе интратуморального введения DCA, что согласуется с результатами in vitro (рис. 6e). Интратуморальное введение DCA также способствовало апоптозу опухоли (рис. 6F).

Для дальнейшей оценки влияния miR-149-3p на ответ клеток CRC на 5-ФУ in vivo, в модели подкожного ксенотрансплантата проводили интратуморальное введение agomiR-149-3p или agomiR-NC плюс внутрибрюшинное введение 5-ФУ. miR-149-3p значительно подавлял рост опухоли в интратуморальной группе по сравнению с контрольной группой, в которой интратуморально вводили agomiR-отрицательный контроль (NC) (рис. 6g, h). Сверхэкспрессия miR-149-3p была подтверждена количественной ПЦР в реальном времени (рис. 6i), а сверхэкспрессия miR-149-3p способствовала апоптозу (рис. 6j) и снижала экспрессию PDK2 и p-PDHA1 (рис. 6k, l). С помощью микропозитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)-КТ с 18F-фтордезоксиглюкозой (ФДГ) визуализацию опухоли проводили через 3 недели лечения. в местах имплантации опухоли наблюдалось поглощение 18F-ФДГ, измерялись максимальное стандартизированное поглощение (SUVmax) и метаболические объемы опухоли (MTVs). Разницы в SUVmax между двумя группами не наблюдалось, в то время как MTV значительно уменьшился в группе miR-149-3p (рис. 6m).

Рисунок 6. Комбинированное лечение 5-ФУ с DCA или miR-149-3p усиливает эффект химиотерапии in vivo. a Репрезентативные изображения опухолей в каждой группе. b Объемы опухолей ксенотрансплантата были рассчитаны в группе внутрибрюшинного введения. Показаны средние значения ± SD, n× 6. c Иммуноокрашивание срезов ксенотрансплантатов опухолей с Ki-67 в группе внутрибрюшинного введения. Положительное окрашивание коричневым цветом (масштабные линейки: 100 мкм) (верхняя панель). Рассчитывался показатель иммунореактивности Ki67 (нижняя панель). Показаны средние значения ± SD, n× 4. d Объемы опухолей ксенотрансплантатов рассчитывались до 39 дня после инокуляции опухоли в интратуморальной группе. e Экспрессия miR-149-3p определялась количественным ПЦР в реальном времени в опухолях ксенотрансплантатов после интратуморального введения DCA. Показаны средние ± SD, n× 6. f Показаны репрезентативные TUNEL окрашенные срезы от мышей в интратуморальной группе (масштабные линейки: 50 мкм). g Репрезентативное изображение опухолей от мышей, которые получали интратуморальную инъекцию agomiR-NC или agomiR-149-3p в течение 3 недель. h Объемы опухолей ксенотрансплантатов рассчитывались до 21 дня после лечения. Показаны средние значения ± SD, n× 6. i Уровни miR-149-3p анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Показаны средние значения ± SD, n× 5. *P< 0.05. j Апоптоз опухолевых клеток определяли с помощью анализа TUNEL (масштабные линейки: 50 мкм). k Ксенотрансплантаты опухолей от трех мышей в каждой группе анализировали методом иммуноблота с указанными антителами. l Изображения для визуализации положительного окрашивания PDK2 в ксенотрансплантатах опухолей (масштабные линейки: 100 мкм) (левая панель). Подсчитан иммунореактивный балл PDK2 (правая панель). Показаны средние значения ± SD, n× 3. m Репрезентативные изображения 18F-ФДГ микро-ПЭТ/КТ мышей, несущих опухоли. Опухоли обозначены красными стрелками и кругами. Значения SUVmax и MTV получены в опухолях. Показаны средние значения ± SD, n× 3. *P<0,05; ns не имеет значения

miR-149-3p обратно коррелирует с PDK2 у пациентов с CRC
Значительная обратная корреляция между уровнями мРНК miR-149-3p и PDK2 наблюдалась в тканях CRC человека (рис. 7a, b). Среди них восемь пациентов в стабильном состоянии/болезни (SD) в течение 3 лет после химиотерапии экспрессировали более высокий уровень miR-149-3p, чем пять пациентов с прогрессирующей болезнью (PD) (Дополнительный рис. S5A). Были проанализированы пять пар пациентов с PD и SD с одинаковой патологией и стадией TNM, и окрашивание PDK2 значительно различалось в образцах от пациентов с PD и SD (Дополнительный рис. S5B). Пациенты CRC из базы данных TCGA с высокой экспрессией PDK2 также характеризовались худшей общей выживаемостью (OS) (рис. 7c). База данных TCGA также показала, что экспрессия PDK2 в группе wt p53 была снижена по сравнению с группой мутантных p53 (рис. 7d). Эти результаты позволили предположить, что PDK2 негативно регулируется miR-149-3p у пациентов с CRC.

Рисунок 7. Экспрессия miR-149-3p обратно коррелирует с PDK2 у больных CRC. a Корреляция между экспрессией miR-149-3p и PDK2 была определена с помощью линейного регрессионного анализа(n× 28, r× -0,5058, P<0,01) и b парным t-тестом с теми же образцами(P<0,001) у больных CRC. c OS больных CRC была стратифицирована по экспрессии PDK2 в наборе данных TCGA(n× 603, P× 0.0486, значения P были получены с помощью теста log-rank). d Уровень мРНК PDK2 в группах wt p53 и мутантных p53 был определен с помощью непарного t-теста(P× 0,0057) в наборах данных TCGA. e Мультипликационная зарисовка, изображающая, как DCA восстанавливает ответ CRC на химиотерапию через p53/miR-149-3p/PDK2-опосредованный путь метаболизма глюкозы

Обсуждение

CRC характеризуется туморигенными аномалиями и измененными метаболическими путями и является одной из основных причин смерти от рака [2]. Резистентность к химиотерапии является основной причиной неудачного лечения [7]. В этом исследовании мы обнаружили, что DCA может увеличить химиотерапевтический эффект 5-FU в химиорезистентных клетках CRC и что активация пути p53/miR-149-3p/PDK2 способна увеличить химиочувствительность in vitro и in vivo.

Все больше данных указывают на то, что повышенный гликолиз тесно связан с устойчивостью к химиотерапии [15, 17, 40]. Здесь мы также обнаружили, что по сравнению с родительскими клеточными линиями, химиорезистентные клетки CRC показали повышенное потребление глюкозы, выработку лактата и гликолиз, что говорит о том, что метаболические нарушения являются типичной особенностью, но молекулярные механизмы все еще остаются неясными в клетках CRC.

Было отмечено, что DCA снижает уровень лактата в крови in vivo у грызунов в дозах ~25-50 мг/кг/24 ч [41], а также применение DCA в широком диапазоне доз от 1 до 50 мМ [26]. Примечательно, что неблагоприятное действие DCA у людей обычно ограничивается обратимой сенсорной и моторной периферической нейропатией, которая зависит от возраста и генотипа [42]. Недавно DCA был определен в качестве новой метаболической терапии для различных онкологических больных [26, 29].

Сообщается, что DCA способен ингибировать активность PDK и преобразовывать пируват в ацетил-КоА, что приводит к переходу выработки энергии от гликолиза к митохондриальному окислительному фосфорилированию [43,44]. Также было показано, что DCA ослабляет вызванную гипоксией устойчивость к 5-ФУ при раке желудка [45], преодолевает устойчивость к сорафенибу при гепатоцеллюлярной карциноме [46] и ослабляет устойчивость к цисплатину при раке головы и шеи [47]. Наше исследование показало, что DCA способен ослаблять химиорезистентность клеток CRC к 5-ФУ. Более того, мы продемонстрировали, что DCA снижает потребление глюкозы и выработку лактата в химиорезистентных клетках CRC до базового уровня химиочувствительных клеток CRC. Учитывая, что аутофагия способна подпитывать метаболизм рака [48], было определено влияние DCA и miR-149-3p на аутофагию. Мы обнаружили, что DCA активирует аутофагию, а miR-149-3p не влияет на аутофагию. Это позволило предположить, что аутофагия не вовлечена в эффект DCA/miR-149-3p в регуляции метаболизма глюкозы (Дополнительный рисунок S6).

PDKs, как ключевые регуляторы гликолиза при раке, вызвали большую озабоченность в связи с результатами многих исследований [49]. Существует четыре изоформы PDK (PDK1-4), и каждая из них проявляется в тканеспецифической манере следующим образом: PDK1 высоко экспрессируется в сердце, PDK2 экспрессируется повсеместно, PDK3 имеет относительно ограниченное тканевое распределение, а PDK4 экспрессируется в сердце и скелетных мышцах [27]. PDK2 экспрессируется на более высоких уровнях по сравнению с другими изоферментами, что позволяет предположить, что он может быть основной изоформой, ответственной за регуляцию ферментативной активности пируватдегидрогеназного комплекса (ПДГК) [50]. Кроме того, изоферменты PDK различаются по остроте регуляции метаболитами [51]. Здесь мы сосредоточились на PDK2, наиболее чувствительной изоформе к ДКА [31]. Хотя молекулярные взаимодействия между ДКА и PDK были изучены, потенциальный механизм транскрипционной регуляции PDK остается неясным. В недавнем исследовании сообщалось, что miR-182 играет регуляторную роль в метаболических путях рака легких, нацеливаясь на PDK4 [52]. Настоящее исследование показало, что PDK2 регулируется miR-149-3p в CRC и что уровни PDK2 в первичных опухолях пациентов CRC обратно коррелируют с экспрессией miR-149-3p. Поскольку PDK2 широко присутствует в большинстве тканей, воздействие на PDK2 может стать более важным и эффективным способом уничтожения опухолевых клеток и преодоления химиорезистентности.

Сообщалось, что miR-149-3p играет важную роль в различных видах рака и индуцируется некоторыми противоопухолевыми препаратами [36, 37, 53]. В частности, мы обнаружили, что обработка DCA может индуцировать связывание p53 с восходящей областью (от -677 до -477) miR-149 и что miR-149-3p повышается под воздействием обработки DCA в зависимости от p53. TP53, классический опухолевый супрессор, часто инактивируется в опухолях [54], и недавно сообщалось, что он регулирует метаболизм глюкозы при раке. Было показано, что Wt p53 может подавлять «эффект Варбурга», контролируя PDK2. Однако частота мутаций TP53 в CRC составляет ~40-50% [55, 56], что приводит к потере его супрессивной функции. Сообщалось, что пациенты CRC с wt TP53 получают преимущество в выживании после химиотерапии на основе 5-FU, а пациенты с мутантным TP53 — нет [57]. Наши результаты показывают новый механизм между р53 и PDK2, который модулируется miR-149-3p. Эти данные позволяют предположить, что пациенты с мутантным TP53 могут получить больше пользы от смежной химиотерапии с miR-149-3p, а не с DCA. Учитывая высокую частоту мутаций TP53 в CRC, мы считаем, что miR-149-3p играет важную роль в мониторинге и модуляции химиочувствительности в CRC.

Раковые клетки потребляют большое количество глюкозы и демонстрируют высокий уровень аэробного гликолиза, поэтому снижение поглощения глюкозы является перспективной стратегией для ограничения роста рака [58]. Мы наблюдали, что повышение уровня miR-149-3p значительно подавляло гликолиз в химиорезистентных клетках CRC; однако, по сравнению с контрольной группой, в группе ксенотрансплантатов, которым интратуморально вводили мимикрирующий miR-149-3p, SUVmax оставался неизменным. Возможно, этот противоречивый результат может быть связан с развитием некроза в основной части подкожных опухолевых тканей, что требует изучения.

В целом, мы обнаружили, что сигнальный путь p53/miR-149-3p/PDK2 потенциально может быть направлен на преодоление химиорезистентности CRC при лечении DCA, что обеспечивает потенциальную стратегию лечения CRC с точки зрения вмешательства в метаболизм опухоли (рис. 7e).

Материалы и методы

Раковая ткань
В период с 2013 по 2016 год в исследование были включены 28 пациентов с раком CRC из Девятой народной больницы при Медицинской школе Шанхайского университета Цзяо Тун. Тринадцать из этих пациентов получили послеоперационную химиотерапию на основе 5-ФУ и наблюдались в течение не менее 3 лет. Все ткани были собраны после получения информированного согласия, а все процедуры с участием пациентов проводились в соответствии с правилами, установленными Этическим комитетом Девятой народной больницы при Медицинском колледже Шанхайского университета Цзяо Тун. Клиническая информация о пациентах с КРК представлена в Дополнительной таблице 1.

Дополнительная таблица 1.

Культура клеток
Устойчивая к 5-ФУ клеточная линия HCT-8/F и ее родительская клеточная линия HCT-8 были приобретены у iCell Bioscience, Inc. (Шанхай, Китай). Устойчивая к 5-ФУ клеточная линия HCT116/F и ее родительская клеточная линия HCT116 были любезно предоставлены доктором Гу (Yanhong Gu, Нанкинский медицинский университет, Цзянсу, Китай). Клетки HCT116-/- были подарены доктором Лу (Hua Lu, Университет Фудань, Шанхай, Китай). Линия клеток эмбриональной почки человека 293T была получена из American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Клетки линий 293T, HCT116, HCT-8 культивировали в среде Дульбекко (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, HyClone, Utah, US) или среде RPMI-1640 (HyClone, Utah, US), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Gemini, California, US), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (HyClone, Utah, US) в увлажненном инкубаторе при 37 °C, 5%CO2. В культуральную среду клеточных линий HCT-8/F и HCT116/F добавляли 15 мкг/мл 5-ФУ и 5 мкг/мл 5-ФУ, соответственно. Все клеточные линии были подтверждены путем секвенирования коротких тандемных повторов компанией Genetic Testing Biotechnology Corporation (Сучжоу, Цзянсу, Китай). DCA был приобретен у компании Sigma-Aldrich Co. Ltd. (МО, США).

Иммунофлуоресцентное окрашивание Edu и ROS
Клетки HCT-8/F и HCT116/F высевали в 96-луночные планшеты в количестве 15 000 клеток/лунку. После ночной инкубации клетки обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. Окрашивание Edu проводили в соответствии с инструкцией производителя (Ribobio, Гуанчжоу, Китай). Уровень ROS измеряли в клетках, инкубированных с 10 мкМ 2′,7′-дихлорфлуоресцеин диацетата (DCF-DA) (Beyotime, Шанхай, Китай) в течение 30 мин при 37 °C. Затем планшеты промывали дважды, и клетки анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

Рост клеток
Клетки высевали в 96-луночные планшеты по 5000 клеток/лунку на ночь, обрабатывали препаратами в течение 24 ч, после чего каждую лунку заменяли смесью из 10

мкл

CCK8 (Dojindo, Япония) и 90

мкл

культуральной среды. Абсорбцию измеряли при значении OD 450 нм с помощью энзимного микропланшетного ридера (BioTeck, Вермонт, США) через два часа. Коэффициент ингибирования препарата рассчитывали по следующей формуле: 1-ODdrug/ODctrl. IC50 каждой клетки рассчитывали с помощью GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Анализ апоптоза клеток
Клетки HCT-8/F и HCT116/F высевали в шестилуночные планшеты в концентрации 2 ×105 клеток/лунку. Клетки обрабатывали DCA (15 мМ) / 5-ФУ (50 мкг/мл) и DCA (20 мМ) / 5-ФУ (25 мкг/мл), соответственно, в течение 48 ч. Затем клетки трипсинизировали, промывали и окрашивали антителами Annexin V-FITC/PI или Annexin V-PE/7-AAD в соответствии с протоколом производителя (BD, CA, США). Апоптоз измеряли методом проточной цитометрии (BD, CA, США).

Анализ образования колоний
Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали DCA (15 мМ)/5-FU (50 мкг/мл) и DCA (20 мМ)/5-FU (25

мкг/мл

), соответственно, в течение 24 часов. Затем клетки высевали в шестилуночные планшеты по 1000 клеток в лунку и культивировали в свежей среде при 37 °C в течение 1-2 недель, после чего фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин; затем клетки окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым и подсчитывали количество колоний клеток с помощью счетчика (Gelcount, Optronix, Oxford).

Переходная трансфекция генов
Мимики miR-149-3p, ингибиторы, siPDK2, sip53 и соответствующие им последовательности олигонуклеотидов NC были синтезированы компанией GenePharma (Шанхай, Китай). Плазмида Flag-p53 была любезно предоставлена доктором Лу (Хуа Лу, Университет Фудань, Шанхай, Китай). Трансфекцию проводили с помощью Lipofectamine 3000 (Invitrogen, CA, США) при конечной концентрации 50 нмоль/л (мимики и siRNAs) или 100 нмоль/л (ингибиторы). Клетки собирали для анализа через 24 или 48 ч после трансфекции. Последовательности siRNA, мимиков и ингибиторов представлены в Дополнительной таблице 2.

Дополнительная таблица 2.

Трансфекция стабильных генов
LV-PDK2 и соответствующий NC-вирус были приобретены у компании GeneChem (Шанхай, Китай). shPDK2-1, shPDK2-2 и контрольная плазмида были приобретены у компании GeneChem (Шанхай, Китай). Вирусный супернатант собирали из 293 Т-клеток. Затем клетки CRC были инфицированы вирусом и обследованы с помощью пуромицина. Эффективность инфекции была подтверждена проточной цитометрией и флуоресцентной микроскопией. Экспрессию мРНК и белка PDK2 далее анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени и Вестерн-блота.

репортерные люциферазные анализы 3′-UTR
wt или мутантные последовательности связывания miR-149-3p в 3′UTR PDK2 человека были клонированы в downstream люциферазы pmiR-RB-Reporter (Ribobio, Guangzhou, China), обозначенные как WT, MUT1, MUT2 и MUT3 на рис. 3c. клетки 293 T и HCT116 высевали в 24-луночные планшеты с последующей котрансфекцией 500 нг репортерных конструкций и либо 50 нмоль/л мимика miR-149-3p, либо NC с помощью Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA). Активность люциферазы измеряли после 48 ч инкубации с помощью системы Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Мэдисон, США) в соответствии с протоколом производителя.

Потребление глюкозы и выработка лактата
Клетки HCT-8/F и HCT116/F высевали в 24-луночные планшеты в количестве 1 ×105 клеток/лунку на ночь, затем обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. После обработки клетки культивировали в среде без фенолового красного, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, в течение 24 ч. Культурную среду собирали, измеряли потребление глюкозы и выработку лактата. Лактат измеряли с помощью набора Lactate Assay Kit (Njjcbio, Нанкин, Китай), а глюкозу — с помощью набора Glucose Assay Kit (Rsbio, Шанхай, Китай). Все значения были стандартизированы путем подсчета равного количества клеток. Для оценки состояния гликолиза в культивируемые клетки добавляли 100 нг/мл олигомицина (ингибитор АТФ-синтазы; Sangon Biotech) на 6 ч. Соотношение концентрации лактата в присутствии и отсутствии олигомицина измеряли и определяли, как описано ранее [46].

Seahorse XF-96 glycolytic rate assay
Клетки высевали в 96-луночный культуральный планшет при плотности 25 000 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи в ростовой среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Сенсорный картридж увлажняли в течение ночи. На следующий день среду для клеток меняли на безбикарбонатную низкобуферную среду анализа, дополненную глюкозой, пируватом натрия и глутамином. После того как клетки инкубировали в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе без CO2, скорость потребления кислорода и скорость внеклеточного закисления измеряли до и после введения DCA/ctrl, ротенона (Rot) + антимицина A (AA) и 2-дезокси-d-глюкозы (2-DG) с помощью прибора Seahorse XF (Agilent, Santa Clara, CA), как описано ранее [59, 60]. Эксперименты проводились в режиме реального времени в пяти-шести повторных лунках. Гликоперы, включая базальный гликопер, индуцированный гликопер и компенсаторный гликопер, рассчитывались автоматически с помощью программного обеспечения Wave (Agilent, Santa Clara, CA).

Количественная ПЦР в реальном времени и микрочипы миРНК
Общая РНК была выделена из тканей или клеток CRC с помощью TRIzol Reagent (Life, CA, USA). кДНК была синтезирована с помощью PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, Tokyo, Japan). Анализ микрочипов проводили с тремя репликами клеток HCT116, обработанных 5 мМ, 10 мМ или 20 мМ DCA в течение 12, 24 или 48 ч. Исходные данные были загружены в базу данных GEO (GSE125309). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием премикса Ex Taq 420 A (TaKaRa, Токио, Япония) на платформе ABI-7500. Актин и U6 использовали в качестве внутренних контролей. Последовательности праймеров представлены в Дополнительной таблице 3.

Вестерн-блоты
Загружали тридцать микрограммов лизатов общего белка и наносили первичные антитела: анти-PDK2 (sc-100534, Santa Cruz, California, US), анти-p-PDHA1 (S293) (ABS204, Merck, Darmstadt, Germany), анти-PDHA1 (ab168379, Abcam, Cambridge, UK), анти-p53 (sc-126, Santa Cruz, California, US), anti-c-PARP (D64E10, CST, Массачусетс, США), anti-Bax (D2E11, CST, Массачусетс, США), anti-LC3B (L7543, sigma, MO, США), anti-GAPDH (Proteintech, Ухань, Китай) и anti-α-tubulin (Proteintech, Ухань, Китай). Вторичные антитела были приобретены у компании Sungene (Тяньцзинь, Китай). Блот-анализы визуализировали с помощью системы хемилюминесценции (Bioshine, Шанхай, Китай).

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)
Клетки HCT116, посеянные в 10-см планшеты, обрабатывали 20 мМ DCA или без него в течение 24 ч, затем проводили фиксацию клеток и фрагментацию хромосом в соответствии с инструкциями производителя (Pierce Agarose ChIP Kit, Thermo). Хроматин инкубировали с антителами IgG и анти-р53 (Sigma, MO, США) при 4°C в течение ночи. После инкубации добавляли 60 ul протеина А агарозы/ДНК спермы лосося. Затем осажденный комплекс промывали буферами для промывки IP 1, 2, 3 и элюировали буфером для элюирования. Сшивание было отменено добавлением 6 мкл 5 М NaCl и 2 мл протеиназы К при 65°C в течение 1,5 ч. Иммунопреципитированная ДНК и ДНК цельноклеточного экстракта (входная) были очищены и затем использованы для ПЦР-анализа с использованием соответствующих праймеров. Для контроля эксперимента использовался контрольный праймер. Последовательности праймеров для ПЦР представлены в Дополнительной таблице 3.

Подкожная ксенотрансплантация опухоли у голых мышей и микро-ПЭТ/КТ визуализация
Сначала 1 ×107 клеток HCT-8/F, разведенных в 100

мкл

PBS, подкожно имплантировали голым мышам (самцы, 6 недель). Через 12 дней мышей случайным образом разделили на шесть групп (по шесть на группу). Мыши из групп I — IV получали ежедневную внутрибрюшинную инъекцию PBS, DCA (50 мг/кг)/PBS, 5-FU (10 мг/кг)/PBS и 5-FU (10 мг/кг)/DCA (50 мг/кг), соответственно. Мышам из группы V и группы VI интратуморально вводили PBS или DCA (50 мг/кг), соответственно, каждый второй день и внутрибрюшинную инъекцию 5-FU (10 мг/кг) каждый второй день. Объем опухоли измеряли вслепую каждые 3 дня. Мышей приносили в жертву после 3 недель лечения, опухоли иссекали, взвешивали и замораживали при -80 °C для дальнейшего изучения.

Чтобы оценить, оказывает ли miR-149-3p эффект химиосенсибилизации, были созданы еще две группы животных моделей. Вкратце, мышам подкожно имплантировали 6 ×106 клеток HCT-8/F. После того, как размеры опухоли достигали ~50 мм3, мыши получали внутрибрюшинную дозу 5-FU (10 мг/кг) каждый второй день, а также интратуморальную инъекцию 5 нмоль холестерин-конъюгированных мимиков miR-149-3p или NC каждые 3 дня в течение 3 недель. Затем трех мышей из каждой группы постили на ночь и внутривенно вводили 0,15 мКи 18F-ФДГ. через 60 мин проводилось микро-ПЭТ-КТ сканирование с 18F-ФДГ (Siemens, Берлин, Германия). Изображения, полученные в ходе ПЭТ, были представлены с использованием псевдоцветной карты, где красный цвет указывал на высокое поглощение 18F-ФДГ. SUVmax и MTV использовались для определения активности 18F-ФДГ-ПЭТ. Все эксперименты и уход за животными были одобрены Этическим комитетом Девятой народной больницы при медицинском колледже Шанхайского университета Цзяо Тун.

Иммуногистохимическое и иммунофлуоресцентное окрашивание
Вкратце, срезы тканей инкубировали с первичными антителами Ki67 (Servicebio, Ухань, Китай) и PDK2 (Proteintech, Ухань, Китай) при 4 °C в течение ночи, а затем инкубировали со вторичным антителом. Хромогенную реакцию проводили с 3,3-диаминобензидином и контрастировали гематоксилином. Иммунореактивный балл (IRS) рассчитывался двумя исследователями, слепыми к распределению по группам. IRS = SI (интенсивность окрашивания) × PP (процент положительных клеток). SI присваивался следующим образом: 0 × отрицательный; 1 × слабый; 2 × умеренный; 3 × сильный. PP определяется как 0 × 0%; 1 × 0-25%; 2 × 25-50%; 3 × 50-75%; 4 × 75-100%. Шестимиллиметровые замороженные срезы окрашивали с помощью набора для реакции TUNEL (Roche, Базель, Швейцария) и контрастировали DAPI. Изображения получали с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующими фильтрами возбуждения и испускания.

Статистический анализ
Данные анализировали с помощью программы GraphPad Prism 6.0. Данные представлены как среднее ± SD/SEM из трех независимых экспериментов. Каждый эксперимент проводился как минимум в трех повторах. Для сравнения различий между двумя группами использовали двухфакторный t-тест Стьюдента. Для множественных сравнений использовался односторонний ANOVA с последующим пост-хок тестом Бонферрони. Кривые Каплана-Мейера для анализа выживаемости определялись с помощью теста log-rank. Связь между miR-149-3p и PDK2 оценивали с помощью анализа коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81272745, 81872419 и 81272404) и Программой для профессора специального назначения (Восточный стипендиат JW) в Шанхайских высших учебных заведениях. Мы благодарим д-ра Yanhong Gu за предоставление клеточных линий HCT116, устойчивых к 5-FU, и д-ра Hua Lu за предоставление плазмиды p53.

Соблюдение этических норм

Конфликт интересов
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Примечание издателя
Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и институциональной принадлежности.

Открытый доступ
Эта статья лицензирована по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, обмен, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате при условии, что вы отдаете должное оригинальному автору (авторам) и источнику, даете ссылку на лицензию Creative Commons и указываете, были ли внесены изменения. Изображения или другие материалы третьих лиц в этой статье включены в статью по лицензии Creative Commons, если иное не указано в кредитной строке к материалу. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а предполагаемое вами использование не разрешено законом или выходит за рамки разрешенного использования, вам необходимо получить разрешение непосредственно у правообладателя. Чтобы ознакомиться с копией этой лицензии, посетите сайт http://creativecommons. org/licenses/by/4.0/.

DCA усиливает противоопухолевое действие капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 мыши и ксенотрансплантате немелкоклеточного рака легкого A549 человека

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1007/s00280-013-2281-z

Кафедрабиохимии, факультет наук о жизни, Фуданьский университет, Хандан Роуд 220, Шанхай, 200433, Китай.
Электронная почта: e-mail: whuang@fudan.edu.cn


Получено: 16 мая 2013 г.
Принято: 27 августа 2013 г.
Опубликовано: 17 сентября 2013 г

Аннотация

Цель: Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью. Недавно дихлорацетат натрия (ДХА) показал большой потенциал в качестве противоракового агента. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином при раке со скромной экспрессией TP.

Методы: Для оценки эффекта комбинированного лечения DCA и капецитабином использовали аллотрансплантат меланомы мыши B16 и ксенотрансплантат немелкоклеточного рака легкого человека A549. Гистология и иммуногистохимия использовались для выявления апоптоза и пролиферации раковых клеток. ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот проводились для определения экспрессии TP и каспаз, соответственно.

Результаты: Впервые мы сообщаем, что DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в мышином аллотрансплантате B16 и человеческом ксенотрансплантате A549, способствуя апоптозу опухолевых клеток. DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP.

Выводы: Наши результаты свидетельствуют о том, что DCA в комбинации с капецитабином может стать потенциально новым терапевтическим режимом против некоторых видов рака.

Ключевые слова: DCA, капецитабин, комбинация, противоопухолевый эффект

ВВЕДЕНИЕ

Дихлорацетат натрия (ДХА) — это маленькая молекулярная соль дихлоруксусной кислоты с молекулярной массой 150 Да. DCA ингибирует активность киназы пируватдегидрогеназы, тем самым активируя митохондриальный ферментный комплекс пируватдегидрогеназы [1] и переводя гликолитический путь метаболизма на окислительное фосфорилирование. В течение последних 40 лет DCA использовался в качестве сиротского препарата для лечения врожденного молочнокислого ацидоза у детей и молочнокислого ацидоза, осложненного другими заболеваниями [2], и показал высокую эффективность и низкую токсичность как в доклинических, так и в клинических испытаниях [3]. Недавно DCA продемонстрировал большой потенциал в качестве противоракового средства из-за сходства метаболического ремоделирования некоторых опухолевых клеток с процессами, происходящими при молочнокислом ацидозе [4]. Раковые клетки, особенно раковые стволовые клетки (РСК), сопротивляются апоптозу, производя энергию путем гликолиза и молочнокислого брожения, а не окислительного фосфорилирования, из-за гипоксической природы опухолевой микросреды — явления, известного как эффект Варбурга [5,6]. Было показано, что после перорального приема DCA восстанавливает функцию митохондрий и избирательно способствует апоптозу опухолевых клеток по митохондриально-зависимому пути [7,8]. Терапевтическая активность DCA против глиобластомы была проверена в клинических испытаниях (NCT00540176) и показала некоторые положительные результаты [9]. Однако исследование II фазы NCT01029925 по определению частоты ответа на пероральный прием дихлорацетата у пациентов с рецидивирующим и/или метастатическим и предварительно леченным раком молочной железы и немелкоклеточным раком легкого было прекращено из-за более высокого, чем ожидалось, риска и проблем с безопасностью. Таким образом, клиническая польза DCA для борьбы с раком нуждается в более тщательной оценке.

Как сенсибилизатор апоптоза, DCA также использовался в комбинации с другими методами лечения рака. Cao и другие [10] сообщили, что DCA сенсибилизировал клетки рака простаты к радиации in vitro. Сяо и др. [11] установили, что DCA усиливает гибель опухолевых клеток в сочетании с онколитическим аденовирусом, экспрессирующим опухолевый супрессор MDA-7/IL-24. Недавно метаболическая таргетная терапия с использованием DCA была продемонстрирована как новая стратегия лечения для улучшения результатов фотодинамической терапии [12]. Тонг и др. [13] обнаружили, что DCA и 5-фторурацил проявляют синергетический противоопухолевый эффект в клетках колоректального рака in vitro. Однако до сих пор существуют противоречивые результаты и сомнения относительно применения DCA отдельно или в комбинации с другими препаратами. Шахрзад и др. [14] показали, что DCA снижает апоптоз раковых клеток в гипоксических условиях как in vitro, так и in vivo. Хеше и др. [15] предупредили, что DCA снижает цитотоксичность некоторых стандартных противораковых препаратов, таких как цисплатин и доксорубицин, но не влияет на активность темозоломида в 7 из 10 клеточных линий в их исследовании. Эти противоречивые результаты означают, что применение DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения может зависеть от типа рака и конкретного агента.

Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью и лицензирован в качестве первой линии лечения метастатического рака прямой кишки или альтернативного лечения метастатического рака молочной железы в сочетании с доцетакселом [16,17]. Капецитабин является пролекарством 5-фторурацила (5-ФУ) и требует 3 ферментативных реакций для окончательного превращения в 5-ФУ в опухолевых клетках. Последняя реакция катализируется тимидинфосфорилазой (TP), которая в некоторых опухолях выражена в большей степени, чем в нормальных тканях [18]. Поэтому цитотоксический 5-ФУ образуется в большей степени в опухолевых клетках, чем в тканях вне опухоли, что делает капецитабин малотоксичным химиотерапевтическим препаратом [18]. Уровни экспрессии TP различны в разных типах опухолей [18]; это ограничивает применение капецитабина только несколькими типами рака. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином для раковых опухолей со скромной экспрессией TP. Мы предположили, что DCA усиливает противораковый эффект и снижает эффективную дозу капецитабина. Комбинация DCA с капецитабином может дать хорошую схему лечения, поскольку оба агента можно принимать перорально при хорошей приверженности пациентов. Кроме того, генерические формы DCA могут снизить эффективную дозу капецитабина, тем самым уменьшая побочные эффекты и стоимость лечения рака.

Материалы и методы

Материалы
Дихлорацетат натрия (ДХА, CSA:2156-56-1), чистота 99 %, был получен от компании Shanghai Jieshi Chemical Co. (Китай). 5-фторурацил (5-FU) и 5′-дезокси-фторуридин (5DFUR) были получены от Sigma-Aldrich (США). МТТ был получен от Shanghai Biological Engineering Co. (Китай). Таблетки капецитабина (Xeloda) были получены от Roche (США). Мышиная меланома B16 и человеческая немелкоклеточная линия клеток рака легкого A549 были получены из Американской коллекции клеточных культур (ATCC, США).

Исследования на животных моделях

Модель аллотрансплантата

Мыши C57BL/6, самки, возраст 6-8 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Один миллион одиночных клеток B16 был подкожно (s.c.) инокулирован в правый фланг мышей C57BL/6. Мышей разбили на случайные группы, по 6 мышей на группу в клетке. Было две группы мышей. DCA и капецитабин вводили этим двум группам мышей через 3 и 10 дней после инокуляции, соответственно. DCA добавляли в стерильную питьевую воду до конечной концентрации 1,4 г/л. Измерение объема потребленной воды показало, что количество ДКА, введенного каждой мыши, было приблизительно равно 100 мг/кг/день. Таблетки капецитабина измельчали и суспендировали в стерильной воде с 4 % карбоксиметилцеллюлозы для получения различных концентраций. Двести микролитров суспензии капецитабина вводили внутрижелудочно каждой мыши. Каждые 2 дня длинный (a) и короткий (b) диаметры опухолей измеряли с помощью штангенциркуля, а также регистрировали массу тела. Объем опухоли рассчитывали по формуле V = 0,5ab2. Через 22 дня после инокуляции мышей умертвили, опухоли удалили и взвесили.

Модель ксенотрансплантата

Мыши BALB/c-nu, самцы, возраст 5-6 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Приблизительно 2 × 2 мм срезы только что измельченных опухолевых тканей A549, полученных от мышей BALB/c-nu, ранее инокулированных клетками A549, были введены внутривенно в область правого фланга самцов мышей BALB/c-nu. DCA и капецитабин вводили мышам, когда объем опухоли достигал ~0,2 см3. Через тридцать-тридцать пять дней после лечения мышей умерщвляли, опухоли удаляли и взвешивали. Другие методы были такими же, как описанные в эксперименте с аллотрансплантацией.

Исследования на животных были одобрены группой по благополучию животных и этике факультета лабораторных животных Фуданьского университета.

Гистология и иммуногистохимия
Гистологическое исследование опухолевых узлов проводили с использованием дополнительных животных (по 3 мыши в каждой группе), которые не рассматривались для мониторинга роста опухоли. Ткани фиксировали в 4 % (w/v) параформальдегиде, после фиксации в течение ночи при комнатной температуре образцы обезвоживали в градуированном этаноле и встраивали в парафин. После этого различные части опухоли произвольно вырезали для получения 4-мкм срезов на микротоме Leica. После депарафинизации и регидратации три среза из разных частей каждого образца были отобраны для последующих операций. Терминальное дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованное никелирование концевого участка ДУТФ (TUNEL) и окрашивание 4′6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) проводили в соответствии с инструкциями производителей наборов TUNEL и DAPI (Beyotime, Китай). Срезы анализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Olympus, Япония). Выявление ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) проводили после депарафинизации срезов и инкубации при 96-100 °C в течение 20 мин. Активность эндогенной пероксидазы гасили 0,3 % (v/v) перекисью водорода в 60 % (v/v) метаноле в течение 30 мин. Неспецифическую адсорбцию минимизировали путем инкубации срезов в 2 % (v/v) нормальной козьей сыворотке в PBS в течение 20 мин. Участки тканей инкубировали в течение ночи с кроличьим поликлональным антителом анти-PCNA (Abcam; 1:100 в PBS), промывали PBS 3 раза, по 30 мин каждый раз, и инкубировали с биотин-конъюгированным козьим антирабическим IgG в течение 2 ч при 37 °C и авидин-биотин-пероксидазным комплексом в течение 1 ч при 37 °C. Срезы контрастировали гематоксилином (Sigma-Aldrich) и анализировали с помощью световой микроскопии (Olympus, Япония). Для анализа иммуногистохимии использовали по три опухоли на группу. Один или два среза на опухоль были слепо отобраны для измерения PCNA- или TUNEL-позитивных клеток. Пять случайных полей на слайде при увеличении 400× измеряли вслепую (n = 250 клеток на группу). При проведении количественного анализа TUNEL-позитивных клеток, возможные некротические клетки исключались путем наблюдения за ядерной морфологией с помощью окрашивания DAPI. Для обеспечения точности результатов проводили как положительный, так и отрицательный контроль.

Выделение белка и вестерн-блоттинг
Опухолевые ткани из каждой группы (3 дополнительные мыши в каждой группе) были объединены вместе и измельчены под жидким азотом, а затем лизированы в 150

мкл

буфера для лизиса тканей (Beyotime, Китай). Пробирки энергично встряхивали в течение 1 мин, помещали на лед на 20 мин и центрифугировали при 5 000g в течение 5 мин при 4 °C. Концентрацию общего белка определяли с помощью набора для определения белка BCA (BioRad). Тридцать микрограммов общего белка из каждого образца разделяли методом SDS-PAGE на 10 % геле, переносили на PVDF мембрану, блокировали, инкубировали в течение ночи с первичным антителом, инкубировали в течение 1 ч с вторичным антителом и окрашивали хромогенным субстратом NBT/BCIP. Мышиное моноклональное антитело против антикаспазы 3 (1:500), антитело против антикаспазы 9 (1:1 000), анти-β-актин (1:2 000) и кроличье поликлональное антитело против антикаспазы 8 (1:1 000) были получены от Beyotime (Нанкин, Китай). Мышиное моноклональное антитело анти-ТФ (1:2,000) было получено от Abcam (Великобритания). в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Плотность полос вестерн-блота анализировали с помощью программы Clinx Gel Analysis V2.02 (Clinx Science, Китай).

ПЦР в реальном времени
Опухоли B16 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши C57BL/6, ранее инокулированной клетками B16 (использовали 3 мышей, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Colo205/A549 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши BALB/c-nu, ранее инокулированной клетками Colo205/A549 (3 мыши были использованы, соответственно, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Для анализа экспрессии TP после лечения образцы опухолей объединяли из 3 опухолевых тканей одинакового веса в каждой группе. Тотальную РНК выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США) и подвергали обратной транскрипции с помощью набора реагентов PrimeScript® RT (Takara, Япония). кДНК нормировали на β-актин. ПЦР в реальном времени проводили трехэтапным методом с использованием набора SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takata, Япония) с температурой отжига 55 °C и 40 циклами амплификации. Отдельный тест проводили в трех экземплярах. в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Относительное количество каждой кДНК анализировали с помощью2-△△Ct. Праймеры для ПЦР в реальном времени: β-актин F: 5′-TCAAGATCATTGCTC CTCCTG-3′ и β-актин R: 5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′, hTP F: 5′-TGGCTCAGTCGGGACAGCAG-3′ и hTP R: 5′-TCCGCTGATCATTG GCACCT-3′, mTP F: 5′-GCCTAGCTAAAGCATTGTGCTC-3′ и mTP R: 5′-AAGGGTGCT CGATCTGATAGCA-3′.

Статистика
Мы использовали множественные сравнения ANOVA с post hoc анализом (тест Тьюки), используя программное обеспечение SPSS 16.0 (SPSS Inc., США). Данные представлены как среднее ± SEM, значимым считалось P < 0,05.

Результаты

Экспрессия TP в меланоме мыши B16 и опухолях человека A549 NSCLC
Экспрессия TP в опухолях B16 и A549, удаленных у мышей, была проанализирована методом ПЦР в реальном времени. Печень человека экспрессирует относительно больше TP, чем другие нормальные ткани [18]. В типичных типах рака, подходящих для лечения капецитабином, экспрессия TP в опухоли близка или выше, чем в печени, например, в колоректальном раке и раке молочной железы [18,19]. В ксенотрансплантатах рака человека раковые опухоли с высокой активностью TP были более восприимчивы к лечению капецитабином, чем раковые опухоли с низкой активностью TP [20]. Клеточная линия колоректального рака Colo205 была выбрана в качестве эталона на основании ее умеренной экспрессии TP и умеренной чувствительности к капецитабину [21]. Как показано на рис. 1a, уровень транскрипции TP в Colo205 был немного выше, чем в печени мыши BALB/c-nu. Как показано на рис. 1б, в, уровни транскрипции TP в опухолях B16 и A549 были близки к таковым в печени мышей. Таким образом, B16 и A549 также являются умеренно экспрессирующими TP клеточными линиями. Мы можем сделать вывод, что B16 и A549 будут в определенной степени реагировать на лечение капецитабином, не перекрывая эффект DCA. Таким образом, модели аллотрансплантата B16 и ксенотрансплантата A549 были пригодны для изучения противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина в комбинации.

Рисунок 1. По сравнению с печенью мыши, опухоли B16 и A549 скромно экспрессируют TP ПЦР в реальном времени Анализ уровня транскрипции TP. Использовались праймеры, специфически нацеленные на ТП мыши и человека. Праймер на β-актин подходит как для мышей, так и для человека. a Уровень транскрипции TP в опухоли Colo205 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. b Уровень транскрипции TP в опухоли A549 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. c Уровень транскрипции TP в опухоли B16 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей C57BL/6. В каждой группе использовались образцы от 3 мышей

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате мышиной меланомы B16 без дополнительной токсичности
Поскольку гипоксическая природа опухолевой микросреды является критической для оптимальной активности DCA, противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин был протестирован на животных моделях вместо клеточных линий. Тридцать шесть мышей C57BL/6 были инокулированы 1 ×106 клетками меланомы B16 и случайным образом разделены на 6 групп (n = 6): контрольная группа, не получавшая лекарств, группа, получавшая только DCA, группа, получавшая только капецитабин 10 мг/день, и три группы, получавшие DCA плюс капецитабин 5, 10 или 20 мг/день. Через три дня после инокуляции опухолевых клеток мышам вводили DCA в питьевой воде и перорально (p.o.) капецитабин в качестве отдельных агентов или в комбинации с возрастающими концентрациями капецитабина. Как показано на верхней панели рис. 2a, как DCA, так и капецитабин в дозе 10 мг/день в одиночку незначительно подавляли рост опухолей меланомы B16 по сравнению с контрольной группой. Напротив, DCA плюс 10 мг/день капецитабина значительно усиливали ингибирование роста опухоли (P < 0,05). Противоопухолевый эффект DCA плюс 20 мг/день капецитабина был аналогичен тому, который наблюдался при использовании DCA плюс 10 мг/день капецитабина; рост опухоли был почти полностью подавлен. Примечательно, что у мышей, получавших DCA плюс 20 мг/день капецитабина, наблюдалось резкое снижение массы тела (рис. 2а, нижняя панель), в то время как DCA плюс 10 мг/день капецитабина практически не влиял на массу тела по сравнению с контролем.

Рисунок 2. DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 у мышей без дополнительной токсичности. a Через три дня после инокуляции мышам вводили DCA и капецитабин (CAP) по отдельности или в комбинации. Вводили эскалированные дозы [5, 10 и 20 мг/день (мг/день)] капецитабина в комбинации с постоянной дозой DCA. Показаны кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель). b Через 10 дней после прививки мышам вводили DCA и 7,5 мг/день капецитабина отдельно или в комбинации. Представлены кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель)

Для оценки противоопухолевого эффекта DCA плюс капецитабин против пальпируемых, обнаруживаемых опухолей, через 10 дней после инокуляции опухолевых клеток, DCA и капецитабин отдельно или в комбинации вводили второй группе из 36 мышей C57BL/6, инокулированных 1 ×106 клетками меланомы B16. Мыши с пальпируемыми опухолями были случайным образом разделены на 4 группы (n = 9, 3 мыши использовались для анализа иммуногистохимии): контроль, только DCA, только капецитабин в дозе 7,5 мг/день и DCA плюс капецитабин в дозе 7,5 мг/день. Как показано на верхней панели рис. 2б, DCA плюс капецитабин 7,5 мг/день значительно подавляли рост опухоли по сравнению с DCA или капецитабином (P < 0,05). Через 22 дня после инокуляции DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина подавляли рост опухоли на 75 % (P < 0,05), в то время как только DCA и капецитабин подавляли рост только на 25 % и 35 %, соответственно (P < 0,05). DCA не вызывал резкой потери массы тела по сравнению с лечением только капецитабином (рис. 2b, нижняя панель). Эти результаты показывают, что DCA и капецитабин могут оказывать синергетический противоопухолевый эффект в опухолях меланомы B16.

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели НСКЛ человека A549 без дополнительной токсичности
Ранее сообщалось, что НСКЛ человека можно лечить либо DCA [7], либо капецитабином [22-24]. В настоящем исследовании мы изучили противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин в модели ксенотрансплантата НСКЛ A549 человека. Шестьдесят шесть самцов мышей BALB/c-nu с опухолями человека NSCLC A549 (~2 × 2 мм), привитыми внутривенно в правый фланг, были случайным образом разделены на 9 групп: контроль; только DCA; 2,5, 5, 7,5 или 10 мг/день только капецитабина; или DCA плюс 2,5, 5 или 7.5 мг/день капецитабина (n = 6, кроме контроля, только DCA, 7,5 мг/день капецитабина и DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина; в этих группах n = 9, 3 мыши были использованы для иммуногистохимического анализа и анализа Вестерн-блот или ПЦР в реальном времени). Капецитабин в дозе 10 мг/день был установлен в качестве контроля высокой дозы. Когда объем опухоли достигал 0,15-0,2 см3, мышам вводили препараты. Капецитабин вводили внутривенно по схеме 14 дней в день/7 дней в день. Как показано на левой панели рис. 3a, b и c, только DCA оказывал незначительное ингибирующее действие на опухоли A549; этот результат не согласуется с данными предыдущих отчетов [7], в которых только DCA проявлял больший противоопухолевый эффект. Только капецитабин в дозе 10 мг/день значительно подавлял рост опухолей A549, но при этом отмечалось резкое снижение массы тела, что указывает на сильную токсичность (рис. 3a, b, c, правые панели). Как показано на левой панели рис. 3а, 2,5 мг/день только капецитабина значительно уменьшали рост опухолей A549; комбинация DCA плюс 2,5 мг/день капецитабина усиливала ингибирование роста. Кривая увеличения объема опухоли при лечении только DCA предполагает, что капецитабин оказывает доминирующее противоопухолевое действие при комбинированном лечении. Эффект DCA плюс 5 мг/сут капецитабина был немного лучше, чем DCA плюс 2,5 мг/сут капецитабина, хотя и хуже, чем 10 мг/сут капецитабина, и не наблюдалось значительного снижения массы тела (рис. 3б, правая панель). Примечательно, что DCA плюс 5 мг/сут капецитабина значительно усилили ингибирование роста опухоли по сравнению с 5 мг/сут только капецитабина (рис. 3б, левая панель). Противоопухолевый эффект комбинации был близок к лечению капецитабином 10 мг/день, но без значительной потери массы тела (рис. 3б, правая панель). Эффект только капецитабина 7,5 мг/сут (рис. 3c) был немного лучше, чем капецитабина 5 мг/сут; однако при сочетании с ДКА не было значительной разницы между ДКА плюс капецитабин 7,5 мг/сут и ДКА плюс капецитабин 5 мг/сут. Эти результаты означают, что DCA может снизить дозу капецитабина без потери противоопухолевого эффекта или увеличения токсичности.

Рисунок 3. DCA увеличивает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели NSCLC A549 человека без дополнительной токсичности. a DCA плюс 2,5 мг/день (мг/день) капецитабина. b DCA плюс 5 мг/день капецитабина. c DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. Группа лечения капецитабином 10 мг/день использовалась в качестве контроля больших доз. Показаны кривые роста опухоли(левые панели) и кривые массы тела(правые панели). Объем опухоли представлен на логарифмической оси

DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина на клетки B16 и A549 in vivo
Гистологическое исследование опухолей меланомы B16 проводилось через 7 дней после начала лечения. Окрашивание TUNEL показало, что лечение опухолей меланомы B16 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало клеточный апоптоз на 8 и 17 %, соответственно. В комбинации DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина индуцировали апоптоз примерно на 30 %, что больше, чем сумма отдельных препаратов вместе взятых (рис. 4a, c, левая панель). Окрашивание PCNA в опухолях меланомы B16 показало, что только DCA оказывал незначительное влияние на пролиферацию, в то время как капецитабин 7,5 мг/день значительно снижал пролиферацию. DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина не усиливали ингибирование пролиферации только капецитабином в опухолевых клетках B16 (рис. 4b, c, правая панель).

Рисунок 4. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях меланомы B16. a Иммунофлуоресцентное окрашивание TUNEL образцов опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Иммуногистохимический анализ антигена пролиферации PCNA в образцах опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. c Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток(слева) и PCNA-позитивных клеток(справа). *P < 0.05

Подобно опухолям меланомы B16, лечение опухолей NSCLC A549 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало апоптоз на 15 и 30 %, соответственно. При совместном применении DCA плюс 7,5 мг/сут капецитабина индуцировали апоптоз на 50 %, что больше, чем сумма лечения одним агентом вместе взятым (рис. 5a, b). Эти результаты позволяют предположить, что DCA и капецитабин оказывают синергетическое действие на апоптоз опухолевых клеток NSCLC A549. DCA не усиливал ингибирование пролиферации капецитабином в опухолевых клетках NSCLC A549 (данные не показаны).

Рисунок 3. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях NSCLC A549. a Иммуногистохимический анализ TUNEL образцов опухолей NSCLC A549 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток. c Вестерн-блот активации каспаз в опухолях NSCLC A549. Активация инициаторных каспаз (каспазы 8 и каспазы 9) и эффекторных каспаз (каспазы 3) была обнаружена в опухолях NSCLC A549, инокулированных мышам BALB/c-nu, получавшим DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. d Плотный анализ расщепленных каспаз (C. caspase). Нормализовано по β-актину. *P < 0.05

Вестерн-блот показал, что DCA не оказывает значительного влияния на экспрессию и активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3 в опухолях NSCLC A549 по сравнению с контролем на 7-й день после лечения (рис. 5c, d). Только капецитабин в дозе 7,5 мг/день увеличивал активацию всех трех прокаспаз (рис. 5c, d). Интересно, что хотя DCA сам по себе не оказывал значительного влияния на экспрессию и активацию трех прокаспаз, DCA плюс капецитабин повышали экспрессию прокаспазы 8 и прокаспазы 3 по сравнению с лечением только капецитабином и усиливали активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3.

DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP в опухоли
Мы проанализировали экспрессию TP в образцах опухоли из ксенотрансплантата A549 на 7-й день после лечения. ПЦР в реальном времени (рис. 6a) и Вестерн-блот (рис. 6b) показали, что DCA как отдельный агент или в комбинации с капецитабином мало влияет на экспрессию TP, что означает, что механизм действия DCA и капецитабина в комбинации отличается от других синергистов капецитабина, о которых сообщалось ранее [19,25-27]. ПЦР в реальном времени также показала, что DCA не влияет на экспрессию других ферментов метаболизма капецитабина (тимидилат синтазы, оротат фосфорибозилтрансферазы, дигидропиримидин дегидрогеназы, тимидин киназы 1 и цитидин деаминазы, данные не показаны). Полученные результаты позволяют предположить, что DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не приведет к повышению токсичности капецитабина.

Рисунок 6. Транскрипция и экспрессия TP в опухоли A549 после лечения. a Анализ транскрипции TP методом ПЦР в реальном времени. Нормализовано по β-актину. b Вестерн-блот анализ экспрессии TP. в качестве внутреннего контроля использовался β-актин. Опухоли A549 резецировали у мышей BALB/c-nu через 7 дней после лечения DCA, 7,5 мг/день капецитабина, DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина или контрольной группы. Образцы из трех опухолей каждой группы были объединены вместе

Обсуждение

DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения был протестирован в клинических испытаниях; однако нет сообщений о противоопухолевом действии DCA в комбинации с капецитабином. Мы предположили, что стимулирующее апоптоз действие DCA на клетки солидных опухолей сделает их более чувствительными к капецитабину. В настоящем исследовании только 1,4 г/л DCA не оказывал значительного влияния на рост опухоли NSCLC A549 у мышей. Однако совместное введение DCA и капецитабина позволило снизить эффективную дозу капецитабина на 50 %. DCA усиливал противоопухолевый эффект капецитабина in vivo через сенсибилизацию апоптоза. DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не увеличивает токсичность капецитабина.

Поскольку были получены как положительные, так и отрицательные результаты (как показано в разделе «Введение»), до сих пор существуют разногласия по поводу использования DCA в качестве противоракового агента. Это расхождение может быть связано с различными экспериментальными условиями, особенно между результатами in vivo и in vitro. Клеточные анализы, использованные в настоящем исследовании, показали, что опухолевые клетки нечувствительны к DCA при культивировании in vitro, IC50 превышает 50 мМ. (данные не показаны). Действие DCA на раковые клетки не связано с прямой цитотоксичностью, а зависит от метаболического паттерна раковых клеток [7, 28]. Клеточные линии, культивируемые in vitro, не могут воспроизвести микроокружение опухоли и могут утратить «эффект Варбурга». Поэтому клеточные анализы in vitro могут быть не самыми подходящими модельными системами для определения применения DCA. Поэтому в настоящем исследовании комбинированный противоопухолевый эффект DCA и капецитабина был оценен на мышиных моделях опухолей in vivo. Мы также обнаружили, что эффект DCA на ксенотрансплантат NSCLC A549 в настоящем исследовании был меньше, чем в работе Bonnet et al. [7], даже несмотря на использование большей дозы DCA. Это может быть связано с разницей в метаболической способности ДКА у мышей и крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что на эффект ДКА может влиять состояние раковых клеток и состояние пациентов, что требует тщательного изучения при клиническом использовании ДКА в лечении рака.

В настоящем исследовании на животных моделях было показано, что DCA сам по себе проявляет слабый противоопухолевый эффект против установленных опухолей. Но в сочетании с капецитабином DCA резко усиливал противоопухолевый эффект капецитабина, что видно как из исследований на животных моделях, так и из результатов иммуногистохимии апоптоза. В соответствии с этим, анализ вестерн-блотов показал, что DCA сам по себе оказывает незначительное влияние на экспрессию и расщепление прокаспаз. Но в сочетании с капецитабином DCA значительно увеличивает экспрессию и расщепление прокаспаз 8, 9 и 3. Сообщается, что цитотоксический агент, такой как 5-Fu, может привести к увеличению экспрессии и активации каспазы 8 [29,30]. Причина, по которой капецитабин приводит к увеличению экспрессии и активации каспазы 9, до сих пор не ясна. Возможно, это связано с антиангиогенетическим действием капецитабина. Сообщается, что DCA может нормализовать ось митохондрий-K+ каналов и действовать как сенсибилизатор апоптоза [7]. Мы предполагаем, что DCA может деполяризовать митохондриальный потенциал раковых клеток, нормализуя эту ось, и тем самым усиливать активацию каспазы 8 и каспазы 9 капецитабином. Повышенная активация каспазы 8 и каспазы 9 приводит к повышенной активации каспазы 3.

Недавно был подчеркнут критический вклад CSCs с их повышенной опухолеродной способностью и устойчивостью к радио- и химиотерапии в злокачественное поведение [31]. Сообщается, что CSCs в солидных опухолях играют важную роль в антихимиотерапевтических и антирадиотерапевтических характеристиках опухолей [32, 33]. Обсуждается множество методов лечения, направленных на CSCs [34, 35], а комбинированные методы лечения, направленные как на CSCs, так и на «нормальные» раковые клетки, вызывают большой интерес [36-38]. Сообщается, что DCA индуцирует апоптоз в предполагаемых стволовых клетках глиобластомы как in vitro, так и in vivo [9]. В нашем исследовании после 7 дней лечения DCA количество CD133-положительных клеток в опухолевых срезах A549, определенных с помощью иммуногистохимии, уменьшилось до 0,5 % по сравнению с 6 % в контрольной группе (данные не показаны), что позволяет предположить, что DCA может также влиять на индуцирование апоптоза в КСК рака легких. Мы предполагаем, что DCA может сенсибилизировать опухолевые клетки, особенно КСК, к капецитабину. Комбинация DCA и капецитабина действует против опухолевых клеток двумя способами: капецитабин нацелен на «нормальные» раковые клетки, щадя CSCs, а DCA нацелен на CSCs и способствует апоптозу капецитабина. Другой вероятный сценарий объяснения эффекта комбинации заключается в том, что DCA подавляет ангиогенез рака in vivo [9], при котором DCA не проявляет прямого действия на раковые клетки. В дополнение к своей классической противоопухолевой активности, капецитабин может действовать как антиангиогенетическая молекула, согласно последним исследованиям [39]. DCA может усиливать антиангиогенный эффект капецитабина, что объясняет противоопухолевый эффект комбинации. Для определения подробного механизма будут проведены углубленные исследования.

В заключение, мы использовали модели опухолей, привитых сингенетически, и ксенотрансплантированных опухолей для изучения комбинированного противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина и обнаружили, что DCA впервые потенцировал противоопухолевый эффект капецитабина. Мы определили, что DCA обладает способностью сенсибилизировать раковые клетки и усиливать апоптотическое действие капецитабина. При комбинированном применении DCA позволял снизить эффективную дозу капецитабина без увеличения токсичности. Недорогой, непатентованный и пероральный DCA в сочетании с пероральным капецитабином может стать хорошей терапевтической схемой против рака.

Благодарности

Мы очень благодарны Венлонг Рену из Шанхайского института фармацевтической промышленности за помощь в подготовке мышиных опухолевых моделей.

Конфликт интересов

Нет.

преведено с английского SAID-lab.com

Амигдалин как перспективный противораковый агент:

молекулярный Механизмы и будущие перспективы развития Новые наноформулы для его доставки

1Кафедра нутрициологии и диетологии, Школа наук о здоровье, Международный Греческий университет, 54700 Синдос, Греция2Отделение клинической диетологии и питания, 424 Главный военный госпиталь, 56429 Салоники, Греция3Кафедра питания и диетологии, Факультет физического воспитания, спортивной науки и диетологии, Университет Фессалии, 42132 Трикала, Греция4Ортопедическое отделение, 424 Главный военный госпиталь, 56429 Салоники, Греция5Лаборатория физиологии растений и послеуборочной физиологии плодов, Департамент сельского хозяйства, Международный Греческий университет, 54700 Синдос, Греция6Кафедра пищевых наук и питания, Школа окружающей среды, Эгейский университет, 81400 Лемнос, Греция*Автор, которому следует адресовать корреспонденцию

Международный журнал молекулярных наук 2023 , 24 (18), 14270; https://doi.org/10.3390/ijms241814270Получено: 15 августа 2023 г. / Пересмотрено: 14 сентября 2023 г. / Принято: 15 сентября 2023 г. / Опубликовано: 19 сентября 2023 г.

(Эта статья относится к специальному выпуску « Питание и рак: молекулярные механизмы связи питания и этиологии, профилактики и лечения рака »)

Абстрактный

Уровень заболеваемости раком растет, и рак является одной из основных причин смерти во всем мире. Амигдалин, также известный как витамин B17 (и синтетическое соединение лаэтрил), представляет собой цианогенное гликозидное соединение, которое в основном содержится в ядрах и мякоти фруктов. Это соединение предлагалось на протяжении десятилетий как многообещающее природное вещество, которое может оказывать противораковое действие. Это всеобъемлющий обзор, который критически суммирует и анализирует имеющиеся исследования, изучающие противораковое действие амигдалина, подчеркивая его потенциальные противораковые молекулярные механизмы, а также необходимость нетоксичной формулы этого вещества. Глубокие исследования проводились с использованием самых точных научных баз данных, например, PubMed, Cochrane, Embase, Medline, Scopus и Web of Science, с применением эффективных, характерных и релевантных ключевых слов. Существует несколько доказательств, подтверждающих идею о том, что амигдалин может оказывать противораковое действие против рака легких, груди, простаты, колоректального рака, рака шейки матки и желудочно-кишечного тракта. Сообщалось, что амигдалин вызывает апоптоз раковых клеток, подавляя пролиферацию раковых клеток и замедляя метастатическое распространение опухоли. Однако было проведено лишь несколько исследований на животных моделях in vivo, а клинических исследований еще меньше. Текущие данные не могут подтвердить рекомендацию использования пищевых добавок с амигдалином из-за его циано-группы, которая вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Предварительные данные показали, что использование наночастиц может быть многообещающей альтернативой для усиления противоракового действия амигдалина при одновременном снижении его неблагоприятных побочных эффектов. Амигдалин, по-видимому, является многообещающим природным агентом против развития и прогрессирования раковых заболеваний. Однако существует большая потребность в исследованиях на животных in vivo, а также в клинических исследованиях на людях для изучения потенциальной эффективности профилактики и/или лечения амигдалином рака. Более того, амигдалин можно использовать в качестве ведущего соединения, эффективно применяя последние разработки в процессах разработки лекарств.Ключевые слова:амигдалин ; лаэтрил ; витамин B17 ; противораковые эффекты ; противораковые молекулярные механизмы ; рак ; апоптоз ; пролиферация раковых клеток ; наночастицы ; пищевые добавки ; открытие новых лекарств

1. Введение

Характеристика глобальных изменений в бремени болезней и тенденций с течением времени дает важную информацию об этиологии рака и служит основой для стратегий профилактики и лечения. Злокачественные опухоли считаются основной причиной смерти во всем мире; число новых случаев рака во всем мире достигло 19,3 миллиона, и почти 10 миллионов человек умерли в 2020 году [ 1 ]. Тревожно, что обновленные данные показывают, что число новых случаев с 2020 по 2040 год составит 28,4 миллиона во всем мире [ 2 ]. Кроме того, самые последние данные Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) показывают, что рак молочной железы остается наиболее распространенным злокачественным заболеванием у женщин в 158 из 183 стран (86%) и основной причиной смертности от рака в 173 из 183 стран (95%) [ 3 ]. Вторая по частоте причина смерти от рака во всем мире и третья по частоте диагностирования злокачественная опухоль — это колоректальный рак, согласно данным Глобальной статистики рака 2020 года (GLOBOCAN) [ 1 , 4 ]. Более того, текущие модели смертности и продольные тенденции для основных типов рака в 47 странах мира, за исключением Африки, показывают, что показатели инфекционно-связанных раковых заболеваний, таких как рак шейки матки и желудка, и раковых заболеваний, связанных с табакокурением, таких как рак легких и пищевода, возросли примерно в 10 раз [ 5 ]. В Европейском союзе (ЕС) общее прогнозируемое число смертей от рака в 2023 году оценивается в 1 261 990 (702 214 для мужчин и 559 776 для женщин) [ 6 ]. Общая смертность от рака в 2022 году оценивается в 1 269 200 [ 7 ], в то время как колоректальный рак и рак легких являются основными причинами смерти от рака (> 30 %) в ЕС. В Греции число новых случаев в 2020 году составило 64 530, а число смертей — 33 166 [ 5 , 6 , 7 ]. В Соединенных Штатах число новых случаев рака в 2023 году составит приблизительно 1 958 310 или приблизительно 5370 случаев в день [ 8 ]. В этом контексте следует отметить, что эти оценочные случаи на 2023 год основаны на недавно доступных данных о заболеваемости до 2019 года и не учитывают влияние пандемии COVID-19 на диагностику рака [ 8 ]. Соответственно, прогнозируемая смертность от рака в 2023 году основана на данных до 2020 года [ 8 ].Интерес представляет тема роли амигдалина, также известного как витамин B17 или лаэтрил (его синтетическое соединение), в профилактике и/или совместном лечении рака. Несколько исследований продемонстрировали широкий спектр биологических свойств амигдалина, предполагая, что он может оказывать профилактическое или даже совместное лечебное воздействие на рак шейки матки, молочной железы, простаты, легких и мочевого пузыря, что в основном может быть приписано ингибированию пролиферации раковых клеток [ 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ]. Оценки биологического действия экстрактов амигдалина из трех сортов маниоки ( Manihot esculenta ), выращенных в Бенине, как in vitro, так и in vivo продемонстрировали, что эта натуральная молекула может эффективно действовать в профилактике и совместном лечении рака, подавляя образование раковых клеток [ 14 ]. Исследования in vitro задокументировали индукцию апоптоза амигдалином из-за повышенной экспрессии белка Bax и каспазы-3 и сниженной экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 [ 15 , 16 ]. В области химиопрофилактического потенциала амигдалина Эрикель и др. (2023) отметили, что амигдалин может оказывать модулирующее действие на химиотерапевтические агенты, которые, по-видимому, вызывают геномные повреждения в лимфоцитах человека [ 17 ].Основные противораковые молекулярные механизмы амигдалина в основном приписывались ингибированию клеточного цикла, индукции апоптоза, стимуляции цитотоксического эффекта и регуляции иммунной функции в организме человека [ 15 , 18 , 19 ]. Более того, основным молекулярным механизмом апоптоза является активация протеазы каспазы-3, которая инициируется клеточной репликацией белка Bax цитохрома C [ 20 ]. Высокая экспрессия проапоптотического белка Bax была связана с апоптозом и последующей пролиферацией клеток [ 21 ]. В этой связи считалось, что амигдалин индуцирует апоптоз, увеличивая активность каспазы-3 в клетках HeLa и подавляя Bcl-2 [ 22 ]. Параллельно с этим, Bax, по-видимому, был повышен в клетках HeLa, обработанных амигдалином, что предполагает, что эндогенный путь может быть вовлечен в апоптоз [ 22 ]. Несколько линий человеческих клеток, включая клетки рака легких, молочной железы, толстой кишки, яичек, простаты, прямой кишки и мочевого пузыря, показали, что амигдалин может вызывать апоптоз и остановку клеточного цикла [ 19 , 20 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 ].Несмотря на многообещающие результаты имеющихся в настоящее время исследований противораковых эффектов амигдалина, существует острая потребность в дальнейших исследованиях в этой области. На сегодняшний день Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) не одобрило медицинское использование амигдалина в качестве сопутствующего лечения рака или других заболеваний в Соединенных Штатах из-за отсутствия адекватных данных об эффективности амигдалина и риска потенциальных неблагоприятных побочных эффектов [ 27 , 28 ]. В связи с этим настоящий обзор направлен на критическое обобщение и изучение имеющихся данных относительно потенциальных противораковых эффектов амигдалина, подчеркивая его противораковые молекулярные механизмы и его возможное будущее применение в клинической практике против рака.

2. Методы

Всесторонний и глубокий обзор был проведен с использованием наиболее точных научных баз данных, например, PubMed, Scopus, Web of Science и Google Scholar, с применением эффективных, характерных и релевантных ключевых слов, таких как «амигдалин» или «лаэтрил» или «витамин B17» и «токсичность», «противоопухолевые эффекты» и/или «рак» и «молекулярные механизмы». Критериями включения были исследования, написанные на английском языке, клинические исследования на людях, исследования на животных in vitro и in vivo и рандомизированные клинические испытания (РКИ). Серая литература, комментарии, редакционные статьи, письма редактору, обзоры, рефераты в материалах конференций и статьи в нерецензируемых журналах были исключены из окончательного анализа. Поиск был дополнен сканированием списков литературы соответствующих исследований и ручным поиском ключевых журналов, комментариев, редакционных статей и рефератов в материалах конференций. Найденные опросы были дополнительно всесторонне проверены на наличие связанных исследований, цитируемых в их тексте.Все авторы выступали в качестве рецензентов. Для повышения согласованности среди рецензентов все рецензенты просмотрели все найденные публикации, обсудили результаты и внесли поправки в руководство по просмотру и извлечению данных перед началом просмотра для этого обзора. Все рецензенты работали парами, чтобы последовательно оценить заголовки, аннотации, а затем полные тексты всех публикаций, выявленных в ходе нашего поиска потенциально релевантных публикаций. Мы разрешили разногласия по выбору исследований и извлечению данных путем консенсуса и обсуждения со всеми авторами/рецензентами, если это было необходимо. Форма диаграммы данных была совместно разработана двумя рецензентами (MS и CG) для определения того, какие переменные следует извлекать. Два рецензента независимо друг от друга составили диаграмму данных, обсудили результаты и постоянно обновляли форму диаграммы данных в итеративном процессе. Результаты отбирались на основе релевантности, и наиболее релевантные из них были выбраны для обсуждения ниже в соответствии с блок-схемой, изображенной на рисунке 1 .Рисунок 1. Блок-схема отбора для исследования. * Количество записей, выявленных в каждой базе данных или регистре, в которых выполнялся поиск (а не общее количество по всем базам данных/регистрам), ** Сколько записей было исключено человеком, а сколько — средствами автоматизации.

3. Результаты

3.1 Амигдалин: основные сведения и свойства

Амигдалин был открыт в 1803 году Шрадером при изучении ингредиентов горького миндаля и впервые выделен в 1830 году двумя французскими химиками, Пьером-Жаном Робике и Антуаном Франсуа Бутрон-Шарларом [ 29 , 30 ]. Химики Хаворт и Уайлам окончательно определили его точную химическую структуру в 1923 году ( рисунок 2 ) [ 31 ]. Амигдалин (d-минделонитрил-β-d-глюкозид-6-β-глюкозид) представляет собой цианогенное гликозидное соединение, которое состоит из дибензальдегида, синильной кислоты и двух молекул глюкозы (D-минделонитрил-β-D-глюкозид-6-β-глюкозид) [ 32 ]. Его биоактивная форма (D-минделонитрил-β-глюкоза) была использована для патента США (USP). Laetrile — это частично искусственная, синтетическая форма природного вещества амигдалина ( рисунок 2 ) [ 32 ]. В Мексике структура была дифференцирована и определена как D-манделонитрил-β-гентиобиозид [ 33 ]. Национальный центральный институт США (NCI) продемонстрировал, что мексиканская форма амигдалина (пероральная и внутривенная) не соответствует стандартам США по лекарственным средствам, и это вещество было запрещено для потребления человеком [ 33 ]. Амигдалин в основном содержится в ядрах и мякоти фруктов, таких как сливы, абрикосовые косточки, черная вишня, персики и горький миндаль, и широко используется в альтернативной медицине [ 34 , 35 , 36 ]. Молекулярная формула амигдалина — C20H27NO11, а его молекулярная масса составляет 457,42 г·моль −1 [ 37 ].Рисунок 2. Химическая структура амигдалина и лаэтрила.Амигдалин может производить миндальный нитрил и праназин посредством гидролиза под действием глюкозидазы и в конечном итоге распадается на синильную кислоту и бензальдегид [ 30 ]. Цитотоксическое действие амигдалина на раковые клетки in vitro и распределение амигдалина в растениях, которые обычно употребляются в пищу человеком, являются двумя наиболее интересными темами в недавних исследованиях. Однако это не новое соединение, и оно использовалось в традиционной и альтернативной медицине на протяжении столетий из-за его противораковых и противовоспалительных свойств и, в целом, его многочисленных медицинских преимуществ [ 35 , 36 , 38 ]. Он был полезен для облегчения боли и лихорадки; подавления кашля, жажды и тошноты; и как средство профилактики рака и сопутствующего лечения в последние годы [ 39 , 40 ].

3.2 Противораковые эффекты и молекулярные механизмы амигдалина: доказательства in vitro и in vivo

На сегодняшний день несколько исследований изучили потенциальные противораковые эффекты амигдалина, подчеркнув его противораковые молекулярные механизмы, особенно при раке легких, груди, простаты, колоректальном, шейки матки и желудочно-кишечном раке. Потенциальные противораковые эффекты и молекулярные механизмы амигдалина изображены на рисунке 3. Клинические исследования на людях, а также на раковых клетках человека и животных представлены в таблице 1 .Рисунок 3. Противораковые молекулярные механизмы амигдалина. ↑: увеличение, ↓: уменьшение.

3.2.1 Рак легких

Амигдалин может быть полезен в качестве котерапевтического агента при опухолях легких. Это соединение значительно индуцировало апоптоз клеток рака легких A549 и PC9 дозозависимым образом через митохондриально-опосредованный и зависимый от каспазы апоптотический путь [ 41 ]. Одновременно в клетках рака легких A549 и PC9 наблюдалось увеличение цитохрома C и усиление активности каспазы-9 и каспазы-3. Для подавления пролиферации линий клеток рака легких H1299/M и PA/M in vitro требовалась высокая концентрация амигдалина [ 42 ]. Однако при более низкой концентрации амигдалина было отмечено, что способность к инвазии и миграции раковых клеток H1299/M PA/M была значительно подавлена ​​[ 42 ]. Таким образом, было высказано предположение, что амигдалин, вероятно, обладает антиметастатической активностью, вызывая апоптоз и подавляя пролиферацию клеток рака легких [ 42 ].

3.2.2 Рак молочной железы

Было показано, что амигдалин вызывает апоптоз и подавляет адгезию клеток рака молочной железы за счет повышения уровня проапоптотических белков Bax и активности каспазы-3 и снижения уровня антиапоптотического белка Bcl-2 [ 20 ]. Важно отметить, что в клетках рака молочной железы как MCF-7, так и MDA-MB-231 амигдалин значительно увеличивал апоптоз, подавляя пролиферацию клеток и повышая эффективность радиотерапии за счет индукции остановки клеточного цикла (на стадиях клеточного цикла G1 и суб-G1) [ 11 ]. Также было обнаружено, что амигдалин снижает миграцию клеток MDA-MB-231 больше, чем клеток MCF-7 [ 43 ]. Кроме того, предполагалось, что ингибирование протеолитических ферментов способствует активации апоптотических событий в клетках рака молочной железы MCF-7 [ 44 ]. Кроме того, было показано, что амигдалин увеличивает экспрессию Bax и снижает экспрессию Bcl-2 в клетках рака молочной железы SK-BR-3 и MCF-7. Однако, по сравнению с конъюгатом аффибоди амигдалина и ZHER2, эффект на экспрессию Bax и Bcl-2 в клетках SK-BR-3 был сильнее, чем в клетках MCF-7 [ 45 ]. Также была продемонстрирована способность амигдалина снижать рост клеток рака молочной железы человека MCF-7 и T47D в зависимости от концентрации путем стимуляции продукции малонового диальдегида (МДА) и окисленного глутатиона. Более того, наблюдалось значительное снижение общего уровня глутатиона и активности глутатионредуктазы в клетках рака молочной железы [ 46 ].

3.2.3 Рак предстательной железы

Амигдалин дозозависимо ингибировал рост опухоли и уменьшал количество опухолевых клонов в клеточных линиях рака простаты, ингибируя фазу G0/G1 [ 47 ]. Более того, ингибирование роста клеток рака простаты и роста опухоли амигдалином было очевидным, что раскрывает функцию метаболических ферментов бетаглюкозидазы (β-глюкозидазы) и роданезы в регуляции противораковой активности амигдалина in vivo [ 10 ]. Активацию амигдалина β-глюкозидазой можно считать стратегией ферментной/лекарственной терапии, которая может быть многообещающим новым подходом к целенаправленному лечению рака простаты [ 48 ]. Было также обнаружено, что воздействие амигдалина на определенные клетки рака простаты, такие как DU-145, ингибирует метастатическое распространение, стимулируемое α6-интегрином [ 49 ].

3.2.4 Колоректальный рак

В альтернативной и традиционной медицине амигдалин обычно используется для профилактики и лечения злокачественных опухолей толстой кишки [ 50 ]. Было обнаружено, что противораковое действие амигдалина на клетки колоректального рака, например, на клетки колоректального рака человека SNU-C4, усиливается за счет снижения экспрессии генов, связанных с клеточным циклом [ 51 ]. Сообщалось, что клетки рака толстой кишки более чувствительны к воздействию амигдалина по сравнению с нормальными клетками из-за более высокой концентрации β-глюкозидазы и более низких уровней печеночного фермента роданезы, который может преобразовывать цианид в относительно безвредное соединение тиоцианат [ 52 ].

3.2.5 Рак шейки матки

Было задокументировано, что амигдалин значительно подавляет пролиферативную активность клеток рака шейки матки HeLa [ 19 ]. Антиапоптотический белок Bcl-2 был подавлен, а проапоптотический Bax был повышен в клетках HeLa, обработанных амигдалином [ 22 ]. Более того, отношение Bax к Bcl-2 и активность каспазы-3 были увеличены при обработке амигдалином в клетках HeLa, что усилило апоптотический эффект амигдалина на клетки рака шейки матки [ 22 , 53 ].

3.2.6 Рак желудочно-кишечного тракта

Было показано, что амигдалин стимулирует процесс апоптоза путем повышения экспрессии каспазы-3 и снижения экспрессии Bcl-2, а также ингибирует пролиферацию клеток гепатоцеллюлярного рака HepG2 и EAC и повышает экспрессию Beclin-1 [ 54 ]. Примечательно, что сочетание амигдалина с метформином оказало многообещающий эффект по сравнению с одним амигдалином; их сочетание было более цитотоксичным, показывая большую способность вызывать апоптоз и останавливать клеточный цикл в клетках гепатоцеллюлярного рака [ 55 ]. В дополнение к этому сочетанию также было показано, что активность амигдалина с цинком вызывает усиленный апоптотический эффект при лечении HepG2 по сравнению с эффектом амигдалина без цинка [ 56 ].

3.2.7 Другие злокачественные опухоли

Ингибирующее действие амигдалина на маркеры роста и дифференцировки E- и N-кадгерин в клетках почечно-клеточной карциномы (RCC) было также продемонстрировано путем применения 10 г/мл амигдалина к линиям клеток RCC A498, Caki-1 и KTC-26 в течение 24 часов или 2 недель in vitro [ 35 ]. Исследование воздействия амигдалина (1,25–10 мг/мл) на несколько линий клеток рака мочевого пузыря (UMUC-3, RT112 и TCCSUP) также показало положительные результаты [ 57 ]. Наиболее примечательное воздействие амигдалина было приписано оси cdk2–циклин A. Исследования по нокдауну siRNA показали положительную связь с cdk2/циклином. Также было обнаружено, что амигдалин ингибирует развитие опухоли посредством снижения регуляции cdk2 и циклина [ 57 ]. Напротив, колониеобразующие клетки из лейкозных клеточных линий и нормального костного мозга были относительно толерантны к амигдалину и его метаболитам in vitro. Хотя наблюдалось увеличение скорости апоптоза, не было селективного разрушения между лейкозными клеточными линиями человека и нормальными клетками костного мозга [ 58 ].Таблица 1. Исследования, оценивающие противораковые эффекты и противораковые молекулярные механизмы амигдалина.

3.3 Токсичность амигдалина

Чрезмерное потребление амигдалина может привести к отравлению (более 1 мг/л цианида в крови). Амигдалин превращается в глюкозу, бензальдегид и цианистый водород эндогенным ферментом (β-глюкозидазой) при измельчении косточек фруктов. Более аналитически, когда высвобождается HCN, цитохромоксидаза C может реагировать с ионом железа. Это может вызвать образование комплексов ионов металлов, которые лизируют клетки и ингибируют синтез АТФ [ 65 ].Сообщалось, что амигдалин оказывает токсическое действие при приеме внутрь с добавками. Пероральный прием 500 мг амигдалина может высвободить 30 мг цианида [ 66 ]. Токсичность цианида может быть опасной для жизни из-за снижения использования кислорода митохондриями, что приводит к гибели клеток. Раковые клетки лишены роданазы, фермента, который действует как детоксицирующий агент, связывая серные центры железа на клеточных мембранах и превращая HCN в менее токсичный метаболит, тиоцианат. Однако после парентерального введения амигдалина/лаэтрила путем инъекции в моче крыс и кроликов было обнаружено более 80% тиоцианата [ 66 ]. Неблагоприятные побочные эффекты токсичности цианида включают тахикардию, спутанность сознания, тошноту, головную боль и, что более серьезно, нейромиопатию, цианоз, кому, судороги и смерть [ 67 ].За последние десятилетия было проведено несколько исследований in vitro и in vivo с использованием однократных или многократных доз и различных форм введения амигдалина (внутривенно и внутримышечно), которые не показали образования HCN, что подчеркивает важную роль кишечника в физиологии человеческого организма после потребления веществ. Анаэробные бактериальные типы, существующие в кишечнике, демонстрируют высокую активность β-глюкозидазы, которая необходима для гидролиза HCN амигдалином. Тем не менее, было обнаружено, что токсичность HCN существует при определенных обстоятельствах. В некоторых случаях токсичность была вызвана приемом различных доз амигдалина, и не было никаких побочных эффектов HCN, связанных с высокими дозами. Несколько факторов, включая потребление пробиотиков или пребиотиков, диету и возраст, могут изменить консорциум кишечника, который отвечает за условия, при которых возникает токсичность. В частности, не было зарегистрировано серьезных реакций при пероральном приеме дозы 3 г амигдалина у пациентов с раком, которые искали альтернативные методы лечения. Минимальная смертельная доза амигдалина для взрослого человека составляет 50 мг или 0,5–3,5 мг/кг массы тела. Однако взаимодействие с сопутствующим потреблением витамина С, по-видимому, активирует его неблагоприятные побочные эффекты, в то время как витамин В12 и раствор дисульфата натрия использовались в качестве антидотов без неблагоприятных побочных эффектов [ 65 ].

3.4 Клинические исследования амигдалина/лаэтрила при злокачественных опухолях человека в 20 веке

Несколько исследований продемонстрировали противораковую активность амигдалина и его терапевтическое применение для лечения рака и облегчения боли [ 30 , 68 ]. Хотя научные доказательства противоракового эффекта амигдалина, основанные на клинических испытаниях, ограничены, было проведено несколько испытаний, изучающих действие амигдалина против злокачественных опухолей у людей. Несколько клинических испытаний амигдалина/лаэтрила были рассмотрены на протяжении многих лет [ 32 ]. В 1980 году Отделение исследований лекарственных средств Национального института рака (NCI) объявило, что около 200 больных раком, «для которых никакое другое лечение не оказалось эффективным», планируют получать химическое вещество, специальную диету и дополнительные витамины (см. «Национальный институт рака начинает клиническое испытание лаэтрила», 1980) [ 69 ]. В течение следующих двух лет были проведены два клинических испытания в области лаэтрила при раке человека. Первое из этих двух клинических испытаний было проведено в 1981 году на шести пациентах с запущенным раком [ 32 ]. Амигдалин вводился как внутривенно, так и перорально в течение 21 дня, без каких-либо признаков токсических реакций. Эти результаты соответствовали предыдущим наблюдениям за пациентом после самостоятельного приема лаэтрила [ 70 ]. В 1982 году было проведено еще одно клиническое испытание с общим числом 178 пациентов с раком, которые получили лечение амигдалином плюс «метаболическую терапию» [ 59 ]. Не было отмечено никаких существенных преимуществ с точки зрения излечения, улучшения или стабилизации рака, улучшения симптомов, связанных с раком, или продления жизни. Опасности терапии амигдалином были подтверждены у нескольких пациентов симптомами токсичности цианида или уровнями цианида в крови, приближающимися к летальному диапазону [ 59 , 69 , 70 ]. Однако следует отметить, что эти клинические испытания проводились более 40 лет назад и теперь их следует считать устаревшими, что подчеркивает необходимость проведения новых клинических испытаний, включающих введение амигдалина в различных фармацевтических формулах, которые могли бы быть более переносимыми и приемлемыми для человеческого организма, демонстрируя большую биологическую эффективность и нетоксичные эффекты.

3.5 Наночастицы и амигдалин в 21 веке

Наночастицы считаются перспективным методом в биотехнологии для доставки лекарств и лечения злокачественных опухолей человека, избегая при этом токсичности. Несколько исследований на линиях клеток рака человека продемонстрировали положительные результаты относительно метаболизма амигдалина без побочных эффектов. Как уже упоминалось, амигдалин, несмотря на его противораковое действие, столкнулся с противоречиями из-за высвобождения цианида. Сохаил и Аббас исследовали наночастицы альгината-хитозана (ACNP) как способ введения лекарств посредством инкапсуляции амигдалина и доставки его в опухолевые клетки (H1299) [ 64 ]. Наночастицы показали стабильное высвобождение лекарства в течение десятичасового периода и значительную скорость набухания в слегка кислой и нейтральной среде. Было показано, что ACNP оказывают более выраженное противоопухолевое действие на линии клеток H1299, чем свободный амигдалин, что предполагает большее поглощение клетками соединения, инкапсулированного в наночастицы. В этой связи биомиметические и биосовместимые наночастицы бальгината-хитозана могут быть использованы в качестве выгодной системы доставки лекарств для длительной и контролируемой доставки амигдалина с повышенной цитотоксической активностью против опухолевых клеток, одновременно защищая нормальные ткани человека и здоровые клетки [ 64 ].Наночастицы серебра, инкапсулирующие амигдалин и сшивающие микрокапсулы, заряженные хитозаном, также были исследованы в линиях клеток рака груди. Противораковый ответ также наблюдался в соответствии с контролируемым высвобождением амигдалина из-за соединения с хитозаном, преодолевая низкие цитотоксические эффекты при высоких дозах [ 63 ].Кроме того, наночастицы продемонстрировали устойчивые свойства высвобождения амигдалина и фолиевой кислоты и очевидную селективность к клеткам, подавляя рост опухоли. В то же время было обнаружено, что они повышают эффективность радиотерапии за счет усиления апоптоза, блокирования клеточного цикла и снижения пролиферации клеток рака молочной железы путем снижения уровня железа и митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK/P38). Было также показано, что амигдалин и фолиевая кислота ингибируют дифференциацию экспрессии комплекса CD4 и CD80, вызывая подавление трансформации экспрессии фактора роста бета (TGF-бета)/интерлейкина-6, (IL-2)/интерферона-гамма, (INF-g)/интерлейкина-2 и (IL-2)/фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) на сигнальном пути, одновременно модулируя экспрессию гена CD8 и группы естественных киллеров 2D [ 11 ].Мосайеби и коллеги наноформулировали амигдалин с β-циклодекстрином, чтобы исследовать усиление его действия против миграции клеточной линии MCF-7, апоптоза и миграции генов. Наноформулированный амигдалин показал больший эффект на опухолевые клетки, чем амигдалин в одиночку [ 62 ].

3.6 Пищевые добавки с амигдалином для лечения рака

Амигдалин, лаэтрил или витамин B17 были заявлены как средство для лечения различных заболеваний, особенно злокачественных опухолей, с 1845 года [ 33 ]. Однако в 1982 году возникло мнение, что амигдалин может быть токсичным препаратом и неэффективен при лечении рака [ 59 ]. Недавние теоретические и практические разработки показали, что амигдалин может оказывать благоприятное воздействие на онкологических больных [ 28 , 62 , 63 ]. Амигдалин использовался для лечения рака как в качестве единственного средства, так и в сочетании с метаболической терапией. Поэтому стоит отметить, что токсичность витаминных добавок не является редким явлением, и амигдалин рекомендуется пациентам в качестве пищевой добавки для лечения рака, при этом предлагаются высокие дозы [ 71 ]. Таблетки и капсулы амигдалина в настоящее время продаются как натуральная пищевая добавка под неправильным названием лаэтрил или сомнительным названием «витамин B17» [ 72 ].Некоторые исследования отчетов о случаях продемонстрировали обратный метаболический ацидоз после массивной передозировки амигдалином и опасную для жизни интоксикацию цианидом, включая нефрогенный несахарный диабет [ 73 , 74 , 75 , 76 ]. Токсичность амигдалина может быть вызвана ядовитым составным продуктом бензальдегида и цианида после перорального приема [ 35 ]. И токсикологи, и нефрологи должны знать о потенциале этого «витамина» вызывать отравление цианидом [ 77 ]. Кроме того, в настоящее время существует серьезная обеспокоенность тем, что натуральные пищевые добавки не подвергаются строгим аналитическим и клиническим испытаниям. На основании Регламента Европейского союза ((EC) № 178/2002) относительно общего законодательства о пищевых продуктах, пищевые добавки считаются продуктами питания, а не лекарственными средствами [ 78 ]. Согласно приведенным выше данным, предполагающим, что клиническое использование пищевых добавок амигдалина может сопровождаться неблагоприятными побочными эффектами, баланс риска и пользы в этом отношении не благоприятен для амигдалина [ 78 , 79 ]. Более того, амигдалин неправильно называют витамином B17; это соединение не является витамином [ 36 ].

4. Обсуждение

В альтернативной медицине амигдалин в течение нескольких десятилетий считался противораковым средством без строгой научной поддержки его эффективности и безопасности. Несколько тематических исследований выявили риск плохо регулируемых добавок [ 79 ]. Недавние исследования in vitro продемонстрировали, что амигдалин может оказывать противораковое действие, влияя на клеточный цикл, способствуя апоптозу и цитотоксичности, а также модулируя иммунный ответ [ 29 , 80 , 81 ]. Однако клинические испытания показали, что метаболиты амигдалина могут превращаться в синильную кислоту и что накопление синильной кислоты с течением времени может привести к неблагоприятному токсическому эффекту у людей [ 82 ].Более того, имеющиеся в настоящее время исследования имеют некоторые ограничения. На сегодняшний день проведено лишь несколько исследований на животных in vivo. Кроме того, результаты исследований противоречивы, возможно, из-за неоднородности их метода разработки. Доза, форма вещества, тип введения, отсутствие РКИ на людях и отсутствие клинических испытаний III и IV фазы являются значительными ограничениями для рекомендации введения амигдалина для профилактики и/или лечения рака в клинической практике. Таким образом, сильная сторона нашей обзорной статьи касается выявления пробела в литературе относительно эффективности клинических исследований амигдалина. С другой стороны, по-прежнему отсутствуют надежные данные относительно биодоступности амигдалина и соответствующих уровней его концентрации в кровотоке. Соответственно, нет данных относительно того, можно ли использовать амигдалин в качестве сопутствующего лечения вместе с другими химиотерапевтическими средствами.Значительный научно-исследовательский разрыв между концом 20-го века и началом 21-го века возник, поскольку на сегодняшний день была проведена ограниченная исследовательская деятельность. Более того, большинство исследований, подтверждающих противораковые эффекты амигдалина, были выполнены на различных линиях раковых клеток in vitro. Таким образом, разумно предположить, что его противораковые эффекты не могут быть экстраполированы на людей. Противоречивые результаты исследований in vitro и in vivo [ 41 , 51 , 60 , 83 , 84 , 85 , 86 ] и нескольких клинических испытаний [ 61 ] еще больше подчеркивают необходимость дополнительных исследований в области терапии рака, особенно связанных с исследованием новой, нетоксичной формулы амигдалина, и с учетом роли нанотехнологий в современную эпоху биомедицинской науки. В целом, существует острая потребность в дальнейших исследованиях на животных in vivo, а также в клинических исследованиях на людях для изучения потенциальной эффективности профилактики и/или лечения амигдалином против развития и прогрессирования раковых заболеваний. Кроме того, расхождения, обнаруженные в некоторых клинических испытаниях, могут быть обусловлены малыми размерами выборки, а также различными индивидуальными характеристиками включенных в исследование лиц, что подчеркивает необходимость проведения в будущем хорошо спланированных клинических исследований с адекватными размерами выборки.База данных систематических обзоров Кокрейна в 2015 году заявила, что лаэтрил или амигдалин оказывают благотворное воздействие на онкологических больных, что в настоящее время не подтверждается научно обоснованными клиническими данными [ 28 ]. В приведенном выше отчете документально подтверждено, что существует значительный риск серьезных неблагоприятных побочных эффектов от отравления цианидом после приема лаэтрила или амигдалина, особенно после перорального приема [ 28 ]. Таким образом, баланс риска и пользы лаэтрила или амигдалина в качестве лечения рака остается однозначно сомнительным [ 28 ]. Тем не менее, с 2015 года было проведено много исследований. Более того, Национальный институт рака сообщил, что частота отравления цианидом намного выше, когда лаэтрил принимается перорально, поскольку кишечные бактерии и некоторые часто употребляемые в пищу растения содержат ферменты (бета-глюкозидазы), которые активируют высвобождение цианида после приема лаэтрила [ 87 ].Наконец, эффективно применяя последние разработки в процессах открытия лекарств, амигдалин может быть использован в качестве ведущего соединения для синтеза и разработки более биоактивных аналогов амигдалина с более высокой эффективностью и селективностью мишени, а также с уменьшенными побочными эффектами и улучшенной пероральной биодоступностью. Например, методы машинного обучения произвели революцию в области разработки лекарств на основе структуры в последние годы [ 88 ]. Подходы искусственного интеллекта для ускорения и предотвращения сбоев в конвейере открытия лекарств также могут быть применены в случае амигдалина [ 89 ]. Помимо методов машинного обучения и искусственного интеллекта, квантовые вычисления являются еще одним значительным достижением в технологии генеративной химии и процессах открытия лекарств, которые исследователи могут использовать в случае амигдалина [ 90 ]. Функционализация на поздней стадии также представляет новые проблемы для введения новых химических групп фрагментов, таких как амигдалин и его будущие потенциальные синтетические аналоги, в конце синтетической последовательности, что означает, что новые молекулы, к которым можно было бы быстро получить доступ без трудоемкого химического синтеза de novo [ 91 ]. Этот конкретный подход может обеспечить такие преимущества, как эффективный доступ к разнообразным библиотекам для изучения взаимосвязей структура-активность и улучшения физико-химических и фармакокинетических свойств [ 91 ].Компьютерное открытие лекарств также может обеспечить быструю идентификацию весьма разнообразных, мощных, целеизбирательных и подобных лекарствам лигандов к белкам, что открывает новые возможности для экономически эффективной разработки более безопасных и эффективных низкомолекулярных методов лечения, таких как амигдалин [ 92 ]. Липофильность и биомиметические свойства также играют важную различную и пересекающуюся роль в поддержке процесса открытия лекарств, в основном за счет повышения пероральной биодоступности кандидатов на лекарства и значительного снижения их потенциальных неблагоприятных побочных эффектов [ 93 , 94 ]. Липофильность имеет уникальную ценность на раннем этапе разработки лекарств для скрининга библиотек и для идентификации перспективных соединений для начала, в то время как биомиметические свойства полезны для экспериментальной оценки свойств абсорбции, распределения, метаболизма и выведения (ADME) синтезированных новых соединений, поддерживая приоритизацию кандидатов на лекарства и направляя дальнейший синтез; Эти подходы могут быть применены в случае амигдалина для получения новых синтетических аналогов амигдалина с повышенной пероральной биодоступностью и сниженными побочными эффектами [ 93 , 94 ].В поддержку вышеизложенных соображений, моделирование двойной стыковки и молекулярной динамики недавно было применено для разработки новых подходов к объяснению влияния амигдалина на динамическое поведение комплекса Bcl-2/BAX, каспазы-3 и PARP-1 [ 95 ]. Эти молекулярные мишени могут играть определяющую роль в апоптотических путях и могут рассматриваться как потенциальные терапевтические мишени для лечения рака [ 95 ]. В целом, эти вычислительные наблюдения можно считать хорошим доказательством для опровержения убеждения, что цианогруппа амигдалина, которая является основной группой, ответственной за противораковую активность амигдалина [ 95 ], может быть заменена другим химическим фрагментом с меньшими побочными эффектами [ 96 , 97 ]. Кроме того, результаты вычислений подтвердили, что амигдалин имеет уникальную структуру и может рассматриваться как эталонное соединение для разработчиков лекарственных препаратов с целью разработки новых молекул с аналогичной эффективной противораковой химической структурой, но с меньшими побочными эффектами [ 95 , 96 , 97 ].

5. Выводы

В настоящее время существует несколько линий доказательств in vitro, предполагающих, что амигдалин и его синтетический аналог, лаэтрил, обладают противораковыми свойствами, а предыдущие и предстоящие исследования на животных in vivo, по-видимому, подтверждают их противораковые свойства. Однако существуют определенные возникающие и серьезные проблемы, связанные с их токсичностью из-за их циано-группы, а также их плохой пероральной биодоступности. В этой связи новые технологии в разработке лекарств должны эффективно применяться для минимизации их неблагоприятных побочных эффектов, а также для повышения их пероральной биодоступности. В этой связи медицинские химики должны сосредоточиться на лабораторном синтезе химических аналогов, которые могли бы поддерживать противораковую активность амигдалина, одновременно снижая его неблагоприятные побочные эффекты. Технология наночастиц кажется многообещающей для повышения биодоступности и противораковой активности амигдалина, одновременно снижая его токсические эффекты. Однако в литературе имеется значительный пробел относительно проведения клинических испытаний для изучения его противораковой активности у людей и для обеспечения безопасности амигдалина перед его внедрением в клиническую практику. Сочетание технологии наночастиц с использованием новых и более безопасных синтетических аналогов амигдалина может повысить эффективность этого природного соединения и представить новую терапевтическую стратегию лечения рака.

Вклады авторов

Концептуализация, MS, SS, SKP и CG; методология, MS, SKP, ES и KP; формальный анализ, DK, ES, KP и AG; расследование, MS, SS, SKP и AG; ресурсы, DK, ES, KP и AG; курирование данных, MS, SS, DK, ES и KP; написание — подготовка первоначального черновика, MS, SS, SKP и CG; написание — рецензирование и редактирование, MS, SKP, AG и CG; визуализация, MS, SS, SKP и CG; руководство, SKP и CG; администрирование проекта, SKP и CG Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Данное исследование не получало внешнего финансирования.

Заявление о доступности данных

Данные доступны по запросу у соответствующего автора.

Конфликты интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.