Тэг: Рак

Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии

дихлорацетатом натрия (отчет о клиническом случае)

Акбар Хан 1, Дуглас Эндрюс 1, Аннеке С. Блэкберн 1

• PMID: 27803917

• PMCID: PMC5067498

• DOI: 10.12998/wjcc.v4.i10.336

Аннеке С. Блэкберн, Школа медицинских исследований Джона Кертина, Австралийский национальный университет, Канберра, ACT 2601, Австралия 

Вклад авторов: Хан А. лечил пациента и написал большую часть отчета о случае; Эндрюс Д. лечил пациента, разработал протоколы естественной терапии и был соавтором отчета о случае; Блэкберн А.С. выполнил работу in vitro и in vivo, продемонстрировав эффекты DCA как цитостатического средства, и написал части отчета о случае, посвященные исследованию DCA in vitro и in vivo.

Заявление институционального наблюдательного совета: Неприменимо. 

Заявление об информированном согласии: Пациентка, описанная в данной рукописи, дала согласие на публикацию своего случая анонимно. 

Заявление о конфликте интересов: Один из авторов (Хан) проводит терапию дихлорацетатом для онкологических больных через онкологические центры Medicor Cancer Centres за плату и без получения прибыли. Клиника принадлежит члену семьи этого автора. Другим авторам нечего раскрывать.

Открытый доступ: эта статья является статьей открытого доступа, которая была выбрана внутренним редактором и полностью проверена внешними рецензентами. Она распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), которая позволяет другим распространять, перерабатывать, адаптировать, строить на основе этой работы некоммерческие работы и лицензировать свои производные работы на других условиях, при условии, что оригинальная работа должным образом цитируется и использование является некоммерческим. См.: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Адрес для корреспонденции: Акбар Хан, доктор медицины, медицинский директор, 
Medicor Cancer Centres Inc., 4576 Yonge St., Suite 301, Toronto, 
ON M2N 6N4, Canada. akhan@medicorcancer.com
Телефон: +1-416-2270037
Факс: +1-416-2271915

 Получено:  30 апреля 2016 г.
  Начало рецензирования:  3 мая 2016 г.
  Первое решение:  17 июня 2016 г.
  Исправлено:  23 июля 2016 г.
  Принято:  6 августа 2016 г.
  Статья в печати:  8 августа 2016 г.
  Опубликовано онлайн:  16 октября 2016 г.

Абстрактный

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) исследовался как новая метаболическая терапия для различных видов рака с 2007 года на основе данных Боннета и др. о том, что DCA может вызывать апоптоз клеток рака легких, молочной железы и мозга человека. Ответ на терапию в исследованиях на людях измеряется стандартными критериями оценки ответа для определений солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации.

Однако Блэкберн и др. продемонстрировали, что DCA также может действовать как цитостатический агент in vitro и in vivo, не вызывая апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Представлен случай, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины в течение почти 4 лет без серьезной токсичности. Поскольку естественное течение рака толстой кишки 4 стадии представляет собой неуклонное прогрессирование, приводящее к инвалидности и смерти, этот случай демонстрирует новое применение DCA в качестве цитостатического средства с потенциалом поддержания долгосрочной стабильности рака на поздней стадии.

Ключевые слова: Дихлорацетат; Рак; Толстая кишка; Колоректальный; Цитостатик; Стабилизация; Ингибирование роста; Внутривенный

© Автор(ы) 2016. Опубликовано Baishideng Publishing Group Inc. Все права защищены.

Основной совет: Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) был исследован как новая метаболическая терапия для различных видов рака. Ответ на терапию в исследованиях на людях измеряется стандартными критериями оценки ответа для определений солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации.

Однако DCA может также действовать как цитостатический агент, не вызывая апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Представлен случай, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации опухоли рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины на период почти 4 года без серьезной токсичности.

Хан А., Эндрюс Д., Блэкберн А.К. Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии дихлорацетатом натрия. World J Clin Cases 2016; 4(10): 336-343

Доступно по адресу: URL: http://www.wjgnet.com/2307-8960/full/v4/i10/336.htm  
DOI: http://dx.doi.org/10.12998/wjcc.v4.i10.336

ВВЕДЕНИЕ

Препарат дихлорацетат натрия (DCA) исследовался как новая метаболическая терапия для различных видов рака с 2007 года, когда Боннет и др. [1] опубликовали комбинированное исследование in vitro/in vivo на крысах, демонстрирующее эффективность DCA в лечении рака легких, молочной железы и мозга человека путем ингибирования киназы митохондриальной пируватдегидрогеназы. Stacpoole и др . [2-4] ранее опубликовали несколько исследований с использованием DCA для лечения врожденного лактоацидоза, который состоит из набора наследственных митохондриальных заболеваний [5] .

Эти исследования установили профиль безопасности перорального DCA у людей. Было обнаружено, что DCA является безопасным препаратом, не оказывающим токсического воздействия на сердце, легкие, почки или костный мозг [4] . Наиболее серьезным распространенным побочным эффектом является периферическая невропатия, которая является обратимой [6] . Сообщалось о делирии, который является обратимым после прекращения приема DCA [7] . У небольшого процента пациентов было зарегистрировано бессимптомное и обратимое повышение уровня печеночных ферментов [3] .

Предшествующие работы по врожденному лактатацидозу способствовали быстрому прогрессированию DCA в онкологической клинике. В настоящее время опубликовано четыре отчета о клинических испытаниях рака с использованием DCA, что указывает на растущее признание потенциальной полезности DCA [8-11] . Однако эти испытания, в которых лечили пациентов на поздней стадии, смогли сообщить только о лечении в течение относительно коротких периодов времени.

В первоначальной статье 2007 года Боннета и др . [1] сообщалось, что DCA снижает потенциал митохондриальной мембраны, что приводит к избирательному апоптозу в раковых клетках. Выявленный механизм заключается в ингибировании аэробного гликолиза (эффект Варбурга) и активации митохондриальных калиевых ионных каналов [1] .

Дальнейшие исследования DCA подтвердили противораковую активность при нескольких типах рака, включая рак толстой кишки [12] , предстательной железы [13] , яичников [14] , нейробластому [15] , карциноид легких [16] , шейки матки [17] , эндометрия [18] , холангиокарциному [19] , саркому [20] и Т-клеточную лимфому [21] .

Также были предложены другие противоопухолевые действия DCA. Они включают блокаду ангиогенеза [22] , изменения в экспрессии HIF1-α [23] , изменение регуляторов pH V-АТФазы и MCT1, а также других регуляторов выживания клеток, таких как PUMA, GLUT1, Bcl2 и p53 [24] .

Однако в поисках цитотоксической активности многие отчеты in vitro используют концентрации DCA, которые вряд ли будут достигнуты клинически [25] . В некоторых исследованиях использовались ограниченные концентрации и было обнаружено, что DCA является цитостатическим, а не цитотоксическим, но способным усиливать апоптоз с другими агентами [26-28] .

В отчете об успешном лечении рака молочной железы in vivo с помощью DCA Сан и др . [26] обнаружили, что DCA является цитостатическим средством, ингибирующим пролиферацию без увеличения апоптоза. DCA смог значительно снизить метастатическую нагрузку в легких крыс в высокометастатической модели рака молочной железы in vivo. Это предполагает новую роль DCA как стабилизирующего рак агента, аналогичного антиангиогенной терапии.

Однако, насколько известно авторам, пока не опубликовано никаких данных по человеку, подтверждающих использование DCA для долгосрочного поддержания стабильного заболевания. В результате новаторской публикации Боннета о DCA в начале 2007 года Хан начал клиническое использование DCA для лечения онкологических больных с плохим прогнозом или тех, кто не отреагировал на одобренные методы лечения рака.

Протокол натуральных лекарств был разработан для решения проблемы ограничивающей дозу неврологической токсичности в сотрудничестве с врачом-натуропатом (Эндрюс). Разработанный пероральный режим DCA включал три натуральных лекарства: ацетил L-карнитин [29-31] , R-альфа-липоевую кислоту [32-34] и бенфотиамин [35-37] , для основной цели профилактики невропатии.

Данные наблюдений, собранные у более чем 300 онкологических больных с запущенным заболеванием, показали измеримые преимущества терапии DCA в 60%-70% случаев. Риск нейропатии при включении натуральных нейропротекторов составил примерно 20% при дозировке 20-25 мг/кг в день в течение 2 недель приема/1 неделя перерыва. Обратимое повышение уровня печеночных ферментов было отмечено примерно у 2% в этой группе пациентов (данные клинических наблюдений опубликованы онлайн на www.medicorcancer.com).

Представлен случай пациента, иллюстрирующий цитостатические эффекты перорального лечения DCA, поддерживаемые в течение нескольких лет. У этого пациента был плохой прогноз (медианная выживаемость 9-12 месяцев при колоректальном раке 4 стадии с использованием агрессивной традиционной паллиативной химиотерапии) [38] . Пациента лечил Хан в сотрудничестве с врачом-натуропатом Эндрюсом, который разработал протокол, состоящий из натуральных нейропротекторов.

ОТЧЕТ О ДЕЛЕ

Женщина 57 лет обратилась в клинику автора (Khan) в марте 2012 года в поисках терапии метастатического колоректального рака. Первоначально рак прямой кишки был диагностирован у пациентки в середине 2010 года, когда она обратилась к врачу по поводу нового запора и боли в пояснице. Была предпринята попытка провести колоноскопию, но колоноскоп не удалось провести из-за наличия частично перекрывающей ректальную опухоль. Биопсия подтвердила умеренно дифференцированную колоректальную аденокарциному.

Компьютерная томография (КТ) того времени выявила заболевание 4 стадии с множественными метастазами в печени диаметром до 3 см, возможными мелкими метастазами в легких и кольцевидной карциномой прямой кишки, которую было трудно измерить (края рака было трудно отличить от окружающих тканей при КТ).

Пациенту была проведена петлевая илеостомия для обхода обструкции, а опухоль прямой кишки не была удалена. После операции была проведена химиотерапия, состоящая из 5-фторурацила, иринотекана, лейковорина и бевацизумаба (FOLFIRI + бевацизумаб). Первоначально пациент отреагировал на химиотерапию уменьшением метастазов в печени, уменьшением первичного поражения прямой кишки и уменьшением маркера карциноэмбрионального антигена крови (CEA) с 260,9 нг/мл до химиотерапии до 3,5 нг/мл непосредственно перед началом терапии DCA. Затем реакция на химиотерапию начала выходить на плато. К тому времени, как пациент обратился в клинику автора, химиотерапия вызывала минимальное уменьшение заболевания и по сути просто поддерживала стабильность.

Пациентка ранее была здорова и курила в течение 20 лет. Алкоголь употребляла время от времени. В семейном анамнезе был положительный анамнез рака толстой кишки и рака желудка. Лекарства включали текущую химиотерапию, как описано, клизмы с перекисью водорода, пероральный витамин С, иногда пероральный витамин D, гидроморфон замедленного высвобождения 32 мг два раза в день и гидроморфон короткого действия 2-4 мг перорально по мере необходимости при «прорывной» боли. Аллергий не было.

Функциональное обследование выявило несколько легких язв во рту, связанных с продолжающейся химиотерапией, легкую диарею (ожидаемую при илеостомии) и легкое прерывистое ректальное кровотечение. Была ноющая/жгучая боль в пояснице и крестце интенсивностью до 6 из 10, а также легкая боль в правом плече, усугубленная химиотерапией (по ощущениям, это была отраженная боль, связанная с метастазами в печени).

Поскольку химиотерапия все еще была эффективна, и у пациента не наблюдалось серьезных побочных эффектов, первоначальный подход заключался в поддержке существующей терапии пациента, а не в ее замене. Интегративный план был разработан совместно с врачом-натуропатом (Эндрюс).

План состоял из добавления высокой дозы перорального витамина D в размере 10 000 международных единиц в день, замены перорального витамина C на витамин C 50 г внутривенно (iv) еженедельно и добавления дихлорацетата натрия (DCA) 3000 мг внутривенно (49 мг/кг) еженедельно (производитель: Tokyo Chemical Industry, США). Для снижения риска побочных эффектов DCA были назначены 3 натуральные добавки: альфа-липоевая кислота (рацемическая) 500 мг внутривенно с каждой дозой DCA, пероральная R-альфа-липоевая кислота 150 мг 3 раза в день, пероральный ацетил L-карнитин 500 мг 3 раза в день и пероральный бенфотиамин 80 мг два раза в день.

Инфузии планировались вокруг инфузий химиотерапии (отделенных как минимум на 2 дня от химиотерапии), чтобы избежать любых потенциальных помех или лекарственных взаимодействий. Липоевая кислота не вводилась в дни химиотерапии или в течение 1 дня до или после химиотерапии, поскольку она является мощным антиоксидантом и может снижать эффективность химиотерапии. Интегративная терапия началась в марте 2012 года. Побочных эффектов не было отмечено, поэтому DCA была увеличена до 4000 мг внутривенно (66 мг/кг) в неделю. Единственным побочным эффектом, отмеченным при более высокой дозе DCA, была легкая постинфузионная седация.

Таблица 1 Анализ крови до терапии дихлорацетатом натрия

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

Пероральный метформин был добавлен, чтобы помочь сенсибилизировать рак к химиотерапии, начиная с 500 мг перорально один раз в день с титрованием до 500 мг 3 раза в день [39] . Прегабалин был добавлен, чтобы помочь контролировать невропатическую крестцовую боль (начало с 50 мг в день, титрование до 50 мг 3 раза в день). Побочные эффекты химиотерапии включали тошноту и рвоту (до начала приема метформина), и метформин пропускали в дни, когда пациент чувствовал себя плохо, чтобы предотвратить потенциальную токсичность, если у пациента возникнет обезвоживание.

Были получены стандартные базовые анализы крови, включая полный подсчет клеток, стандартную метаболическую панель, ферменты печени и билирубин (таблица 1). Была доступна базовая КТ, которая была выполнена за 2 месяца до начала интегративной терапии с DCA. 

После 4 месяцев интегративной терапии, как описано, было проведено новое КТ-сканирование (рисунок 1), которое было сообщено как «стабильное и неизмененное», но никаких измерений предоставлено не было. Было отмечено случайное обнаружение желчного камня (также стабильного с предыдущего сканирования). Пациент был расстроен тем, что не было отмечено никакого улучшения, и в отчете КТ не было указано никаких подробных измерений. Была предпринята попытка получить позитронно-эмиссионную томографию, чтобы прояснить живые или некротические опухоли, но государственное финансирование получить не удалось, и пациент отказался платить за сканирование в частном порядке.

После некоторого обсуждения пациент решил продолжить терапию и пройти будущие КТ-сканирования в другой больнице. К сентябрю 2012 года были отмечены усиливающиеся побочные эффекты химиотерапии, включая усталость, тошноту и рвоту. Новое КТ-сканирование показало, что все поражения печени были «либо меньше, либо больше не определялись». Однако наибольшее уменьшение опухоли составило всего 2 мм (маркерное поражение 2,5 см в сегменте печени 4a уменьшилось до 2,3 см). Новых поражений не было выявлено.

Рисунок 1. Абдоминальная компьютерная томография через 4 месяца интегративной терапии дихлорацетатом натрия, 5-фторурацилом и натуральными препаратами.  Показаны три среза с различными измеримыми метастазами печени. A: метастаз печени 23 мм × 33 мм; B: метастаз печени диаметром 15 мм; C: метастаз печени 11,2 мм × 25 мм 
.

Таблица 2 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, январь 2013 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

После обзора КТ пациент решил прекратить всю химиотерапию, а также бевацизумаб и метформин. Введение DCA внутривенно было продолжено, и доза была увеличена до 4500 мг внутривенно в неделю. Тошнота и рвота прекратились. Боль оставалась под контролем.

Новое КТ-сканирование было получено через 3 месяца, которое показало остаточную опухоль прямой кишки со стриктурой и проксимальной фекальной нагрузкой (без изменений), а также «метастазы в печени, без существенных изменений». Пациент сообщил о легком онемении пальцев рук и ног. Было отмечено дальнейшее увеличение бессимптомных повышений печеночных ферментов (таблица 2). Оба эти явления были диагностированы как побочные эффекты DCA. Во время терапии до этого момента CEA показывал легкие колебания, но в целом считался стабильным (рисунок 2).
Терапия DCA была прервана на 3 месяца, чтобы разрешить побочные эффекты DCA.

В это время применялись только натуральные методы лечения (прописанные Эндрюсом). Ацетил L-карнитин, бенфотиамин и альфа-липоевая кислота были продолжены для ускорения восстановления нейропатии DCA. Пероральный куркумин [40] и хонокиол (экстракт магнолии) были добавлены в попытке поддерживать контроль над раком [41] . В период, когда DCA был остановлен, CEA увеличился с 4,1 до 5,1 нг/мл (рисунок 2). Легкая нейропатия DCA разрешилась, и печеночные ферменты начали улучшаться.

К марту 2013 года из-за беспокойства о стоимости инфузионной терапии было решено начать оральную терапию DCA. Новое базовое КТ показало увеличение на 1 мм маркерного поражения сегмента печени 7 и увеличение на 1 мм маркерного аортокавального лимфатического узла, но было сообщено как «стабильный вид толстой кишки» и «стабильные метастазы в печени».

Пероральный DCA был начат в дозе 500 мг (8,2 мг/кг) два раза в день, и нейропротекторные добавки, состоящие из перорального ацетил L-карнитина, бенфотиамина и R-альфа-липоевой кислоты, были продолжены. Добавки давались непрерывно, а DCA давался по циклу 2 недели приема/1 неделя отдыха.

В декабре 2013 года в качестве обезболивающего средства был произведен переход с гидроморфона на метадон по 10 мг 3 раза в день для простоты, улучшения контроля боли и экономии средств.

Пациентка продолжила этот режим с регулярными КТ-сканированиями каждые 3–6 месяцев. Пациентка стала менее приверженной регулярным анализам крови из-за плотного рабочего графика. Она оставалась высокофункциональной (уровень ECOG 1) с легкой хронической нейропатией DCA, которая была контролируемой и не влияла на ее повседневную деятельность.

Была сделана попытка увеличить дозу DCA до 500 мг 3 раза в день, но это привело к значительному бессимптомному повышению уровня печеночных ферментов и усилению невропатии. В результате доза DCA 500 мг два раза в день была возобновлена ​​после кратковременного перерыва в терапии.

Продолжающиеся КТ-сканирования продолжали выявлять стабильное заболевание (рисунок 3), без появления новых очагов. Общий CEA существенно не изменился с начала терапии DCA (CEA 3,5 в начале терапии DCA до CEA 3,7 после почти 4 лет терапии). Общий анализ крови также был благоприятным на отметке 3 года (таблица 3) и после отметки 4 года (таблица 4).

Вкратце, после получения обычной химиотерапии в течение приблизительно 18 месяцев пациентка получала внутривенную терапию DCA с сопутствующей химиотерапией в течение приблизительно 6 месяцев, после чего последовала внутривенная и пероральная терапия DCA без сопутствующей обычной терапии рака в течение почти 4 лет. Во время лечения пероральным DCA у пациентки наблюдалась стабильная болезнь по данным КТ и стабильная болезнь по данным измерения опухолевого маркера CEA. Она также была клинически стабильна без эскалации дозы метадона, сохраняла функцию ECOG уровня 1, стабильную легкую нейропатию DCA, и она смогла успешно вести свой собственный бизнес.

Рисунок 2. График карциноэмбрионального антигена в ходе терапии. РЭА: карциноэмбриональный антиген.Рисунок 3. Абдоминальное компьютерное томографическое сканирование после 3 дополнительных месяцев интегративной терапии (дихлорацетат натрия + 5-фторурацил + натуральные лекарства), за которыми последовали почти 4 года дихлорацетата натрия без какой-либо сопутствующей традиционной терапии рака. Сканирование демонстрирует отсутствие повторного роста рака и отсутствие новых метастазов в печени. Показаны те же срезы, что и на рисунке 1. A: метастаз в печени 11,3 мм × 27,5 мм; B: метастазы не видны; C: метастазы не видны.

Таблица 3 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, май 2015 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

Таблица 4 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, апрель 2016 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.ОБСУЖДЕНИЕ

В данном случае применения DCA-терапии у пациента с раком толстой кишки четвертой стадии по клиническим, биохимическим и рентгенологическим критериям продемонстрирована долгосрочная стабильность заболевания.

Продолжительность стабильности при использовании DCA без другой активной химиотерапии в настоящее время составляет 46 месяцев (почти 4 года), а продолжительность жизни с момента первоначальной диагностики колоректального рака 4 стадии составляет 6 лет.

Согласно обзору статистики рака SEER Национального института рака за 1975-2011 гг., 5-летняя относительная выживаемость женщин с диагнозом рак толстой кишки/прямой кишки IV стадии составила 14,4% (http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/). Хотя нельзя сделать окончательный вывод об эффективности DCA, выживаемость в течение этого периода времени при отсутствии постоянной химиотерапии была бы относительно маловероятной.

Было отмечено, что DCA оказывает цитостатическое, а не цитотоксическое действие на колоректальные и другие раковые клетки, что подтверждает этот клинический вывод [ 23 , 27 , 42-44 ] . На сегодняшний день состояние пациентки остается клинически хорошим, и она продолжает получать терапию DCA.

Помимо поддержания стабильного течения заболевания, этот случай демонстрирует переносимость перорального DCA у онкологического пациента в течение гораздо более длительных периодов времени, чем те, о которых в настоящее время сообщают из опубликованных клинических испытаний у онкологических пациентов. Чу и др. [11] сообщили о 24 пациентах, получавших лечение в течение медианного времени 2 месяца в дозе 6,25 или 12,5 мг/кг два раза в день, на непрерывном пероральном DCA без нейропротекторных добавок.

Они пришли к выводу, что рекомендуемая доза для фазы 2 составляет 6,25 мг/кг два раза в день (12,5 мг/кг в день), при этом необходим тщательный мониторинг невропатии. Данбар и др. [9] рекомендовали 5 мг/кг два раза в день в качестве начальной дозы для большинства пациентов, при этом в их исследовании вводили 4, 8 или 12,5 мг/кг два раза в день непрерывно (медианное время на DCA 34 дня), также без нейропротекторных добавок.

Пациент в этом отчете принимал 500 мг два раза в день, что эквивалентно 8,2 мг/кг два раза в день, 2 недели приема/1 неделя перерыва, но не мог переносить эту дозу три раза в день (всего 25 мг/кг в день). Данбар и др. [9] предполагают, что генотипирование полиморфизмов в GSTZ1, ферменте метаболизма DCA в печени, который инактивируется при продолжающемся использовании DCA [45] , следует учитывать при определении начальной дозы для пациентов.

Однако необходима дальнейшая работа для сбора убедительных данных о генотипах и переносимости дозы. В настоящее время проводится клиническое исследование DCA у пациентов с множественной миеломой, чтобы внести вклад в этот пул данных (Реестр клинических испытаний Австралии и Новой Зеландии #ACTRN12615000226505, http://www.anzctr.org.au).

Необходимы дальнейшие исследования для определения оптимального режима дозировки для максимально переносимого острого или хронического лечения с помощью DCA, а также для определения дозы, необходимой для обеспечения эффективности.

Представленный случай показывает, что DCA имеет большие перспективы в качестве терапии рака. Пациентка получила значительную пользу от своей терапии, с легкими побочными эффектами и без гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичности. Наблюдалась некоторая гепатотоксичность (таблица 2), которая легко купировалась прерыванием терапии DCA с последующей корректировкой дозы.

Сообщалось о легкой обратимой периферической нейротоксичности. Натуральные методы лечения, которые сочетались с DCA (ацетил L-карнитин, альфа-липоевая кислота и бенфотиамин), помогли пациенту уменьшить побочные эффекты, но, как известно, не действуют как методы лечения рака.

На момент написания статьи не проводилось активных клинических испытаний, изучающих использование DCA в качестве цитостатического средства у людей. Поскольку DCA не имеет патента, сбор достаточных средств для поддержки крупномасштабных испытаний на людях является серьезной проблемой. Надеемся, что этот случай, иллюстрирующий преимущества перорального DCA, послужит стимулом для дальнейших клинических исследований.

На основании нашего клинического опыта в сочетании с существующими публикациями можно сделать вывод, что терапия DCA не по назначению является вариантом для пациентов с ограниченными возможностями традиционного лечения, если они понимают и принимают риски и преимущества терапии.

Этот отчет о случае показывает, что даже на поздней стадии заболевания DCA имеет потенциал для продления жизни без ущерба для качества жизни пациента по сравнению с химиотерапией с ее частыми изнурительными побочными эффектами или нарушением физиологических функций. Учитывая его разумную стоимость и умеренную токсичность, DCA заслуживает дальнейшего изучения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентку за ее поддержку и согласие опубликовать ее случай.

КОММЕНТАРИИ 

Характеристика случая
Пациентка 57 лет обратилась с жалобами на запор и боли в пояснице.

Клинический диагноз
У пациента диагностирован рак прямой кишки с частичной обструкцией. 

Лабораторная диагностика.
Повышенный уровень раково-эмбрионального антигена, онкомаркера.

Диагностика с помощью визуализации:
опухоль прямой кишки, обнаруженная при колоноскопии толстой кишки.

Патологический диагноз:
Умеренно дифференцированная колоректальная аденокарцинома. 

Лечение
Петлевая илеостомия с последующей химиотерапией, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, лейковорина и бевацизумаба, затем добавление дихлорацетата натрия (ДХА), затем ДХА без химиотерапии в течение почти 4 лет.

Сопутствующие отчеты
Отчеты компьютерной томографии демонстрируют снижение заболеваемости раком при комбинированной химиотерапии + DCA, а затем стабилизацию заболевания в течение почти 4 лет при DCA и отсутствии химиотерапии.

Объяснение термина 
DCA: Дихлорацетат натрия; RECIST: Критерии оценки ответа на солидные опухоли; ECOG: Восточная кооперативная онкологическая группа; SEER: Наблюдение, эпидемиология и конечные результаты.

Опыт и уроки
DCA не только является проапоптотическим препаратом, но и может действовать как цитостатический агент, и, таким образом, может обеспечить долгосрочную стабилизацию запущенного рака без серьезных побочных эффектов, как показано на примере этого случая рака прямой кишки. 

Рецензируемый
DCA, натриевая соль дихлорацетата, является дешевым химическим соединением, которое показало некоторый явный потенциал в качестве альтернативного лечения рака, которое использовалось в ряде испытаний с людьми, страдающими раком мозга или глиобластомой. Это хорошо написанный отчет о случае, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации опухоли рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины на период более 3 лет, без серьезной токсичности. Этот отчет охватывает то, что он обещает.

Авторы проделали солидную работу по объяснению основ терапии DCA и ее роли в различных типах опухолей. Наряду с добавлением механизмов действия против раковых клеток и терапевтического потенциала DCA, авторы предоставляют хороший ресурс для читателей, которые не знакомы с терапией DCA, но также предоставляют детали.

Амигдалин как перспективный противораковый агент 

Оригинал статьи: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37762572/

Мария Спанудаки 1 2, София Стоумпу 1, Соусана К. Пападопулу 1, Димитра Карафиллаки 3, Эвангелос Соловос 4, Константинос Пападопулос 4, Анастасия Джаннакула 1 5, Константинос Гиагинис 6

 PMCID: PMC10531689

 DOI: 10.3390/ijms241814270

Уровень заболеваемости раком растет, и рак является одной из основных причин смерти во всем мире. Амигдалин, также известный как витамин B17 (и синтетическое соединение лаэтрил), представляет собой цианогенное гликозидное соединение, которое в основном содержится в ядрах и мякоти фруктов. Это соединение предлагалось на протяжении десятилетий как многообещающее природное вещество, которое может оказывать противораковое действие. Это всеобъемлющий обзор, который критически суммирует и анализирует имеющиеся исследования, изучающие противораковое действие амигдалина, подчеркивая его потенциальные противораковые молекулярные механизмы, а также необходимость нетоксичной формулы этого вещества. Глубокие исследования проводились с использованием самых точных научных баз данных, например, PubMed, Cochrane, Embase, Medline, Scopus и Web of Science, с применением эффективных, характерных и релевантных ключевых слов. Существует несколько доказательств, подтверждающих идею о том, что амигдалин может оказывать противораковое действие против рака легких, груди, простаты, колоректального рака, рака шейки матки и желудочно-кишечного тракта. Сообщалось, что амигдалин вызывает апоптоз раковых клеток, подавляя пролиферацию раковых клеток и замедляя метастатическое распространение опухоли. Однако было проведено лишь несколько исследований на животных моделях in vivo, а клинических исследований еще меньше. Текущие данные не могут подтвердить рекомендацию использования пищевых добавок с амигдалином из-за его циано-группы, которая вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Предварительные данные показали, что использование наночастиц может быть многообещающей альтернативой для усиления противоракового действия амигдалина при одновременном снижении его неблагоприятных побочных эффектов. Амигдалин, по-видимому, является многообещающим природным агентом против развития и прогрессирования раковых заболеваний. Однако существует большая потребность в исследованиях на животных in vivo, а также в клинических исследованиях на людях для изучения потенциальной эффективности профилактики и/или лечения амигдалином рака. Более того, амигдалин может быть использован в качестве ведущего соединения путем эффективного применения последних разработок в процессах разработки лекарств.

Ключевые слова: амигдалин; противораковые эффекты; противораковые молекулярные механизмы; апоптоз; рак; пролиферация раковых клеток; открытие лекарств; лаэтрил; наночастицы; пищевые добавки; витамин B17.

Влияние дихлорацетата натрия как отдельного препарата, так и в составе комбинированной терапии на рост и метастазирование опухолей легких

оригинал статьи: https://www.academia.edu/65113034/Impact_of_Sodium_Dichloroacetate_Alone_and_in_Combination_Therapies_on_Lung_Tumor_Growth_and_Metastasis?email_work_card=title

Айя Аль-Азави

1, Шахразада Сулейман

1, Холуд Арафат

1, Джавед Ясин 2

, Абдеррахим Неммар 3,4

и Самир Аттуб 1,4,5,*

• Кафедра фармакологии и терапии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных

Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; 201870001@uaeu.ac.ae (AA-A.); sharazadjeffy@uaeu.ac.ae (SS); kholoud.arafat@uaeu.ac.ae (KA)

• Кафедра медицины, Колледж медицины и медицинских наук, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; yasin@uaeu.ac.ae Кафедра
• физиологии, Колледж медицины и медицинских наук, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; anemmar@uaeu.ac.ae Центр
• медицинских наук имени Заида, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские
• Эмираты Национальный институт здравоохранения и медицинских исследований (INSERM), 75013 Париж,

Франция * Адрес для корреспонденции: samir.attoub@uaeu.ac.ae

Комбинированная терапия легких Рост опухоли и метастазы. Int. J. Молекулярные науки 2021, 22, 12553. https:// doi.org/10.3390/ijms222212553

Получено: 24 октября 2021 г.

Принято: 17 ноября 2021 г.

Опубликовано: 21 ноября 2021 г.

Аннотация: Метаболическое перепрограммирование признано важнейшим признаком нового рака. Сообщалось, что дихлорацетат (DCA), ингибитор киназы пируватдегидрогеназы (PDK), обладает противораковыми эффектами, обращая вспять гликолиз, связанный с опухолью. Это исследование было проведено с целью изучения противоракового потенциала DCA при раке легких как отдельно, так и в сочетании с химиотерапией и таргетной терапией с использованием двух клеточных линий немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), а именно A549 и LNM35.

DCA заметно вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности и роста колоний клеток A549 и LNM35 in vitro. DCA также снижал рост опухолевых ксенотрансплантатов как в хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, так и в моделях голых мышей in vivo. Кроме того, DCA снижал ангиогенную способность эндотелиальных клеток пупочной вены человека in vitro. С другой стороны, DCA не ингибировал клеточную миграцию и инвазию in vitro , а также заболеваемость и рост метастазов подмышечных лимфатических узлов in vivo у голых мышей. Лечение DCA не показало никакой токсичности у куриных эмбрионов и голых мышей. Наконец, мы продемонстрировали, что DCA значительно усиливал противораковый эффект цисплатина в LNM35. Кроме того, сочетание DCA с гефитинибом или эрлотинибом приводит к аддитивным эффектам на ингибирование роста колоний LNM35 после семи дней лечения и к синергетическим эффектам на ингибирование роста колоний A549 после 14 дней лечения. В совокупности это исследование демонстрирует, что DCA является безопасным и перспективным терапевтическим средством для лечения рака легких.

Рак легких является вторым по частоте встречаемости видом рака с самым высоким уровнем смертности в мире, составив 2,2 миллиона случаев и 1,8 миллиона смертей в 2020 году. Прогнозируется, что заболеваемость и смертность продолжат расти примерно на 60%, до предполагаемых 3,6 миллиона и 3 миллионов соответственно в 2040 году [1]. Большинство случаев рака легких — это НМРЛ, на которые приходится 80–85% всех случаев рака легких [2]. Развитие таргетной и иммунотерапии произвело революцию в лечении НМРЛ. Однако побочные эффекты, резистентность и эффективность в небольшой терапевтически чувствительной группе пациентов создают неравенство в доступе к таким агентам [3–5]. Таким образом, это подчеркивает необходимость более безопасных и эффективных агентов. Метаболическое перепрограммирование является одним из признаков рака, который является многообещающей целью для разработки эффективных терапевтических подходов [6]. По сравнению с

Нормальные клетки, которые в основном полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) в аэробных условиях, раковые клетки отклоняются от этого нормального метаболического фенотипа, полагаясь в основном на цитозольный гликолиз и молочную ферментацию, даже в присутствии кислорода, чтобы удовлетворить потребности высокой пролиферации [7]. Это явление известно как эффект Варбурга, который использовался в качестве терапевтической мишени для подавления роста опухоли PDK входит в число основных ферментов, контролирующих гликолиз и OXPHOS [9]. Он отключает митохондриальный OXPHOS, фосфорилируя и ингибируя пируватдегидрогеназу (PDH), ключевой фермент, катализирующий окислительное превращение пирувата в ацетилкофермент А в митохондриях [10]. DCA — это препарат с небольшой молекулярной массой, который использовался при лактоацидозе, врожденных митохондриальных дефектах и диабете [11]. Интересно, что DCA продемонстрировал способность переключать метаболизм опухоли с цитозольного аэробного гликолиза на митохондриальный OXPHOS путем ингибирования PDK и повышения активности PDH [12]. Следовательно, сообщалось, что DCA оказывает противораковое действие за счет увеличения оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, а также повышения уровня ROS с последующей гибелью раковых клеток [11,13 15]. Однако в клинических исследованиях профиль безопасности DCA вызывал беспокойство. Тем не менее, Гарон и др. (2014), которые провели клиническое исследование с DCA на пациентах с раком легких, пришли к выводу, что: «в отсутствие более крупного контролируемого исследования четкие выводы относительно связи между неблагоприятными событиями у пациента и DCA неясны». Они рекомендовали рассматривать DCA с химиотерапией на основе платины при гипоксических опухолях, а не как единственный агент при распространенном немелкоклеточном раке легких [16]. Считается, что DCA является мощной молекулой , которая требует дальнейшего изучения ее противоракового потенциала при НМРЛ. Целью данного исследования было изучение влияния DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ, рост колоний, миграцию и инвазию клеток in vitro, а также на рост опухоли, метастазирование и токсичность in vivo. Кроме того, непосредственное влияние DCA на ангиогенез оценивалось in vitro. Кроме того, мы исследовали влияние DCA в комбинированной терапии с химиотерапией и первым поколением ингибиторов тирозинкиназы EGFR (EGFR-TKi). 2. Результаты 2.1 Влияние DCA на жизнеспособность клеток и рост колоний линий клеток НМРЛ Эффект увеличения концентрации DCA (3,125–100 мМ) был исследован на двух линиях клеток NSCLC, а именно A549 и LNM35. Как показано на рисунке 1, DCA снижал жизнеспособность A549 (рисунок 1A) и LNM35 (рисунок 1B) в зависимости от концентрации и времени. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC50) DCA через 48 ч составляет приблизительно 25 мМ для обеих линий клеток. Для дальнейшей оценки противоракового эффекта DCA было исследовано его влияние на рост предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. Для этого обе клеточные линии выращивали при определенной плотности в течение 1 недели для формирования колоний, а затем обрабатывали возрастающей концентрацией DCA в течение 1 недели. Как показано на рисунке 1, DCA вызывал зависимое от концентрации сокращение числа колоний для обеих клеточных линий, с более высокой чувствительностью, показанной в колониях LNM35 (рисунок 1D,E) по сравнению с колониями A549 (рисунок 1C,E). Эти результаты подтверждают противораковый эффект DCA in vitro

Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие A549 (A) и LNM35 (B)

Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие раковые клетки A549 (A) и LNM35

(B) инкубировали в отсутствие или в присутствии увеличивающихся концентраций DCA (3,125–100 мМ) в течение 24, 48 и 72 ч. Жизнеспособность клеток оценивали, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее трех раз. Формы представляют средние значения, столбцы представляют SEM. Раковые клетки A549 (C) и LNM35 (D) выращивали в течение 7 дней для формирования колоний, которые обрабатывали различными концентрациями DCA (6,25–50 мМ) в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». (E) Репрезентативные фотографии контрольных и обработанных DCA колоний показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Результаты представлены в виде процента колоний (среднее значение ± SEM) обработанных клеток по сравнению с контролем. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.

• Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухоли НМРЛ в курином эмбрионе CAM и голых мышах in vivo

Для подтверждения фармакологической значимости наших результатов in vitro противораковый эффект DCA оценивали in vivo с использованием анализа CAM куриного эмбриона.

Ксенотрансплантированные опухоли A549 и LNM35 на CAM обрабатывали 50 мМ DCA каждые 48 ч в течение 1 На E17 опухоли были извлечены из верхней части CAM и взвешены. Как показано на рисунке 2, 50 мМ

DCA значительно снизили рост ксенотрансплантатов опухоли A549 примерно на 40% (рисунок 2A), в то время как не показали значительного снижения роста ксенотрансплантатов опухоли LNM35 (рисунок 2B). Поэтому 100 мМ DCA были исследованы на ксенотрансплантатах опухоли LNM35, и они значительно снизили рост примерно на 40% (рисунок 2C). Токсичность также оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах. На E17 DCA не показал цитотоксичности, поскольку процент живых эмбрионов был схож с контрольной и обработанной DCA (рисунок 2D–F).

Рисунок 2. Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухолей A549 и LNM35 в CAM куриного эмбриона in vivo. (A)

Масса опухоли раковых клеток A549, ксенотрансплантированных на CAM с плотностью 1 миллион клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ) в течение 1 недели. (B, C) Масса опухоли раковых клеток LNM35, ксенотрансплантированных на CAM с плотностью 0,3 миллиона клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ и 100 мМ). (D) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах A549. (E, F) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах LNM35. Столбцы — средние значения; полосы — SEM *** Значительно отличается при <0,001. **** Значительно отличается при <0,0001. ns — незначимо.

Влияние DCA на опухолевые ксенотрансплантаты также оценивалось in vivo с использованием бестимусных мышей, инокулированных клетками A549 и LNM35. Сообщалось, что средние летальные дозы (LD50) DCA составляли 4,5 г/кг и 5,5 г/кг у крыс и мышей соответственно [17]. Поэтому мыши с опухолевыми ксенотрансплантатами A549 получали перорально ежедневно (5 дней в неделю) 50 мг/кг и 200 мг/кг DCA в течение 38 последовательных дней. Лечение DCA (50 мг/кг) не вызвало значительного уменьшения объема опухолевых ксенотрансплантатов A549, в то время как DCA (200 мг/кг) значительно

уменьшил объем примерно на 45% (рисунок 3A). Аналогичная разница наблюдалась также в весе опух Не было выявлено никаких явных признаков токсичности или каких-либо проявлений нежелательного воздействия DCA на поведение животных, массу тела (рисунок 3C), компоненты крови, функцию

печени и почек (рисунок 3D).

Рисунок 3. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата A549, привитого голым мышам in vivo. (A) Объем опухоли ксенотрансплантата A549, привитого подкожно голым мышам и леченного DCA (50 и 200 мг/кг) перорально или только контрольным раствором- носителем в течение 38 дней. (B) Вес опухоли, полученный от тех же контрольных и обработанных DCA голых мышей. (C) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. (D) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции

печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. * Значительно отличается при <0,05.

** Значимое различие при <0,01. ns — несущественно.

С другой стороны, наблюдался рост ксенотрансплантатов опухоли LNM35, и мыши получали перорально 200 мг/кг и 500 мг/кг DCA каждый день (5 дней в неделю) в течение 10 и 24 дней соответственно. Лечение DCA (200 мг/кг) вызвало незначительное уменьшение объема ксенотрансплантатов опухоли LNM35 (рисунок 4A), в то время как DCA (500 мг/кг) значительно уменьшил объем опухоли почти на 75% (рисунок 4B). Почти такие же различия были замечены в весе опухоли в конце экспериментов (рисунок 4C). Никаких признаков токсичности не наблюдалось в поведении животных или не было обнаружено по весу мышей (рисунок 4D,E), компонентам крови, печени и функции почек (рисунок 4F)

Рисунок 4. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата LNM35, привитого голым мышам in vivo. (A, B) Объем опухоли ксенотрансплантата LNM35, привитого подкожно голым мышам и обработанного соответственно DCA (200 и 500 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем ежедневно в течение 10 и 24 дней. (C) Вес опухоли, полученный от контрольных и голых мышей, получавших DCA в дозе 500 мг/кг. (D, E) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. (F) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение

± SEM для 9–11 мышей/группу. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при

<0,001. ns — статистически незначимо.

• Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур и прорастание HUVEC in vitro

Ангиогенез является одним из признаков рака, который обеспечивает поставку питательных веществ и кислорода для роста и распространения раковых клеток. Влияние DCA на ангиогенез было исследовано in vitro с использованием HUVEC, которые могут образовывать капилляроподобные структуры при засевании

на Матригель. Как показано на рисунке 5A, HUVEC образовали организованные капилляроподобные структуры

структуры в отсутствие DCA, и эта организация была нарушена после добавления DCA.

Длины трубок измеряли вручную (рисунок 5B) и с помощью анализа изображений Wimasis (рисунок 5C), и было обнаружено, что 25 мМ DCA способны значительно ингибировать способность HUVEC формировать нитевидные структуры примерно на 30–40%. Это ингибирование наблюдалось при концентрациях

Рисунок 5. Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур HUVEC in vitro. (A) Формы ангиогенеза , индуцированные в HUVEC, культивируемых на матрице Matrigel в 96-луночном планшете в отсутствие и в присутствии различных концентраций DCA. Для контрастной фотографии использовался инвертированный микроскоп (4×) , а для уточнения изображений использовалось программное обеспечение Wimasis. (B,C) Количественная оценка тубулярного ангиогенеза, индуцированного в клетках HUVEC, культивируемых в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–

25 мМ) вручную и с использованием программного обеспечения Wimasis соответственно. (D) Жизнеспособность клеток HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы», в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ). Эксперименты повторяли не менее 3 раз.

Столбцы представляют средние значения; полосы представляют SEM *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.

В анализе прорастания сфероиды HUVECs были встроены в 3D коллагеновую матрицу в присутствии и отсутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или комбинации VEGF и DCA. Рисунок 6A показывает в репрезентативном эксперименте, что проростки, образованные в

присутствии VEGF, были ингибированы DCA, 25 мМ. Были измерены общие длины проростков, и было обнаружено, что общая длина была значительно увеличена в присутствии VEGF, а

DCA значительно уменьшил длину проростков, индуцированных VEGF (Рисунок 6B). Это ингибирование наблюдалось при концентрации, которая не показала никакого снижения жизнеспособности HUVECs (Рисунок 6C).

Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование ангиогенеза в опухолях может быть потенциальным механизмом, выходящим за рамки противоракового действия DCA.

Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков встроенными сфероидами HUVECs in vitro. (A) Представитель Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков встроенными сфероидами HUVECs in vitro. (A) Представительные изображения предварительно окрашенных

сфероидов HUVEC через 24 часа после встраивания в коллагеновую матрицу в присутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или VEGF + DCA. Использовался инвертированный микроскоп с 20-кратным увеличением. (B) Среднее значение общей длины ростков различных сфероидов для каждого условия из одного представительного эксперимента. (C) Жизнеспособность HUVECs определялась, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты были повторены 2 раза. Столбцы представляют средние значения 12 сфероидов; столбцы представляют SEM **** Значительно отличается при <0,0001. #### Значимое отличие при <0,0001. ns: незначимо.

• Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro

Метастазирование — многоступенчатый процесс, включающий отделение клеток от первичной опухоли, миграцию клеток в соседние ткани с последующей инвазией клеток в кровь или лимфатическую систему до колонизации этих клеток в отдаленных органах. Влияние DCA на метастазирование у мышей, которым ксенотрансплантировали клетки рака легких с высокой степенью метастазирования, а именно LNM35, оценивали путем проверки веса и частоты подмышечных лимфатических узлов в контрольной и обработанной DCA группах. DCA снижает рост метастазов в лимфатических узлах, не достигая статистической значимости (рисунок 7A).

Кроме того, он не влияет на частоту метастазов в лимфатических узлах (рисунок 7B).

Для оценки способности DCA инвазировать и миграцию клеток A549 и LNM35 in vitro использовались анализ инвазии в камере Бойдена и анализ миграции при заживлении ран. Чтобы убедиться, что потенциальное влияние DCA на миграцию и инвазию не обусловлено гибелью клеток, мы использовали более низкие концентрации DCA. В этих условиях 6,25 мМ и

12,5 мМ DCA не смогли ингибировать клеточную инвазию LNM35 (рисунок 7C) и A549 (рисунок 7D). Аналогичным образом, эти концентрации не смогли ингибировать клеточную миграцию обеих клеточных линий (рисунок 7E–H).

1. Обсуждение

Несмотря на недавние достижения в скрининге, диагностике и лечении рака легких, в дополнение к замечательному прогрессу в понимании его молекулярной биологии, рак легких является вторым наиболее часто диагностируемым видом рака с самым высоким уровнем смертности во всем мире в 2020 году [1].

Поэтому прилагаются различные усилия для разработки эффективных агентов и подходов с хорошими запасами безопасности для воздействия на рак легких в попытке обеспечить излечение или улучшить общую выживаемость пациента. Целью данного исследования было изучение влияния метаболического препарата DCA на рост, миграцию, инвазию и ангиогенез рака легких in vitro и рост опухоли и метастазы in vivo, а также влияние целевого метаболизма DCA на цитотоксический эффект одобренной химиотерапии и таргетной терапии в качестве шага к достижению лучшей эффективности и лучшего профиля безопасности.

Настоящее исследование показало, что DCA (3,125–100 мМ) вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности клеток и роста предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. IC50 DCA через 48 ч составлял приблизительно 25 мМ в обеих

клеточных линиях. Наши результаты согласуются с другими отчетами, в которых DCA (10–90 мМ) ингибировал

жизнеспособность клеток линий колоректального рака (КРР), а именно, SW620, LS174t, LoVo и HT-29, в зависимости от концентрации через 48 ч с диапазоном IC50 30–50 мМ в зависимости от типа клеточной линии [18]. Аналогичным образом, DCA (20 мМ) значительно снизил жизнеспособность клеток КРР, а именно, SW480, LoVo и HT-29 через 48 ч, с большим эффектом на плохо дифференцированные клетки SW480 и метастатические клетки LoVo по сравнению с хорошо дифференцированными клетками HT-29 [19]. С другой стороны, более высокая IC50 была зарегистрирована в клетках рака шейки матки, клетках Hela и SiHa [20], в то время как DCA (20 мМ) не смог ингибировать жизнеспособность клеток линии клеток рака молочной железы MCF-7 [21].

Наши данные in vitro были подтверждены путем тестирования влияния DCA на прогрессирование опухоли in vivo с использованием моделей CAM куриного эмбриона и бестимусных мышей. Во-первых, мы продемонстрировали, что значительное снижение роста было достигнуто в A549 и LNM35, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона, при использовании доз DCA 50 мМ и 100 мМ соответственно. Во время написания этой рукописи было опубликовано исследование, в котором изучалось

влияние натрия DCA на линии клеток глиобластомы U87 MG и PBT24, ксенотрансплантированных на CAM куриного Авторы сообщили об изменении роста опухолей U87 MG и PBT24 в ответ на различные концентрации натрия DCA. Сообщалось, что 10 мМ натрия DCA были эффективны в снижении роста опухоли PBT24,

но не роста опухоли U87, что отражает некоторые различия в биологии двух клеточных линий [22]. Во-вторых, мы продемонстрировали, что лечение DCA в дозах 200 мг/кг ежедневно (5 дней в неделю) вызвало значительное снижение роста ксенотрансплантированной опухоли A549 на 40%, в то время как для значительного снижения роста ксенотрансплантированной опухоли LNM35 требовалась более высокая доза DCA (500 мг/кг) . В этом контексте ранее сообщалось, что DCA (100 мг/кг) увеличил время удвоения опухолей A549 и H1975 NSCLC примерно с 3 до 6,5 дней [15], но не оказал значительного ингибирующего эффекта на мышей с опухолью MDA-MB-231 [23]. С другой стороны, значительная задержка роста также наблюдалась в ксенотрансплантатах HT-29, обработанных пероральным DCA (200 мг/кг) ежедневно в течение четырех дней [24].

Исследование токсичности потенциальных противораковых препаратов так же важно, как и исследование их эффективности, поскольку тяжелая токсичность может помешать их использованию в клинике. DCA не показал цитотоксичности для куриных эмбрионов и бестимусных мышей. Процент живых эмбрионов был одинаковым в группах, получавших DCA, и контрольных группах. Кроме того, DCA не повлиял на поведение мышей, вес, общий анализ крови, параметры функции печени и почек по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с предыдущими доклиническими и клиническими отчетами, которые не показали никаких доказательств тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности при лечении DCA [13,14]. Немногие пациенты, получавшие лечение DCA, жаловались на общие желудочно-кишечные эффекты. Кроме того, наиболее распространенным ограничением для введения DCA является обратимая периферическая невропатия, которую можно свести

к минимуму путем снижения дозы или дополнительного введения антиоксидантов [11]. Включение DCA в системы доставки лекарств (СДЛ), такие как наночастицы, является перспективным подходом для сохранения противораковой активности DCA с минимальными побочными эффектами [25–27].

Сообщалось, что противораковый эффект DCA частично обусловлен индукцией апоптоза, как это наблюдалось в клетках колоректального рака [19] и клетках НМРЛ [15] , или ингибированием ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза, такие как антитело к VEGF бевацизумаб и блокатор рецепторов VEGF рамуцирумаб, были клинически одобрены для лечения рака легких [28]. Несмотря на их подтвержденную эффективность, их скромные общие терапевтические эффекты с сопутствующими побочными эффектами подчеркивают очевидную необходимость в более эффективном подходе, нацеленном на ангиогенез [28]. Наше исследование показало, что DCA (25 мМ) является перспективным антиангиогенным средством, поскольку он способен значительно ингибировать образование и прорастание эндотелиальных клеток in vitro. Кроме того, более низкие концентрации DCA (6,25 и 12,5 мМ) не влияли на образование трубок HUVEC. Эти результаты согласуются с отчетом Шунджанса и его коллег, которые продемонстрировали, что 5 мМ и 10 мМ DCA не повлияли на формирование трубок HUVEC in vitro [29]. В соответствии с нашими данными, DCA вызвал снижение плотности микрососудов опухоли у обработанных крыс, у которых также было отмечено подавление HIF1α в опухолевых клетках [30]. С другой стороны, Чжао и его коллеги

Недавно сообщалось, что DCA стимулирует ангиогенез в модели сосудистой деменции у крыс за счет улучшения функции эндотелиальных клеток-предшественников [31].

Примерно у 30–40% пациентов с НМРЛ на момент постановки диагноза наблюдалось метастатическое заболевание . Отдаленные метастазы отрицательно влияют на варианты лечения, ответ и выживаемость

[32] и являются основной причиной смерти от рака легких [33]. Метастазирование — это многоступенчатый процесс, включающий отсоединение раковых клеток, миграцию, инвазию и колонизацию в отдаленных участках. Поэтому терапевтические агенты и схемы, уменьшающие такой отличительный признак рака, имеют большое значение в терапии рака. Несмотря на продемонстрированную антиангиогенную активность DCA, это исследование не показало влияния DCA на метастазирование клеток LNM35, ксенотрансплантированных бестимусным мышам, получавшим перорально эффективную дозу. В этом исследовании клетки LNM35, ксенотрансплантированные путем подкожной инокуляции бестимусным мышам, вызвали 90% случаев метастазов в подмышечных лимфатических узлах, и DCA не смог снизить частоту и рост этих метастазов в лимфатических узлах. Линия клеток LNM35 была создана в 2000 году как первая линия клеток рака легких человека, имеющая лимфогенные метастатические свойства со 100% частотой после подкожной инъекции в боковой бок голых мышей [34]. Кроме того, DCA не показал никаких ингибирующих эффектов на миграционные и инвазивные свойства клеток LNM35 и A549 in vitro. Аналогичным образом сообщалось, что монотерапия DCA не была эффективна в снижении метастазов в легких из метастатических клеток рака молочной железы, ксенотрансплантированных голым мышам [23].

Комбинированная терапия является фундаментальным подходом в лечении рака. Объединение различных противораковых препаратов позволяет воздействовать на различные основные сигнальные пути для усиления терапевтических преимуществ, избегания приобретенной резистентности и снижения тяжести побочных эффектов [35]. Химиотерапия играет неотъемлемую роль в лечении пациентов с НМРЛ. Обычно используется схема с платиной (цисплатин или карбоплатин) плюс паклитаксел, гемцитабин , доцетаксел, винорелбин, иринотекан или пеметрексед [36]. Неселективные характеристики химиотерапевтических агентов приводят к скромному увеличению выживаемости при значительной токсичности для пациента [37]. Это подчеркивает необходимость в более эффективных стратегиях для улучшения результатов лечения пациентов с минимальными побочными эффектами. В настоящем

исследовании DCA не удалось усилить противораковый эффект камптотецина и гемцитабина в обеих линиях клеток Н Кроме того, DCA не смог значительно усилить противораковые эффекты цисплатина в клеточной линии

A549 in vitro, но он усилил цитотоксический эффект цисплатина в клеточной линии LNM35, что отражает роль генетического фона раковых клеток в определении пути гибели клеток, вызванного препаратами. Ким и др. сообщили, что клетки A549 имеют более низкую скорость аэробного гликолиза по сравнению с клетками H460 из-за дифференциальной экспрессии некоторых метаболических ферментов [38]. Аэробный

гликолиз при раке был связан с химиорезистентностью, и ингибирование связанных путей было предложено в качестве механизма преодоления такой резистентности. Например, сверхэкспрессия PDK4 при раке мочевого пузыря высокой степени злокачественности заставляет совместное введение DCA с цисплатином вызывать резкое снижение роста опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [39].

Аналогичным образом, введение DCA с паклитакселом было описано как успешный подход к преодолению резистентных к паклитакселу клеток НМРЛ из-за сверхэкспрессии PDK2 [40]. Кроме того, Галгамува и др. заявили, что предварительное лечение DCA значительно ослабило нефротоксичность, вызванную цисплатином у мышей, сохранив противораковые эффекты цисплатина [41].

Открытие таргетной терапии помогло врачам адаптировать варианты лечения для пациентов с НМРЛ. Было разработано много таргетных препаратов, которые стали частью первой линии лечения НМРЛ, например, гефитиниб и эрлотиниб, которые считаются первым поколением EGFR-TKi [42]. Гефитиниб и эрлотиниб были одобрены более 10 лет назад для лечения пациентов с прогрессирующим мутантным EGFR НМРЛ, не получавших химиотерапию, в качестве первой линии лечения. Они также используются в качестве второй линии терапии после неудачи химиотерапии [43]. Некоторые отчеты показали, что эрлотиниб имеет хорошую эффективность у пациентов с EGFR - диким типом НМРЛ [44]. Поддерживающая доза может принести пользу этим пациентам после химиотерапии на основе платины, которая считается основной терапией при диком типе EGFR НМРЛ [45]. Несмотря на замечательные преимущества, многие пациенты приобрели терапевтическую резистентность через 10–14 месяцев лечения из-за вторичной мутации в гене EGFR [46].

В этом исследовании мы стремились изучить способность DCA сенсибилизировать линии клеток NSCLC дикого типа EGFR при сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. DCA значительно усилил ингибирующий эффект гефитиниба и эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35. Это исследование также показало аддитивные эффекты на рост колоний LNM35 при сочетании DCA с гефитинибом или эрлотинибом в течение семи дней лечения. Более того, эта комбинация оказала синергическое действие на рост колоний A549 после четырнадцати дней лечения. Кроме того, все эти протоколы комбинирования привели к существенному снижению клеточной плотности отдельных колоний как A549, так и LNM35. В этом контексте сообщалось, что DCA с гефитинибом или эрлотинибом синергически подавляет жизнеспособность и способность к образованию колоний мутантных клеток EGFR (NCI-H1975 и NCI-H1650) из-за синергического эффекта в продвижении апоптоза. В клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI- H460) они показали, по сравнению с индивидуальными обработками, что комбинация вызывала повышенное значение фракции, затронутой (Fa), в жизнеспособности клеток, не достигая уровня синергизма в клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460), и эта комбинация не подавляла значительно образование колоний этих линий клеток [47]. Различия в экспериментальных условиях между вышеупомянутым отчетом и нашим исследованием могут объяснить такие переменные результаты. В своем клоногенном анализе исследователи обрабатывали отдельные клетки в течение трех последовательных дней, а затем инкубировали в среде без лекарственных средств в течение 15 дней для формирования колоний; Однако в наших экспериментах клетки сначала инкубировали в течение десяти дней для формирования колоний, а затем подвергали обработке в течение семи и четырнадцати дней.

Подводя итог, можно сказать, что это исследование продемонстрировало, что DCA является перспективным противораковым средством для лечения НМРЛ, подавляя жизнеспособность клеток и рост колоний клеток НМРЛ in vitro , а также рост опухолей у эмбрионов цыплят CAM и голых мышей, в которых также оценивалась безопасность этого средства. DCA подавляет способность эндотелиальных клеток образовывать капилляроподобные структуры и прорастать in vitro, что позволяет предположить ингибирование ангиогенеза как потенциальный механизм противоракового эффекта. Это исследование также выявило потенциальную ценность DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro.

Результаты этого исследования прокладывают путь для подтверждения влияния комбинации DCA с гефитинибом или эрлотинибом на рост опухоли in vivo, в дополнение к исследованию влияния DCA в сочетании с EGFR-TKi второго и третьего поколения.

1. Материалы и методы 4.1.Клеточная культура и реагенты

Клетки NSCLC, A549 и LNM35, поддерживались в среде RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) в увлажненном инкубаторе при температуре 37  C и 5% CO2. Среда была дополнена 1% раствора пенициллина- стрептомицина (Hyclone, Cramlington, UK) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Cramlington, UK). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) поддерживались в полном наборе сред EndoGROTM-VEGF (Merck Millipore, Massachusetts, USA) в увлажненном инкубаторе при температуре 37 C и 5% CO2 в колбах , покрытых 0,2% желатином. Культуральную среду всех клеток меняли каждые 3 дня, а клетки пересевали один раз в неделю, когда культура достигала 95% конфлюэнтности для раковых клеток и 80% для HUVEC.

Натрий DCA, цисплатин, камптотецин, гемцитабин HCl, эрлотиниб HCl и гефитиниб были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). DCA был свежерастворен в воде HyPure (Hyclone, Крамлингтон, Великобритания) перед началом любого эксперимента для приготовления исходного раствора 1 М, который затем был разбавлен до требуемых концентраций для лечения.

4.2. Жизнеспособность

клеток Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночный планшет.

Через 24 часа клетки обрабатывали возрастающей концентрацией DCA (3,125–100 мМ) в двух повторностях в течение 24, 48 и 72 часов, тогда как контрольные клетки обрабатывали лекарственным средством ( вода Hypure), смешанным со средой. В указанные временные точки использовали анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) для определения

влияния DCA на жизнеспособность клеток путем количественной оценки АТФ, которая будет пропорциональна

к числу метаболически активных клеток. Люминесцентный сигнал измеряли с помощью люминометра GloMax® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность клеток представляли в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности клеток, обработанных DCA, с контрольными клетками, жизнеспособность которых предполагалась равной 100%.

Во втором наборе экспериментов клетки обрабатывали в течение 48 ч возрастающей концентрацией гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ). Кроме того, клетки обрабатывали в течение 48 ч комбинацией DCA и других противораковых агентов, а именно цисплатина, камптотецина,

гемцитабина , гефитиниба и эрлотиниба. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo® Анализ люминесцентной жизнеспособности клеток и люминометр GloMax® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность была представлена в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности обработанных лекарством клеток с контрольными клетками.

4.3. Клоногенный анализ

В 6-луночный планшет высевали клетки A549 и LNM35, соответственно, по 50 и 100 клеток на лунку. Клетки выдерживали для роста в колонии в течение 7–10 дней во влажной атмосфере при 37  C и 5% CO2, при этом среду меняли каждые три дня. Образованные колонии обрабатывали каждые 3 дня в течение 7 дней возрастающими концентрациями DCA (6,25–50 мМ). После этого колонии промывали три раза 1× PBS, фиксировали и окрашивали в течение 2 часов 0,5% кристаллическим фиолетовым, растворенным в 50% метаноле (об./об.). Наконец, колонии промывали 1× PBS и фотографировали, и подсчитывали колонии с более чем 50 клетками . Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных DCA, с контрольными колониями. Плотность клеток колоний оценивали путем фотографирования колоний в каждой группе с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа (4×).

Во втором наборе экспериментов сформированные колонии обрабатывались каждые 3 дня в течение 7 или 14 дней комбинацией DCA и гефитиниба или DCA и эрлотиниба. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных препаратом, с контрольными колониями.

4.4 Анализ роста опухоли in ovo

Оплодотворенные яйца леггорнов инкубировали в инкубаторе для яиц, установленном на температуру 37,5  C и влажность 50% в течение первых 3 дней после оплодотворения. На 3-й день эмбрионального развития (E3) САМ был удален путем просверливания небольшого отверстия в яичной скорлупе напротив круглого, широкого конца с последующей аспирацией ~1,5–2 мл альбумина с помощью шприца объемом 5 мл с иглой 18G. Затем в яичной скорлупе над САМ было вырезано небольшое окно с помощью тонких ножниц, которое было заклеено полупроницаемой клейкой пленкой (Suprasorb® F). Яйца снова содержались в инкубаторе до 9-го дня эмбрионального развития (E9), на котором раковые клетки были трипсинизированы, центрифугированы и суспендированы в 80% матрице Matrigel® (Corning, Bedford, UK) для получения 1 × 106 клеток/100 мкл для A549 и 0,3 ×

106 клеток/100 мкл для LNM35. 100 мкл инокулята добавляли на САМ каждого яйца, в общей сложности 10–13 я

На 11-й день эмбрионального развития (E11) образовавшиеся опухоли обрабатывали местно, капая 100 мкл DCA, приготовленного на 0,9% NaCl для первой группы, или лекарственного носителя для контрольной группы. Обработку повторяли на E13 и E15. Все описанные шаги выполняли в асептических условиях.

Наконец, на 17-й день эмбрионального развития (E17) эмбрионы гуманно умерщвляли путем местного добавления 10–30 мкл пентобарбитона натрия (300 мг/мл, Jurox, Окленд, Новая Зеландия). Опухоли осторожно извлекали из нормальных верхних тканей CAM, промывали 1× PBS и взвешивали для определения влияния DCA на рост опухолей. Данные представлены в виде сравнений среднего веса опухолей в контрольной группе и группе, обработанной DCA. Токсичность препарата оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах в конце эксперимента.

Живость эмбрионов определялась путем проверки их произвольных движений, а также целостности и пульсации кровеносных сосудов.

Этот анализ представляет собой рандомизированный открытый анализ, который был проведен в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных в Университете Объединенных Арабских Эмиратов . Согласно Европейской директиве 2010/63/EU о защите животных, используемых

Для проведения научных экспериментов с использованием куриных эмбрионов на E18 и ранее не требуется одобрения со стороны Комитета по уходу и использованию животных (IACUC).

4.5 Анализ роста опухоли и метастазирования

Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, утвержденным

комитетом по этике работы с животными Университета ОАЭ в марте 2019 года (код протокола ERA_2019_5872).

Шести-восьминедельных бестимусных мышей-самцов линии NMRI nude (nu/nu, Charles River,

Германия) содержали в ламинарных шкафах с фильтруемым воздухом и соблюдали асептические условия.

Клетки A549 (5 × 106 клеток/200 мкл PBS) и клетки LNM35 (0,4 × 106 клеток/200 мкл PBS) вводили

подкожно в боковой бок голых мышей. Спустя десять дней, когда опухоли достигли объема приблизительно 50 мм3, животные с ксенотрансплантатами A,549 были случайным образом

разделены на три группы по 9–10 мышей в каждой. Эти группы получали перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 50 мг/кг или 200 мг/кг или лекарственный носитель в течение 38 дней. С другой стороны, животные с ксенотрансплантатами LNM35 получали перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 200 мг/кг или лекарственный носитель в течение 10 дней и DCA 500 мг/кг или лекарственный носитель в течение 24 дней. Размеры опухолей и вес животных проверяли каждые три или четыре дня. Кроме того, физические признаки и поведение проверялись каждый день. Объем опухоли рассчитывался по формуле V = L × W2 ×

0,5, где L представляет собой длину , а W — ширину опухоли. В конце экспериментов животных анестезировали и умерщвляли путем смещения шейных позвонков, а опухоли удаляли и взвешивали. Влияние DCA на рост опухоли было представлено путем сравнения среднего веса опухоли в конце эксперимента между контрольной группой и группой, получавшей DCA. Его также оценивали путем сравнения объема опухоли между контрольной и группой, получавшей DCA, на протяжении всего эксперимента. Образцы крови собирали у каждой мыши и анализировали с помощью счетчика крови животных SCIL VET ABC™ Animal Blood Counter для полного анализа крови. Кроме того, плазму крови отделяли центрифугированием для биохимического анализа. Для изучения влияния DCA на метастазирование подмышечные

лимфатические узлы были вырезаны и взвешены у животных с ксенотрансплантатами LNM35 в конце

• Анализ формирования

сосудистых трубок Матрикс Matrigel® (Corning, Bedford, UK) размораживали и добавляли 40– 50 мкл в лунки 96-луночного планшета для покрытия. Для того чтобы Матригель затвердел, планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37                                                                                    C и 5% CO2 в течение 1 ч. HUVEC

трипсинизировали и высевали на покрытый планшет с плотностью 2,5 × 104 клеток/100 мкл/ лунку в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA. Через 8 ч инкубации сети

трубок в разных лунках фотографировали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Влияние DCA на способность HUVEC формировать капилляроподобные структуры оценивали путем измерения общей длины сформированных трубок в контрольных и обработанных DCA лунках. Общая длина трубок измерялась вручную и с помощью программного обеспечения для онлайн-анализа изображений, разработанного Wimasis (https://www.wimasis.com/ en/products/13/WimTube - дата доступа 1 марта 2019 г.). Влияние различных концентраций DCA

на жизнеспособность HUVEC определялось с помощью анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), как ранее описано в разделе о жизн

• Анализ прорастания сфероидов HUVEC

Сфероиды HUVEC были приготовлены путем первого окрашивания клеток путем инкубации 190 000 клеток с 2 мкМ раствором красителя CellTrackerTM Green CMFDA (Invitrogen Molecular probes, Paisley, UK) в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе, установленном на 37  C и 5% CO2, с последующим центрифугированием в течение 5 мин и удалением супернатанта. Осадок HUVEC был суспендирован в дополненной среде HUVEC (5 мл), смешанной с раствором метоцела (1,25 мл), который должен быть приготовлен ранее [48]. Затем 25 мкл клеточной суспензии пипеткой наносили на крышку чашки Петри. Примерно 50 капель пипеткой наносили в каждую чашку Петри.

Наконец, капли держали перевернутыми в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе, установленном на 37

Образованные сфероиды в каждой чашке (~50 сфероидов) собирали отдельно с 1× PBS и центрифугировали при 150× g в течение 5 мин. Тем временем рабочий раствор коллагена I готовили на льду путем осторожного смешивания исходного коллагена I из хвоста крысы (1500 мкл) (Millipore, MA, США) с 10× средой 199 (150 мкл) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, США) и ледяным стерильным 1N NaOH (34 мкл), который приобрел красный цвет. Каждый сфероидный осадок покрывали слоем раствора метоцела, содержащего 4% FBS (0,25 мл), рабочего раствора коллагена I (0,25 мл) и 60 мкл базальной среды или VEGF 30 нг/мл или DCA 25 мМ или их комбинации.

Сразу после осторожного перемешивания смесь добавляли в предварительно нагретый 24-луночный планшет и инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37  C и 5% CO2 в течение 24 часов, что позволяло полимеризовать коллаген и прорасти сфероидам. Через 24 часа сфероиды были захвачены с помощью инвертированного микроскопа с 20-кратным увеличением. Длина проростков в 12 сфероидах в каждом состоянии была измерена с помощью ImageJ.

• Анализ подвижности при

заживлении ран Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 1 × 106 клеток/лунку в 6-луночный планшет. Через 24 часа с помощью наконечника объемом 200 мкл делали царапину в сливающемся монослое . После этого клетки дважды промывали 1× PBS с последующим добавлением свежей среды с добавлением лекарственного носителя или DCA. В верхней части планшета были отмечены два места для мониторинга уменьшения размера раны с течением времени с использованием инвертированного микроскопа при объективе 4× (Olympus 1X71, Токио, Япония). Планшеты инкубировали во влажной атмосфере при 37  C и 5% CO2 , а ширину раны измеряли через 0, 2, 6 и 24 часа после инкубации.

Расстояние миграции выражалось как среднее значение разницы между измерениями в нулевой момент времени и в периоды времени 2, 6 и 24 часа.

• Анализ камер инвазии в матригеле

Согласно протоколу производителя (Corning, Bedford, MA, USA), в нижние камеры добавляли 0,5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS. После этого раковые клетки высевали с плотностью 1 × 105 клеток/ 0,5 мл в верхние камеры в среде без FBS в присутствии и отсутствии DCA. Планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37  C и 5% CO2 в течение 24 часов. Инвазивные клетки разрушают матригель и проходят через поры вставки размером 8 мкм. Непроникающие клетки верхних камер удаляли, осторожно протирая область ватным тампоном. Затем полупроницаемую мембрану удаляли с помощью очень тонких ножниц.

Инвазивные клетки были обнаружены с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), ранее описанного в разделе жизнеспособности клеток. Влияние DCA на клеточную инвазию было представлено в процентах (%) путем сравнения инвазирующих клеток в присутствии DCA с контролем.

• Статистический анализ

Помимо анализа in ovo и экспериментов на голых мышах, каждый эксперимент проводился не менее трех раз. Данные выражены как среднее значение ± SEM Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 8.3.1 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния,

США). Для оценки разницы между двумя группами использовался непарный t-тест . Для сравнения 3 или более групп с контрольной группой использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Даннетта . Кроме того, для комбинированных экспериментов

использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного*сравнения Тьюки. p

** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001 указывают на значимые различия.

Вклад авторов: Концептуализация, SA; методология, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; валидация, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; формальный анализ, SA и AA-A.; расследование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; курирование данных, SA; написание — подготовка первоначального черновика, SA и AA-A.; написание — рецензирование и редактирование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; визуализация, SA, AA-A. и AN; руководство, SA; администрирование проекта, SA; получение финансирования, SA Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование: Это исследование частично финансировалось за счет гранта Центра медицинских наук имени Зайеда, Университета Объединенных Арабских Эмиратов, № 31R136.

Заявление институционального наблюдательного совета: Исследование на голых мышах проводилось в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации и протоколом, одобренным Комитетом по этике обращения с животными Университета Объединенных Арабских Эмиратов (код протокола ERA_2019_5872).

Заявление об информированном согласии: Неприменимо.

Заявление о доступности данных: Неприменимо.

Благодарности: Авторы выражают благодарность Такаши Такахаши за предоставление клеток LNM35.

Конфликты интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не принимали участия в разработке исследования, в сборе, анализе или интерпретации данных, в написании рукописи или в решении опубликовать результаты.

Оригинал статьи: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25362214/

Новая форма терапии дихлорацетатом для пациентов с запущенными стадиями рака: описание 3 случаев

Абстрактный

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) в настоящее время исследуется как монотерапия и как вспомогательное средство для лечения различных видов рака. Одним из факторов, ограничивающих его клиническое использование в непрерывном пероральном режиме, является дозозависимая, обратимая нейротоксичность, включая периферическую нейропатию и энцефалопатию. Внутривенный (IV) путь имеет ряд потенциальных преимуществ, включая (1) импульсное дозирование для достижения более высоких концентраций, чем это возможно при пероральном применении, (2) более длительный период вымывания для снижения потенциальной нейротоксичности и (3) обход пищеварительной системы, что особенно важно для пациентов с раком на поздней стадии. Были доступны данные о высоких дозах IV DCA (до 100 мг/кг/доза), которые подтвердили его безопасность как у здоровых добровольцев, так и у пациентов в критическом состоянии, что позволило авторам начать нестандартное лечение онкологических больных. У нескольких своих пациентов, получавших IV DCA, авторы наблюдали клинические, гематологические или радиологические ответы. В этой статье представлены 3 случая пациентов с рецидивирующим раком, у которых все традиционные методы лечения оказались неэффективными: (1) 79-летний мужчина с раком толстой кишки и метастазами в печень, (2) 43-летний мужчина с ангиосаркомой и метастазами в поджелудочную железу и кости, и (3) 10-летний мужчина с нейроэндокринной карциномой поджелудочной железы и метастазами в печень. (Altern Ther Health Med. 2014;20(suppl 2):21-28.)

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) — это препарат, который в настоящее время исследуется как монотерапия и дополнительное лечение рака. 1 На момент написания этой статьи в Университете Альберты проходит текущее исследование фазы I перорального DCA для рецидивирующих или метастатических солидных опухолей, а в Стэнфордском университете проводятся 2 испытания перорального DCA для лечения рака головы и шеи.
DCA был широко изучен Стэкпулом 2-5 для лечения врожденного лактоацидоза, который включает группу наследственных митохондриальных заболеваний. Профиль безопасности использования перорального DCA у людей был установлен в ходе этой работы. Было обнаружено, что препарат относительно безопасен, не имеет гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичности. 6 Основная токсичность — неврологическая, в первую очередь периферическая невропатия, и это состояние обратимо . 7 Наблюдался делирий, вызванный DCA, который быстро обращался после отмены препарата. 8 Бессимптомное, но обратимое повышение уровня печеночных ферментов может наблюдаться у небольшого процента пациентов. 9
В январе 2007 года Боннет и др. 10 опубликовали новаторскую работу, в которой продемонстрировали, что DCA эффективен при лечении рака груди, легких и мозга человека in vitro и in vivo (у крыс) с помощью новых метаболических путей, включающих ингибирование киназы пируватдегидрогеназы митохондрий. Исследователи сообщили, что DCA селективно запускает апоптоз в раковых клетках, снижая потенциал митохондриальной мембраны, блокируя аэробный гликолиз (эффект Варбурга) и активируя митохондриальные калиевые каналы. Впоследствии DCA был дополнительно изучен и обнаружен противораковый эффект в отношении многих типов рака, включая рак толстой кишки11, предстательной железы12, яичников13 , нейробластому14 , карциноид легких15 , рак шейки матки16 , эндометрия17, холангиокарциному18 , саркому19 и Т -клеточную лимфому20. Также были предложены другие механизмы действия DCA против раковых клеток . Эти методы включают (1) ингибирование ангиогенеза21, ( 2) изменение экспрессии фактора 1-α, индуцируемого гипоксией (HIF1-α), 21 и (3) изменение регуляторов pH вакуолярного типа H + -АТФазы (V-АТФазы) и монокарбоксилатного транспортера 1 (MCT1) и других регуляторов выживания клеток, таких как p53-активируемый модулятор апоптоза (PUMA), транспортер глюкозы 1 (GLUT1), белок В-клеточной лимфомы 2 (BCL2) и клеточный опухолевый антиген p53 (p53) .20
Однако некоторые исследования дали иные результаты, показав снижение апоптоза в определенных линиях раковых клеток в условиях гипоксии22,23. Также
было показано, что DCA in vitro увеличивает цитотоксичность выбранных соединений платины, что предполагает потенциал для клинического применения при резистентном к платине мелкоклеточном раке легких; саркоме Юинга; и раке яичников24. Другое исследование in vitro обнаружило значительные, синергические, антипролиферативные эффекты при использовании линий клеток рака шейки матки с комбинацией DCA и цисплатина25. Основная часть литературы ясно показывает потенциал для дальнейших исследований и разработок DCA.
Основываясь на оригинальной работе Бонне и др.10 , один из нынешних авторов начал использовать пероральный DCA в 2007 году в качестве лечения не по назначению для онкологических больных, у которых был плохой прогноз или которые не отреагировали на традиционную терапию рака. Было отмечено, что периферическая невропатия26 является основным фактором, ограничивающим клиническую полезность. Этот автор разработал протокол DCA для лечения невропатии в сотрудничестве с другим автором, врачом-натуропатом. Результатом этой работы стал режим перорального приема DCA, который включал натуральные нейропротекторные препараты ацетил-L-карнитин, 27-30 R-α-липоевую кислоту, 31-34 и бенфотиамин. 35-37 Клиническое наблюдение за более чем 300 пациентами с запущенным раком, лечившимися по этому режиму, показало, что 60–70 % продемонстрировали измеримые преимущества от DCA. Приблизительный риск невропатии составил 20 % при дозе DCA 20–25 мг/кг/день, которая была в цикле 2 недели приема/1 неделя перерыва, в сочетании с 3 натуральными добавками.
Внутривенный (IV) путь имеет ряд терапевтических преимуществ, включая (1) более высокие уровни в крови, поскольку импульсное IV дозирование может достигать более высокой концентрации, чем это возможно при пероральном приеме, (2) более длительный период вымывания для снижения потенциальной нейротоксичности и (3) обход пищеварительной системы, что особенно важно для пациентов с поздней стадией рака. Были доступны данные о высокой дозе IV DCA до 100 мг/кг/доза, которые подтвердили ее безопасность как для здоровых добровольцев38, так и для пациентов в критическом состоянии39. Авторы Элиаз и Хан разработали протокол лечения IV-DCA и внедрили его в клиническую практику. У Хана был предыдущий опыт, начиная с 2007 года, с IV DCA, он использовал его для лечения пациентов с полной непроходимостью кишечника. Однако при более раннем использовании IV DCA Ханом, датируемом 2007 годом, не было возможности оценить долгосрочные ответы, поскольку лечение проводилось у пациентов на конечной стадии с прогнозом продолжительности жизни от 4 до 6 недель.
В этой статье представлены 3 случая, иллюстрирующих эффекты лечения IV-DCA. Все пациенты и/или опекуны пациентов дали согласие на публикацию своих случаев. У этих пациентов был очень плохой прогноз и/или они не отреагировали на традиционную терапию. Все пациенты получили существенные преимущества от терапии DCA с минимальными побочными эффектами, без миелосупрессии и без токсичности для органов. Пациенты в этих исследованиях случаев лечились в сотрудничестве с 3 авторами, которые являются врачами-натуропатами. Они разработали индивидуальные протоколы, которые включали натуральные адъюванты, такие как лечение внутривенной аскорбиновой кислотой/витамином C (IVC) и натуральными нейропротекторами.

СЛУЧАЙ 1: РАК ТОЛСТОЙ КИШКИ

Мужчина 79 лет обратился за лечением метастатического рака толстой кишки с первоначальным диагнозом аденокарциномы сигмовидной кишки T3N1M0, которая была умеренно дифференцированной. Сопутствующие заболевания включали анамнез стенокардии, инфаркта миокарда, четырехкратного коронарного шунтирования, гипертонии, гиперхолестеринемии и дивертикулеза. Первоначально его лечили левой гемиколэктомией и колостомией, затем химиотерапией 5-фторурацилом (5-ФУ) и иринотеканом в течение примерно 6 месяцев и последующей отменой колостомии.
Пациент оставался здоровым в течение примерно 3 лет, после чего начал расти раково-эмбриональный антиген (CEA), а компьютерная томография (КТ) показала новые метастазы в печени и легких. Его снова лечили химиотерапией 5-ФУ и иринотеканом в течение 3 циклов, которые были неэффективны и осложнились крайней усталостью и недомоганием. Химиотерапию прекратили, и пациента направили на паллиативную помощь.
Пациент решил пройти натуропатическое лечение в клинике одного автора, начиная с декабря 2010 года. Терапия включала гомеопатические средства и IVC в дозе 75 г два раза в неделю с последующим повышением уровня энергии и набора веса. Лекарствами и добавками в то время были пантопразол, альфузозин, метопролол, рамиприл, симвастатин, амлодипин, клопидогрель, витамин D, комплекс витаминов группы B, ацидофилус и α-липоевая кислота. Пациент продолжал лечение до 2011 года с хорошим контролем симптомов; однако его CEA продолжал расти. КТ в ноябре 2011 года показало обширное, диффузное, метастатическое заболевание печени и многочисленные увеличивающиеся легочные узелки, соответствующие интервальному прогрессированию заболевания. Затем пациент решил пройти пробный курс IV DCA. Базовые анализы крови, включая CEA и ферменты печени, были получены 19 декабря 2011 года. Первая доза 3000 мг (41 мг/кг) IV DCA была введена 22 декабря 2011 года вместе с 50 г IVC. Тест CEA был запланирован на 4 недели позже, но был ошибочно повторен через 1 день после инфузии вместе с измерением ферментов печени. Было отмечено быстрое снижение ферментов печени и CEA. (См. Рисунок 1 и Рисунок 2.)

Рисунок 1. Раково-эмбриональный антиген
На рисунке показано постепенное увеличение раково-эмбрионального антигена (РЭА) во время натуропатического лечения и его резкое снижение после внутривенного введения дихлорацетата натрия (ДХА).Рисунок 2.
Сокращения ферментов печени: АСТ = аспартатаминотрансфераза; АЛТ = аланинаминотрансфераза; ГГТ = γ-глутамилтранспептидаза; АЛКП = щелочная фосфатаза.
На рисунке показано немедленное резкое падение и продолжающееся снижение ферментов печени при введении внутривенного DCA.

Вторая инфузия DCA была сделана через 6 дней в дозе 3500 мг (48 мг/кг) вместе с 35 г IVC. После инфузии пациент отметил новые симптомы: озноб, потливость и усталость. Третья инфузия DCA в дозе 3700 мг (50 мг/кг) и 50 г IVC была сделана через 8 дней после второй дозы, и последующие анализы крови показали дальнейшее улучшение (рисунок 2).
Однако пациент снова отметил кратковременный период усталости и недомогания после инфузии и, вопреки совету врачей, решил прекратить лечение на основании этих побочных эффектов. Новое УЗИ брюшной полости было сделано через 1 месяц после лечения DCA. В отчете говорилось: «Учитывая различия в методах визуализации, внешний вид метастазов печени существенно не изменился по сравнению с предыдущей КТ брюшной полости от 10 ноября 2011 года». Метастазы в легких не оценивались, поскольку респираторные симптомы не были очевидны.

СЛУЧАЙ 2: АНГИОСАРКОМА

43-летний мужчина обратился за лечением метастатической ангиосаркомы правой бедренной кости. У пациента в анамнезе была остеосаркома правой большеберцовой кости, диагностированная в возрасте 27 лет в 1995 году и пролеченная резекцией и реконструкцией опухоли-протеза, за которой последовала химиотерапия доксорубицином и цисплатином. Этот рак считался излеченным.
В возрасте 39 лет в 2007 году он обратился к врачу с болью и отеком над правым коленом. После магнитно-резонансной томографии (МРТ) и биопсии был поставлен диагноз ангиосаркомы. Этот рак считался потенциальной вторичной злокачественной опухолью, вызванной предыдущей химиотерапией. Пациент получил химиотерапию доксорубицином и ифосфамидом, но предполагаемый курс был сокращен из-за инфекции и последующего повреждения почек, вторичного по отношению к лечению антибиотиком ванкомицином. Затем в 2008 году ему провели резекцию опухоли и реконструкцию.
В 2009 году, через год после этой операции, у него развились метастазы в легких, которые были удалены хирургическим путем с помощью резекции клина легкого. Впоследствии развились дальнейшие метастазы в легких, по поводу которых пациент перенес 2 дополнительные резекции легких в период с 2009 по 2011 год. В августе 2011 года был обнаружен метастаз в левом подвздошном крыле, который был вылечен путем иссечения и лучевой терапии. В октябре 2011 года в результате КТ был диагностирован новый метастаз в хвосте поджелудочной железы размером 6,1 × 5,7 см, который был немедленно вылечен лучевой терапией. На КТ также был обнаружен увеличивающийся метастаз в левой верхней доле легкого размером 12 мм.
В ноябре 2011 года пациент обратился за консультацией к одному из авторов, врачу-натуропату. Пациенту было назначено внутривенное введение Viscum album (экстракт омелы) и IVC. Дозы были увеличены до 300 мг вискума белого и 75 г IVC 3 раза в неделю. Он также получал добавки, включая витамин D, модифицированный цитрусовый пектин, пищеварительные ферменты, омега-3 жирные кислоты, биоперин и артемизинин.
В январе 2012 года еще одно КТ-сканирование выявило новые небольшие метастазы в позвоночнике, несмотря на агрессивную натуропатическую терапию. Масса хвоста поджелудочной железы увеличилась до 7,6 × 5,6 см через 2 месяца после лучевой терапии. Было обнаружено несколько новых небольших узелков в легких. Были обнаружены новые литические метастазы в костях, включающие C3, T9, L2 и рукоятку.
На основании прогрессирования заболевания пациент решил начать терапию IV DCA в феврале 2012 года. Исходные результаты анализа крови были значительными для анемии (гемоглобин 101 г/л), легкой почечной недостаточности (мочевина 12,6 ммоль/л и креатинин 195 мкмоль/л) и легкого повышения γ-глутамилтранспептидазы (ГГТ) (77 ЕД/л). Его щелочная фосфатаза (ALKP) была в норме. Перед началом DCA в качестве исходного уровня была проведена МРТ позвоночника.
IV DCA была начата с дозы 3000 мг (47 мг/кг) еженедельно и увеличена в течение 2 недель до 5000 мг (47 мг/кг) дважды в неделю. Побочных эффектов не наблюдалось. Одновременно с началом DCA пациент также получил стереотаксическую радиотерапию позвоночника. После 2 месяцев IV DCA в сочетании с продолжающимся натуропатическим лечением КТ показала стабильность всех метастазов в легких и уменьшение метастаза поджелудочной железы с 7,6 × 5,6 см до 5,9 × 5,2 см. Была обнаружена едва заметная новая область просветления на уровне T12 с небольшим увеличением просветления всех других метастазов в костях. Сканирование костей с технецием в апреле 2012 года не показало соответствующей активности ни в одной из областей просветления, обнаруженных на КТ. Новая МРТ позвоночника подтвердила смешанный ответ, при этом наибольший рост метастазов в костях составил 1–2 мм.
После 4 месяцев терапии IV DCA МРТ продемонстрировала стабильность почти всех метастазов в позвоночнике, 2 из которых были немного больше, без указания измерений. Новых метастазов в позвоночнике отмечено не было. КТ месяц спустя, после 5 месяцев IV DCA, показало, что все легочные узелки стабильны, а масса поджелудочной железы еще больше уменьшилась в размерах с 5,9 × 5,2 см до 4,4 × 4,4 см. Новых интраторакальных или интраабдоминальных метастазов не было. Многие из существующих костных метастазов продемонстрировали небольшое увеличение прозрачности. ALKP оставался нормальным, и не произошло ухудшения количества клеток или функции почек. Хотя он продолжал терапию IV DCA, пациент начал поиск более агрессивных вариантов лечения с целью достижения полной ремиссии. За исключением спинальной стереотаксической радиотерапии, никакая сопутствующая традиционная терапия не проводилась одновременно с IV DCA.
Пациент оставался клинически стабильным до сентября 2012 года, когда он прервал лечение IV DCA после 8 месяцев терапии, чтобы поехать в частную клинику в Германии для низкодозной химиотерапии с общей гипертермией тела и потенцированием инсулина.

СЛУЧАЙ 3: НЕЙРОЭНДОКРИННАЯ КАРЦИНОМА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Десятилетний мальчик с метастатической нейроэндокринной карциномой поджелудочной железы был привезен из Португалии его родителями в клинику одного автора в Канаде для лечения DCA после неэффективности традиционной химиотерапии. Сначала он обратился к своему врачу в Португалии с жалобами на усталость и анорексию. Диагноз был поставлен с помощью УЗИ и биопсии, которые выявили массу поджелудочной железы с метастазами в брюшные лимфатические узлы и обширные метастазы в печень, занимающие всю паренхиму печени. Сцинтиграфия рецепторов соматостатина показала поражение поджелудочной железы с высоким поглощением, но показала низкое поглощение во всех поражениях печени. На основании многопрофильного обсуждения случая с детской онкологической группой в региональном онкологическом центре в Лиссабоне, Португалия, в качестве первичного лечения были выбраны 6 циклов цисплатина и этопозида. КТ после 2 циклов химиотерапии показала уменьшение метастазов и первичной опухоли. К пятому циклу онколог отметил ухудшение ответа на основе новых КТ-сканов и маркеров крови, и у пациента началось клиническое ухудшение с потерей веса, тошнотой и рвотой. Возможность высокодозной химиотерапии и трансплантации печени были исключены командой трансплантологов. Терапия была прекращена после полного лечения цисплатином в дозе 600 мг/м 2 и этопозидом в дозе 1800 мг/м 2 .
Пациент прибыл в Канаду для оценки относительно терапии DCA через 2 месяца. В то время его лекарства включали метоклопрамид, ондансетрон, флуконазол, лоперамид, эзомепразол, налтрексон (4,5 мг) перед сном и парацетамол (ацетаминофен). DCA в дозе 2500 мг внутривенно (74 мг/кг) и октреотид в дозе 100 мкг внутривенно были начаты дважды в неделю в условиях клиники. Октреотид был добавлен с надеждой на усиление действия только против основной опухоли поджелудочной железы; он показал высокое поглощение при предыдущем сканировании рецепторов соматостатина. Терапия была начата в течение 2 недель после последнего КТ-сканирования. Поддерживающее внутривенное лечение проводилось одновременно и состояло из R-α-липоевой кислоты в дозе 250 мг, аминокислот, IVC, кальция, магния, комплекса витаминов B и многокомпонентных минералов без меди. После 2 инфузий IVC был увеличен с 5 до 20 г после того, как безопасность была подтверждена нормальным уровнем сывороточной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD). Октреотид был увеличен до 100 мкг внутривенно ежедневно.
Пациент испытывал временное усиление боли в животе и новую боль в левом плече через 1 день после инфузий. Он также сообщил об увеличении своего уровня энергии. Он продолжал испытывать временное усиление боли после каждой инфузии, которое хорошо купировалось пероральным морфином после прекращения приема налтрексона. Он проходил лечение дважды в неделю в течение 2 недель в условиях офиса. Новые анализы крови после 4 внутривенных процедур показали снижение аланинаминотрансферазы (АЛТ), стабильной аспартатаминотрансферазы (АСТ) и ГГТ, значительное увеличение дегидрогеназы молочной кислоты (ЛДГ) и падение гемоглобина (таблица 1). Затем он был выписан под наблюдение своих врачей в Португалии, которые продолжили внутривенную терапию DCA вместе с поддерживающей внутривенной терапией и внутривенной α-липоевой кислотой без осложнений.

Таблица 1. Нейроэндокринная карцинома поджелудочной железы, сводка анализа крови
Сокращения: ЛДГ = дегидрогеназа молочной кислоты; ГГТ = γ-глутамилтранспептидаза; АСТ = аспартатаминотрансфераза; АЛТ = аланинаминотрансфераза.

КТ после 6 недель терапии показало уменьшение самого крупного метастаза в печени на 2 см (рисунки 3А и 3Б). Второй по величине метастаз также уменьшился почти на 2 см (рисунки 4А и 4Б).

Рисунки 3А и 3Б. Результаты КТ-сканирования самого большого метастаза печени после 6 недель терапии
Рисунок 3А показывает самый большой метастаз до начала терапии с помощью IV DCA. Рисунок 3Б показывает уменьшение этой опухоли на 2 см после терапииРисунки 4А и 4Б. Результаты КТ второго по величине метастаза после 6 недель терапии
Рисунок 4А показывает второй по величине метастаз до начала терапии с помощью внутривенного введения DCA. Рисунок 4Б показывает уменьшение этой опухоли почти на 2 см.

Новое сканирование соматостатина (позитронно-эмиссионная томография с галлием-68), проведенное через неделю после КТ, не выявило «никаких признаков опухолевых поражений с повышенной экспрессией рецепторов соматостатина 2, 3 или 5». На основании этого открытия внутривенный октреотид был прекращен, а терапия DCA была продолжена. Пациент оставался клинически стабильным без каких-либо изменений в терапии в течение еще 3 месяцев. В этот момент он попросил прекратить терапию, поскольку его личной целью было достижение функционального статуса уровня ECOG 0 (полностью активный без ограничений физических возможностей), и эта цель считалась недостижимой.

ОБСУЖДЕНИЕ

Было представлено три случая терапии IV DCA для пациентов с запущенным раком, в которых авторы наблюдали благоприятные клинические, биохимические или радиологические ответы.
Случай 1 иллюстрирует биохимический ответ метастатического рака толстой кишки на IV DCA в сочетании с высокой дозой IVC. Ранее CEA пациента неуклонно повышался при использовании IVC только в течение 10 месяцев. Таким образом, снижение CEA можно отнести к терапии DCA. Поскольку в литературе сообщается о возможности снижения CEA более чем на 50% в течение 10 часов после метастатэктомии печени, 40 большое падение CEA на 1 день после любой другой терапии является правдоподобным, если рак быстро отреагировал, и не должно считаться ошибочным результатом. Более того, быстрое снижение печеночных ферментов согласуется с уменьшением повреждения печени в результате гибели раковых клеток или ингибирования роста.
Ультразвуковое исследование после лечения DCA не показало никаких изменений в размерах опухоли; Однако непосредственно перед началом лечения DCA не было базового сканирования, а сравнительное КТ было выполнено за 2 месяца до начала терапии. Таким образом, нельзя сделать выводов о том, произошло ли уменьшение размера опухоли. В рамках ограничений времени сканирования и сравнения КТ с УЗИ авторы, по крайней мере, наблюдали стабильность опухоли. Нельзя сделать выводов о длительности ответа, поскольку пациент прекратил терапию очень рано. Авторы пришли к выводу, что IV DCA, по-видимому, обладает активностью у людей против аденокарциномы толстой кишки.
Случай 2 иллюстрирует частичный ответ метастатической ангиосаркомы на IV DCA в сочетании с естественной терапией. Несмотря на уже имеющуюся анемию и хроническую почечную недостаточность, эффективное лечение было возможно, поскольку DCA не является миелосупрессивным или нефротоксичным. У этого пациента наблюдалось уменьшение большого метастаза поджелудочной железы, который не реагировал на предыдущую лучевую терапию. Уменьшение размера более чем на 30% соответствует определению частичного ответа в соответствии с Критериями оценки ответа при солидных опухолях (RECIST). Результатом стала стабильность множественных метастазов в легких и почти полная стабильность существующих метастазов в костях. Ответ метастазов в костях можно было бы отнести к сопутствующей стереотаксической спинальной радиотерапии, но ответ других метастазов нельзя. Крошечные новые метастазы в костях появились во время начального 5-месячного курса терапии DCA. Никаких новых интраторакальных или интраабдоминальных метастазов не появилось во время терапии DCA, тогда как метастазы в легких и поджелудочной железе выросли до этой терапии. У пациента не было никаких существенных побочных эффектов, связанных с лечением.
Смешанные ответы можно ожидать из-за гетерогенности опухоли. Другим возможным объяснением усиленного ответа метастазов поджелудочной железы по сравнению с метастазами легких является то, что DCA может быть более эффективным в предварительно облученных опухолях. Этот результат был зарегистрирован ранее. 41 Частичный ответ обнадеживает, учитывая плохой прогноз для пациента, особенно потому, что лечение хорошо переносилось без гематологической, почечной или неврологической токсичности. При более мягкой, нетоксичной терапии частичный ответ может быть полностью приемлемым и от него не нужно отказываться. Авторы пришли к выводу, что IV DCA, по-видимому, обладает активностью у людей против ангиосаркомы.
Случай 3 иллюстрирует уменьшение опухоли с помощью IV DCA в сочетании с высокой дозой IVC. Этот результат классифицируется как стабильное заболевание в соответствии с определением RECIST, поскольку уменьшение опухоли было ниже 30%. Наблюдались минимальные побочные эффекты. На основании сканирования октреотида до и после лечения, уменьшение крупных метастазов печени не может быть отнесено к терапии октреотидом; Ни одно сканирование не показало рецепторов октреотида в метастазах печени. Кроме того, исчезновение рецепторов октреотида из опухоли поджелудочной железы еще больше подчеркивает отсутствие пользы, связанной с терапией октреотидом. Таким образом, ответ можно отнести к введению DCA в сочетании с натуральными лекарствами. Временное обострение боли, связанной с опухолью, иногда отмечается при внутривенном введении DCA и может быть признаком ответа опухоли с последующим воспалением. Внезапное увеличение сывороточного ЛДГ пациента согласуется с этим эффектом. Из-за короткой продолжительности оценки нельзя сделать вывод о длительности ответа. Авторы пришли к выводу, что внутривенный DCA, по-видимому, обладает активностью у людей против нейроэндокринной карциномы поджелудочной железы. Представленные
случаи указывают на то, что внутривенный DCA является многообещающей терапией рака. Все пациенты получили значимую пользу от своей терапии с минимальными субъективными побочными эффектами и без гематологической, почечной или неврологической токсичности, несмотря на позднюю стадию заболевания во всех случаях. Такие методы лечения, как высокодозный IVC, которые сочетались с DCA, были поддерживающими с точки зрения качества жизни и могли иметь синергетический эффект с IV DCA. Однако было ясно, что эти методы лечения сами по себе не объясняли реакции опухоли. Интересно отметить, что все пациенты в этой серии случаев использовали IVC с IV DCA. Считается, что IVC может оказывать противораковое действие посредством иммуномодуляции 42,43 или посредством индукции аутофагии, опосредованной генерацией H 2 O 2 и истощением АТФ. 44-46 Было показано, что IVC действует как адъювант в других методах лечения рака, таких как гемцитабин при карциноме поджелудочной железы. 47-49Таким образом, IVC может играть важную роль в качестве вспомогательного средства к IV DCA при лечении запущенных форм рака.
На момент написания этой статьи 4 активных клинических испытания изучают роль перорального DCA в качестве терапии рака, но ни одно из испытаний в настоящее время не изучает способ введения IV. Из-за непатентованного статуса DCA исследователям сложно собрать средства в масштабах, необходимых для проведения испытаний на людях. Есть надежда, что эти случаи, иллюстрирующие преимущества IV DCA, побудят к более формальным клиническим исследованиям. Необходимы дальнейшие исследования in vitro и in vivo, чтобы помочь определить механизмы действия DCA и особенности типа опухоли и микросреды, которые благоприятно реагируют на этот препарат. Клинические испытания с участием пациентов, у которых уже известно, что опухоли благоприятно реагируют на DCA, необходимы для лучшей оценки преимуществ препарата и оптимизации схемы лечения. DCA показал себя многообещающим в сочетании с некоторыми традиционными химиотерапевтическими средствами, преимущество, которое также следует изучить подробнее.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании литературы и клинического опыта авторов, не по назначению IV DCA является многообещающим вариантом лечения для пациентов, которые полностью понимают и принимают его риски и преимущества, особенно тех, у кого нет доступных традиционных вариантов лечения. Эти исследования случаев показывают, что DCA имеет потенциал для продления жизни без снижения качества жизни пациентов с изнурительными побочными эффектами или ухудшением физиологических функций, даже при заболевании на очень поздней стадии. В представленных случаях терапия IV DCA была ограниченной продолжительности, что затрудняет оценку степени преимущества для выживания. Однако, основываясь на опыте авторов хронического использования перорального DCA, причем самым долгоживущим на данный момент является 48-летний мужчина с глиобластомой, который был стабилен в течение 6 лет при пероральном DCA без традиционной терапии, авторы полагают, что препарат обладает потенциалом для долгосрочной стабилизации и/или регрессии, а также существенного повышения выживаемости. Учитывая его доступность и низкую токсичность, DCA заслуживает дальнейшего изучения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентов за их поддержку и согласие на публикацию их случаев.

ЗАЯВЛЕНИЕ АВТОРА О РАСКРЫТИИ

В своих клиниках авторы применяли индивидуальные, интегративные, дополнительные протоколы к пациентам с раком за плату, включающую стоимость одного или нескольких лекарств, перечисленных в этой публикации. Клиники принадлежат авторам и/или членам их семей. Авторы не получали никаких других грантов или финансовой поддержки для этого исследования.

ССЫЛКИ

1 1. Результаты поиска «Дихлорацетатный рак». Веб-сайт ClinicalTrials.gov. http:// clinicaltrials.gov/ct2/results?term=dichloroacetate+cancer. Доступ 22 июля 2014 г.
2 Stacpoole PW, Harman EM, Curry SH, Baumgartner TG, Misbin RI. Лечение лактоацидоза дихлорацетатом. N Engl J Med. 1983;309(7):390-396.
3 Stacpoole PW, Lorenz AC, Thomas RG, Harman EM. Дихлорацетат в лечении лактоацидоза. Ann Intern Med. 1988;108(1):58-63.
4 Stacpoole PW, Wright EC, Baumgartner TG и др. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения лактоацидоза у взрослых: группа по изучению дихлорацетата и лактоацидоза. N Engl J Med. 1992;327(22):1564-1569.
5 Stacpoole PW, Kurtz TL, Han Z, Langaee T. Роль дихлорацетата в лечении генетических митохондриальных заболеваний. Adv Drug Deliv Rev. 2008;60(13- 14):1478-1487.
6 Stacpoole PW, Kerr DS, Barnes C и др. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактоацидоза у детей. Pediatrics. 2006;117(5):1519-1531.
7 Kaufmann P, Engelstad K, Wei Y и др. Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование. Neurology. 2006;66(3):324-330.
8 Brandsma D, Dorlo TP, Haanen JH, Beijnen JH, Boogerd W. Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом. J Neurol. 2010;257(12):2099-2100.
9 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE и др. Оценка долгосрочного лечения детей с врожденным лактоацидозом с помощью дихлорацетата. Pediatrics. 2008;121(5):e1223-e1228.
10 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J и др. Ось митохондриального-K+ канала подавляется при раке, и ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака. Cancer Cell. 2007;11(1):37-51.
11 Madhok BM, Yeluri S, Perry SL, Hughes TA, Jayne DG. Дихлорацетат индуцирует апоптоз и остановку клеточного цикла в клетках колоректального рака. Br J Cancer. 2010;102(12):1746-1752.
12 Cao W, Yacoub S, Shiverick KT и др. Дихлорацетат (DCA) сенсибилизирует как дикие, так и сверхэкспрессирующие Bcl-2 клетки рака предстательной железы in vitro к облучению. Prostate. 2008;68(11):1223-1231.
13 Saed GM, Fletcher NM, Jiang ZL, Abu-Soud HM, Diamond MP. Дихлорацетат индуцирует апоптоз эпителиальных клеток рака яичников посредством механизма, включающего модуляцию окислительного стресса. Reprod Sci. 2011;18(12):1253-1261.
14 Vella S, Conti M, Tasso R, Cancedda R, Pagano A. Дихлорацетат ингибирует рост нейробластомы, специфически действуя против злокачественных недифференцированных клеток. Int J Cancer. 2012;130(7):1484-1493.
15Fiebiger W, Olszewski U, Ulsperger E, Geissler K, Hamilton G. In vitro цитотоксичность новых препаратов на основе платины и дихлорацетата против линий клеток карциноида легких. Clin Transl Oncol. 2011;13(1):43-49.
16 Liu D, Liu S, Jing X, Li X, Li W, Huang Y. Некроз карциномы шейки матки дихлорацетатом, выделяемым из электропряденых полилактидных матов. Biomaterials. 2012;33(17):4362-4369.
17 Wong JY, Huggins GS, Debidda M, Munshi NC, De Vivo I. Дихлорацетат индуцирует апоптоз в клетках рака эндометрия. Gynecol Oncol. 2008;109(3):394-402.
18 Ishiguro T, Ishiguro R, Ishiguro M, Iwai S. Co-treatment of dichloroacetate, omeprazole and tamoxifen displayed synergistically antiproliferative effect on malignant tumors: in vivo experimentals and a case report. Гепатогастроэнтерология. 2012;59(116):994-996.
19 Sorokina LV, Pyatchanina TV, Didenko GV, Kaplia AA, Khyzhnyak SV. Влияние дихлорацетата натрия на окислительные процессы при саркоме 37. Exp Oncol. 2011;33(4):216-221.
20 Kumar A, Kant S, Singh SM. Новые молекулярные механизмы противоопухолевого действия дихлорацетата против Т-клеточной лимфомы: влияние измененного метаболизма глюкозы, гомеостаза pH и регуляции выживания клеток. Chem Biol Interact. 2012;199(1):29-37.
21 Sutendra G, Dromparis P, Kinnaird A и др. Активация митохондрий путем ингибирования PDKII подавляет сигнализацию HIF1a и ангиогенез при раке. Oncogene. 2013;32(13):1638-1650.
22 Shahrzad S, Lacombe K, Adamcic U, Minhas K, Coomber BL. Дихлорацетат натрия (DCA) снижает апоптоз при гипоксии колоректальных опухолей. Cancer Lett. 2010;297(1):75-83.
23 Anderson KM, Jajeh J, Guinan P, Rubenstein M. In vitro эффекты дихлорацетата и CO2 на гипоксические клетки HeLa. Anticancer Res. 2009;29(11):4579-4588.
24 Olszewski U, Poulsen TT, Ulsperger E, Poulsen HS, Geissler K, Hamilton G. In vitro цитотоксичность комбинаций дихлорацетата с противораковыми соединениями платины. Clin Pharmacol. 2010;2:177-183.
25 Xie J, Wang BS, Yu DH и др. Дихлорацетат переключает метаболизм с гликолиза на окисление глюкозы и проявляет синергическое ингибирование роста с цисплатином в клетках HeLa. Int J Oncol. 2011;38(2):409-417.
26 Данные наблюдений за лечением DCA онкологическим центром Medicor. Веб-сайт онкологических центров Medicor. http://medicorcancer.com/dca_therapy/dca-therapy-datajuly-2009/. Обновлено 1 июля 2009 г. Доступ 22 июля 2014 г.
27 Де Грандис Д. Ацетил-L-карнитин для лечения периферической нейропатии, вызванной химиотерапией: краткий обзор. Препараты для лечения ЦНС. 2007;21(suppl 1):39-43.
28Maestri A, De Pasquale Ceratti A, Cundari S, Zanna C, Cortesi E, Crino L. Пилотное исследование эффекта ацетил-L-карнитина при периферической нейропатии, вызванной паклитакселом и цисплатином. Tumori. 2005;91(2):135-138.
29 Evans JD, Jacobs TF, Evans EW. Роль ацетил-L-карнитина в лечении диабетической периферической нейропатии. Ann Pharmacother. 2008;42(11):1686-1691.
30 Di Cesare Mannelli L, Ghelardini C, Toscano A, Pacini A, Bartolini A. Защитный агент от нейропатии ацетил-L-карнитин активирует протеинкиназу C-гамма и MAPK в модели нейропатической боли у крыс. Neuroscience. 2010;165(4):1345-1352.
31 Mijnhout GS, Kollen BJ, Alkhalaf A, Kleefstra N, Bilo HJ. Альфа-липоевая кислота при симптоматической периферической нейропатии у пациентов с диабетом: метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. Int J Endocrinol. 2012;2012:456279.
32 Vallianou N, Evangelopoulos A, Koutalas P. Альфа-липоевая кислота и диабетическая нейропатия. Rev Diabet Stud. 2009;6(4):230-236.
33 Liu F, Zhang Y, Yang M и др. Лечебный эффект альфа-липоевой кислоты на периферическую нейропатию при диабете 2 типа: клиническое исследование [на китайском языке]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2007;87(38):2706-2709.
34 Ziegler D, Hanefeld M, Ruhnau KJ и др. Лечение симптоматической диабетической периферической нейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой: 3-недельное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN). Diabetologia. 1995;38(12):1425-1433.
35 Winkler G, Kempler P. Патомеханизм диабетической нейропатии: предпосылки патогенез-ориентированной терапии [на венгерском языке]. Orv Hetil. 2010;151(24):971-981.
36 Ang CD, Alviar MJ, Dans AL и др. Витамин B для лечения периферической нейропатии. Cochrane Database Syst Rev. 2008;(3):CD004573.
37 Winkler G, Pal B, Nagybeganyi E, Ory I, Porochnavec M, Kempler P. Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии. Arzneimittelforschung. 1999;49(3):220-224.
38 Savasi I, Evans MK, Heigenhauser GJ, Spriet LL. Метаболизм скелетных мышц не зависит от инфузии DCA и гипероксии после начала интенсивных аэробных упражнений. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002;283(1):E108-E115.
39 Shangraw RE, Lohan-Mannion D, Hayes A, Moriarty RM, Fu R, Robinson ST. Дихлорацетат стабилизирует интраоперационный кислотно-щелочной баланс во время трансплантации печени. Liver Transpl. 2008;14(7):989-998.
40. Lokich J, Ellenberg S, Gerson B, Knox WE, Zamcheck N. Очищение плазмы от карциноэмбрионального антигена после гепатоцеллюлярной метастатэктомии. J Clin Oncol. 1984;2(5):462-465.
41Khan A. Использование перорального дихлорацетата для облегчения боли в ноге, возникающей при метастатической низкодифференцированной карциноме: отчет о случае. J Palliat Med. 2011;14(8):973-977.
42 См. D, Mason S, Roshan R. Повышение фактора некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и функции естественных клеток-киллеров (NK) с использованием интегративного подхода при поздних стадиях рака. Immunol Invest. 2002;31(2):137-153.
43 Mikirova N, Casciari J, Rogers A, Taylor P. Влияние высоких доз внутривенного витамина C на воспаление у онкологических пациентов. J Transl Med. Сентябрь 2012;10:189.
44 Chen P, Yu J, Chalmers B, et al. Фармакологический аскорбат вызывает цитотоксичность в клетках рака простаты через истощение АТФ и индукцию аутофагии. Противораковые препараты. 2012;23(4):437-444.
45 Чен П., Стоун Дж., Салливан Г., Дриско Дж. А., Чен К. Противораковый эффект фармакологического аскорбата и его взаимодействие с дополнительным парентеральным глутатионом в доклинических моделях рака. Free Radic Biol Med. 2011;51(3):681-687.
46 Дойбзер Б., Майер Ф., Кучи З. и др. Цитотоксичность фармакологических концентраций аскорбата, опосредованная H(2)O(2), по отношению к клеткам нейробластомы: потенциальная роль лактата и ферритина. Cell Physiol Biochem. 2010;25(6):767-774.
47 Welsh JL, Wagner BA, van't Erve TJ и др. Фармакологический аскорбат с гемцитабином для контроля метастатического и лимфоположительного рака поджелудочной железы (PACMAN): результаты клинического исследования фазы I. Cancer Chemother Pharmacol. 2013;71(3):765-775.
48 Monti DA, Mitchell E, Bazzan AJ и др. Фаза I оценки внутривенной аскорбиновой кислоты в сочетании с гемцитабином и эрлотинибом у пациентов с метастатическим раком поджелудочной железы. PloS One. 2012;7(1):e29794.
49 Cullen JJ, Spitz DR, Buettner GR. Комментарий к «Фармакологический аскорбат синергизирует с гемцитабином в доклинических моделях рака поджелудочной железы», т. е. все, что мы говорим, это дать шанс C. Свободные радикалы Биол. Мед. 2011;50(12):1726-1727.

Определение цитотоксического эффекта амигдалина в клеточной линии DLD-1 и антицитотоксического эффекта в клеточной линии CCD-18CO

 Год 2022 , Том: 44 Выпуск: 4, 377 - 383, 31.12.2022

Альпаслан Озтюрк  , Айбюке Афра Кескинер , Берна Коджаман , Эдже Авулоглу Йылмаз

https://doi.org/10.7197/cmj.1185366

Абстрактный

Цель: Амигдалин, который является частью ароматической цианогенной гликозидной группы, содержится в семенах растений, таких как абрикос, персик, слива, яблоко, груша и вишня. Было показано, что амигдалин обладает противоопухолевыми свойствами против многих видов рака, таких как рак толстой кишки, молочной железы и легких. Целью данного исследования было определение цитотоксического и антицитотоксического действия амигдалина на клетки рака толстой кишки человека (DLD-1) и нормальный эпителий толстой кишки (CCD-18Co) с использованием теста MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-YL)-2,5-дифенилтетразолий бромид).
Материалы и методы: Клетки DLD-1 и CCD-18Co выращивали в колбах, содержащих Roswell Park Memorial Institute-1640 и минимальную необходимую среду Игла соответственно. Обе группы клеток обрабатывали концентрациями амигдалина 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 и 1,56 мМ в течение 24 часов. Затем в лунки аспирированных планшетов добавляли 20% красителя МТТ и инкубировали в течение 3 часов. После остановки реакции чистым диметилсульфоксидом (ДМСО) в конце периода значения поглощения планшетов считывали спектрофотометрически при длине волны 570 нм.
Результаты: значения процента жизнеспособности для линии клеток DLD-1 были обнаружены в диапазоне 48,3–71,6%, а значение IC50 было рассчитано как 74,03 мМ. Значения жизнеспособности для линии клеток CCD-18Co после обработки амигдалином варьировались от 101,6 до 117,9%.
Заключение: В то время как амигдалин показал цитотоксический эффект в клеточной линии DLD-1, он показал антицитотоксический эффект в клеточной линии CCD-18Co. В нашем исследовании было установлено, что амигдалин снизил жизнеспособность раковых клеток DLD-1 дозозависимым образом и не показал цитотоксического эффекта на нормальные эпителиальные клетки CCD18-Co. Необходимы более комплексные контролируемые клинические испытания, чтобы продемонстрировать возможность использования амигдалина в сочетании с другими противоопухолевыми препаратами и разработать искусственный синтез активных ингредиентов в амигдалине с целью повышения противоопухолевой активности этих препаратов.

Ключевые слова

Амигдалин, Лечение рака, Культура клеток, Рак толстой кишки, Витамин В17, Амигдалин, Лечение рака, Клеточная культура, Рак толстой кишки, Витамин B17

Ссылки

• 1. Herbst MC. Ассоциация по борьбе с раком Южной Африки (CANSA). Информационный бюллетень о десяти основных видах рака в каждой группе населения. 2015 г. https://www.compcom.co.za/wp-content/uploads/2020/03/Fact-Sheet-on-Cancer-of-an-Unknown-Primary-CUP.pdf.
• 2. Африн С., Джампьери Ф., Гаспаррини М., Форбс-Эрнандес Т.Й., Варела-Лопес А. и др. Химиопрофилактические и терапевтические эффекты съедобных ягод: фокус на профилактике и лечении рака толстой кишки. Molecules. 2016; 21(169):1 – 41.
• 3. Хаксли Р.Р., Ансари-Могаддам А., Клифтон П., Чернихов С., Парр К.Л. и др. Влияние факторов риска, связанных с питанием и образом жизни, на риск колоректального рака: количественный обзор эпидемиологических данных. Int J Cancer. 2009;125(1):171 – 80.
• 4. Котеча Р., Таками А., Эспиноза Дж. Л. Фитохимические вещества в рационе и химиопрофилактика рака: обзор клинических данных. Oncotarget 2016; 7(32):52517–29. Doi: 10.18632/oncotarget.9593.
• 5. Ван Дж., Цзян Й. Ф. Природные соединения как противораковые агенты: экспериментальные данные. World J Exp Med 2012; 2(3):45–57.
• 6. Аббуд ММ, Аль Авайда В, Альхатиб ХХ, Абу-Айяд А.Н. Противоопухолевое действие амигдалина на клетки рака молочной железы человека путем селективной сенсибилизации к окислительному стрессу. Nutr Cancer. 2019;71(3):483-490. doi: 10.1080/01635581.2018.1508731.
• 7. Сириша Д., Редди Б.С., Реджинальд БА, Самата М., Камал Ф. Влияние амигдалина на линию клеток рака полости рта: исследование in vitro. J Oral Maxillofac Pathol. 2019; 23(1): 104–107.
• 8. Santos Pimenta LP, Schilthuizen M, Verpoorte R, Choi YH. Количественный анализ амигдалина и пруназина в Prunus serotina Ehrh. с использованием (1) спектроскопии ЯМР-Н. Phytochem Anal 2014; 25:122–126. https://doi.org/10.1002/pca.2476.
• 9. Owa C, Messina ME, Halaby R, Halaby R. Триптолид индуцирует лизосомально-опосредованную запрограммированную клеточную смерть в клетках рака груди MCF-7. Int J Womens Health 2013; 5:557–569. doi.org/10.2147/IJWH.S44074.
• 10. Ши Дж., Чэнь Цюй, Сюй М., Ся Цюй, Чжэн Т. и др. Последние обновления и будущие перспективы относительно амигдалина как потенциального противоракового средства: обзор. Cancer Medicine 2019; 8(6), 3004-3011.
• 11. Lea MA, Koch MR. Влияние цианата, тиоцианата и амигдалина на поглощение метаболитов в нормальных и опухолевых тканях крыс. J Natl Cancer Inst. 1979;63(5):1279‐1283.
• 12. Шаки Ф., Сабери-Хасанабади П. Фармакологическая активность и токсикологические эффекты амигдалина: обзор. Фармацевтические и биомедицинские исследования 2022; 8(1), 1-12.
• 13. Сюй С, Сун З. Расширенные исследования противоопухолевых эффектов амигдалина. J Cancer Res Ther 2014; 1:3-7. doi.org/10.4103/0973-1482.139743.
• 14. Keydar I, Chen L, Karby S, Weiss FR, Delarea J, et al. Создание и характеристика линии клеток происхождения человеческой карциномы молочной железы. Eur J Cancer 1979; 15, 659–670.
• 15. Chang HK, Shin MS, Yang HY, Lee JW, Kim YS и др. Амигдалин индуцирует апоптоз посредством регуляции экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака простаты человека DU145 и LNCaP. Biol Pharm Bull 2006; 8: 1597–1602.
• 16. Пак Х.Дж., Юн Ш.Х., Хан Л.С., Чжэн Л.Т., Юнг К.Х. и др.: Амигдалин ингибирует гены, связанные с клеточным циклом в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4. World J Gastroenterol 2005; 11: 5156–5161.
• 17. El-Kholy WB, Abdel-Rahman SA, Abd El-Hady El-Safti FEN, Issa NM. Влияние витамина B17 на экспериментально вызванный рак толстой кишки у взрослых самцов белых крыс. Folia Morphol (Warsz) 2021; 80(1): 158–169 DOI: 10.5603/FM.a2020.0021.
• 18. Cassiem W, Kock M. Антипролиферативное действие экстрактов абрикосовых и персиковых косточек на клетки рака толстой кишки человека in vitro. BMC Complement Altern Med. 2019; 19(1): 32. doi: 10.1186/s12906-019-2437-4.
• 19. Димитров М., Илиев И., Бардаров К., Георгиева Д., Тодорова Т. Фитохимическая характеристика и биологическая активность экстракта абрикосовых косточек в тестах на основе дрожжевых клеток и клеточных линиях гепатоцеллюлярной и колоректальной карциномы. J Ethnopharmacol. 2021 28 октября; 279:114333. https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.114333.
• 20. Макаревич Дж., Рутц Дж., Юнгель Э., Каульфусс С., Цаур И. и др.: Амигдалин влияет на адгезию и инвазию клеток рака мочевого пузыря in vitro. PLoS One 2014; 9: e110244.
• 21. Квон ХЙ, Хонг СП, Хан ДХ и Ким ДЖХ: Индукция апоптоза экстракта семени персика в клетках промиелоцитарного лейкоза человека (HL-60). Arch Pharm Res 2003; 26: 157–161.
• 22. Qian L, Xie B, Wang Y, Qian J. Амигдалин-опосредованное ингибирование инвазии клеток немелкоклеточного рака легких in vitro. Int J Clin Exp Pathol 2015; 8:5363–5370
• 23. Кадир М., Фатима К. Обзор фармакологической активности амигдалина. Arch Cancer Res 2017; 5: 10–12.
• 24. Jucaa M, Bandeira B, Carvalho D, Leal AT. Сравнительное исследование 1,2-диметилгидразина и азоксиметана по индукции колоректального рака у крыс. J Coloproctol. 2014; 34(3): 167–173. doi: 10.1016/j.jcol.2014.06.003.
• 25. Chari KY, Polu PR, Shenoy RR. Оценка экстракта семян тыквы при раке толстой кишки, вызванном 1,2-диметилгидразином у крыс Wistar. J Toxicol. 2018; 6086490, doi: 10.1155/2018/6086490.
• 26. Chen Y, Ma J, Wang F, Hu J, Cui A и др. Амигдалин индуцирует апоптоз в клетках линии HeLa рака шейки матки человека. Immunopharmacol Immunotoxicol 2013; 35(1): 43–51. doi: 10.3109/08923973.2012.738688.
• 27. Newmark J, Brady RO, Grimley PM, Gal AE, Waller SG и др. Амигдалин (Laetrile) и пруназин бетаглюкозидазы: распределение в безмикробных крысах и в опухолевой ткани человека. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 6513-6516.

Показать меньше ссылок

Влияние дихлорацетата натрия как отдельного препарата, так и в составе комбинированной терапии на рост и метастазирование опухолей легких

Кафедра фармакологии и терапии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты2Медицинский факультет, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты3Кафедра физиологии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты4Центр медицинских наук имени Зайеда, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты5Национальный институт здоровья и медицинских исследований (INSERM), 75013 Париж, Франция*Автор, которому следует адресовать корреспонденцию.

Международный журнал молекулярных наук 2021 , 22 (22), 12553; https://doi.org/10.3390/ijms222212553Получено: 24 октября 2021 г. / Пересмотрено: 14 ноября 2021 г. / Принято: 17 ноября 2021 г. / Опубликовано: 21 ноября 2021 г.(Эта статья относится к разделу Биохимия )

Абстрактный

Метаболическое перепрограммирование было признано важнейшим признаком нового рака. Сообщалось, что дихлорацетат (DCA), ингибитор пируватдегидрогеназной киназы (PDK), обладает противораковыми эффектами, обращая вспять гликолиз, связанный с опухолью. Это исследование было проведено для изучения противоракового потенциала DCA при раке легких отдельно и в сочетании с химио- и таргетной терапией с использованием двух линий клеток немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), а именно A549 и LNM35. DCA заметно вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности и роста колоний клеток A549 и LNM35 in vitro. DCA также снижал рост опухолевых ксенотрансплантатов как в хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, так и в моделях голых мышей in vivo. Кроме того, DCA снижал ангиогенную способность эндотелиальных клеток пупочной вены человека in vitro. С другой стороны, DCA не ингибировал in vitro клеточную миграцию и инвазию, а также in vivo заболеваемость и рост метастазов подмышечных лимфатических узлов у голых мышей. Лечение DCA не показало никакой токсичности у куриных эмбрионов и голых мышей. Наконец, мы продемонстрировали, что DCA значительно усилил противораковый эффект цисплатина в LNM35. Кроме того, сочетание DCA с гефитинибом или эрлотинибом приводит к аддитивным эффектам на ингибирование роста колоний LNM35 после семи дней лечения и к синергетическим эффектам на ингибирование роста колоний A549 после 14 дней лечения. В совокупности это исследование демонстрирует, что DCA является безопасным и перспективным терапевтическим средством для лечения рака легких.Ключевые слова:рак легких ; дихлорацетат ; ингибитор киназы пируватдегидрогеназы ; рост опухоли ; ангиогенез ; гефитиниб ; эрлотиниб

1. Введение

Рак легких является вторым по частоте встречаемости видом рака с самым высоким уровнем смертности в мире, составив 2,2 миллиона случаев и 1,8 миллиона смертей в 2020 году. Прогнозируется, что заболеваемость и смертность продолжат расти примерно на 60%, до предполагаемых 3,6 миллиона и 3 миллионов соответственно в 2040 году [ 1 ]. Большинство случаев рака легких — это НМРЛ, на которые приходится 80–85% всех случаев рака легких [ 2 ]. Развитие таргетной и иммунотерапии произвело революцию в лечении НМРЛ. Однако побочные эффекты, резистентность и эффективность в небольшой терапевтически чувствительной группе пациентов создают неравенство в доступе к таким агентам [ 3 , 4 , 5 ]. Таким образом, это подчеркивает необходимость в более безопасных и эффективных агентах.Метаболическое перепрограммирование является одним из отличительных признаков рака, который является многообещающей целью для разработки эффективных терапевтических подходов [ 6 ]. По сравнению с нормальными клетками, которые в основном полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) в аэробных условиях, раковые клетки отклоняются от этого нормального метаболического фенотипа, полагаясь в основном на цитозольный гликолиз и молочнокислое брожение, даже в присутствии кислорода, чтобы удовлетворить потребности высокой пролиферации [ 7 ]. Это явление известно как эффект Варбурга, который использовался в качестве терапевтической цели для ингибирования роста опухоли [ 8 ]. PDK является одним из основных ферментов, контролирующих гликолиз и OXPHOS [ 9 ]. Он отключает митохондриальный OXPHOS путем фосфорилирования и ингибирования пируватдегидрогеназы (PDH), ключевого фермента, катализирующего окислительное превращение пирувата в ацетилкофермент А в митохондриях [ 10 ].DCA — это препарат с небольшой молекулярной массой, который использовался при лактоацидозе, врожденных митохондриальных дефектах и ​​диабете [ 11 ]. Интересно, что DCA продемонстрировал способность переключать метаболизм опухоли с цитозольного аэробного гликолиза на митохондриальный OXPHOS путем ингибирования PDK и повышения активности PDH [ 12 ]. Таким образом, сообщалось, что DCA оказывает противораковое действие за счет увеличения оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, а также повышения уровня ROS с последующей гибелью раковых клеток [ 11 , 13 , 14 , 15 ]. Однако в клинических исследованиях профиль безопасности DCA вызывал беспокойство. 

2. Результаты

2.1 Влияние DCA на жизнеспособность клеток и рост колоний линий клеток НМРЛ

Эффект увеличения концентрации DCA (3,125–100 мМ) был исследован на двух линиях клеток NSCLC, а именно, A549 и LNM35. Как показано на рисунке 1 , DCA снижал жизнеспособность A549 ( рисунок 1 A) и LNM35 ( рисунок 1 B) в зависимости от концентрации и времени. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC 50 ) DCA через 48 ч составляет приблизительно 25 мМ для обеих линий клеток.Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие раковые клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) инкубировали в отсутствие или в присутствии увеличивающихся концентраций DCA (3,125–100 мМ) в течение 24, 48 и 72 ч. Жизнеспособность клеток оценивали, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее трех раз. Формы представляют средние значения, столбцы представляют SEM. Раковые клетки A549 ( C ) и LNM35 ( D ) выращивали в течение 7 дней для формирования колоний, которые обрабатывали различными концентрациями DCA (6,25–50 мМ) в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E ) Репрезентативные фотографии контрольных и обработанных DCA колоний показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Результаты представлены в виде процента колоний (среднее значение ± SEM) обработанных клеток по сравнению с контролем. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Для дальнейшей оценки противоракового эффекта DCA было исследовано его влияние на рост предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. Для этого обе клеточные линии выращивали при определенной плотности в течение 1 недели для формирования колоний, а затем обрабатывали возрастающей концентрацией DCA в течение 1 недели. Как показано на рисунке 1 , DCA вызывал зависимое от концентрации сокращение числа колоний для обеих клеточных линий, с более высокой чувствительностью, показанной в колониях LNM35 ( рисунок 1 D,E) по сравнению с колониями A549 ( рисунок 1 C,E). Эти результаты подтверждают противораковый эффект DCA in vitro.

2.2 Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухоли НМРЛ в курином эмбрионе CAM и голых мышах in vivo

Для подтверждения фармакологической значимости наших результатов in vitro противораковый эффект DCA оценивали in vivo с использованием анализа CAM на курином эмбрионе. Ксенотрансплантированные опухоли A549 и LNM35 на CAM обрабатывали 50 мМ DCA каждые 48 ч в течение 1 недели. На E17 опухоли извлекали из верхней части CAM и взвешивали. Как показано на рисунке 2 , 50 мМ DCA значительно снизили рост ксенотрансплантатов опухоли A549 примерно на 40% ( рисунок 2 A), в то время как не показали значительного снижения роста ксенотрансплантатов опухоли LNM35 ( рисунок 2 B). Поэтому 100 мМ DCA исследовали на ксенотрансплантатах опухоли LNM35, и это значительно снизило рост примерно на 40% ( рисунок 2 C). Токсичность также оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах. На E17 DCA не проявил цитотоксичности, поскольку процент живых эмбрионов был аналогичен контрольной группе и группе DCA ( рисунок 2 D–F).Рисунок 2. Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухолей A549 и LNM35 в CAM куриного эмбриона in vivo. ( A ) Масса опухоли раковых клеток A549, ксенотрансплантированных на CAM при плотности 1 миллион клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ) в течение 1 недели. ( B , C ) Масса опухоли раковых клеток LNM35, ксенотрансплантированных на CAM при плотности 0,3 миллиона клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ и 100 мМ). ( D ) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах A549. ( E , F ) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах LNM35. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Влияние DCA на опухолевые ксенотрансплантаты также оценивалось in vivo с использованием бестимусных мышей, инокулированных клетками A549 и LNM35. Сообщалось, что средние летальные дозы (LD50) DCA составляли 4,5 г/кг и 5,5 г/кг у крыс и мышей соответственно [ 17 ]. Поэтому мыши с опухолевыми ксенотрансплантатами A549 получали перорально ежедневно (5 дней в неделю) 50 мг/кг и 200 мг/кг DCA в течение 38 последовательных дней. Лечение DCA (50 мг/кг) не вызвало значительного уменьшения объема опухолевых ксенотрансплантатов A549, в то время как DCA (200 мг/кг) значительно уменьшил объем примерно на 45% ( Рисунок 3 A). Аналогичная разница также наблюдалась в весе опухоли в конце эксперимента ( Рисунок 3 B). Не было выявлено никаких явных признаков токсичности или каких-либо проявлений нежелательного воздействия DCA на поведение животных, массу тела ( рисунок 3 C), компоненты крови, функцию печени и почек ( рисунок 3 D).Рисунок 3. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата A549, инокулированного голым мышам in vivo. ( A ) Объем опухоли ксенотрансплантата A549, инокулированного подкожно голым мышам и леченного DCA (50 и 200 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем в течение 38 дней. ( B ) Вес опухоли, полученный от тех же контрольных и обработанных DCA голых мышей. ( C ) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. ( D ) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. * Значительно отличается при <0,05. ** Значительно отличается при <0,01. ns — незначимо.С другой стороны, наблюдался рост ксенотрансплантатов опухоли LNM35, и мышам вводили перорально 200 мг/кг и 500 мг/кг DCA каждый день (5 дней в неделю) в течение 10 и 24 дней соответственно. Лечение DCA (200 мг/кг) вызвало незначительное уменьшение объема ксенотрансплантатов опухоли LNM35 ( Рисунок 4 A), в то время как DCA (500 мг/кг) значительно уменьшило объем опухоли почти на 75% ( Рисунок 4 B). Почти такие же различия наблюдались в весе опухоли в конце экспериментов ( Рисунок 4 C). Никаких признаков токсичности не наблюдалось в поведении животных или не было обнаружено по весу мышей ( Рисунок 4 D,E), компонентам крови, печени и функции почек ( Рисунок 4 F).Рисунок 4. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата LNM35, инокулированного голым мышам in vivo. ( A , B ) Объем опухоли ксенотрансплантата LNM35, инокулированного подкожно голым мышам и леченного, соответственно, DCA (200 и 500 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем ежедневно в течение 10 и 24 дней. ( C ) Вес опухоли, полученный от контрольных и голых мышей, получавших 500 мг/кг DCA. ( D , E ) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. ( F ) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–11 мышей/группу. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. ns — недостоверно.

2.3 Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур и прорастание HUVEC in vitro

Ангиогенез является одним из признаков рака, который обеспечивает поставку питательных веществ и кислорода для роста и распространения раковых клеток. Влияние DCA на ангиогенез было исследовано in vitro с использованием HUVEC, которые могут образовывать капилляроподобные структуры при посеве на Матригель. Как показано на рисунке 5 A, HUVEC образовывали организованные капилляроподобные структуры в отсутствие DCA, и эта организация была нарушена после добавления DCA. Длины трубок измеряли вручную ( рисунок 5 B) и с помощью анализа изображений Wimasis ( рисунок 5 C), и было обнаружено, что 25 мМ DCA были способны значительно ингибировать способность HUVEC образовывать нитевидные структуры почти на 30–40%. Это ингибирование наблюдалось при концентрациях, которые не показывали никакого снижения жизнеспособности HUVEC ( рисунок 5 D).Рисунок 5. Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур HUVEC in vitro. ( A ) Формы ангиогенеза, индуцированного в HUVEC, культивируемых на матрице Matrigel в 96-луночном планшете в отсутствие и в присутствии различных концентраций DCA. Для контрастной фотографии использовался инвертированный микроскоп (4×), а для уточнения изображений использовалось программное обеспечение Wimasis. ( B , C ) Количественная оценка канальцевого ангиогенеза, индуцированного в клетках HUVEC, культивируемых в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ) вручную и с помощью программного обеспечения Wimasis соответственно. ( D ) Жизнеспособность клеток HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы», в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ). Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Столбцы представляют средние значения; полосы представляют SEM *** Значительно отличается при <0,001. **** Значимое отличие при <0,0001. ns — незначимо.В анализе прорастания сфероиды HUVECs были встроены в 3D коллагеновую матрицу в присутствии и отсутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или комбинации VEGF и DCA. Рисунок 6A показывает в репрезентативном эксперименте, что проростки, образованные в присутствии VEGF, были ингибированы DCA, 25 мМ. Были измерены общие длины проростков, и было обнаружено, что общая длина была значительно увеличена в присутствии VEGF, а DCA значительно уменьшил длину проростков, индуцированных VEGF ( Рисунок 6B ). Это ингибирование наблюдалось при концентрации, которая не показывала никакого снижения жизнеспособности HUVECs ( Рисунок 6C ).Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков внедренными сфероидами HUVEC in vitro. ( A ) Представительные изображения предварительно окрашенных сфероидов HUVEC через 24 часа внедрения в коллагеновую матрицу в присутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или VEGF + DCA. Использовался инвертированный микроскоп с 20-кратным увеличением. ( B ) Среднее значение общей длины ростков различных сфероидов для каждого условия из одного представительного эксперимента. ( C ) Жизнеспособность HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты были повторены 2 раза. Столбцы представляют средние значения 12 сфероидов; полосы представляют SEM **** Значительно отличается при <0,0001. #### Значительно отличается при <0,0001. ns: незначимо.Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование ангиогенеза в опухолях может быть потенциальным механизмом, выходящим за рамки противоракового действия DCA.

2.4 Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro

Метастазирование — многоступенчатый процесс, включающий отделение клеток от первичной опухоли, миграцию клеток в соседние ткани с последующей инвазией клеток в кровь или лимфатическую систему до колонизации этих клеток в отдаленных органах. Влияние DCA на метастазирование у мышей, которым ксенотрансплантировали клетки рака легких с высокой степенью метастазирования, а именно LNM35, оценивали путем проверки веса и частоты подмышечных лимфатических узлов в контрольной и обработанной DCA группах. DCA снижает рост метастазов в лимфатических узлах, не достигая статистической значимости ( рисунок 7 A). Кроме того, он не влияет на частоту метастазов в лимфатических узлах ( рисунок 7 B).Рисунок 7. Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro. ( A ) Вес подмышечных лимфатических узлов с метастазами LNM35 в контрольной группе и группе, получавшей DCA (500 мг/кг перорально). ( B ) Процент мышей с метастазами в лимфатических узлах LNM35 в контрольной группе и группе, получавшей DCA. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. Используя анализ в камере инвазии Бойдена, клетки LNM35 ( C ) и A549 ( D ) инкубировали в течение 24 ч в отсутствие и в присутствии DCA (6,25, 12,5 мМ). Клетки, которые проникли в Матригель и пересекли поры 8 мкм, определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». Царапины были нанесены на сливающиеся монослои клеток LNM35 ( E ) и A549 ( F ), культивируемых в 6-луночном планшете в отсутствие и в присутствии DCA (6,25, 12,5 мМ). Инвертированный микроскоп с 4-кратным увеличением использовался для измерения среднего расстояния, на которое клетки мигрировали от края соскобленной области в течение 2, 6 и 24 ч. Фотографии индуцированных царапин на сливающихся монослоях клеток LNM35 ( G ) и клеток A549 ( H ) в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA через 0, 2, 6 и 24 ч. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы или формы являются средними значениями; столбцы являются SEM * Значительно отличается при <0,05. ** Значительно отличается при <0,01. ns — незначимо.Для оценки способности DCA инвазии и миграции клеток A549 и LNM35 in vitro использовались анализ инвазии в камере Бойдена и анализ миграции при заживлении ран. Чтобы убедиться, что потенциальное влияние DCA на миграцию и инвазию не обусловлено гибелью клеток, мы использовали более низкие концентрации DCA. В этих условиях 6,25 мМ и 12,5 мМ DCA не смогли ингибировать клеточную инвазию LNM35 ( Рисунок 7 C) и A549 ( Рисунок 7 D). Аналогично, эти концентрации не смогли ингибировать клеточную миграцию обеих клеточных линий ( Рисунок 7 E–H).

2.6 Влияние DCA в сочетании с EGFR-TKi на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний

Влияние 48-часовой инкубации с увеличивающимися концентрациями гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ) было исследовано на раковых клетках A549 и LNM35. Гефитиниб вызывал зависимое от концентрации снижение жизнеспособности раковых клеток A549 и LNM35 ( Рисунок 9 A,B); аналогично, эрлотиниб показал ту же картину снижения в двух клеточных линиях ( Рисунок 9 C,D). Количество 20 мкМ гефитиниба и эрлотиниба обладает способностью в обеих клеточных линиях ингибировать клеточную жизнеспособность A549 и LNM35 примерно на 40%, и эта концентрация использовалась в комбинированных экспериментах с DCA.Рисунок 9. Влияние EGFR-Tki на жизнеспособность клеток НМРЛ. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A , C ) и LNM35 ( B , D ) обрабатывали лекарственным носителем, гефитинибом или эрлотинибом (5–80 мкМ) в течение 48 ч. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Столбцы — средние значения; полосы — SEM * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Обработка клеток в течение 48 ч 25 мМ DCA значительно усилила эффект гефитиниба на жизнеспособность клеток A549 ( Рисунок 10 A) и LNM35 ( Рисунок 10 B). Затем был проведен клоногенный анализ для оценки эффекта комбинации на рост предварительно сформированных колоний обеих клеточных линий после семи дней обработки. Концентрация 20 мкМ гефитиниба вызвала 20–40%-ное снижение количества колоний A549 ( Рисунок 10 C) и LNM35 ( Рисунок 10 D). По сравнению с индивидуальными обработками, комбинация DCA с гефитинибом приводит к значительному снижению количества колоний обеих клеточных линий ( Рисунок 10 C, D), вызывая аддитивный эффект в LNM35 по сравнению с расчетным аддитивным значением отдельных обработок (86% против 90%). Кроме того, эта комбинация показывает значительное снижение плотности клеток отдельных колоний обеих клеточных линий ( рисунок 10 E,F).Рисунок 10. Влияние DCA в сочетании с гефитинибом на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) обрабатывали, соответственно, DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo. ( C , D ) Обработка предварительно сформированных колоний клеток A549 и LNM35, соответственно, DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E , F ) Репрезентативные изображения колоний для контрольной и обработанной групп показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Аналогично, DCA усиливает ингибирующее действие эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35 ( Рисунок 11 A, B). Количество колоний A549 и LNM35 было значительно снижено при применении эрлотиниба на 30–40% ( Рисунок 11 C, D), и это снижение было усилено DCA в LNM35 ( Рисунок 11 D), но не в A549 ( Рисунок 11 C). Комбинация вызвала аддитивные эффекты в LNM35, уменьшив количество колоний на 76 ± 2,8%, что статистически незначимо по сравнению с расчетным аддитивным значением отдельных обработок (91 ± 5,8%). Несмотря на незначительное снижение количества колоний A549 при использовании комбинации по сравнению с обработкой одним препаратом, плотность клеток каждой колонии была значительно снижена по сравнению с отдельными обработками ( Рисунок 11 E). Аналогичным образом, плотность клеток колоний LNM35 была снижена в группе, получавшей комбинированную терапию ( рисунок 11 F).Рисунок 11. Влияние DCA в сочетании с эрлотинибом на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) обрабатывали, соответственно, DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo. ( C , D ) Обработка предварительно сформированных колоний клеток A549 и LNM35, соответственно, DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E , F ) Репрезентативные изображения колоний для контрольной и обработанной групп показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Для изучения различий между двумя клеточными линиями в воздействии комбинированной терапии на рост колоний была исследована более длительная продолжительность лечения DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом на рост колоний A549. Как показано на рисунке 12 , комбинация DCA с гефитинибом приводит к значительному сокращению числа колоний ( рисунок 12 A,B). Эта комбинация вызвала большее ингибирование числа колоний по сравнению с рассчитанными аддитивными эффектами препаратов, используемых по отдельности ( рисунок 12 C). Аналогичное наблюдение было отмечено при комбинации DCA и эрлотиниба ( рисунок 12 D–F). В заключение следует отметить, что увеличение продолжительности лечения с семи до четырнадцати дней приводит к синергетическим эффектам предлагаемых комбинированных протоколов.Рисунок 12. Влияние более длительного лечения DCA в сочетании с гефитинибом и эрлотинибом на рост колоний A549. Обработка предварительно сформированных колоний A549 DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ ( A , B ) и DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ ( D , E ) в течение 14 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( C , F ) Влияние комбинаций DCA и гефитиниба или эрлотиниба на рост колоний по сравнению с рассчитанными аддитивными эффектами двух препаратов по отдельности. Все эксперименты были повторены 3 раза. Столбцы представляют собой средние значения; полосы представляют собой SEM ** Значительно отличается при <0,01. *** Значительно отличается при <0,001. **** Значительно отличается при <0,0001.

3. Обсуждение

Несмотря на недавние достижения в скрининге, диагностике и лечении рака легких, в дополнение к замечательному прогрессу в понимании его молекулярной биологии, рак легких является вторым наиболее часто диагностируемым видом рака с самым высоким уровнем смертности во всем мире в 2020 году [ 1 ]. Поэтому прилагаются различные усилия для разработки эффективных агентов и подходов с хорошими пределами безопасности для воздействия на рак легких в попытке обеспечить излечение или улучшить общую выживаемость пациента. Целью данного исследования было изучение влияния метаболического препарата DCA на рост, миграцию, инвазию и ангиогенез рака легких in vitro и рост опухоли и метастазы in vivo, а также влияние целевого метаболизма DCA на цитотоксический эффект одобренной химиотерапии и таргетной терапии в качестве шага к достижению лучшей эффективности и лучшего профиля безопасности.Настоящее исследование показало, что DCA (3,125–100 мМ) вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности клеток и роста предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. IC50 DCA через 48 ч составлял приблизительно 25 мМ в обеих клеточных линиях. Наши результаты согласуются с другими отчетами, в которых DCA (10–90 мМ) подавлял жизнеспособность клеток линий колоректального рака (КРР), а именно SW620, LS174t, LoVo и HT-29, в зависимости от концентрации через 48 ч с диапазоном IC50 30–50 мМ в соответствии с типом клеточной линии [ 18 ]. Аналогично, DCA (20 мМ) значительно снизил жизнеспособность клеток CRC, а именно SW480, LoVo и HT-29 через 48 ч, с большим эффектом на слабодифференцированные клетки SW480 и метастатические клетки LoVo по сравнению с хорошо дифференцированными клетками HT-29 [ 19 ]. С другой стороны, более высокий IC50 был зарегистрирован в клетках рака шейки матки, клетках Hela и SiHa [ 20 ], в то время как DCA (20 мМ) не смог ингибировать жизнеспособность клеток линии рака молочной железы MCF-7 [ 21 ].Наши данные in vitro были подтверждены путем тестирования влияния DCA на прогрессирование опухоли in vivo с использованием моделей CAM куриного эмбриона и бестимусных мышей. Во-первых, мы продемонстрировали, что значительное снижение роста было достигнуто в A549 и LNM35, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона, при использовании доз DCA 50 мМ и 100 мМ соответственно. Во время написания этой рукописи было опубликовано исследование, в котором изучалось влияние натрия DCA на линии клеток глиобластомы U87 MG и PBT24, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона [ 22 ]. Авторы сообщили об изменении роста опухолей U87 MG и PBT24 в ответ на различные концентрации натрия DCA. Сообщалось, что 10 мМ натрия DCA были эффективны в снижении роста опухоли PBT24, но не опухоли U87, что отражает некоторые различия в биологии двух линий клеток [ 22 ]. Во-вторых, мы продемонстрировали, что лечение DCA в дозах 200 мг/кг ежедневно (5 дней в неделю) вызвало значительное снижение роста ксенотрансплантированной опухоли A549 на 40%, в то время как для значительного снижения роста ксенотрансплантированной опухоли LNM35 потребовалась более высокая доза DCA (500 мг/кг). В этом контексте ранее сообщалось, что DCA (100 мг/кг) увеличил время удвоения опухолей A549 и H1975 NSCLC примерно с 3 до 6,5 дней [ 15 ], но не оказал значительного ингибирующего эффекта у мышей с опухолью MDA-MB-231 [ 23 ]. С другой стороны, значительная задержка роста также наблюдалась у ксенотрансплантатов HT-29, леченных пероральным DCA (200 мг/кг) ежедневно в течение четырех дней [ 24 ].Исследование токсичности потенциальных противораковых препаратов так же важно, как и исследование их эффективности, поскольку тяжелая токсичность может помешать их использованию в клинике. DCA не показал цитотоксичности для куриных эмбрионов и бестимусных мышей. Процент живых эмбрионов был одинаковым в группах, получавших DCA, и контрольных группах. Кроме того, DCA не повлиял на поведение мышей, вес, общий анализ крови, параметры функции печени и почек по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с предыдущими доклиническими и клиническими отчетами, которые не показали никаких доказательств тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности при лечении DCA [ 13 , 14 ]. Немногие пациенты, получавшие лечение DCA, жаловались на общие желудочно-кишечные эффекты. Кроме того, наиболее распространенным ограничением для введения DCA является обратимая периферическая невропатия, которую можно свести к минимуму путем снижения дозы или дополнительного введения антиоксидантов [ 11 ]. Включение DCA в системы доставки лекарств (СДЛ), такие как наночастицы, является многообещающим подходом для сохранения противораковой активности DCA с минимальными побочными эффектами [ 25 , 26 , 27 ].Сообщалось, что противораковый эффект DCA частично обусловлен индукцией апоптоза, как это наблюдалось в клетках колоректального рака [ 19 ] и клетках НМРЛ [ 15 ] или ингибированием ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза, такие как антитело к VEGF бевацизумаб и блокатор рецепторов VEGF рамуцирумаб, были клинически одобрены для лечения рака легких [ 28 ]. Несмотря на их подтвержденную эффективность, их скромные общие терапевтические эффекты с сопутствующими побочными эффектами подчеркивают очевидную необходимость в более эффективном подходе, нацеленном на ангиогенез [ 28 ]. Наше исследование показало, что DCA (25 мМ) является перспективным антиангиогенным средством, поскольку он способен значительно ингибировать образование и прорастание эндотелиальных клеток in vitro. Кроме того, более низкие концентрации DCA (6,25 и 12,5 мМ) не влияли на образование трубок HUVEC. Эти результаты согласуются с отчетом Шунджанса и его коллег, которые продемонстрировали, что 5 мМ и 10 мМ DCA не повлияли на формирование трубок HUVEC in vitro [ 29 ]. В соответствии с нашими данными, DCA вызвал снижение плотности микрососудов опухоли у обработанных крыс, у которых также было отмечено подавление HIF1α в опухолевых клетках [ 30 ]. С другой стороны, Чжао и его коллеги недавно сообщили, что DCA стимулирует ангиогенез в модели сосудистой деменции у крыс за счет улучшения функции эндотелиальных клеток-предшественников [ 31 ].Примерно у 30–40% пациентов с НМРЛ на момент постановки диагноза наблюдалось метастатическое заболевание. Отдаленные метастазы отрицательно влияют на варианты лечения, ответ и выживаемость [ 32 ] и являются основной причиной смерти от рака легких [ 33 ]. Метастазирование — это многоступенчатый процесс, включающий отсоединение раковых клеток, миграцию, инвазию и колонизацию в отдаленных участках. Поэтому терапевтические агенты и схемы, уменьшающие такой отличительный признак рака, имеют большое значение в терапии рака. Несмотря на продемонстрированную антиангиогенную активность DCA, это исследование не показало влияния DCA на метастазирование клеток LNM35, ксенотрансплантированных бестимусным мышам, получавшим перорально эффективную дозу. В этом исследовании клетки LNM35, ксенотрансплантированные путем подкожной инокуляции бестимусным мышам, вызвали 90% случаев метастазов в подмышечных лимфатических узлах, и DCA не смог снизить частоту и рост этих метастазов в лимфатических узлах. Линия клеток LNM35 была создана в 2000 году как первая линия клеток рака легких человека, имеющая лимфогенные метастатические свойства со 100% частотой после подкожной инъекции в боковой бок голых мышей [ 34 ]. Кроме того, DCA не показал никаких ингибирующих эффектов на миграционные и инвазивные свойства клеток LNM35 и A549 in vitro. Аналогичным образом сообщалось, что монотерапия DCA не была эффективна в снижении метастазов в легких из метастатических клеток рака груди, ксенотрансплантированных голым мышам [ 23 ].Комбинированная терапия является фундаментальным подходом в лечении рака. Сочетание различных противораковых препаратов позволяет воздействовать на различные основные сигнальные пути для усиления терапевтических преимуществ, избегания приобретенной резистентности и снижения тяжести побочных эффектов [ 35 ]. Химиотерапия играет неотъемлемую роль в лечении пациентов с НМРЛ. Обычно используется схема с платиной (цисплатин или карбоплатин) плюс паклитаксел, гемцитабин, доцетаксел, винорелбин, иринотекан или пеметрексед [ 36 ]. Неселективные характеристики химиотерапевтических агентов приводят к скромному увеличению выживаемости при значительной токсичности для пациента [ 37 ]. Это подчеркивает необходимость в более эффективных стратегиях для улучшения результатов лечения пациентов с минимальными побочными эффектами. В настоящем исследовании DCA не удалось усилить противораковый эффект камптотецина и гемцитабина в обеих линиях клеток НМРЛ. Кроме того, DCA не смог значительно усилить противораковые эффекты цисплатина в клеточной линии A549 in vitro, но он усилил цитотоксический эффект цисплатина в клеточной линии LNM35, что отражает роль генетического фона раковых клеток в определении пути гибели клеток, вызванного препаратами. Ким и др. сообщили, что клетки A549 имеют более низкую скорость аэробного гликолиза по сравнению с клетками H460 из-за дифференциальной экспрессии некоторых метаболических ферментов [ 38 ]. Аэробный гликолиз при раке был связан с химиорезистентностью, и ингибирование связанных путей было предложено в качестве механизма преодоления такой резистентности. Например, сверхэкспрессия PDK4 при раке мочевого пузыря высокой степени злокачественности заставляет совместное введение DCA с цисплатином вызывать резкое снижение роста опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [ 39 ]. Аналогичным образом, введение DCA с паклитакселом было описано как успешный подход к преодолению резистентных к паклитакселу клеток НМРЛ из-за сверхэкспрессии PDK2 [ 40 ]. Кроме того, Галгамува и др. заявили, что предварительное лечение DCA значительно ослабило нефротоксичность, вызванную цисплатином у мышей, сохранив противораковые эффекты цисплатина [ 41 ].Открытие таргетной терапии помогло врачам адаптировать варианты лечения для пациентов с НМРЛ. Было разработано много таргетных препаратов, которые стали частью первой линии лечения НМРЛ, например, гефитиниб и эрлотиниб, которые считаются первым поколением EGFR-TKi [ 42 ]. Гефитиниб и эрлотиниб были одобрены более 10 лет назад для лечения пациентов с прогрессирующим мутантным EGFR НМРЛ, не получавших химиотерапию, в качестве первой линии лечения. Они также используются в качестве второй линии терапии после неудачи химиотерапии [43]. Некоторые отчеты показали, что эрлотиниб имеет хорошую эффективность у пациентов с НМРЛ с диким типом EGFR [ 44 ]. Поддерживающая доза может принести пользу этим пациентам после химиотерапии на основе платины, которая считается основной терапией при НМРЛ с диким типом EGFR [ 45 ]. Несмотря на значительные преимущества, у многих пациентов после 10–14 месяцев лечения развилась терапевтическая резистентность из-за вторичной мутации в гене EGFR [ 46 ].В этом исследовании мы стремились изучить способность DCA сенсибилизировать линии клеток NSCLC дикого типа EGFR при сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. DCA значительно усилил ингибирующий эффект гефитиниба и эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35. Это исследование также показало аддитивные эффекты на рост колоний LNM35 при сочетании DCA с гефитинибом или эрлотинибом в течение семи дней лечения. Более того, эта комбинация оказала синергическое действие на рост колоний A549 после четырнадцати дней лечения. Кроме того, все эти протоколы комбинирования привели к существенному снижению клеточной плотности отдельных колоний как A549, так и LNM35. В этом контексте сообщалось, что DCA с гефитинибом или эрлотинибом синергически подавляет жизнеспособность и способность к образованию колоний мутантных клеток EGFR (NCI-H1975 и NCI-H1650) из-за синергического эффекта в продвижении апоптоза. В клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460) они показали, по сравнению с индивидуальными обработками, что комбинация вызывала повышенное значение фракции, затронутой (Fa), в жизнеспособности клеток, не достигая уровня синергизма в клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460), и эта комбинация не подавляла значительно образование колоний этих линий клеток [ 47 ]. Различия в экспериментальных условиях между вышеупомянутым отчетом и нашим исследованием могут объяснить такие переменные результаты. В своем клоногенном анализе исследователи обрабатывали отдельные клетки в течение трех последовательных дней, а затем инкубировали в среде без лекарственных средств в течение 15 дней для формирования колоний; Однако в наших экспериментах клетки сначала инкубировали в течение десяти дней для формирования колоний, а затем подвергали обработке в течение семи и четырнадцати дней.Подводя итог, можно сказать, что это исследование продемонстрировало, что DCA является перспективным противораковым средством для лечения НМРЛ, подавляя жизнеспособность клеток и рост колоний клеток НМРЛ in vitro, а также рост опухолей у эмбрионов цыплят CAM и голых мышей, в которых также оценивалась безопасность этого средства. DCA подавляет способность эндотелиальных клеток образовывать капилляроподобные структуры и прорастать in vitro, что позволяет предположить ингибирование ангиогенеза как потенциальный механизм противоракового эффекта. Это исследование также выявило потенциальную ценность DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. Результаты этого исследования прокладывают путь для подтверждения влияния комбинации DCA с гефитинибом или эрлотинибом на рост опухоли in vivo, в дополнение к исследованию влияния DCA в сочетании с EGFR-TKi второго и третьего поколения.

4. Материалы и методы

4.1. Культура клеток и реагенты

Клетки NSCLC, A549 и LNM35, поддерживались в среде RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 . Среда была дополнена 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Hyclone, Cramlington, UK) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Cramlington, UK). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) поддерживались в полном наборе сред EndoGRO TM -VEGF (Merck Millipore, Massachusetts, USA) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в колбах, покрытых 0,2% желатином. Культуральную среду всех клеток меняли каждые 3 дня, а клетки пересевали один раз в неделю, когда культура достигала 95% конфлюэнтности для раковых клеток и 80% для HUVEC.Натрий DCA, цисплатин, камптотецин, гемцитабин HCl, эрлотиниб HCl и гефитиниб были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). DCA был свежерастворен в воде HyPure (Hyclone, Крамлингтон, Великобритания) перед началом любого эксперимента для приготовления исходного раствора 1 М, который затем был разбавлен до требуемых концентраций для лечения.

4.2 Жизнеспособность клеток

Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночный планшет. Через 24 часа клетки обрабатывали возрастающей концентрацией DCA (3,125–100 мМ) в двух повторностях в течение 24, 48 и 72 часов, тогда как контрольные клетки обрабатывали лекарственным средством (вода Hypure), смешанным со средой. В указанные временные точки использовали анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) для определения влияния DCA на жизнеспособность клеток путем количественной оценки АТФ, которая будет пропорциональна количеству метаболически активных клеток. Люминесцентный сигнал измеряли с помощью люминометра GloMax ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность клеток была представлена ​​в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности клеток, обработанных DCA, с контрольными клетками, жизнеспособность которых предполагалась равной 100%.Во втором наборе экспериментов клетки обрабатывали в течение 48 ч возрастающей концентрацией гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ). Кроме того, клетки обрабатывали в течение 48 ч комбинацией DCA и других противораковых агентов, а именно цисплатина, камптотецина, гемцитабина, гефитиниба и эрлотиниба. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа люминесцентной жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® и люминометра GloMax ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность представляли в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности обработанных лекарством клеток с контрольными клетками.

4.3 Клоногенный анализ

В 6-луночный планшет высевали клетки A549 и LNM35, соответственно, по 50 и 100 клеток на лунку. Клетки выдерживали для роста в колонии в течение 7–10 дней во влажной атмосфере при 37 °C и 5% CO2 , при этом среду меняли каждые три дня. Образованные колонии обрабатывали каждые 3 дня в течение 7 дней возрастающими концентрациями DCA (6,25–50 мМ). После этого колонии промывали три раза 1× PBS, фиксировали и окрашивали в течение 2 часов 0,5% кристаллическим фиолетовым, растворенным в 50% метаноле ( об. / об. ). Наконец, колонии промывали 1× PBS и фотографировали, и подсчитывали колонии с более чем 50 клетками. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных DCA, с контрольными колониями. Плотность клеток колоний оценивали путем фотографирования колоний в каждой группе с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа (4×).Во втором наборе экспериментов сформированные колонии обрабатывались каждые 3 дня в течение 7 или 14 дней комбинацией DCA и гефитиниба или DCA и эрлотиниба. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных препаратом, с контрольными колониями.

4.4 Анализ роста опухоли in ovo

Оплодотворенные яйца леггорнов инкубировались в инкубаторе для яиц, установленном на температуру 37,5 °C и влажность 50% в течение первых 3 дней после оплодотворения. На 3-й день эмбрионального развития (E3) САМ удалялся путем просверливания небольшого отверстия в яичной скорлупе напротив круглого, широкого конца с последующей аспирацией ~1,5–2 мл альбумина с помощью шприца объемом 5 мл с иглой 18G. Затем в яичной скорлупе над САМ вырезалось небольшое окно с помощью тонких ножниц и заклеивалось полупроницаемой клейкой пленкой (Suprasorb ® F). Яйца снова содержались в инкубаторе до 9-го дня эмбрионального развития (E9), на котором раковые клетки были трипсинизированы, центрифугированы и суспендированы в 80% матрице Matrigel ® (Corning, Bedford, UK) для получения 1 × 10 6 клеток/100 мкл для A549 и 0,3 × 10 6 клеток/100 мкл для LNM35. 100 мкл инокулята добавляли на САМ каждого яйца, в общей сложности 10–13 яиц на состояние. На 11-й день эмбрионального развития (E11) образовавшиеся опухоли обрабатывали местно, капая 100 мкл DCA, приготовленного на 0,9% NaCl для первой группы или лекарственного носителя для контрольной группы. Лечение повторяли на E13 и E15. Все описанные шаги выполняли в асептических условиях. Наконец, на 17-й день эмбрионального развития (E17) эмбрионы были гуманно умерщвлены путем нанесения 10–30 мкл пентобарбитона натрия (300 мг/мл, Jurox, Окленд, Новая Зеландия). Опухоли были осторожно извлечены из нормальных верхних тканей CAM, промыты 1× PBS и взвешены для определения влияния DCA на рост опухоли. Данные представлены в виде сравнений среднего веса опухолей в контрольной группе и группе, обработанной DCA. Токсичность препарата оценивалась путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах в конце эксперимента. Живые эмбрионы определялись путем проверки произвольных движений эмбрионов в дополнение к целостности и пульсации кровеносных сосудов.Этот анализ представляет собой рандомизированный открытый анализ, который был проведен в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных в Университете Объединенных Арабских Эмиратов. Согласно Европейской директиве 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях, эксперименты с использованием куриных эмбрионов на E18 и до нее не требуют одобрения со стороны Комитета по уходу и использованию институциональных животных (IACUC).

4.5 Анализ роста опухоли и метастазирования

Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных университета ОАЭ в марте 2019 года (код протокола ERA_2019_5872). Шести-восьминедельные бестимусные самцы мышей NMRI nude (nu/nu, Charles River, Германия) содержались в ламинарных шкафах с фильтрованным воздухом и обрабатывались в асептических условиях. Клетки A549 (5 × 10 6 клеток/200 мкл PBS) и клетки LNM35 (0,4 × 10 6 клеток/200 мкл PBS) вводились подкожно в боковой бок мышей nude. Через десять дней, когда опухоли достигли объема приблизительно 50 мм 3 , животные с ксенотрансплантатами A549 были случайным образом разделены на три группы по 9–10 мышей в каждой. Эти группы лечились перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 50 мг/кг или 200 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 38 дней. С другой стороны, животные с ксенотрансплантатами LNM35 лечились перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 200 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 10 дней и DCA 500 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 24 дней. Размеры опухолей и вес животных проверялись каждые три или четыре дня. Кроме того, физические признаки и поведение проверялись каждый день. Объем опухоли рассчитывался по формуле V = L × W 2 × 0,5, где L представляет собой длину, а W - ширину опухоли. В конце экспериментов животных анестезировали и умерщвляли путем смещения шейных позвонков, а опухоли удаляли и взвешивали. Влияние DCA на рост опухоли было представлено путем сравнения среднего веса опухоли в конце эксперимента между контрольной группой и группой, получавшей DCA. Его также оценивали путем сравнения объема опухоли между контрольной и обработанной DCA группами на протяжении всего эксперимента. Образцы крови собирали у каждой мыши и анализировали с помощью SCIL VET ABC™ Animal Blood Counter для полного анализа крови. Кроме того, плазму крови отделяли центрифугированием для биохимического анализа. Для изучения влияния DCA на метастазирование подмышечные лимфатические узлы вырезали и взвешивали у животных с ксенотрансплантатами LNM35 в конце эксперимента.

4.6 Анализ формирования сосудистой трубки

Matrigel ® Matrix (Corning, Bedford, UK) размораживали и добавляли 40–50 мкл в лунки 96-луночного планшета для покрытия. Для того чтобы Matrigel затвердел, планшет держали во влажном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч. HUVEC трипсинизировали и высевали на покрытый планшет с плотностью 2,5 × 104 клеток /100 мкл/лунку в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA. Через 8 ч инкубации сети трубок в разных лунках фотографировали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Влияние DCA на способность HUVEC образовывать капилляроподобные структуры оценивали путем измерения общей длины сформированных трубок в контрольных и обработанных DCA лунках. Общая длина трубок измерялась вручную и с помощью программного обеспечения для онлайн-анализа изображений, разработанного Wimasis ( https://www.wimasis.com/en/products/13/WimTube - дата доступа 1 марта 2019 г.). Влияние различных концентраций DCA на жизнеспособность HUVEC определялось с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), как ранее описано в разделе о жизнеспособности клеток.

4.7. Анализ прорастания сфероидов HUVEC

Сфероиды HUVEC были приготовлены путем первого окрашивания клеток путем инкубации 190 000 клеток с 2 мкМ раствором красителя CellTracker TM Green CMFDA (Invitrogen Molecular probes, Paisley, UK) в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе, установленном на 37 °C и 5% CO2 , с последующим центрифугированием в течение 5 мин и удалением супернатанта. Осадок HUVEC был суспендирован в дополненной среде HUVEC (5 мл), смешанной с раствором метоцела (1,25 мл), который должен быть приготовлен ранее [ 48 ]. Затем 25 мкл клеточной суспензии пипеткой наносили на крышку чашки Петри. Примерно 50 капель пипеткой наносили в каждую чашку Петри. Наконец, капли держали перевернутыми в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе, установленном на 37 °C и 5% CO2 .Образованные сфероиды в каждой чашке (~50 сфероидов) собирали отдельно с 1× PBS и центрифугировали при 150× g в течение 5 мин. Тем временем рабочий раствор коллагена I готовили на льду путем осторожного смешивания исходного коллагена I из хвоста крысы (1500 мкл) (Millipore, MA, США) с 10× средой 199 (150 мкл) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, США) и ледяным стерильным 1N NaOH (34 мкл), который приобрел красный цвет. Каждый сфероидный осадок покрывали слоем раствора метоцела, содержащего 4% FBS (0,25 мл), рабочего раствора коллагена I (0,25 мл) и 60 мкл базальной среды или VEGF 30 нг/мл или DCA 25 мМ или их комбинации. Сразу после осторожного перемешивания смесь добавляли в предварительно нагретый 24-луночный планшет и инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов, что позволяло полимеризовать коллаген и прорасти сфероидам. Через 24 часа сфероиды были захвачены с помощью инвертированного микроскопа с 20-кратным увеличением. Длина проростков в 12 сфероидах в каждом состоянии была измерена с помощью ImageJ.

4.8. Анализ подвижности при заживлении ран

Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 1 × 10 6 клеток/лунку в 6-луночный планшет. Через 24 часа с помощью наконечника объемом 200 мкл делали царапину через сливающийся монослой. После этого клетки дважды промывали 1× PBS с последующим добавлением свежей среды с лекарственным носителем или DCA. В верхней части планшета отмечали два места для мониторинга уменьшения размера раны с течением времени с использованием инвертированного микроскопа при объективе 4× (Olympus 1X71, Токио, Япония). Планшеты инкубировали во влажной атмосфере при 37 °C и 5% CO 2 , а ширину раны измеряли через 0, 2, 6 и 24 часа после инкубации. Расстояние миграции выражали как среднее значение разницы между измерениями в нулевой момент времени и в периоды времени 2, 6 и 24 часа.

4.9. Анализ камеры вторжения Матригеля

Следуя протоколу производителя (Corning, Bedford, MA, USA), в нижние камеры добавляли 0,5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS. После этого раковые клетки высевали с плотностью 1 × 10 5 клеток/0,5 мл в верхние камеры в среде без FBS в присутствии и отсутствии DCA. Планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO 2 в течение 24 часов. Инвазивные клетки разрушают Матригель и проходят через 8 мкм поры вставки. Непроникающие клетки верхних камер удаляли, осторожно протирая область ватным тампоном. Затем полупроницаемую мембрану удаляли с помощью очень тонких ножниц. Инвазивные клетки были обнаружены с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), ранее описанного в разделе жизнеспособности клеток. Влияние DCA на клеточную инвазию было представлено в процентах (%) путем сравнения инвазирующих клеток в присутствии DCA с контролем.

4.10 Статистический анализ

За исключением анализа in ovo и экспериментов на голых мышах, каждый эксперимент проводился не менее трех раз. Данные выражены как среднее значение ± SEM Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 8.3.1 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Для оценки разницы между двумя группами использовался непарный t -тест. Для сравнения 3 или более групп с контрольной группой использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Даннетта. Кроме того, для комбинированных экспериментов использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Тьюки. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001 указывают на значимые различия.

Вклады авторов

Концептуализация, SA; методология, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; валидация, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; формальный анализ, SA и AA-A.; расследование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; курирование данных, SA; написание — подготовка первоначального черновика, SA и AA-A.; написание — рецензирование и редактирование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; визуализация, SA, AA-A. и AN; руководство, SA; администрирование проекта, SA; получение финансирования, SA Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование частично финансировалось за счет гранта Центра медицинских наук имени Зайеда при Университете Объединенных Арабских Эмиратов, № 31R136.

Отчет о клиническом случае длительной полной ремиссии метастатического плоскоклеточного рака почки после паллиативной лучевой терапии и адъювантной терапии дихлорацетатом

оригинал статьи: https://ibimapublishing.com/articles/ACRT/2012/441895/

Акбар Хан

Медицинский директор, Medicor Cancer Centres Inc., Торонто, Канада

Том 2012 (2012), идентификатор статьи 441895, Достижения в области исследований и лечения рака, 7 страниц, DOI: 10.5171/2012.441895Дата публикации: 19 июля 2012 г.

Авторские права © 2012 Akbar Khan. Это статья открытого доступа, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License unported 3.0, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.

Плоскоклеточный рак почек — редкая форма рака почек, которая считается неизлечимой после появления метастазов. Прогноз неблагоприятный, а средняя выживаемость на поздней стадии заболевания обычно составляет несколько месяцев, несмотря на все доступные традиционные методы лечения. Мы описываем случай 72-летней женщины с метастатическим плоскоклеточным раком почек, у которой была проведена радикальная нефрэктомия с положительными хирургическими краями, инвазией почечной вены и метастазами в несколько абдоминальных лимфатических узлов. Она получила курс паллиативной лучевой терапии брюшной полости с дозой 4500 сГр в 25 фракций в течение 5 недель. После лучевой терапии ее лечили циклическим режимом перорального дихлорацетата натрия («DCA»). Лечение было прекращено через 3 месяца из-за развития периферической нейропатии. Последующая визуализация после завершения лечения DCA не выявила признаков метастатического заболевания. Нейропатия постепенно улучшилась, и компьютерная томография через четыре года не выявила рецидива рака. Пациент продолжает чувствовать себя хорошо, клинических признаков рецидива не наблюдается спустя пять лет после завершения терапии, он ведет нормальную и активную жизнь.

Введение

Плоскоклеточный рак почек («RSCC») — редкая форма рака почек, которая возникает из почечной лоханки. RSCC составляет около 0,5–0,8% всех злокачественных опухолей почек (Bhaijee 2012). Хотя хирургическое вмешательство иногда излечивает локализованное заболевание, метастатический плоскоклеточный рак почек («mRSCC») считается неизлечимым (Holmang et al. 2007). Многочисленные публикации врачей, имеющих опыт лечения RSCC, установили, что этот тип рака является радиорезистентным, и что системная химиотерапия дает мало пользы. (Bhandari et al. 2010), (Di Battista et al. 2012), (Kimura et al. 2000), (Li and Cheung 1987). Средняя выживаемость при поздней стадии заболевания крайне низкая (в пределах нескольких месяцев), а пятилетняя выживаемость, как сообщается, составляет менее 10% (Holmang et al. 2007). В обзоре 15 случаев Ли и др. сообщили о медианной выживаемости в 3,5 месяца (Lee et al. 1998).

Был проведен поиск в Medline (Medline RSCC 2012) для определения того, были ли зарегистрированы какие-либо случаи длительной полной ремиссии mRSCC. Он выявил более 200 ссылок на RSCC, но только один опубликованный случай 5-летней полной ремиссии/излечения (Carlson 1960). В этом случае пациенту была проведена полная нефроуретерэктомия, включая резекцию околопочечного жира и манжеты мочевого пузыря. Патология не выявила какого-либо вовлечения хирургических краев, и не было зарегистрировано никаких метастазов.

Дихлорацетат натрия («DCA») — это препарат, который был тщательно изучен для лечения врожденного лактоацидоза, входящего в группу наследственных митохондриальных заболеваний (Stacpoole et al. 2006), (Stacpoole et al. 1992), (Stacpoole et al. 1988). Профиль безопасности использования DCA у людей был установлен в ходе этой работы. Было обнаружено, что это относительно безопасный препарат, не обладающий гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичностью. Основная токсичность — неврологическая (в первую очередь периферическая невропатия), и она обратима (Kaufmann et al. 2006). Наблюдался делирий, вызванный DCA, который также обратим после отмены препарата (Brandsma et al. 2010). У небольшого процента пациентов может наблюдаться незначительное обратимое повышение уровня печеночных ферментов (Stacpoole et al., 2008).

В январе 2007 года была опубликована знаменательная статья, в которой было показано, что DCA эффективен при лечении рака груди, легких и мозга человека in vitro и in vivo (крысы) с помощью новых метаболических путей (Bonnet et al. 2007). Было показано, что DCA ингибирует митохондриальную пируватдегидрогеназную киназу, что приводит к ингибированию аэробного гликолиза, обычного пути производства энергии в раковых клетках человека (известного как эффект Варбурга). Поскольку раковые клетки обычно не способны переходить к окислению глюкозы при ингибировании гликолиза, обработанные DCA клетки будут истощены в своем энергоснабжении АТФ (Xu et al. 2005). Также было показано, что DCA селективно запускает апоптоз в раковых клетках за счет снижения мембранного потенциала гиперполяризованных митохондрий и активации потенциалзависимых калиевых каналов Kv1.5 (Bonnet et al. 2007).

С 2007 года исследования DCA продолжались, и было показано, что DCA имеет эффективность in vitro против нескольких линий клеток рака человека, включая яичники (Saed et al. 2011), нейробластому (Vella et al. 2012), толстую кишку (Tong et al. 2011), карциноид легких (Fiebiger et al. 2011), шейку матки (Xie et al. 2011) и эндометрий (Wong et al. 2008). Синергизм с радиотерапией также был продемонстрирован на линиях клеток рака простаты (Cao et al. 2008). Механизм синергизма, предложенный Cao et al., заключается в повышенной экспрессии связанного с BCL-2 белка X (проапоптотического внутриклеточного белка), что приводит к повышению скорости апоптоза. DCA также показал эффективность in vivo у людей против глиобластомы (Michelakis et al. 2010).

Автор начал использовать терапию DCA «не по назначению» с 2007 года для лечения онкологических больных с плохим прогнозом или не поддающихся лечению традиционными методами лечения рака. Наблюдение за пациентами, получавшими лечение DCA, показало, что значительное число пациентов, по всей видимости, извлекло пользу из использования этого препарата либо по субъективным критериям, таким как уменьшение боли, либо по объективным критериям, таким как уменьшение опухоли (Medicor DCA Data 2009). Презентация случая
 

Женщина 72 лет первоначально обратилась к своему семейному врачу с болью в правом бедре, гематурией и потерей веса. Масса в правой почке была диагностирована с помощью ультразвука. Была проведена компьютерная томография («КТ»), которая показала опухоль, поражающую правую почечную лоханку, верхний и нижний полюса почки и распространяющуюся на проксимальный правый мочеточник (рисунок 1). Были обнаружены множественные увеличенные лимфатические узлы в брюшной полости (рисунок 2). Было проведено сканирование костей, которое было отрицательным для метастазов в кости.

Рисунок 1 – КТ брюшной полости, показывающая опухоль правой почки до начала лечения.

Рисунок 2 – КТ брюшной полости, показывающая патологический забрюшинный лимфатический узел размером 2 см до начала лечения.

Пациентке была проведена правосторонняя радикальная нефрэктомия в мае 2007 года. В отчете об операции было отмечено, что полное иссечение невозможно. Была затронута почечная вена, и ее не удалось полностью очистить от опухоли. Во время операции были визуализированы множественные патологические лимфатические узлы, простирающиеся вверх по нижней полой вене, но они не были удалены. Была проведена интраоперационная биопсия одного из лимфатических узлов. Окончательная гистопатология подтвердила диагноз плоскоклеточного рака почки с положительным хирургическим краем и метастазами в лимфатические узлы. После операции пациентку направили на консультацию к радиоонкологу. Она получила курс внешней лучевой терапии с паллиативной целью на парааортальную область живота с дозой 4500 сГр в 25 фракциях в течение 5 недель с августа по сентябрь 2007 года. Была проведена консультация терапевтического онколога, и ей не было предложено лечение химиотерапией.

Пациентка узнала об исследовании рака DCA из местных СМИ и решила изучить возможность DCA в качестве постоянного лечения, учитывая ее плохой прогноз. Она посетила клинику автора для консультации по терапии DCA.

При первом посещении клиники была изучена ее полная история болезни. Обследование показало, что это здоровая на вид женщина с нормальными жизненными показателями и без существенных физических данных. Первоначальные анализы крови были в целом хорошими. Единственными отклонениями были небольшое повышение мочевины до 7,4 (норма 3,0–7,1 ммоль/л) и низкое количество лимфоцитов до 0,6 (норма 1,2–3,4 x 10 9 /л). Это не было тревожным, так как небольшое повышение мочевины или креатинина было бы ожидаемым у пациента после нефрэктомии. Лечение DCA
 

Были обсуждены риски и преимущества DCA, и пациентка согласилась на лечение DCA, которое было начато в течение 3 недель после последней фракции паллиативной лучевой терапии. Пациентке был назначен DCA по 500 мг перорально два раза в день (18 мг/кг/день) циклом 2 недели приема / 1 неделя перерыва. Циклическое лечение было выбрано из-за предыдущего опыта автора с неприемлемым уровнем побочных эффектов у взрослых пациентов, использующих непрерывную дозировку DCA. Ей был назначен бенфотиамин (жирорастворимая форма витамина B1) по 80 мг перорально два раза в день и R-альфа-липоевая кислота по 150 мг перорально 3 раза в день для снижения риска невропатии DCA, поскольку оба этих природных соединения доказали свою эффективность в лечении невропатии другой этиологии (Ziegler et al. 1999), (Winkler et al. 1999). Ей также назначили пантопразол 40 мг перорально один раз в день для профилактики расстройства желудка от DCA. После первого 3-недельного цикла DCA увеличили до 500 мг перорально три раза в день (27 мг/кг/день). Дозу увеличивали постепенно, чтобы обеспечить переносимость из-за сниженного метаболизма DCA с возрастом пациента (Shroads et al. 2008).

Пациент в целом чувствовал себя хорошо в течение первого месяца лечения DCA, за исключением легкой усталости, которая также могла быть побочным эффектом радиотерапии. Даже при увеличении дозы DCA через 3 недели никаких проблем не возникло в течение второго месяца терапии. DCA была остановлена ​​к концу третьего месяца из-за новых симптомов, указывающих на периферическую невропатию.

На момент остановки DCA пациенту сделали трехфазную КТ, которая не показала никаких признаков остаточного рака. Еще через 6 месяцев пациенту сделали КТ, которая снова не показала никаких признаков рака (рисунок 3).

Рисунок 3 – КТ брюшной полости, показывающее отсутствие рецидива заболевания через 6 месяцев после завершения лечения DCA. Стрелки указывают на хирургические клипсы в правом почечном ложе после нефрэктомии.

Пациентка продолжала регулярно наблюдаться в онкологической клинике своей местной больницы с плановыми КТ-сканированиями примерно каждые 6 месяцев. Последнее КТ-сканирование в октябре 2011 года не показало никаких признаков рецидива mRSCC. Последующий визит к онкологу-радиологу в декабре 2011 года подтвердил отсутствие рецидива. Физическое обследование было нормальным, а ее статус работоспособности был на уровне ECOG 0. Сентябрь 2011 года ознаменовал 4-летнюю точку с момента лучевой терапии и начала лечения DCA, а декабрь 2011 года ознаменовал 4-летнюю точку с момента завершения 3-месячной терапии DCA. По состоянию на сентябрь 2012 года, через 5 лет с даты начала терапии DCA, у пациентки не было никаких симптомов. Она не получала никакого другого лечения рака в течение этого времени (включая DCA), поскольку не было никаких признаков рецидива заболевания.

Обсуждение

Мы считаем, что это первый опубликованный случай длительной полной ремиссии (и вероятного излечения) mRSCC. В литературе, проиндексированной в Medline, за последние 50 лет описан только один похожий случай 5-летней полной ремиссии RSCC, однако у этого пациента не было метастатического заболевания. Наш случай требует пристального внимания, поскольку mRSCC очень агрессивен, медиана выживаемости составляет несколько месяцев при использовании всех доступных традиционных методов лечения.

Радиотерапия сама по себе обеспечивает незначительный эффект на выживаемость при mRSCC (Holmang et al. 2007). Увеличенное до 5 недель время лечения паллиативной радиотерапией в этом случае еще больше снижает вероятность излечения (маловероятную, поскольку она изначально основана на типе рака) в силу снижения гибели клеток посредством процесса, называемого «ускоренной репопуляцией». Репопуляция определяется как способность клеток в ткани восстанавливаться после дозы радиации. Репопуляция увеличивается по мере увеличения общего времени лечения для доставки дозы радиации во время курса фракционированной радиотерапии. Этот эффект снижает вред для здоровой ткани, но также снижает гибель раковых клеток — что соответствует цели паллиативной терапии. Репопуляция наиболее выражена при общем времени лучевой терапии 4-6 недель и более, и эта пациентка получила свою фракционированную радиотерапию в течение 5 недель (Abeloff 21 мая 2008 г.).

Как отмечалось ранее, DCA имеет синергизм с радиотерапией при раке простаты. Опыт автора в лечении пациентов с помощью DCA предполагает, что синергизм с радиотерапией может иметь место при различных типах рака, отличных от рака простаты. Примеры включают: 53-летнюю женщину с 3-летней полной ремиссией карциномы бартолиновой железы, леченной с помощью лучевой терапии и адъювантной DCA, и 32-летнюю женщину с 3-летней полной ремиссией анапластической астроцитомы после химиолучевой терапии с адъювантной DCA (случаи готовятся к публикации).

В этом случае mRSCC адъювантное использование DCA после курса лучевой терапии привело к удивительно полной ремиссии без каких-либо вредных побочных эффектов, кроме обратимой периферической невропатии. У этого пациента профилактический бенфотиамин и R-альфа-липоевая кислота не остановили развитие периферической невропатии от DCA. Теперь автор добавляет ацетил L-карнитин к режиму профилактики невропатии DCA, поскольку он также доказал свою эффективность при лечении невропатии другой этиологии, такой как диабетическая, химио- и антиретровирусная невропатия (Herzmann et al. 2005), (Quatraro et al. 1995), (De Grandis and Minardi 2002), (Bianchi et al. 2005).

В настоящее время нет активных клинических испытаний, изучающих роль DCA в сочетании с радиотерапией. В настоящее время проводится одно испытание, изучающее DCA в сочетании с химиотерапией и облучением при карциноме головы и шеи (Clinicaltrials.gov 2012). Из-за непатентованного статуса DCA исследователям было сложно собрать средства для проведения дорогостоящих испытаний на людях. Мы надеемся, что публикация ясных случаев, иллюстрирующих преимущества DCA в качестве адъюванта к традиционным методам лечения рака, побудит исследователей найти новые креативные механизмы сбора средств, чтобы DCA можно было официально исследовать в дальнейших испытаниях на людях. Мы надеемся, что DCA таким образом станет более широко принятой в онкологическом сообществе и будет использоваться на благо пациентов с неизлечимыми злокачественными новообразованиями.

Поскольку завершение клинических испытаний на людях может занять много лет, в промежуточный период мы считаем этичным осторожно назначать DCA «не по назначению» в сочетании с паллиативной радиотерапией или после нее для пациентов, которые полностью понимают и принимают риски и преимущества. DCA может сыграть еще одну роль в качестве нового терапевтического подхода в сочетании с радиотерапией для радиорезистентных неметастатических видов рака, но это еще предстоит прояснить. Подтверждение
 

Автор хотел бы поблагодарить доктора Хумайру Хан и доктора Айзека Элиаза за их помощь в подготовке этого отчета о случае, а также пациентку за согласие опубликовать ее случай.

Заявление автора о раскрытии информации

Автор назначает лекарства для лечения рака (включая дихлорацетат), которые предоставляются через онкологические центры Medicor за плату. Эта клиника принадлежит члену семьи автора.
 

(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Ссылки

Abeloff, MD, Armitage, JO, Niederhuber, JE, Kastan, MB & McKenna, WG (21 мая 2008 г.). Клиническая онкология Абелоффа , 4-е издание, Глава: Биологические эффекты радиации.
Издатель – Google Scholar

Бхайджи, Ф. (2012). « Плоскоклеточная карцинома почечной лоханки », Энн Диагн Патол, 16(2), 124-7.
Издатель – Google Scholar

Бхандари, А., Аласси, О., Роджерс, К. и Макленнан, Г. Т. (2010). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки », J Urol, 183(5), 2023-4.
Издатель – Google Scholar

Bianchi, G., Vitali, G., Caraceni, A., Ravaglia, S., Capri, G., Cundari, S., Zanna, C. и Gianni, L. (2005). « Симптоматические и нейрофизиологические ответы невропатии, вызванной паклитакселом или цисплатином, на пероральный ацетил-L-карнитин », Eur J Cancer, 41(12), 1746-50.
Издатель – Google Scholar

Bonnet, S., Archer, SL, Allalunis-Turner, J., Haromy, A., Beaulieu, C., Thompson, R., Lee, CT, Lopaschuk, GD, Puttagunta, L., Bonnet, S., Harry, G., Hashimoto, K., Porter, CJ, Andrade, MA, Thebaud, B. и Michelakis, ED (2007). « Ось митохондриального канала K+ подавляется при раке, а ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака », Cancer Cell, 11(1), 37-51.
Издатель – Google Scholar

Брандсма, Д., Дорло, ТПК, Хаанен, Дж. Х., Бейнен, Дж. Х. и Бугерд, В. (2010). « Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом », J Neurol, 257 (12), 2099–100.
Издатель – Google Академия

Cao, W., Yacoub, S., Shiverick, KT, Namiki, K., Sakai, Y., Porvasnik, S., Urbanek, C. и Rosser, CJ (2008). « Дихлорацетат (DCA) сенсибилизирует как дикие, так и сверхэкспрессирующие Bcl-2 клетки рака простаты in vitro к радиации », Prostate, 68(11), 1223-31.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Карлсон, Х. Э. (1960). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки: пятилетнее лечение », J Urol, 83, 813-4.
Издатель – Google Scholar

Clinicaltrials.Gov (2012). [Онлайн], Доступно: http://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=dichloroacetate+radiotherapy [доступ 1 сентября 2012 г.].
Издатель

De Grandis, D. & Minardi, C. (2002). « Ацетил-L-карнитин (левацекарнин) в лечении диабетической невропатии. Долгосрочное, рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование », Drugs RD, 3(4), 223-31.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Ди Баттиста Л., Стио Ф., Гуарино С., Галани А., Матуро А., Димко М., Манчини М. и Галло П. (2012). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки с камнями и инфильтрацией нижней полой вены. Отчет о случае », Дж. Чир, 33 (5), 182–5.
Издатель – Google Академия

Fiebiger, W., Olszewski, U., Ulsperger, E., Geissler, K. & Hamilton, G. (2011). « Цитотоксичность in vitro новых препаратов на основе платины и дихлорацетата против линий клеток карциноида легких », Clin Transl Oncol, 13(1), 43-9.
Издатель – Google Scholar

Herzmann, C., Johnson, MA и Youle, M. (2005). « Долгосрочный эффект ацетил-L-карнитина при антиретровирусной токсической нейропатии », HIV Clin Trials, 6(6), 344-50.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Холманг, С., Леле, СМ и Йоханссон, СЛ (2007). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки и мочеточника: заболеваемость, симптомы, лечение и исход », J Urol, 178(1), 51-6.
Издатель – Google Scholar

Kaufmann, P., Engelstad, K., Wei, Y., Jhung, S., Sano, MC, Shungu, DC, Millar, WS, Hong, X., Gooch, CL, Mao, X., Pascual, JM, Hirano, M., Stacpoole, PW, Dimauro, S. и De Vivo, DC (2006). « Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование », Neurology, 66(3), 324-30.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Kimura, T., Kiyota, H., Asano, K., Madarame, J., Yoshino, Y., Miki, K., Abe, K., Hasegawa, T. и Ohishi, Y. (2000). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки с расширением нижней полой вены », Int J Urol, 7(8), 316-9; Обсуждение 320.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Lee, TY, Ko, SF, Wan, YL, Cheng, YF, Yang, BY, Huang, DL, Hsieh, HH, Yu, TJ и Chen, WJ (1998). « Плоскоклеточный рак почек: результаты КТ и клиническое значение », Abdom Imaging, 23(2), 203-8.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Ли, МК и Чунг, ВЛ (1987). « Плоскоклеточный рак почечной лоханки », J Urol, 138(2), 269-71.
Издатель – Google Scholar

Medicor (данные DCA 2009) [онлайн], доступно: www.medicorcancer.com/DCAdata.html [дата обращения: 1 октября 2012 г.].

Medline (RSCC 2012) [онлайн], доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed , критерии поиска: почки [название] или почки [название] и («плоскоклеточная карцинома» [название]) [доступ 1 октября 2012 г.].
Издатель

Michelakis, ED, Sutendra, G., Dromparis, P., Webster, L., Haromy, A., Niven, E., Maguire, C., Gammer, TL, Mackey, JR, Fulton, D., Abdulkarim, B., McMurtry, MS и Petruk, KC (2010). « Метаболическая модуляция глиобластомы с помощью дихлорацетата », Sci Transl Med, 2(31), 31ra34.
Издатель – Google Scholar 

Кватраро А., Рока П., Донцелла К., Акампора Р., Марфелла Р. и Джулиано Д. (1995). « Ацетил-L-карнитин при симптоматической диабетической нейропатии », Diabetologia, 38(1), 123.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Saed, GM, Fletcher, NM, Jiang, ZL, Abu-Soud, HM и Diamond, MP (2011). « Дихлорацетат индуцирует апоптоз эпителиальных клеток рака яичников посредством механизма, включающего модуляцию окислительного стресса », Reprod Sci, 18(12), 1253-61.
Издатель – Google Scholar 

Shroads, AL, Guo, X., Dixit, V., Liu, HP, James, MO и Stacpoole, PW (2008). « Кинетика и метаболизм дихлорацетата, зависящие от возраста: возможная связь с токсичностью », J Pharmacol Exp Ther, 324(3), 1163-71.
Издатель – Google Scholar

Stacpoole, PW, Gilbert, LR, Neiberger, RE, Carney, PR, Valenstein, E., Theriaque, DW и Shuster, JJ (2008). « Оценка долгосрочного лечения детей с врожденным лактатацидозом с помощью дихлорацетата », Pediatrics, 121(5), E1223-8.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Stacpoole, PW, Kerr, DS, Barnes, C., Bunch, ST, Carney, PR, Fennell, EM, Felitsyn, NM, Gilmore, RL, Greer, M., Henderson, GN, Hutson, AD, Neiberger, RE, O'Brien, RG, Perkins, LA, Quisling, RG, Shroads, AL, Shuster, JJ, Silverstein, JH, Theriaque, DW и Valenstein, E. (2006). « Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактатацидоза у детей », Pediatrics, 117(5), 1519-31.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Stacpoole, PW, Lorenz, AC, Thomas, RG и Harman, EM (1988). « Дихлорацетат в лечении лактоацидоза », Ann Intern Med, 108(1), 58-63.
Издатель – Google Scholar

Stacpoole, PW, Wright, EC, Baumgartner, TG, Bersin, RM, Buchalter, S., Curry, SH, Duncan, CA, Harman, EM, Henderson, GN, Jenkinson, S. & Et Al. (1992). « Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения лактатацидоза у взрослых. Группа по изучению дихлорацетата и лактатацидоза », N Engl J Med, 327(22), 1564-9.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Tong, J., Xie, G., He, J., Li, J., Pan, F. и Liang, H. (2011). « Синергический противоопухолевый эффект дихлорацетата в сочетании с 5-фторурацилом при колоректальном раке », J Biomed Biotechnol, 2011, 740564.
Издатель – Google Scholar

Велла, С., Конти, М., Тассо, Р., Канседда, Р. и Пагано, А. (2012). « Дихлорацетат подавляет рост нейробластомы, действуя специфически против злокачественных недифференцированных клеток », Int J Cancer, 130(7), 1484-93.
Издатель – Google Scholar 

Winkler, G., Pal, B., Nagybeganyi, E., Ory, I., Porochnavec, M. & Kempler, P. (1999). « Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии », Arzneimittelforschung, 49(3), 220-4.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct 

Wong, JYY, Huggins, GS, Debidda, M., Munshi, NC и De Vivo, I. (2008). « Дихлорацетат индуцирует апоптоз в клетках рака эндометрия », Gynecol Oncol, 109(3), 394-402.
Издатель – Google Scholar

Xie, J., Wang, BS, Yu, DH, Lu, Q., Ma, J., Qi, H., Fang, C. и Chen, HZ (2011). « Дихлорацетат переключает метаболизм с гликолиза на окисление глюкозы и проявляет синергическое ингибирование роста с цисплатином в клетках Hela », Int J Oncol, 38(2), 409-17.
Издатель – Google Scholar

Xu, RH, Pelicano, H., Zhou, Y., Carew, JS, Feng, L., Bhalla, KN, Keating, MJ и Huang, P. (2005). « Ингибирование гликолиза в раковых клетках: новая стратегия преодоления лекарственной устойчивости, связанной с митохондриальным респираторным дефектом и гипоксией », Cancer Res, 65(2), 613-21.
Издатель – Google Scholar 

Ziegler, D., Hanefeld, M., Ruhnau, KJ, Hasche, H., Lobisch, M., Schutte, K., Kerum, G. и Malessa, R. (1999). « Лечение симптоматической диабетической полинейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой: 7-месячное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN III). Группа исследования ALADIN III. Альфа-липоевая кислота при диабетической нейропатии », Diabetes Care, 22(8), 1296-301.
Издатель – Google Scholar –  British Library Direct

Дихлорацетат вызывает апоптоз и остановку клеточного цикла в клетках колоректального рака

оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1038/sj.bjc.6605701

.М. Мадхок*, 1 , С. Йелури 1 , С.Л. Перри 1 , Т.А. Хьюз 2 и Д.Г. Джейн 1

1 Секция трансляционной анестезии и хирургии, Университет Лидса, 7 этаж здания клинических наук, Университетская больница Св. Джеймса, Лидс, Великобритания
2 Институт молекулярной медицины Лидса, Университет Лидса, Университетская больница Св. Джеймса, Лидс, Великобритания

Адрес для переписки: д-р Б. М. Мадхок; Электронная почта: umbm@leeds.ac.uk

Исправлено: 23 марта 2010 г.
Принято: 26 апреля 2010 г.
Опубликовано: 18 мая 2010 г.

Абстрактный

Фон
Раковые клетки сильно зависят от гликолиза. Нашей целью было определить, приведет ли переключение метаболизма с гликолиза на митохондриальное дыхание к снижению роста преимущественно колоректальных раковых клеток по сравнению с нормальными клетками, и изучить лежащие в основе этого механизмы.

Методы.
Репрезентативные линии клеток колоректального рака и нераковых клеток обрабатывались дихлорацетатом (ДХА), ингибитором киназы пируватдегидрогеназы.

Результаты
Дихлорацетат (20 мМ) не снижал рост нераковых клеток, но вызывал значительное снижение пролиферации раковых клеток ( P = 0,009), что было связано с апоптозом и остановкой клеточного цикла в фазе G 2.  Наибольший апоптотический эффект был очевиден в метастатических клетках LoVo, в которых DCA индуцировал до десятикратного увеличения количества апоптотических клеток через 48 ч. Наиболее выраженный арест в фазе G 2  был очевиден в хорошо дифференцированных клетках HT29, в которых DCA вызывал восьмикратное увеличение количества клеток в фазе G 2  через 48 ч. Дихлорацетат снижал уровень лактата в ростовой среде и индуцировал дефосфорилирование субъединицы E1 α  пируватдегидрогеназного комплекса во всех клеточных линиях, но внутренний митохондриальный мембранный потенциал был снижен только в раковых клетках ( P = 0,04).

Выводы
Ингибирование киназы пируватдегидрогеназы ослабляет гликолиз и облегчает митохондриальное окислительное фосфорилирование, что приводит к снижению роста клеток колоректального рака, но не нераковых клеток.

Ключевые слова: дихлорацетат, колоректальный рак, пируватдегидрогеназа, киназа пируватдегидрогеназы
British Journal of Cancer (2010) 102, 1746 – 1752, www.bjcancer.com
doi: 10.1038/sj.bjc.6605701

© 2010 Cancer Research UK

ВВЕДЕНИЕ

Колоректальный рак является третьим по распространенности видом рака в мире и четвертой по значимости причиной смерти от рака (Shike et al, 1990). В 2007 году колоректальный рак стал причиной 17,1 смертей на 100 000 человек в Соединенном Королевстве (UK Bowel Cancer Statistics, 2009). Несмотря на недавние достижения, прогноз для пациентов с запущенным и метастатическим колоректальным раком остается неблагоприятным. Нацеливание на метаболизм опухоли для терапии рака является быстро развивающейся областью (Pan and Mak, 2007). Ранние наблюдения относительно метаболических различий между раковыми и нормальными клетками были сделаны Отто Варбургом, который показал, что раковые клетки по своей природе зависят от гликолиза для производства химической энергии (Warburg, 1956). В настоящее время появляется все больше доказательств того, что этот повышенный гликолиз является результатом влияния множественных молекулярных путей, включая адаптивные ответы на гипоксическую микросреду опухоли, онкогенную сигнализацию и митохондриальную дисфункцию (Gatenby и Gillies, 2004; Gillies и Gatenby, 2007; Wu et al, 2007). Гликолитический фенотип дает раковым клеткам преимущества в росте, противодействуя апоптозу и способствуя распространению опухоли и метастазированию (Yeluri et al, 2009).

Ключевым регулятором клеточного метаболизма является пируватдегидрогеназа (ПДГ). Пируватдегидрогеназа преобразует пируват, полученный в результате гликолиза, в ацетил-КоА, который окисляется в цикле трикарбоновых кислот в митохондриях. Активность пируватдегидрогеназы строго регулируется ингибирующим фосфорилированием киназой пируватдегидрогеназы (ПДК). Фосфорилирование происходит на субъединице E1  α ПДГ (ПДГЭ1 α ) в трех местах: Ser 232 , Ser 293 и Ser 300  (Rardin et al, 2009). Дихлорацетат (DCA) является ингибитором всех четырех изоферментов PDK(1–4) (Stacpoole, 1989), и недавно было показано, что он снижает рост линий клеток рака легких, эндометрия и молочной железы (Bonnet et al, 2007; Wong et al, 2008; Sun et al, 2009). Сообщалось, что он снижает рост этих раковых клеток в основном за счет снижения ингибирующего фосфорилирования PDH, тем самым способствуя окислительному фосфорилированию митохондрий и вызывая апоптоз через митохондриальные, NFAT-Kv 1.5 и p53-активируемый модулятор апоптоза (PUMA)-опосредованные пути.

Было обнаружено, что клетки колоректального рака подвергаются повышенному гликолизу (Bi et al, 2006), а микроокружение опухоли является гипоксическим и ацидотическим, в основном из-за плохо развитого кровоснабжения (Dewhirst et al, 1989; Milosevic et al, 2004). Ранее мы показали, что это особенно верно для более агрессивного фенотипа (Thorn et al, 2009), и экспрессия важных маркеров гипоксии увеличивается при колоректальном раке, особенно на инвазивном крае (Rajaganeshan et al, 2008, 2009). Целью данного исследования было изучение влияния DCA на рост клеток колоректального рака в попытке изучить ингибирование PDK как новую терапевтическую стратегию против колоректального рака.

Материалы и методы

Клеточные культуры
Все клеточные линии были приобретены в Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния, США) или Европейской коллекции клеточных культур (Солсбери, Уилтшир, Великобритания): HB2 (клетки эпителия молочной железы неракового происхождения), 293 (клетки эпителия из почки эмбриона человека), HT29 (высокодифференцированная первичная колоректальная аденокарцинома), SW480 (низкодифференцированная первичная колоректальная аденокарцинома) и LoVo (метастатический левый надключичный лимфатический узел из колоректальной аденокарциномы). Клетки 293 и HB2 содержались в среде DMEM, HT29 и SW480 — в среде RPMI 1640, а LoVo — в среде F12 (все от Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки, в инкубаторе с влажностью 37°C и 5% CO2  . Для экспериментов в гипоксических условиях мы инкубировали клетки в увлажненном гипоксическом инкубаторе (1% O2 , 5% CO2 , 94% N2 , 37°C). Дихлорацетат натрия (Specials Lab, Prudhoe, Великобритания) был предоставлен фармацевтическим отделением больницы St. James's University Hospital, Лидс, Великобритания.

Анализы МТТ
Клетки (1 × 10 4 ) на лунку высевали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей. После ночной инкубации мы заменили среду на свежую среду, содержащую возрастающие дозы DCA (0, 10, 15, 20, 30, 50 и 100 мМ). Через 24 и 48 ч инкубации мы провели анализ МТТ, заменив среду на 50  мкл 1 мг мл -1  раствора МТТ, и планшеты инкубировали в темноте в течение 3 ч. Затем раствор МТТ удаляли, а темно-синие осадки формазана растворяли в 100  мкл пропан-1-ола. Оптическую плотность измеряли с помощью микропланшетного ридера (Opsys MR; Dynex Technologies Ltd, Worthing, West Sussex, UK) при 570 нм.

Анализы аннексина V и 7-AAD
Клетки высевали в колбы для культивирования тканей площадью 25 см2 и  инкубировали в течение ночи в стандартных условиях. Среду заменяли свежей средой, содержащей ряд доз DCA (0, 10, 20 и 50 мМ). Анализ проточной цитометрии проводили после 24 и 48 ч инкубации. Клетки дважды промывали холодным PBS и ресуспендировали в 1 × связывающем буфере (BD Bioscience, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) при концентрации 5 × 106 клеток  на мл. 100  мкл раствора (5 × 105 клеток  ) переносили в культуральные пробирки объемом 5 мл. Эти клетки окрашивали 5  мкл аннексина V-FITC и 10  мкл 7-AAD (BD Bioscience), осторожно встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин в темноте. После этого в каждую пробирку добавляли 400  мкл однократного связывающего буфера и анализировали в течение часа на проточном цитофлуориметре LSR II (BD Bioscience).

Анализы с йодидом пропидия
Клетки размножали, как указано для анализа апоптоза. Использовали дихлорацетат (50 мМ) и сравнивали с контролем-носителем. После сбора мы ресуспендировали клетки в 350  мкл PBS в концентрации 0,5–1,0 × 10 6  клеток на мл. К суспензии клеток добавляли 100  мкл 0,25 мг мл -1  йодида пропидия (PI)/5% Triton (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Затем добавляли 50  мкл 1 мг мл -1  рибонуклеазы A (Sigma). Пробирки с образцами тщательно встряхивали и инкубировали в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре. Проточную цитометрию проводили на проточном цитометре LSR II (BD Bioscience), а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (FlowJo, Эшленд, штат Орегон, США).

Измерения лактата
Измерения лактата в питательных средах проводились отделением химической патологии в General Infirmary, Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. Клетки инкубировали в колбах площадью 25 см2 в  течение ночи в нормоксии. На следующий день среду заменяли на ряд доз DCA (0, 10, 20 и 50 мМ). Через 48 часов инкубации мы собрали 2 мл среды во фторидные пробирки и немедленно перенесли в лабораторию химической патологии. Во время переноса пробирки хранились на льду. Уровни лактата измеряли с помощью автоматического анализатора (система Advia 1200 Chemistry; Siemens Healthcare Diagnostics, Кэмберли, Суррей, Великобритания).

Анализы TMRM
Клетки обрабатывали DCA, как описано для анализа апоптоза. После 24 и 48 ч инкубации мы промывали клетки в PBS и суспендировали 1 × 10 6  клеток на мл в буферном солевом растворе Хэнкса с 50 нМ метиловым эфиром тетраметилродамина (TMRM) (Invitrogen). 100  мкл клеточной суспензии (1 × 10 5  клеток на лунку) переносили в непрозрачные 96-луночные планшеты, инкубировали в течение 30 мин и измеряли флуоресценцию при 530/620 нм при 37 °C с помощью планшетного ридера (Mithras LB 40; Berthold Technologies, Bad, Wildbad, Германия).

Вестерн-блоттинг
Клетки обрабатывали DCA, как описано выше. Через 8 ч обработки мы извлекали белки из клеток в буфере Лэммли (2% SDS, 10% глицерина, 0,7% 2-меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего и 0,5 M Tris-HCl). Лизаты разделяли электрофорезом на гелях NuPAGE Novex 12% Bis-Tris (Invitrogen) в буфере MOPS-SDS (Invitrogen). Белки переносили на поливинилиденфторидную мембрану (GE Healthcare, Chalford St Giles, Bucks, UK). Мембрану блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 5% обезжиренном молоке в TBS-T (трис-буферный физиологический раствор с 0,1% Tween). Затем мембрану зондировали первичными антителами в 1% обезжиренном молоке в TBS-T в течение 90 мин, промывали в TBS-T, а затем зондировали соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), в течение 60 мин. Первичные антитела: кроличьи поликлональные фосфодетектные анти-PDH-E1 α  (pSer 293 ), 1 : 500 (AP1062; EMD Chemicals, Дармштадт, Германия), и мышиные моноклональные анти-PDHE1 α , 1 : 500 (459400; Invitrogen). Вторичные антитела антикроличьи или антимышиные конъюгаты HRP, 1 : 1000 (Dako, Glostrup, Дания). Белки визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата Supersignal West Pico или Femto (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США) и системы Chemidoc XRS (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).  В качестве контроля нагрузки использовали β -актин.

Статистический анализ
Данные проточной цитометрии были получены с использованием специального программного обеспечения, BD FACSDiva 6.0 и программного обеспечения FlowJo. Статистический анализ был выполнен с использованием SPSS для Windows (SPSS версии 15.0, Чикаго, Иллинойс, США). Различия между группами, получавшими DCA, и контрольными группами, получавшими плацебо, оценивались с использованием  U -критерия Манна-Уитни и 95% доверительных интервалов разницы средних значений между двумя группами.  Значение P менее 0,05 считалось статистически значимым. Данные представлены как среднее значение по меньшей мере из трех независимых экспериментов, а планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего значения.

Результаты

DCA снижает пролиферацию раковых клеток, и эффект схож при нормоксии и гипоксии
Во-первых, мы хотели определить, ингибирует ли лечение DCA клеточную пролиферацию и будет ли дифференциальный ответ в раковых и нераковых клетках в нормоксических и гипоксических условиях. Что касается гипоксии, наша гипотеза заключалась в том, что влияние DCA будет особенно сильным при уровнях кислорода, которые недостаточны для поддержки дополнительного окислительного фосфорилирования. Все клеточные линии (HB2, 293, HT29, SW480 и LoVo) обрабатывали диапазоном доз DCA в течение 24–48 ч в нормоксических и гипоксических условиях. Относительное количество клеток оценивали с помощью анализов MTT.

Обработка возрастающими дозами DCA снижала клеточную пролиферацию дозозависимым образом (рисунок 1A-D). Вопреки нашим ожиданиям, профили снижения роста клеток были схожи при гипоксии и нормоксии. Через 24 и 48 ч до 20 мМ DCA не влияли на рост культур нераковых клеток, HB2 и 293. Однако 20 мМ DCA значительно снижали рост культур всех трех линий клеток колоректального рака ( P ⩽ 0,009). Эффект DCA был сильнее на слабодифференцированных клетках SW480 и метастатических клетках LoVo, чем на хорошо дифференцированных клетках HT29. Рост культур клеток LoVo, обработанных 20 мМ DCA, снижался до 40% по сравнению с клетками, обработанными контрольным раствором. Поскольку наблюдалась сравнительно небольшая разница в снижении роста культур, обработанных ДХА в условиях гипоксии и нормоксии, дальнейшие эксперименты проводились только в условиях нормоксии.

Рисунок 1. Дихлорацетат (20 мМ) не оказал значительного снижения роста культур нераковых клеток 293 и HB2, но вызвал значительное снижение роста культур всех клеток колоректального рака ( * P ⩽ 0,009). Клетки обрабатывали различными дозами DCA или контрольным раствором в условиях нормоксии ( A  и  C ) или гипоксии ( B  и  D ), а относительное количество жизнеспособных клеток оценивали через 24 ч ( A  и  B ) и 48 ч ( C  и  D ) с помощью анализа МТТ. Данные выражены в процентах от контроля (доза 0 мМ) ( *  – значительное различие относительно контроля – белый столбец (0 мМ)).

DCA способствует апоптозу в раковых клетках, щадя нераковые клетки
Далее мы хотели исследовать, было ли связано снижение роста культур при обработке DCA с индукцией апоптоза. Клетки обрабатывали диапазоном доз DCA (0, 10, 20 и 50 мМ) в течение 24 и 48 ч, и доля клеток, подвергающихся апоптозу, оценивалась путем обнаружения мембранного фосфатидилсерина с аннексином V-FITC. Клетки окрашивали аннексином V-FITC и витальным красителем 7-AAD и анализировали с помощью проточной цитометрии. Была дозозависимая индукция апоптоза в линиях раковых клеток через 24 и 48 ч обработки, с небольшим, если вообще, апоптозом, вызванным в нераковых клетках (рис. 2A и B). Наибольший эффект наблюдался в метастатических клетках LoVo; 50 мМ DCA вызвал десятикратное увеличение доли апоптотических клеток через 48 ч, тогда как наблюдалось семи- и пятикратное увеличение клеток HT29 и SW480 соответственно. Увеличение среднего процента от общего числа апоптотических клеток при 50 мМ DCA составило: 2,8 (95% ДИ: 2–3) в клетках HT29, 3,5 (95% ДИ: 2–5) в клетках SW480 и 21 (95% ДИ: 8–34) в клетках LoVo. Был минимальный апоптоз, индуцированный в 293 клетках даже при 50 мМ DCA, 0,2 (95% ДИ: −0,2 до 0,6). В клетках HB2 наблюдалось незначительное снижение процента апоптотических клеток при обработке 50 мМ DCA, −0,9 (95% ДИ: −2,2 до 0,4).

Рисунок 2. Дихлорацетат индуцировал дозозависимое увеличение процента апоптотической популяции в раковых клетках с минимальным апоптозом в нераковых клетках. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 ч ( A ) и 48 ч ( B ), окрашивали аннексином V-FITC и 7-AAD и анализировали с помощью проточной цитометрии. Точки данных представляют собой среднее значение (±sd) трех независимых экспериментов для 0 и 50 мМ DCA ( *  – значимое различие относительно контроля).

DCA вызывает остановку фазы G 2  в клетках колоректального рака, но не влияет на профиль клеточного цикла нераковых клеток 293
Мы также хотели изучить, было ли снижение роста культур при обработке DCA связано с индукцией остановки роста. Клетки обрабатывали 50 мМ DCA в течение 24 или 48 ч, а профили клеточного цикла анализировали с помощью проточной цитометрической оценки содержания ДНК после окрашивания PI. Обработка дихлорацетатом вызвала изменения в профилях клеточного цикла всех раковых клеток, но не повлияла на нераковые клетки. Изменения в профиле клеточного цикла были обнаружены через 24 ч обработки и сохранялись через 48 ч (рисунок 3A и B).

Рисунок 3. Дихлорацетат вызвал остановку фазы G 2  в клетках колоректального рака без влияния на профили клеточного цикла нераковых клеток; 293 и HB2. Клетки обрабатывали 50 мМ DCA или контрольным раствором в течение 24 ч ( A ) и 48 ч ( B ), окрашивали PI и анализировали с помощью проточной цитометрии. Для анализа статистической значимости мы сравнили среднюю долю клеток в каждой фазе клеточного цикла (G 1 , S и G 2 ) в клетках, обработанных DCA, со средней долей клеток в соответствующих фазах в необработанных клетках ( *  – значимое различие по сравнению с контролем).

После 48 ч обработки 50 мМ DCA наблюдалось восьмикратное увеличение клеток в фазе G 2  в клетках HT29 и SW480 и трехкратное увеличение клеток LoVo. Увеличение среднего процента всех раковых клеток в фазе G 2  составило: 21 (95% ДИ: 13–30) для клеток HT29, 19 (95% ДИ: 13–24) для клеток SW480 и 14 (95% ДИ: 10–21) для клеток LoVo; тогда как не было никакой разницы в клетках 293, 1 (95% ДИ: −4 до 7), и клетках HB2, −0,3 (95% ДИ: −9 до 9). Было соответствующее уменьшение клеток в фазе G 0 /G 1  во всех линиях раковых клеток. Интересно, что в клетках HT29 наблюдалось небольшое снижение, но в клетках SW480 и LoVo наблюдалось значительное увеличение доли клеток, считающихся находящимися в фазе S (см. раздел «Обсуждение»). Профиль клеточного цикла клеток 293 и HB2 изменился минимально при обработке DCA.

DCA снижает внеклеточный уровень лактата в питательной среде

Чтобы установить, коррелируют ли изменения в росте и апоптозе, вызванные DCA, со снижением гликолиза, мы измерили уровни лактата в ростовой среде. Молочная кислота является конечным продуктом гликолиза. Если бы DCA вызывал митохондриальное окислительное фосфорилирование, пируват декарбоксилировался бы до ацетил-КоА и не восстанавливался бы до лактата, следовательно, уровни лактата в ростовой среде снизились бы. Уровни лактата в ростовой среде всех клеточных линий измеряли через 48 ч обработки диапазоном доз DCA (рисунок 4). Уровни лактата определяли с помощью автоматического анализатора, который обычно используется для биохимического измерения уровней лактата; анализы основаны на колориметрической реакции, катализируемой лактатоксидазой. Обработка DCA снижала внеклеточные уровни лактата в ростовой среде дозозависимым образом во всех раковых и нераковых клеточных линиях.

Рисунок 4. Дихлорацетат снижал уровень лактата в питательной среде в зависимости от дозы как в раковых, так и в нераковых клетках. Клетки обрабатывались различными дозами DCA в течение 48 часов, а внеклеточные уровни лактата измерялись в питательной среде с помощью автоматического анализатора. Результаты выражены как относительные к контролю.

DCA деполяризует внутреннюю митохондриальную мембрану в клетках колоректального рака, но не в нераковых клетках
Чтобы проверить, была ли индукция апоптоза в раковых клетках при лечении DCA связана с усилением митохондриального окислительного фосфорилирования, мы измерили внутренний митохондриальный мембранный потенциал (ΔΨm). Эскалация митохондриального дыхания реактивировала бы цепь переноса электронов и снизила бы гиперполяризованный ΔΨm в раковых клетках. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 и 48 часов и окрашивали красителем TMRM, который позволяет проводить флуоресцентное измерение ΔΨm.

Как и в предыдущих экспериментах, эффект DCA был очевиден через 24 часа обработки и сохранялся через 48 часов (рисунок 5A и B). Обработка дихлорацетатом снизила гиперполяризованный ΔΨm во всех раковых клетках дозозависимым образом. Дихлорацетат не оказал никакого влияния на ΔΨm нераковых клеток HB2, тогда как, что удивительно, ΔΨm нераковых клеток 293 увеличился дозозависимым образом. Через 24 часа обработки 50 мМ DCA значительно снизили ΔΨm во всех раковых клетках; однако в клетках LoVo наблюдалось значительное снижение даже при 20 мМ DCA (рисунок 5A,  P = 0,02). В нераковых клетках 293 наблюдалась тенденция к увеличению ΔΨm при обработке DCA, хотя это не было статистически значимым ( P = 0,08). Через 48 ч лечения наблюдалось значительное снижение ΔΨm во всех раковых клетках и увеличение в 293 клетках при 20–50 мМ DCA (рисунок 5B,  P ⩽ 0,04).

Рисунок 5. Обработка дихлорацетатом снизила внутренний митохондриальный мембранный потенциал (ΔΨm) во всех раковых клетках, увеличила ΔΨm в нераковых клетках 293 и не оказала никакого влияния на ΔΨm в нераковых клетках HB2. Клетки обрабатывали дозами DCA в течение 24 ч ( A ) и 48 ч ( B ), окрашивали TMRM, а флуоресценцию измеряли при 530/620 нм при 37°C ( *  – значительная разница по сравнению с контролем).

Обработка DCA приводит к дефосфорилированию  субъединицы PDHE1 α
. Считается, что DCA ингибирует все четыре изофермента PDK и, следовательно, снижает фосфорилирование субъединицы PDHE1 α  , что, в свою очередь, приводит к активации комплекса PDH. Чтобы проверить, происходило ли дефосфорилирование PDHE1 α  при обработке DCA в используемых клеточных линиях, мы использовали вестерн-блот-анализы лизатов обработанных и необработанных клеток DCA. Во всех клеточных линиях обработка 20 мМ DCA в течение 8 ч вызвала резкое снижение сигнала фосфорилирования на сайте pSer 293  , но никаких изменений в уровнях общего PDHE1 α обнаружено не было  (рисунок 6). Фосфо-специфические антитела для двух других сайтов фосфорилирования, Ser 232  и Ser 300 , пока не доступны в продаже.

Рисунок 6. Обработка дихлорацетатом снизила фосфорилирование PDHE1 α  на сайте pSer 293  , не оказав влияния на уровни общего PDHE1 α  во всех исследованных клеточных линиях. Лизаты цельных клеток были приготовлены после обработки клеток 20 мМ DCA в течение 8 ч и из необработанных клеток, и были проведены анализы вестерн-блоттинга.

Обсуждение

Мы показали, что DCA вызывает дозозависимое снижение роста  in vitro  культур колоректальных раковых клеток и нераковых клеток. Однако раковые клетки были более чувствительны к DCA, при этом доза 20 мМ вызывала значительное ингибирование роста раковых клеток, но оказывала незначительное влияние на нераковые клетки. Мы показали, что компоненты этого дифференциального эффекта следующие: мощная индукция апоптоза и остановка клеточного цикла в раковых клетках, но не в нераковых клетках.

Эти выводы подтверждают простую модель дифференциальной чувствительности к DCA. Однако некоторые данные требуют дальнейшего обсуждения. Во-первых, 50 мМ DCA снизили рост культур нераковых клеток 293 и HB2, однако не наблюдалось увеличения апоптотических клеток или изменения профиля клеточного цикла этих клеток. Возможным объяснением этих результатов может быть то, что эта доза DCA привела к более медленному прохождению этих нераковых клеток через все стадии клеточного цикла, не изменяя относительных пропорций в пределах каждой стадии. Во-вторых, наши результаты указывают на то, что DCA вызвал остановку G 2  в клетках колоректального рака. Это контрастирует с предыдущими исследованиями, которые показали остановку G 1  или отсутствие изменений в профиле клеточного цикла при лечении DCA (Cao et al, 2008; Wong et al, 2008). Wong et al (2008) показали повышенную экспрессию PUMA во всех линиях клеток эндометриального рака, которые имели апоптотический ответ на DCA, и пришли к выводу, что эта активация p53 привела к остановке G 1.  Однако клетки колоректального рака в нашем исследовании остановились в фазе G 2  при лечении DCA, и мы не обнаружили никакой индукции p53 DCA в наших линиях клеток колоректального рака (данные не показаны). Интересно, что Cao et al (2008) обнаружили, что сочетание DCA и радиотерапии остановило клетки рака простаты в фазе G 2  , хотя DCA сам по себе не влиял на профиль клеточного цикла. В-третьих, в клетках SW480 и LoVo лечение DCA привело к увеличению доли клеток, которые, как считается, находятся в фазе S. Это предполагает увеличение пролиферации, а также индукцию апоптоза. Аналогичное открытие было сообщено Wong et al (2008) в одной из нескольких протестированных клеток эндометриального рака. Альтернативное объяснение заключается в том, что часть клеток, находящихся в «S-фазе» после обработки линий раковых клеток DCA, на самом деле представляют собой апоптотические клетки в области «sub-G2 » , как это было ранее описано для клеток лимфомы (Klucar и Al-Rubeai, 1997).

Изменения в клеточном метаболизме при лечении DCA
DCA, по-видимому, подавлял выработку молочной кислоты из пирувата как в раковых, так и в нераковых клетках. Кроме того, лечение DCA приводило к дефосфорилированию PDHE1 α и, следовательно, активации PDH во всех исследованных клеточных линиях. Следовательно, основа дифференциального эффекта DCA на раковые и нераковые клетки может заключаться в его влиянии на митохондриальную функцию. Лечение DCA снижало высокий ΔΨm всех раковых клеток, но не нераковых клеток. Это говорит о том, что DCA, ингибируя PDK и, следовательно, активируя PDH, стимулирует митохондриальное дыхание, что приводит к деполяризации внутренней митохондриальной мембраны, и индуцирует апоптоз по проксимальному митохондриальному пути, как описано в предыдущих исследованиях (Bonnet et al, 2007; Cao et al, 2008; Wong et al, 2008). Индукция апоптоза и изменения в митохондриальной функции были наиболее выражены в высокоинвазивных и метастатических клетках LoVo, чем в менее инвазивных клетках HT29 и SW480. Это может иметь клинические последствия для лечения метастатического колоректального рака, поскольку обычно именно высокоинвазивные метастатические раковые опухоли наиболее устойчивы к традиционной химиотерапии и могут быть наиболее чувствительны к ингибированию PDK. В поддержку этого недавнее исследование показало, что колоректальные опухоли, устойчивые к 5-фторурацилу, с большей вероятностью имеют повышенный гликолиз и, следовательно, более поддаются терапии, направленной на метаболизм рака (Шин и др., 2009). В этом отношении наши результаты противоречат выводам Вонга и др. (2008), которые обнаружили, что высокоинвазивные клетки рака эндометрия наиболее устойчивы к лечению DCA.

Ингибирование PDK в качестве терапии рака против колоректального рака
Мы обнаружили, что дозы 20–50 мМ DCA давали дифференциальные ответы между раковыми и нераковыми клетками. Таким образом, потенциальные терапевтические дозы DCA будут находиться в диапазоне от 20 до 50 мМ. Кроме того, недавнее исследование показало, что IC 50  DCA для клеток рака молочной железы составляет от 20 до 30 мМ (Ko и Allalunis-Turner, 2009). Это контрастирует с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что DCA снижает пролиферацию и вызывает апоптоз в раковых клетках при дозах всего 0,5–10 мМ (Bonnet et al, 2007; Wong et al, 2008; Sun et al, 2009). Было обнаружено, что дихлорацетат относительно безопасен для людей при использовании для лечения лактоацидоза (Stacpoole et al, 2003). Основные побочные эффекты при дозе до 100 мг/кг DCA  оказываются на нервную систему и печень, вызывая легкую седацию или сонливость, обратимую периферическую невропатию и легкое бессимптомное повышение уровня сывороточных трансаминаз, отражающее повреждение гепатоцеллюлярной ткани (Stacpoole et al, 1998). Кроме того, недавние исследования показали, что DCA эффективно снижает рост опухоли в клинически достижимых дозах как  in vitro  , так и  in vivo  (Bonnet et al, 2007; Sun et al, 2009). Было высказано предположение, что DCA может быстро перейти на раннюю фазу клинических испытаний рака (Michelakis et al, 2008). Однако доза DCA, необходимая для ингибирования роста клеток колоректального рака в нашем исследовании, вряд ли будет достигнута клинически без возникновения значительных побочных эффектов. Доза DCA, необходимая для достижения эквивалентных концентраций в плазме  in vivo,  будет примерно в пять-десять раз больше, чем та, которая используется в клинических испытаниях против лактатацидоза. Похоже, что клетки колоректального рака, использованные в нашем исследовании, более устойчивы к DCA, чем клетки рака легких, эндометрия и молочной железы. Интересно, что Сан и др. (2009) в своем исследовании клеток рака молочной железы обнаружили, что DCA подавляет пролиферацию раковых клеток, но не вызывает апоптоз или гибель клеток. Эти результаты заметно отличались от эффектов DCA, наблюдаемых на клетках рака легких (Бонне и др., 2007), эндометрия (Вонг и др., 2008) и колоректального рака в нашем исследовании. Таким образом, хотя DCA подавляет рост различных раковых клеток, эффект и основные механизмы, по-видимому, зависят от типа клеток. Вероятным объяснением этих дифференциальных эффектов может быть разница в экспрессии изоферментов PDK в исследованных раковых клетках. Дихлорацетат является неспецифическим ингибитором PDK (Whitehouse и Randle, 1973) и имеет различную  Ki для  каждого из четырех изоферментов PDK (Bowker-Kinley et al ,1998). Кроме того, известно, что четыре изофермента PDK по-разному экспрессируются в различных тканях. Таким образом, необходимо разработать ингибиторы для отдельных изоферментов PDK, которые должны позволять проводить специфичные для типа раковых клеток метаболические манипуляции.

Дихлорацетат восстанавливает химиочувствительность колоректального рака через p53/miR-149-3p/PDK2-опосредованный путь метаболизма глюкозы

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1038/s41388-019-1035-8

Yu Liang1, Lidan Hou1, Linjing Li1, Lei Li1, Liming Zhu1, Yu Wang1, Xin Huang1, Yichao Hou1, Danxi Zhu1, Huimin Zou1, Yan Gu2, Xiaoling Weng3,4, Yingying Wang5, Yue Li6, Tianqi Wu3, Mengfei Yao3, Isabelle Gross7,8, Christian Gaiddon9,10, Meng Luo2, Jianhua Wang3, Xiangjun Meng1

1 Отделение гастроэнтерологии, Девятая народная больница Шанхая, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай
2 Отделение общей хирургии, Девятая народная больница Шанхая, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай

3

Онкологический институт, Шанхайский онкологический центр Университета Фудань, Университет Фудань, Шанхай, Китай

4

Ningbo Aitagene Technology Co. LTD, Шанхай, Китай
5 Кафедра биохимии и молекулярной и Клеточная биология, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай
6 Центр патологии, Первая народная больница Шанхая, Медицинская школа Шанхайского университета Цзяо Тун, Шанхай, Китай

7

INSERM UMR_S1113, Страсбург F-67200, Франция

8

FMTS, Страсбургский университет, Страсбург F-67000, Франция
9Universite de Strasbourg, Inserm IRFAC UMR_S1113, Laboratory Stress Response and Innovative Therapy «Streinth», Strasbourg 67200, France
10 CLCC Paul Strauss, Strasbourg, France

Meng Luo luotysy@sina.com
Jianhua Wang jianhuaw2007@qq.com
Xiangjun Meng meng_xiangjun@yahoo.com
Эти авторы внесли равный вклад: Yu Liang, Lidan Hou

Received: 16 марта 2019 г.
Пересмотрено: 17 сентября 2019 г.
Принято: 19 сентября 2019 г.
Опубликовано: 9 октября 20199 октября 2019 г

Аннотация

Развитие химиорезистентности остается одной из основных проблем, объясняющих летальность при колоректальном раке (КРР). Дихлорацетат (ДХА) первоначально использовался как регулятор метаболизма при лечении метаболических заболеваний; здесь ДХА был исследован для выявления механизмов, лежащих в основе химиорезистентности CRC. Мы обнаружили, что DCA заметно повышает химиочувствительность клеток CRC к флуороурацилу (5-FU) и снижает образование колоний из-за высокого уровня апоптоза. Используя анализ микрочипов, мы отметили, что miR-149-3p участвует в химиорезистентности CRC, которая была модулирована p53 дикого типа после лечения DCA. Кроме того, PDK2 был идентифицирован как прямая мишень miR-149-3p. Механический анализ показал, что сверхэкспрессия miR-149-3p усиливала 5-FU-индуцированный апоптоз и снижала метаболизм глюкозы, аналогично эффектам нокдауна PDK2. Кроме того, сверхэкспрессия PDK2 частично отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на метаболизм глюкозы. Наконец, было установлено, что лечение DCA и сверхэкспрессия miR-149-3p в клетках CRC, устойчивых к 5-FU, заметно повышают чувствительность к химиотерапевтическому эффекту 5-FU in vivo, и этот эффект также был подтвержден в небольшой ретроспективной когорте пациентов CRC. В целом, мы определили, что сигнальный путь p53/miR-149-3p/PDK2 потенциально может быть направлен на лечение DCA для преодоления химиорезистентности CRC.

Дополнительная информация: Онлайн-версия этой статьи (https:// doi.org/10.1038/s41388-019-1035-8) содержит дополнительные материалы, которые доступны авторизованным пользователям.

Введение

Колоректальный рак (КРР) является четвертой ведущей причиной смертности от рака в Китае [1] и второй ведущей причиной смертности от рака в США [2], что в основном объясняется метастазированием и неудачей химиотерапии из-за устойчивости к лекарствам, что приводит к ~50 000 смертей ежегодно [3].

В последнее время, хотя появившаяся звезда PD1/PDL1 привлекла большой интерес, и все больше биотерапевтических агентов показывают обнадеживающие результаты в лечении рака, ограниченный уровень эффективности и неизбежные побочные эффекты сдерживают их использование в клинике [4,5]. В настоящее время химиотерапия по-прежнему является основным методом выбора в клинике, особенно для пациентов с неоперабельными поздними стадиями и метастатическим раком [6], но развитие лекарственной устойчивости остается самым большим ограничением в химиотерапии [7]. Следовательно, изучение механизмов лекарственной устойчивости и поиск новых комбинаций классических противораковых препаратов для оптимизации эффективности может принести пользу в лечении КРР. Поскольку фторурацил (5-FU) является наиболее часто используемым химиотерапевтическим препаратом при РПК, в данном исследовании использовались 5-FUрезистентные клеточные линии РПК [8,9].

Нарушение метаболизма глюкозы представляет собой один из основных аспектов отличительных признаков рака [10]. Известно, что развитие неконтролируемой клеточной массы приводит к плохой васкуляризации опухоли, что вызывает снижение поступления кислорода. Следовательно, раковые клетки адаптируются к изменениям в микроэнвироменте, переключая свой метаболизм с окислительного обмена на гликолитический, который основан на снабжении глюкозой и производит лактат. Этот сдвиг называется «эффектом Варбурга» и обычно наблюдается в различных раковых клетках как одна из замечательных отличительных черт [11- 13]. Накопление данных последних исследований привело к необходимости уточнения теории Варбурга [14]; например, было показано, что метаболический сдвиг вовлечен в химиорезистентность [15]; следовательно, для преодоления химиорезистентности потенциально может быть использовано воздействие на метаболизм раковых клеток [16,17].

В частности, сообщалось о многочисленных механизмах контроля метаболического сдвига в раковых клетках, включая микроРНК (миРНК) [18-20]. МиРНК представляют собой класс малых эндогенных некодирующих РНК, которые регулируют трансляцию и деградацию мРНК [21] и вовлечены во многие другие биологические процессы, включая клеточную пролиферацию, миграцию, апоптоз, самообновление, инициацию, развитие рака и химиорезистентность [22-24].

Полученные данные свидетельствуют о том, что воздействие на аномальный метаболизм раковых клеток стало интенсивным направлением исследований, нацеленных на «удушение опухоли», стратегии которых заключаются в ингибировании ключевых ферментов, участвующих в гликолитическом метаболизме [15]. В данной рукописи дихлорацетат (ДХА) первоначально использовался для лечения молочнокислого ацидоза и наследственной митохондриальной болезни [25]. ДХА ингибирует ферментативную активность киназ пируватдегидрогеназы (PDK1-4), которая необходима для превращения пирувата в ацетил-КоА, связывая гликолитический метаболизм с циклом лимонной кислоты [26,27]; недавно сообщалось, что ДХА обладает противораковым действием [28-31]. Однако механизм, лежащий в основе влияния ДКА на лечение CRC, остается неустановленным.

Настоящее исследование было посвящено изучению молекулярного механизма, участвующего в регуляции метаболизма глюкозы и устойчивости к химиотерапии в CRC. Используя DCA в клетках CRC, мы изучили роль соответствующих миРНК и тем самым раскрыли сигнальный путь, объясняющий устойчивость к лечению 5-ФУ.

Результаты

DCA восстанавливает химиочувствительность клеток CRC, устойчивых к 5-FU
Сообщалось, что DCA является эффективным противоопухолевым препаратом, который действует на энергетические пути в некоторых видах рака [32]; однако влияние DCA на химиорезистентные клетки CRC не было изучено. Используя анализ CCK8, мы обнаружили, что по сравнению с родительскими клеточными линиями HCT-8 и HCT116, устойчивые к 5-ФУ клетки HCT-8/F и HCT116/F были нечувствительны к 5-ФУ (Дополнительный рис. 1A), а полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC50) DCA в клетках HCT-8/F и HCT116/F составляли ~15 и 20 мМ, соответственно, что согласуется с предыдущими сообщениями [33, 34] (Дополнительный рис. 1B). Далее мы отметили, что DCA значительно подавлял синтез ДНК (дополнительная рис. 1С, верхняя панель) и индуцировал генерацию ROS (дополнительная рис. 1С, нижняя панель) в устойчивых к 5-FU клетках CRC. Маркеры энергетического метаболизма, включая потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз, были заметно повышены в клетках CRC, устойчивых к 5-FU, по сравнению с клетками CRC, чувствительными к 5-FU, в то время как добавление DCA заметно снижало экспрессию этих маркеров (рис. 1a). Учитывая 6 ч предварительной обработки без сыворотки при измерении гликолиза, использовали набор для определения гликолитической скорости Seahorse XF, чтобы устранить эффект предварительной обработки и измерить гликолитическую скорость в реальном времени. Скорость гликолитического оттока протонов (glycoPER) отражает скорость внеклеточного закисления в результате гликолиза. Добавление DCA значительно снижало индуцированный гликолиз по сравнению с соответствующим контролем (рис. 1b и дополнительный рис. 1D).

Рисунок S1. DCA оказывает противоопухолевое действие
(A) Клетки CRC обрабатывали различными концентрациями 5-ФУ в течение 24 часов. Рассчитывали IC50 5-ФУ в каждой клетке. (B) Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали различными концентрациями DCA в течение 24 часов. Рассчитывали IC50 DCA в каждой клетке. (C) Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 часов. Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания Edu (верхняя панель) и репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания ROS (нижняя панель), масштабная линейка: 200 мкм. (D) Определение скорости гликолиза, включая базальный гликопер, индуцированный гликопер и компенсаторный гликопер, рассчитывали с помощью Seahorse Glycolytic Rate Assay Report Generator. (E) Рост клеток определяли с помощью анализа CCK8 после обработки 5-FU и DCA. Диапазон доз 5-ФУ составлял от 100 мкг/мл до 500 мкг/мл для клеток HCT-8/F и от 25 мкг/мл до 150 мкг/мл для клеток HCT116/F. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент проводился в 3-6 биологических репликах. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

DCA значительно преодолевал резистентность к 5-ФУ в клетках HCT-8/F и HCT116/F, что проявлялось в измерении роста клеток (Дополнительный рис. 1E). Способность к образованию колоний была значительно подавлена (рис. 1c), а апоптоз был заметно индуцирован при комбинированном лечении (рис. 1d), все из которых были дополнительно оценены количественно. Эти результаты свидетельствуют о том, что DCA может восстанавливать химиочувствительность клеток CRC, устойчивых к 5-FU.

Рисунок 1. DCA восстанавливает хемочувствительность устойчивых к 5-FU клеток CRC путем изменения метаболизма глюкозы. a Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. Измеряли потребление глюкозы, продукцию лактата и гликолиз клеток CRC. b Гликопер измеряли в режиме реального времени при введении 15/20 мМ DCA, 0,5 мкМ Rot + AA и 50 мМ 2-DG с помощью прибора Seahorse XF. c, d Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали DCA (15 мМ)/5-FU (50 мкг/мл) и DCA (20 мМ)/5-FU (25 мкг/мл), соответственно. Образование колоний определяли с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым. Апоптоз клеток измеряли путем окрашивания Annexin V/PI. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент проводился в трех биологических репликах. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001

miR-149-3p играет решающую роль в химиочувствительности клеток CRC
миРНК считаются перспективным терапевтическим инструментом благодаря их влиянию на подавление опухоли [35]. В связи с этим мы сначала определили профили экспрессии миРНК с помощью массива миРНК, содержащего 2059 человеческих миРНК. В общей сложности 119 миРНК дифференциально экспрессировались в ответ на DCA в клетках HCT116 (рис. 2a и дополнительный рис. S2A). Среди них уровни экспрессии восьми миРНК были дополнительно подтверждены количественной ПЦР в реальном времени (рис. 2b), и было установлено, что miR-149-3p повышается под действием ДКА в дозозависимой манере (дополнительный рис. S2B).

Далее мы обнаружили, что клетки HCT116 с более высоким базальным уровнем miR-149-3p обладают большей чувствительностью к 5-FU и L-OHP, как показано на дополнительном рис. 2C. Более того, трансфекция клеток HCT116 анти-miR-149-3p значительно снижала химиотерапевтический эффект 5-FU (Дополнительный рис. 2D-E). Примечательно, что уровни miR-149-3p в химиочувствительных клетках CRC были значительно выше, чем в химиорезистентных клетках CRC (рис. 2c). Поэтому трансфекция мимиков miR-149-3p значительно увеличивала скорость ингибирования; способствовала апоптозу клеток, индуцированному 5-FU; снижала потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз в клетках HCT-8/F и HCT116/F (рис. 2d-f). Анализ гликолитической скорости Seahorse XF показал, что экспрессия miR-149-3p снижала базальный гликопер в устойчивых к 5-ФУ клетках CRC, что согласуется с вышеприведенными результатами (рис. 2g и дополнительный рис. 2F). Эти результаты позволяют предположить, что miR-149-3p благоприятствует преодолению химиорезистентности в клетках CRC.

Рисунок S2. Нокдаун miR-149-3p снижает химиорезистентность
(A) Тепловая карта профиля дифференциально экспрессированных микроРНК в клетках HCT116, обработанных контролем, 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ DCA в течение 24 часов. (B) Тотальная РНК была получена через 24 часа после обработки 10/7,5 мМ и 20/15 мМ DCA из клеток HCT116 и HCT-8. Уровень miR-149-3p анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. (C) Клетки HCT-8 и HCT116 обрабатывали различными концентрациями 5-FU и оксалиплатина (L-OHP) соответственно в течение 24 часов и рассчитывали половину максимальной ингибирующей концентрации (IC50) (левая панель). Базальные уровни miR-149-3p определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в клетках HCT-8 и HCT116 (правая панель). (D-E) Клетки HCT116 были трансфицированы Anti-NC или ингибитором miR-149-3p. После трансфекции клетки обрабатывали 25 мкг/мл 5-ФУ в течение 24 часов. Рост и апоптоз клеток определяли с помощью CCK8 и проточной цитометрии соответственно. (F) Определение скорости гликолиза, включая базальный гликопер и компенсаторный гликопер в 5-FU-резистентных CRC-клетках, трансфицированных NC или мимиком miR-149-3p, рассчитывали с помощью Seahorse Glycolytic Rate Assay Report Generator. Данные трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент проводился в 3-6 биологических репликах. *p < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ns, нет значимости.

Рисунок 2. miR-149-3p повышает химиочувствительность 5-FU в CRC. a Тепловая карта профиля дифференциально экспрессированных микроРНК в клетках HCT116, обработанных 20 мМ DCA в течение 24 ч. b Из клеток HCT116 готовили тотальную РНК через 24 ч после обработки DCA. Очевидные изменения микроРНК после обработки ДКА были определены с помощью количественной ПЦР в реальном времени. c Общая РНК была получена из клеток HCT116, HCT116 /F, HCT-8 и HCT-8/F. Базальные уровни miR-149-3p были измерены количественной ПЦР в реальном времени. d, e Клетки HCT-8/F и HCT116/F были трансфицированы NC и мимиком miR-149-3p в течение 24 ч, после чего клетки обрабатывались 5-ФУ (50 мкг/мл для HCT-8/F и 25 мкг/мл для HCT116/F) или без него. Измеряли скорость ингибирования и скорость апоптоза. f, g Измеряли потребление глюкозы, продукцию лактата, гликолиз и гликоПЭР клеток CRC, трансфицированных NC или мимиком miR-149-3p. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент содержал не менее трех биологических реплик. *P<0,05; **P<0,01

DCA индуцирует экспрессию miR-149-3p через p53 дикого типа (wt)
Учитывая, что несколько недавних исследований показали, что miR-149-3p регулируется несколькими препаратами [36,37], мы определили, как miR-149-3p регулируется DCA. Мы обнаружили, что DCA значительно увеличивает экспрессию wt p53 и его нижележащих сигналов, включая экспрессию p21, PUMA и MDM2, в клетках CRC (рис. 3a, b). Более того, мы отметили, что изменения в экспрессии wt p53 способны значительно модулировать экспрессию miR-149-3p, как показано на рис. 3c, d, что указывает на то, что miR-149-3p положительно регулируется wt p53. Поэтому, используя р53-нулевую клеточную линию HCT116 (TP53-/-), мы обнаружили, что miR-149-3p не повышалась при обработке DCA, но эктопическая экспрессия р53 отменяла этот эффект. Более того, мы использовали nutlin-3, мощный ингибитор, который подавляет взаимодействие MDM2-p53, что приводит к активации p53 в качестве положительного контроля, при этом экспрессия miR-149-3p была повышена в wt линии клеток HCT116 (TP53+/+) (рис. 3e-g). С помощью программного обеспечения для биоинформационного анализа (IGV) были предсказаны четыре предполагаемых сайта связывания р53 с фланкирующим участком геномной ДНК miR-149. Затем в клетках были проведены анализы ChIP с использованием антитела против wt p53. Вытянутая ДНК была амплифицирована с помощью обычной ПЦР с праймерами, которые были разработаны на основе этих сайтов. Наши результаты показали, что по сравнению с регионом 4, регион 3 был заметно обогащен после обработки DCA в хроматине HCT116, иммунопреципитированном wt p53 (рис. 3h), что указывает на то, что только регион 3 содержит специфический сайт связывания, активируемый DCA. Эти результаты показывают, что DCA модулирует miR-149-3p через wt p53.

Рисунок 3. DCA индуцирует экспрессию miR-149-3p через p53. a Клетки HCT116 и HCT-8 обрабатывали 20 мМ и 15 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. Экспрессию p53 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. b Уровни мРНК p21, puma и MDM2 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. c Клетки HCT116 и клетки HCT-8 были трансфицированы siRNA р53, плазмидой р53 и соответствующим отрицательным контролем в течение 48 ч. Экспрессия р53 определялась с помощью Вестерн-блот анализа. d Экспрессия miR-149-3p измерялась с помощью количественной ПЦР в реальном времени. e Клетки TP53-/- HCT116 обрабатывались DCA, а клетки TP53+/+ HCT116 обрабатывались нутлином-3. Экспрессию р53 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. f TP53-/- HCT116 клетки обрабатывали DCA в течение 24 ч или трансфецировали плазмидой р53 или контрольной плазмидой. g TP53+/+ HCT116 клетки обрабатывали DCA и nutlin-3 в течение 24 ч или трансфецировали р53 siRNA после обработки DCA. Экспрессия miR-149-3p измерялась с помощью количественной ПЦР в реальном времени. h Анализ связывания р53 с фланкирующим miR-149 участком геномной ДНК клеток HCT116, обработанных 20 мМ DCA или без него в течение 24 ч. Результаты трех независимых экспериментов представлены как среднее ± SEM. Каждый эксперимент содержал три биологические реплики. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001; ns нет значимости

PDK2 является прямой мишенью miR-149-3p
Для выяснения механизмов, посредством которых miR-149-3p регулирует химиочувствительность клеток CRC, мы проанализировали гены, связанные с энергетическим метаболизмом, которые регулируются miR-149-3p, используя две общедоступные платформы (TargetScan и miRDB). Наконец, мы определили, что киназа пируватдегидрогеназы 2 (PDK2) и гексокиназа 1 (HK1) являются потенциальными кандидатами (рис. 4a). Для подтверждения этих выводов мимикр или ингибитор miR-149-3p был трансфецирован в клетки CRC. Мы обнаружили, что уровни мРНК PDK2 негативно регулировались miR-149-3p, но не HK1 (рис. 4b и дополнительный рис. 3A). Было обнаружено два возможных сайта связывания miR-149-3p в 3′-UTR PDK2, а двойной люциферазный репортерный анализ показал, что miR-149-3p связывается с предсказанным сайтом (686-693) 3′-UTR PDK2 (рис. 4c, d). Затем мы подтвердили, что уровень белка PDK2 отрицательно регулируется miR-149-3p (рис. 4e).

PDK имеет четыре изофермента PDK1, 2, 3 и 4, все из которых, как сообщалось, регулируются DCA [26, 38, 39]. Затем мы проанализировали экспрессию мРНК PDK1-4 в клетках HCT8 и HCT116 после обработки ДКА. DCA значительно подавлял экспрессию мРНК PDK2, но не других изоферментов PDK (Дополнительный рис. S3B). Кроме того, трансфекция анти-149-3p частично отменяла снижение PDK2 под действием DCA (рис. 4f). Далее мы определили уровни белка PDK2 и его субъединицы пируватдегидрогеназы E1-альфа (PDHA1) в чувствительных к 5-ФУ и устойчивых к 5-ФУ клетках CRC. Базальные уровни PDK2 были повышены в химиорезистентных клетках CRC по сравнению с химиочувствительными клетками. В соответствии с этим повышением, фосфорилирование PDHA1 также было повышено (рис. 4g).

Рисунок 4. PDK2 является прямой мишенью miR-149-3p. a Схематическая диаграмма протокола, использованного для поиска генов-кандидатов, которые предсказуемо регулируются miR-149-3p. b Клетки HCT-8 и HCT116 были транзиторно трансфицированы мимиком или ингибитором miR-149-3p. Уровни мРНК PDK2 и HK1 анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. c Диаграмма предполагаемых сайтов связывания miR-149-3p в 3′-UTR PDK2. Мутантные последовательности, использованные в люциферазных репортерах, обозначены красным цветом. d Клетки эмбриональной почки человека 293 T и клетки HCT116 были котрансфицированы люциферазными репортерными конструкциями и мимикой miR-149-3p (50 нмоль/л) или контрольной миРНК в течение 48 ч. Данные относительной люциферазной активности нормированы на соответствующий контроль. e Клетки HCT-8 и HCT116 трансфицировали мимиком miR-149-3p или ингибитором в течение 48 ч, а экспрессию PDK2 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. f Клетки HCT116, трансфицированные ингибитором miR-149-3p или анти-НК, обрабатывали с или без DCA в течение 24 ч. Экспрессию PDK2 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. g Экспрессию PDK2 и p-PDHA1 в химиочувствительных и химиорезистентных клетках CRC анализировали с помощью Вестерн анализа. Приведенные данные являются репрезентативными снимками трех экспериментов. Результаты трех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах, представлены как среднее ± SEM. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001

Путь miR-149-3p/PDK2 регулирует химиочувствительность
Чтобы понять, как путь miR-149-3p/PDK2 регулирует ответ клеток CRC на 5-FU, клеточная линия HCT-8/F была выбрана в качестве репрезентативной клеточной линии для исследования того, влияют ли уровни экспрессии miR-149-3p и PDK2 на ответ клеток на 5-FU. Нокдаун PDK2 в клетках HCT-8/F подавлял фосфорилирование PDHA1 (рис. 5a) и снижал маркеры энергетического метаболизма, такие как потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз (рис. 5b). Более того, снижение PDK2 усиливало действие 5-ФУ на повышение уровней расщепленного PARP (c-PARP) и Bax, которые являются признанными биомаркерами апоптоза клеток HCT-8/F (рис. 5c). Кроме того, нокдаун PDK2 повышал химиочувствительность к 5-ФУ в клетках HCT-8/F, что определялось с помощью анализа CCK8 и колониеобразования (рис. 5d, e). Нокдаун PDK2 способствовал 5-ФУ-индуцированному апоптозу в клетках HCT-8/F и HCT116/F, что показано на дополнительном рис. S4A, тогда как сверхэкспрессия PDK2 способствовала фосфорилированию PDHA1 и смягчала апоптоз клеток, индуцированный 5-ФУ в клетках HCT-8 и HCT116 (дополнительные рис. S4B-S4C).

Кроме того, сверхэкспрессия PDK2 отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на PDK2 (рис. 5f) и частично отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на потребление глюкозы, производство лактата и гликолиз (рис. 5g). Эктопическая экспрессия PDK2 заметно отменяла ингибирующий эффект miR-149-3p на рост клеток и образование колоний в клетках HCT-8/F, обработанных 5-ФУ (рис. 5h, i). В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что путь miR-149-3p/PDK2 восстанавливает химиочувствительность, по крайней мере, частично регулируя метаболизм глюкозы в химиорезистентных клетках CRC.

Рисунок 5. Сигнализация miR-149-3p/PDK2 подавляет метаболизм глюкозы и повышает химиочувствительность. a PDK2 был нокаутирован путем транзиторной трансфекции с помощью siRNA в клетках HCT-8/F. Нокдаун привел к изменению p-PDHA1. b Были измерены потребление глюкозы, выработка лактата и гликолиз клеток CRC, трансфецированных PDK2 siRNA или NC. c Клетки HCT-8/F обрабатывали 50 мкг/мл 5-ФУ или без него в течение 24 ч после трансфекции PDK2 siRNA или NC. Признанные биомаркеры (c-PARP, Bax) для апоптоза клеток определяли с помощью Вестерн-блот анализа. d Клетки HCT-8/F, трансфецированные PDK2 siRNA или NC, обрабатывали 5-ФУ. Рост клеток определяли с помощью анализа CCK8. e Клетки HCT-8/F, инфицированные PDK2 shRNA или вирусом отрицательного контроля, обрабатывали 5-ФУ. Способность к образованию колоний определяли окрашиванием кристаллическим фиолетовым. f Клетки HCT-8/F трансфицировали NC или мимиком miR-149-3p в течение 24 ч, а затем инфицировали вирусом, сверхэкспрессирующим PDK2. Экспрессию PDK2 и p-PDHA1 определяли с помощью Вестерн-блот анализа. g Измеряли потребление глюкозы, продукцию лактата и гликолиз. h, i После инфицирования клетки обрабатывали 5-ФУ и измеряли рост клеток и способность к образованию колоний. Репрезентативные результаты трех независимых экспериментов, проведенных как минимум в трех экземплярах, представлены как среднее ± SEM. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001

DCA повышает химиочувствительность 5-FU in vivo
Далее 5-FU, DCA или комбинацию 5-FU с DCA вводили внутрибрюшинно в модель подкожного ксенотрансплантата (отмечена как внутрибрюшинная группа). Учитывая недостаточное кровоснабжение центральной части подкожных опухолей, мы также интратуморально вводили DCA или PBS плюс интраперитонеальную инъекцию 5-ФУ (отмечена как интратуморальная группа). Комбинации DCA и 5-FU показали лучший ингибирующий эффект на рост опухоли, чем DCA или 5-FU по отдельности после четырех недель инъекций в группе внутрибрюшинного введения (рис. 6a, b). Экспрессия Ki-67 была снижена после комбинированного лечения в группе внутрибрюшинного введения (рис. 6c). DCA значительно подавлял рост опухоли в интратуморальной группе по сравнению с группой PBS (рис. 6d), а miR-149-3p был повышен в группе интратуморального введения DCA, что согласуется с результатами in vitro (рис. 6e). Интратуморальное введение DCA также способствовало апоптозу опухоли (рис. 6F).

Для дальнейшей оценки влияния miR-149-3p на ответ клеток CRC на 5-ФУ in vivo, в модели подкожного ксенотрансплантата проводили интратуморальное введение agomiR-149-3p или agomiR-NC плюс внутрибрюшинное введение 5-ФУ. miR-149-3p значительно подавлял рост опухоли в интратуморальной группе по сравнению с контрольной группой, в которой интратуморально вводили agomiR-отрицательный контроль (NC) (рис. 6g, h). Сверхэкспрессия miR-149-3p была подтверждена количественной ПЦР в реальном времени (рис. 6i), а сверхэкспрессия miR-149-3p способствовала апоптозу (рис. 6j) и снижала экспрессию PDK2 и p-PDHA1 (рис. 6k, l). С помощью микропозитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)-КТ с 18F-фтордезоксиглюкозой (ФДГ) визуализацию опухоли проводили через 3 недели лечения. в местах имплантации опухоли наблюдалось поглощение 18F-ФДГ, измерялись максимальное стандартизированное поглощение (SUVmax) и метаболические объемы опухоли (MTVs). Разницы в SUVmax между двумя группами не наблюдалось, в то время как MTV значительно уменьшился в группе miR-149-3p (рис. 6m).

Рисунок 6. Комбинированное лечение 5-ФУ с DCA или miR-149-3p усиливает эффект химиотерапии in vivo. a Репрезентативные изображения опухолей в каждой группе. b Объемы опухолей ксенотрансплантата были рассчитаны в группе внутрибрюшинного введения. Показаны средние значения ± SD, n× 6. c Иммуноокрашивание срезов ксенотрансплантатов опухолей с Ki-67 в группе внутрибрюшинного введения. Положительное окрашивание коричневым цветом (масштабные линейки: 100 мкм) (верхняя панель). Рассчитывался показатель иммунореактивности Ki67 (нижняя панель). Показаны средние значения ± SD, n× 4. d Объемы опухолей ксенотрансплантатов рассчитывались до 39 дня после инокуляции опухоли в интратуморальной группе. e Экспрессия miR-149-3p определялась количественным ПЦР в реальном времени в опухолях ксенотрансплантатов после интратуморального введения DCA. Показаны средние ± SD, n× 6. f Показаны репрезентативные TUNEL окрашенные срезы от мышей в интратуморальной группе (масштабные линейки: 50 мкм). g Репрезентативное изображение опухолей от мышей, которые получали интратуморальную инъекцию agomiR-NC или agomiR-149-3p в течение 3 недель. h Объемы опухолей ксенотрансплантатов рассчитывались до 21 дня после лечения. Показаны средние значения ± SD, n× 6. i Уровни miR-149-3p анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Показаны средние значения ± SD, n× 5. *P< 0.05. j Апоптоз опухолевых клеток определяли с помощью анализа TUNEL (масштабные линейки: 50 мкм). k Ксенотрансплантаты опухолей от трех мышей в каждой группе анализировали методом иммуноблота с указанными антителами. l Изображения для визуализации положительного окрашивания PDK2 в ксенотрансплантатах опухолей (масштабные линейки: 100 мкм) (левая панель). Подсчитан иммунореактивный балл PDK2 (правая панель). Показаны средние значения ± SD, n× 3. m Репрезентативные изображения 18F-ФДГ микро-ПЭТ/КТ мышей, несущих опухоли. Опухоли обозначены красными стрелками и кругами. Значения SUVmax и MTV получены в опухолях. Показаны средние значения ± SD, n× 3. *P<0,05; ns не имеет значения

miR-149-3p обратно коррелирует с PDK2 у пациентов с CRC
Значительная обратная корреляция между уровнями мРНК miR-149-3p и PDK2 наблюдалась в тканях CRC человека (рис. 7a, b). Среди них восемь пациентов в стабильном состоянии/болезни (SD) в течение 3 лет после химиотерапии экспрессировали более высокий уровень miR-149-3p, чем пять пациентов с прогрессирующей болезнью (PD) (Дополнительный рис. S5A). Были проанализированы пять пар пациентов с PD и SD с одинаковой патологией и стадией TNM, и окрашивание PDK2 значительно различалось в образцах от пациентов с PD и SD (Дополнительный рис. S5B). Пациенты CRC из базы данных TCGA с высокой экспрессией PDK2 также характеризовались худшей общей выживаемостью (OS) (рис. 7c). База данных TCGA также показала, что экспрессия PDK2 в группе wt p53 была снижена по сравнению с группой мутантных p53 (рис. 7d). Эти результаты позволили предположить, что PDK2 негативно регулируется miR-149-3p у пациентов с CRC.

Рисунок 7. Экспрессия miR-149-3p обратно коррелирует с PDK2 у больных CRC. a Корреляция между экспрессией miR-149-3p и PDK2 была определена с помощью линейного регрессионного анализа(n× 28, r× -0,5058, P<0,01) и b парным t-тестом с теми же образцами(P<0,001) у больных CRC. c OS больных CRC была стратифицирована по экспрессии PDK2 в наборе данных TCGA(n× 603, P× 0.0486, значения P были получены с помощью теста log-rank). d Уровень мРНК PDK2 в группах wt p53 и мутантных p53 был определен с помощью непарного t-теста(P× 0,0057) в наборах данных TCGA. e Мультипликационная зарисовка, изображающая, как DCA восстанавливает ответ CRC на химиотерапию через p53/miR-149-3p/PDK2-опосредованный путь метаболизма глюкозы

Обсуждение

CRC характеризуется туморигенными аномалиями и измененными метаболическими путями и является одной из основных причин смерти от рака [2]. Резистентность к химиотерапии является основной причиной неудачного лечения [7]. В этом исследовании мы обнаружили, что DCA может увеличить химиотерапевтический эффект 5-FU в химиорезистентных клетках CRC и что активация пути p53/miR-149-3p/PDK2 способна увеличить химиочувствительность in vitro и in vivo.

Все больше данных указывают на то, что повышенный гликолиз тесно связан с устойчивостью к химиотерапии [15, 17, 40]. Здесь мы также обнаружили, что по сравнению с родительскими клеточными линиями, химиорезистентные клетки CRC показали повышенное потребление глюкозы, выработку лактата и гликолиз, что говорит о том, что метаболические нарушения являются типичной особенностью, но молекулярные механизмы все еще остаются неясными в клетках CRC.

Было отмечено, что DCA снижает уровень лактата в крови in vivo у грызунов в дозах ~25-50 мг/кг/24 ч [41], а также применение DCA в широком диапазоне доз от 1 до 50 мМ [26]. Примечательно, что неблагоприятное действие DCA у людей обычно ограничивается обратимой сенсорной и моторной периферической нейропатией, которая зависит от возраста и генотипа [42]. Недавно DCA был определен в качестве новой метаболической терапии для различных онкологических больных [26, 29].

Сообщается, что DCA способен ингибировать активность PDK и преобразовывать пируват в ацетил-КоА, что приводит к переходу выработки энергии от гликолиза к митохондриальному окислительному фосфорилированию [43,44]. Также было показано, что DCA ослабляет вызванную гипоксией устойчивость к 5-ФУ при раке желудка [45], преодолевает устойчивость к сорафенибу при гепатоцеллюлярной карциноме [46] и ослабляет устойчивость к цисплатину при раке головы и шеи [47]. Наше исследование показало, что DCA способен ослаблять химиорезистентность клеток CRC к 5-ФУ. Более того, мы продемонстрировали, что DCA снижает потребление глюкозы и выработку лактата в химиорезистентных клетках CRC до базового уровня химиочувствительных клеток CRC. Учитывая, что аутофагия способна подпитывать метаболизм рака [48], было определено влияние DCA и miR-149-3p на аутофагию. Мы обнаружили, что DCA активирует аутофагию, а miR-149-3p не влияет на аутофагию. Это позволило предположить, что аутофагия не вовлечена в эффект DCA/miR-149-3p в регуляции метаболизма глюкозы (Дополнительный рисунок S6).

PDKs, как ключевые регуляторы гликолиза при раке, вызвали большую озабоченность в связи с результатами многих исследований [49]. Существует четыре изоформы PDK (PDK1-4), и каждая из них проявляется в тканеспецифической манере следующим образом: PDK1 высоко экспрессируется в сердце, PDK2 экспрессируется повсеместно, PDK3 имеет относительно ограниченное тканевое распределение, а PDK4 экспрессируется в сердце и скелетных мышцах [27]. PDK2 экспрессируется на более высоких уровнях по сравнению с другими изоферментами, что позволяет предположить, что он может быть основной изоформой, ответственной за регуляцию ферментативной активности пируватдегидрогеназного комплекса (ПДГК) [50]. Кроме того, изоферменты PDK различаются по остроте регуляции метаболитами [51]. Здесь мы сосредоточились на PDK2, наиболее чувствительной изоформе к ДКА [31]. Хотя молекулярные взаимодействия между ДКА и PDK были изучены, потенциальный механизм транскрипционной регуляции PDK остается неясным. В недавнем исследовании сообщалось, что miR-182 играет регуляторную роль в метаболических путях рака легких, нацеливаясь на PDK4 [52]. Настоящее исследование показало, что PDK2 регулируется miR-149-3p в CRC и что уровни PDK2 в первичных опухолях пациентов CRC обратно коррелируют с экспрессией miR-149-3p. Поскольку PDK2 широко присутствует в большинстве тканей, воздействие на PDK2 может стать более важным и эффективным способом уничтожения опухолевых клеток и преодоления химиорезистентности.

Сообщалось, что miR-149-3p играет важную роль в различных видах рака и индуцируется некоторыми противоопухолевыми препаратами [36, 37, 53]. В частности, мы обнаружили, что обработка DCA может индуцировать связывание p53 с восходящей областью (от -677 до -477) miR-149 и что miR-149-3p повышается под воздействием обработки DCA в зависимости от p53. TP53, классический опухолевый супрессор, часто инактивируется в опухолях [54], и недавно сообщалось, что он регулирует метаболизм глюкозы при раке. Было показано, что Wt p53 может подавлять «эффект Варбурга», контролируя PDK2. Однако частота мутаций TP53 в CRC составляет ~40-50% [55, 56], что приводит к потере его супрессивной функции. Сообщалось, что пациенты CRC с wt TP53 получают преимущество в выживании после химиотерапии на основе 5-FU, а пациенты с мутантным TP53 — нет [57]. Наши результаты показывают новый механизм между р53 и PDK2, который модулируется miR-149-3p. Эти данные позволяют предположить, что пациенты с мутантным TP53 могут получить больше пользы от смежной химиотерапии с miR-149-3p, а не с DCA. Учитывая высокую частоту мутаций TP53 в CRC, мы считаем, что miR-149-3p играет важную роль в мониторинге и модуляции химиочувствительности в CRC.

Раковые клетки потребляют большое количество глюкозы и демонстрируют высокий уровень аэробного гликолиза, поэтому снижение поглощения глюкозы является перспективной стратегией для ограничения роста рака [58]. Мы наблюдали, что повышение уровня miR-149-3p значительно подавляло гликолиз в химиорезистентных клетках CRC; однако, по сравнению с контрольной группой, в группе ксенотрансплантатов, которым интратуморально вводили мимикрирующий miR-149-3p, SUVmax оставался неизменным. Возможно, этот противоречивый результат может быть связан с развитием некроза в основной части подкожных опухолевых тканей, что требует изучения.

В целом, мы обнаружили, что сигнальный путь p53/miR-149-3p/PDK2 потенциально может быть направлен на преодоление химиорезистентности CRC при лечении DCA, что обеспечивает потенциальную стратегию лечения CRC с точки зрения вмешательства в метаболизм опухоли (рис. 7e).

Материалы и методы

Раковая ткань
В период с 2013 по 2016 год в исследование были включены 28 пациентов с раком CRC из Девятой народной больницы при Медицинской школе Шанхайского университета Цзяо Тун. Тринадцать из этих пациентов получили послеоперационную химиотерапию на основе 5-ФУ и наблюдались в течение не менее 3 лет. Все ткани были собраны после получения информированного согласия, а все процедуры с участием пациентов проводились в соответствии с правилами, установленными Этическим комитетом Девятой народной больницы при Медицинском колледже Шанхайского университета Цзяо Тун. Клиническая информация о пациентах с КРК представлена в Дополнительной таблице 1.

Дополнительная таблица 1.

Культура клеток
Устойчивая к 5-ФУ клеточная линия HCT-8/F и ее родительская клеточная линия HCT-8 были приобретены у iCell Bioscience, Inc. (Шанхай, Китай). Устойчивая к 5-ФУ клеточная линия HCT116/F и ее родительская клеточная линия HCT116 были любезно предоставлены доктором Гу (Yanhong Gu, Нанкинский медицинский университет, Цзянсу, Китай). Клетки HCT116-/- были подарены доктором Лу (Hua Lu, Университет Фудань, Шанхай, Китай). Линия клеток эмбриональной почки человека 293T была получена из American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Клетки линий 293T, HCT116, HCT-8 культивировали в среде Дульбекко (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, HyClone, Utah, US) или среде RPMI-1640 (HyClone, Utah, US), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Gemini, California, US), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (HyClone, Utah, US) в увлажненном инкубаторе при 37 °C, 5%CO2. В культуральную среду клеточных линий HCT-8/F и HCT116/F добавляли 15 мкг/мл 5-ФУ и 5 мкг/мл 5-ФУ, соответственно. Все клеточные линии были подтверждены путем секвенирования коротких тандемных повторов компанией Genetic Testing Biotechnology Corporation (Сучжоу, Цзянсу, Китай). DCA был приобретен у компании Sigma-Aldrich Co. Ltd. (МО, США).

Иммунофлуоресцентное окрашивание Edu и ROS
Клетки HCT-8/F и HCT116/F высевали в 96-луночные планшеты в количестве 15 000 клеток/лунку. После ночной инкубации клетки обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. Окрашивание Edu проводили в соответствии с инструкцией производителя (Ribobio, Гуанчжоу, Китай). Уровень ROS измеряли в клетках, инкубированных с 10 мкМ 2′,7′-дихлорфлуоресцеин диацетата (DCF-DA) (Beyotime, Шанхай, Китай) в течение 30 мин при 37 °C. Затем планшеты промывали дважды, и клетки анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

Рост клеток
Клетки высевали в 96-луночные планшеты по 5000 клеток/лунку на ночь, обрабатывали препаратами в течение 24 ч, после чего каждую лунку заменяли смесью из 10

мкл

CCK8 (Dojindo, Япония) и 90

мкл

культуральной среды. Абсорбцию измеряли при значении OD 450 нм с помощью энзимного микропланшетного ридера (BioTeck, Вермонт, США) через два часа. Коэффициент ингибирования препарата рассчитывали по следующей формуле: 1-ODdrug/ODctrl. IC50 каждой клетки рассчитывали с помощью GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA).

Анализ апоптоза клеток
Клетки HCT-8/F и HCT116/F высевали в шестилуночные планшеты в концентрации 2 ×105 клеток/лунку. Клетки обрабатывали DCA (15 мМ) / 5-ФУ (50 мкг/мл) и DCA (20 мМ) / 5-ФУ (25 мкг/мл), соответственно, в течение 48 ч. Затем клетки трипсинизировали, промывали и окрашивали антителами Annexin V-FITC/PI или Annexin V-PE/7-AAD в соответствии с протоколом производителя (BD, CA, США). Апоптоз измеряли методом проточной цитометрии (BD, CA, США).

Анализ образования колоний
Клетки HCT-8/F и HCT116/F обрабатывали DCA (15 мМ)/5-FU (50 мкг/мл) и DCA (20 мМ)/5-FU (25

мкг/мл

), соответственно, в течение 24 часов. Затем клетки высевали в шестилуночные планшеты по 1000 клеток в лунку и культивировали в свежей среде при 37 °C в течение 1-2 недель, после чего фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин; затем клетки окрашивали 1% кристаллическим фиолетовым и подсчитывали количество колоний клеток с помощью счетчика (Gelcount, Optronix, Oxford).

Переходная трансфекция генов
Мимики miR-149-3p, ингибиторы, siPDK2, sip53 и соответствующие им последовательности олигонуклеотидов NC были синтезированы компанией GenePharma (Шанхай, Китай). Плазмида Flag-p53 была любезно предоставлена доктором Лу (Хуа Лу, Университет Фудань, Шанхай, Китай). Трансфекцию проводили с помощью Lipofectamine 3000 (Invitrogen, CA, США) при конечной концентрации 50 нмоль/л (мимики и siRNAs) или 100 нмоль/л (ингибиторы). Клетки собирали для анализа через 24 или 48 ч после трансфекции. Последовательности siRNA, мимиков и ингибиторов представлены в Дополнительной таблице 2.

Дополнительная таблица 2.

Трансфекция стабильных генов
LV-PDK2 и соответствующий NC-вирус были приобретены у компании GeneChem (Шанхай, Китай). shPDK2-1, shPDK2-2 и контрольная плазмида были приобретены у компании GeneChem (Шанхай, Китай). Вирусный супернатант собирали из 293 Т-клеток. Затем клетки CRC были инфицированы вирусом и обследованы с помощью пуромицина. Эффективность инфекции была подтверждена проточной цитометрией и флуоресцентной микроскопией. Экспрессию мРНК и белка PDK2 далее анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени и Вестерн-блота.

репортерные люциферазные анализы 3′-UTR
wt или мутантные последовательности связывания miR-149-3p в 3′UTR PDK2 человека были клонированы в downstream люциферазы pmiR-RB-Reporter (Ribobio, Guangzhou, China), обозначенные как WT, MUT1, MUT2 и MUT3 на рис. 3c. клетки 293 T и HCT116 высевали в 24-луночные планшеты с последующей котрансфекцией 500 нг репортерных конструкций и либо 50 нмоль/л мимика miR-149-3p, либо NC с помощью Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA). Активность люциферазы измеряли после 48 ч инкубации с помощью системы Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Мэдисон, США) в соответствии с протоколом производителя.

Потребление глюкозы и выработка лактата
Клетки HCT-8/F и HCT116/F высевали в 24-луночные планшеты в количестве 1 ×105 клеток/лунку на ночь, затем обрабатывали 15 мМ и 20 мМ DCA, соответственно, в течение 24 ч. После обработки клетки культивировали в среде без фенолового красного, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, в течение 24 ч. Культурную среду собирали, измеряли потребление глюкозы и выработку лактата. Лактат измеряли с помощью набора Lactate Assay Kit (Njjcbio, Нанкин, Китай), а глюкозу — с помощью набора Glucose Assay Kit (Rsbio, Шанхай, Китай). Все значения были стандартизированы путем подсчета равного количества клеток. Для оценки состояния гликолиза в культивируемые клетки добавляли 100 нг/мл олигомицина (ингибитор АТФ-синтазы; Sangon Biotech) на 6 ч. Соотношение концентрации лактата в присутствии и отсутствии олигомицина измеряли и определяли, как описано ранее [46].

Seahorse XF-96 glycolytic rate assay
Клетки высевали в 96-луночный культуральный планшет при плотности 25 000 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи в ростовой среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Сенсорный картридж увлажняли в течение ночи. На следующий день среду для клеток меняли на безбикарбонатную низкобуферную среду анализа, дополненную глюкозой, пируватом натрия и глутамином. После того как клетки инкубировали в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе без CO2, скорость потребления кислорода и скорость внеклеточного закисления измеряли до и после введения DCA/ctrl, ротенона (Rot) + антимицина A (AA) и 2-дезокси-d-глюкозы (2-DG) с помощью прибора Seahorse XF (Agilent, Santa Clara, CA), как описано ранее [59, 60]. Эксперименты проводились в режиме реального времени в пяти-шести повторных лунках. Гликоперы, включая базальный гликопер, индуцированный гликопер и компенсаторный гликопер, рассчитывались автоматически с помощью программного обеспечения Wave (Agilent, Santa Clara, CA).

Количественная ПЦР в реальном времени и микрочипы миРНК
Общая РНК была выделена из тканей или клеток CRC с помощью TRIzol Reagent (Life, CA, USA). кДНК была синтезирована с помощью PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, Tokyo, Japan). Анализ микрочипов проводили с тремя репликами клеток HCT116, обработанных 5 мМ, 10 мМ или 20 мМ DCA в течение 12, 24 или 48 ч. Исходные данные были загружены в базу данных GEO (GSE125309). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием премикса Ex Taq 420 A (TaKaRa, Токио, Япония) на платформе ABI-7500. Актин и U6 использовали в качестве внутренних контролей. Последовательности праймеров представлены в Дополнительной таблице 3.

Вестерн-блоты
Загружали тридцать микрограммов лизатов общего белка и наносили первичные антитела: анти-PDK2 (sc-100534, Santa Cruz, California, US), анти-p-PDHA1 (S293) (ABS204, Merck, Darmstadt, Germany), анти-PDHA1 (ab168379, Abcam, Cambridge, UK), анти-p53 (sc-126, Santa Cruz, California, US), anti-c-PARP (D64E10, CST, Массачусетс, США), anti-Bax (D2E11, CST, Массачусетс, США), anti-LC3B (L7543, sigma, MO, США), anti-GAPDH (Proteintech, Ухань, Китай) и anti-α-tubulin (Proteintech, Ухань, Китай). Вторичные антитела были приобретены у компании Sungene (Тяньцзинь, Китай). Блот-анализы визуализировали с помощью системы хемилюминесценции (Bioshine, Шанхай, Китай).

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)
Клетки HCT116, посеянные в 10-см планшеты, обрабатывали 20 мМ DCA или без него в течение 24 ч, затем проводили фиксацию клеток и фрагментацию хромосом в соответствии с инструкциями производителя (Pierce Agarose ChIP Kit, Thermo). Хроматин инкубировали с антителами IgG и анти-р53 (Sigma, MO, США) при 4°C в течение ночи. После инкубации добавляли 60 ul протеина А агарозы/ДНК спермы лосося. Затем осажденный комплекс промывали буферами для промывки IP 1, 2, 3 и элюировали буфером для элюирования. Сшивание было отменено добавлением 6 мкл 5 М NaCl и 2 мл протеиназы К при 65°C в течение 1,5 ч. Иммунопреципитированная ДНК и ДНК цельноклеточного экстракта (входная) были очищены и затем использованы для ПЦР-анализа с использованием соответствующих праймеров. Для контроля эксперимента использовался контрольный праймер. Последовательности праймеров для ПЦР представлены в Дополнительной таблице 3.

Подкожная ксенотрансплантация опухоли у голых мышей и микро-ПЭТ/КТ визуализация
Сначала 1 ×107 клеток HCT-8/F, разведенных в 100

мкл

PBS, подкожно имплантировали голым мышам (самцы, 6 недель). Через 12 дней мышей случайным образом разделили на шесть групп (по шесть на группу). Мыши из групп I — IV получали ежедневную внутрибрюшинную инъекцию PBS, DCA (50 мг/кг)/PBS, 5-FU (10 мг/кг)/PBS и 5-FU (10 мг/кг)/DCA (50 мг/кг), соответственно. Мышам из группы V и группы VI интратуморально вводили PBS или DCA (50 мг/кг), соответственно, каждый второй день и внутрибрюшинную инъекцию 5-FU (10 мг/кг) каждый второй день. Объем опухоли измеряли вслепую каждые 3 дня. Мышей приносили в жертву после 3 недель лечения, опухоли иссекали, взвешивали и замораживали при -80 °C для дальнейшего изучения.

Чтобы оценить, оказывает ли miR-149-3p эффект химиосенсибилизации, были созданы еще две группы животных моделей. Вкратце, мышам подкожно имплантировали 6 ×106 клеток HCT-8/F. После того, как размеры опухоли достигали ~50 мм3, мыши получали внутрибрюшинную дозу 5-FU (10 мг/кг) каждый второй день, а также интратуморальную инъекцию 5 нмоль холестерин-конъюгированных мимиков miR-149-3p или NC каждые 3 дня в течение 3 недель. Затем трех мышей из каждой группы постили на ночь и внутривенно вводили 0,15 мКи 18F-ФДГ. через 60 мин проводилось микро-ПЭТ-КТ сканирование с 18F-ФДГ (Siemens, Берлин, Германия). Изображения, полученные в ходе ПЭТ, были представлены с использованием псевдоцветной карты, где красный цвет указывал на высокое поглощение 18F-ФДГ. SUVmax и MTV использовались для определения активности 18F-ФДГ-ПЭТ. Все эксперименты и уход за животными были одобрены Этическим комитетом Девятой народной больницы при медицинском колледже Шанхайского университета Цзяо Тун.

Иммуногистохимическое и иммунофлуоресцентное окрашивание
Вкратце, срезы тканей инкубировали с первичными антителами Ki67 (Servicebio, Ухань, Китай) и PDK2 (Proteintech, Ухань, Китай) при 4 °C в течение ночи, а затем инкубировали со вторичным антителом. Хромогенную реакцию проводили с 3,3-диаминобензидином и контрастировали гематоксилином. Иммунореактивный балл (IRS) рассчитывался двумя исследователями, слепыми к распределению по группам. IRS = SI (интенсивность окрашивания) × PP (процент положительных клеток). SI присваивался следующим образом: 0 × отрицательный; 1 × слабый; 2 × умеренный; 3 × сильный. PP определяется как 0 × 0%; 1 × 0-25%; 2 × 25-50%; 3 × 50-75%; 4 × 75-100%. Шестимиллиметровые замороженные срезы окрашивали с помощью набора для реакции TUNEL (Roche, Базель, Швейцария) и контрастировали DAPI. Изображения получали с помощью флуоресцентного микроскопа с соответствующими фильтрами возбуждения и испускания.

Статистический анализ
Данные анализировали с помощью программы GraphPad Prism 6.0. Данные представлены как среднее ± SD/SEM из трех независимых экспериментов. Каждый эксперимент проводился как минимум в трех повторах. Для сравнения различий между двумя группами использовали двухфакторный t-тест Стьюдента. Для множественных сравнений использовался односторонний ANOVA с последующим пост-хок тестом Бонферрони. Кривые Каплана-Мейера для анализа выживаемости определялись с помощью теста log-rank. Связь между miR-149-3p и PDK2 оценивали с помощью анализа коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81272745, 81872419 и 81272404) и Программой для профессора специального назначения (Восточный стипендиат JW) в Шанхайских высших учебных заведениях. Мы благодарим д-ра Yanhong Gu за предоставление клеточных линий HCT116, устойчивых к 5-FU, и д-ра Hua Lu за предоставление плазмиды p53.

Соблюдение этических норм

Конфликт интересов
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Примечание издателя
Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и институциональной принадлежности.

Открытый доступ
Эта статья лицензирована по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, обмен, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате при условии, что вы отдаете должное оригинальному автору (авторам) и источнику, даете ссылку на лицензию Creative Commons и указываете, были ли внесены изменения. Изображения или другие материалы третьих лиц в этой статье включены в статью по лицензии Creative Commons, если иное не указано в кредитной строке к материалу. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а предполагаемое вами использование не разрешено законом или выходит за рамки разрешенного использования, вам необходимо получить разрешение непосредственно у правообладателя. Чтобы ознакомиться с копией этой лицензии, посетите сайт http://creativecommons. org/licenses/by/4.0/.

Амигдалин индуцирует апоптоз в клетках линии HeLa рака шейки матки человека

Оригинал статьи: https://www.researchgate.net/publication/233383171_Amygdalin_induces_apoptosis_in_human_cervical_cancer_cell_line_HeLa_cells

Данная работа частично поддержана грантом Ключевого грантового проекта Министерства образования КНР (№ 707020).

Декларация интересов

Авторы не сообщают о каких-либо декларациях интересов.

• Февраль 2013 г.
• Иммунофармакология и иммунотоксикология 35(1):43-51

ДОИ: 10.3109/08923973.2012.738688

• Источник
• PubMed

Авторы:Юй ЧэньЦзиньшу МаФан ВанЦзе Ху

Иммунофармакология и иммунотоксикология, 2013; 35(1): 43–51
© 2013 Informa Healthcare USA, Inc.
ISSN 0892-3973 печать / ISSN 1532-2513 онлайн
DOI: 10.3109/08923973.2012.738688

ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ СТАТЬЯ

Амигдалин индуцирует апоптоз в клетках рака шейки матки человека HeLa

Юй Чен, Цзиньшу Ма, Фан Ван, Цзе Ху, Ай Цуй, Чэнго Вэй, Цин Ян и Фан Ли

Кафедра патогенобиологии, Медицинский колледж Бетьюн, Цзилиньский университет, Чанчунь, Цзилинь, Китай

Аннотация
Амигдалин, природное вещество, было предложено в качестве эффективного противоракового средства. Влияние амигдалина на клетки рака шейки матки ранее не изучалось. В данном исследовании мы обнаружили, что жизнеспособность клеточной линии рака шейки матки человека HeLa значительно подавлялась амигдалином. Окрашивание 4,6-диамино-2-фенилиндолом (DAPI) показало, что клетки HeLa, обработанные амигдалином, развивали типичные апоптотические изменения. Развитие апоптоза в клетках HeLa, обработанных амигдалином, было подтверждено двойным окрашиванием аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI), а также увеличением активности каспазы-3 в этих клетках. Дальнейшие исследования показали, что антиапоптотический белок Bcl-2 был подавлен, тогда как проапоптотический белок Bax был активирован в клетках HeLa, обработанных амигдалином, что указывает на вовлечение внутреннего пути апоптоза. In vivo введение амигдалина ингибировало рост ксенотрансплантатов клеток HeLa через механизм апоптоза. Результаты настоящего исследования предполагают, что амигдалин может предложить новую терапевтическую опцию для пациентов с раком шейки матки.

Ключевые слова: Амигдалин, рак шейки матки, клетки HeLa, апоптоз, ксенотрансплантат

Введение

Рак шейки матки в настоящее время является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований и второй ведущей причиной смерти женщин во всем мире, унося жизни около 280 000 женщин ежегодно. Восемьдесят процентов случаев рака шейки матки происходят в развивающихся странах, и это также вторая ведущая причина смертности среди женщин в возрасте 21–39 лет в США. Несмотря на достижения в радиотерапии и химиотерапии, проблемы, связанные с этими методами лечения, такие как побочные эффекты и развитие лекарственной устойчивости, остаются нерешенными. В то же время высокий уровень смертности от рака шейки матки остается относительно стабильным. Одной из стратегий решения этих проблем является разработка новых методов лечения и их добавление к текущим подходам борьбы с раком шейки матки. В поиске альтернативных методов лечения рака мы обратили внимание на то, что природное цианидсодержащее вещество, амигдалин, приобретает репутацию дополнительного средства для лечения рака благодаря своей эффективности в подавлении роста раковых клеток и легкой доступности. Поэтому механизмы противоракового действия амигдалина и его применение in vivo заслуживают дальнейшего изучения.

Амигдалин в изобилии содержится в семенах абрикосов, миндаля, персиков, яблок и других растений семейства розоцветных и состоит из двух молекул глюкозы, одной молекулы бензальдегида и одной молекулы цианида. Амигдалин, как сообщалось, обладает противораковым эффектом, индуцируя апоптоз в клетках рака простаты и подавляя гены, связанные с клеточным циклом, в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4. Считается, что бензальдегид в амигдалине способен вызывать анальгетический эффект, а цианид в амигдалине может индуцировать противоопухолевый эффект. Амигдалин может стать новым терапевтическим средством для пациентов с раком, хотя использование амигдалина в качестве противоракового препарата вызывает споры из-за опасений токсичности цианида.

Растет интерес к сообщениям об амигдалине как о препарате для лечения рака. Противораковый эффект и механизм действия амигдалина при раке шейки матки ранее не изучались. Настоящее исследование было разработано для изучения апоптотического эффекта амигдалина на клетки рака шейки матки человека HeLa in vitro и in vivo, чтобы обосновать его использование в лечении рака шейки матки.

Материалы и методы

Реагенты
Амигдалин, диметилсульфоксид (DMSO), 4,6-диамино-2-фенилиндол (DAPI) и тритон X-100 были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Мышиные антитела против β-актина, мышиные антитела против Bcl-2 и кроличьи антитела против Bax были приобретены у Santa Cruz (Санта-Круз, Калифорния, США). Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, кроличьи антимышиные или козьи антикроличьи антитела были приобретены у Rockland Inc. (Филадельфия, Пенсильвания, США).

Культура клеток
Клеточная линия рака шейки матки человека HeLa и клеточная линия человеческого эмбрионального амниона FL были приобретены в Онкологическом центре Китайской академии медицинских наук. Клетки культивировали в 75 см² флаконах для культивирования тканей в увлажненной атмосфере с 5% CO₂ при 37°C в среде Дульбекко, модифицированной Игла (DMEM; Gibco, США), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, США) и 1% пенициллина-стрептомицина (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). В ходе эксперимента клетки поддерживались в тех же условиях, за исключением использования 0,2% FBS вместо 10% FBS.

МТТ-тест на цитотоксичность
МТТ-тест на цитотоксичность использовался для определения цитотоксичности амигдалина на клетки HeLa и FL. Клетки HeLa и FL выращивали в конечном объеме 100 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, в 96-луночных планшетах при плотности 1 × 10⁶ клеток/мл. Через 12 часов амигдалин добавляли в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в среде DMEM с 0,2% FBS на 24 часа. После добавления 5 мкл МТТ-реагента (набор для анализа пролиферации клеток MTT; Trevigen, США) в каждую лунку планшет инкубировали в течение 4 часов перед добавлением 100 мкл растворителя DMSO в лунки. Затем оптическую плотность при 570 нм измеряли с помощью микропланшетного ридера (Bio-Tek, Уинуски, Вермонт, США). Процент жизнеспособности клеток рассчитывали по формуле (OD обработанного образца / контрольный OD) × 100%. Тест проводился не менее трех раз.

Морфология клеток HeLa и FL
Клетки HeLa и FL высевали в 96-луночные планшеты для культивирования. Через 12 часов амигдалин добавляли в лунки в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в среде DMEM, содержащей 0,2% FBS, на 24 часа. Затем морфологические изменения клеток наблюдали под инвертированным оптическим микроскопом (CKX41 Olympus; Olympus, Япония).

Окрашивание DAPI
Окрашивание DAPI использовалось для наблюдения морфологических изменений ядра в апоптотических клетках. 2 × 10⁵ клеток HeLa высевали в 6-луночные планшеты и культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, в течение ночи. Затем среду заменяли на DMEM с 0,2% FBS и обрабатывали амигдалином в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в течение 24 часов. После удаления среды клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали 100% этанолом в течение 20 минут при комнатной температуре и снова дважды промывали холодным PBS. Клетки наблюдали под флуоресцентным микроскопом (IX70-SIF2 Olympus; Olympus).

Двойное окрашивание аннексином V-FITC и йодидом пропидия
Индукция апоптоза амигдалином оценивалась с помощью двойного окрашивания аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI). После инкубации клеток HeLa с амигдалином в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в среде DMEM, содержащей 0,2% FBS, в 6-луночных планшетах в течение 24 часов, клетки собирали, дважды промывали холодным PBS и анализировали на апоптоз с помощью двойного окрашивания аннексином V-FITC и PI (набор для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC; KeyGEN, Нанкин, Китай). Вкратце, 5 × 10⁵ клеток ресуспендировали в связывающем буфере (10 мМ HEPES, pH 7,4, 140 мМ NaCl, 1 мМ MgCl₂, 5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl₂), окрашивали 5 мкл аннексина V-FITC в течение 10 минут, а затем окрашивали 5 мкл PI в течение еще 15 минут. Клетки немедленно анализировали с помощью проточного цитометра (FACScan; BD Biosciences, Милан, Италия). На изображении с проточного цитометра клетки в верхней правой части (Q2), нижней левой части (Q3) и нижней правой части (Q4) представляют поздние апоптотические клетки, жизнеспособные клетки и ранние апоптотические клетки соответственно.

Вестерн-блоттинг
Вестерн-блоттинг использовался для оценки экспрессии белков, связанных с апоптозом. После инкубации с амигдалином в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в среде DMEM, содержащей 0,2% FBS, в течение 24 часов, клетки HeLa собирали, дважды промывали PBS и растворяли в лизирующем буфере [150 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 0,5% натрия дезоксихолата, 0,1% SDS, 50 мМ Tris, 1 мМ дитиотреитол (DTT), 5 мМ Na₃VO₄, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 10 мкг/мл трипсина, 10 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл лейпептина; pH 7,4] в течение 2 часов при 4°C. Лизат центрифугировали при 12 000 g в течение 15 минут при 4°C. Концентрацию белка в лизате измеряли с помощью набора для колориметрического анализа белка Bio-Rad (Bio-Rad, США). По 30 мкг белка из каждого образца подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с SDS и переносили на мембрану из поливинилидендифторида. Затем мембрану блокировали PBS, содержащим 5% обезжиренного молока, при 4°C в течение 1 часа и инкубировали с мышиными антителами против β-актина, мышиными антителами против Bcl-2 и кроличьими антителами против Bax (1:200) при 4°C в течение 12 часов. Мембрану промывали буфером TBST (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,05% (об./об.) Tween 20) три раза. Затем мембрану инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, кроличьими антимышиными или козьими антикроличьими антителами (1:500) в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации мембрану полностью покрывали равным количеством усилителя и раствора перекиси из набора ECL Plus (Beyotime, Шанхай, Китай) в течение 2 минут. Затем мембрану экспонировали на пленку (Kodak, США) и проявляли. Эксперимент повторяли не менее трех раз.

Анализ активности фермента каспазы-3
Каспаза-3 является ключевым биомаркером апоптоза. Активность каспазы-3 in vitro измеряли с помощью колориметрического набора (Genscript, Нью-Джерси, США). Согласно инструкции производителя, клетки HeLa, инкубированные в среде DMEM, содержащей 0,2% FBS, обрабатывали амигдалином в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в течение 24 часов. Затем клетки лизировали для обнаружения хромофора p-нитроанилида (pNA) после его отщепления от меченого субстрата DEVD-pNA. Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью микропланшетного ридера. Относительное увеличение активности каспазы-3 определяли путем сравнения оптической плотности pNA из клеток HeLa, обработанных амигдалином, с таковой из необработанного контроля.

Противопухолевая активность амигдалина in vivo
Модель голых мышей, имплантированных клетками HeLa, использовалась для оценки влияния амигдалина на образование опухоли и морфологию. Самцы голых мышей BALB/c (4–6 недель, 16–20 г) были приобретены у Beijing Vital River Experimental Animals Technology (Пекин, Китай). Для создания ксенотрансплантата опухоли HeLa у мышей культивированные 5 × 10⁶ клеток HeLa собирали и вводили в правый бок мышей. Когда размер опухолей достигал 30–50 мм³, мышей случайным образом разделяли на три группы по шесть мышей в каждой. Мыши контрольной группы получали ежедневную внутрибрюшинную инъекцию 0,9% NaCl в объеме 0,2 мл в течение 14 дней. Мыши положительной контрольной группы получали ежедневную внутрибрюшинную инъекцию 30 мг/кг 5-фторурацила (5-FU) в объеме 0,2 мл в течение 14 дней. В группе лечения мыши получали 300 мг/кг амигдалина в объеме 0,2 мл в течение 14 дней. Мышей в каждой группе взвешивали, и размер опухолей регистрировали с помощью штангенциркуля каждые 2 дня. Объем опухоли (TV) рассчитывали по формуле 0,5 × длинная ось × (короткая ось)². Через день после последней инъекции опухоли аккуратно удаляли, фиксировали в 10% нейтральном формалине в PBS и затем заливали в парафин. Все процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Национальным научным советом Китайской Республики.

TUNEL-анализ
Срезы толщиной 5 мкм, полученные из парафиновых блоков опухолевых тканей, использовали для идентификации апоптоза с помощью набора для терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP-концевого мечения (TUNEL) (KeyGEN). Степень апоптоза оценивали путем подсчета TUNEL-положительных клеток. Апоптотический индекс определяли по формуле количество TUNEL-положительных клеток / общее количество клеток в пяти случайно выбранных полях зрения с большим увеличением (увеличение, ×400).

Статистический анализ
Данные были выражены как средние значения и стандартное отклонение для всех экспериментов. Статистически значимые различия определялись между контрольной и обработанной амигдалином группами с использованием t-критерия Стьюдента (программное обеспечение SPSS 16.0). Значимость различий обозначалась как *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001.

Результаты

Влияние амигдалина на жизнеспособность клеток HeLa и FL
Жизнеспособность клеток HeLa, обработанных амигдалином, снижалась в зависимости от дозы. При концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл жизнеспособность клеток HeLa, обработанных амигдалином, составляла 93,38 ± 4,15% (p > 0,05), 91,67 ± 5,29% (p > 0,05), 83,14 ± 5,46% (p < 0,01), 70,67 ± 2,59% (p < 0,001) и 48,56 ± 2,86% (p < 0,001) от контрольного значения соответственно. Интересно, что амигдалин не оказывал влияния на жизнеспособность клеток FL (рисунок 2).

Морфологические изменения клеток HeLa, обработанных амигдалином
Увеличение концентраций амигдалина вызывало тенденцию к снижению количества клеток HeLa, но не вызывало значительных изменений в количестве клеток FL (данные не показаны). Клетки HeLa становились округлыми после обработки амигдалином, особенно при более высоких концентрациях амигдалина (рисунок 3A). Окрашивание DAPI клеток HeLa, обработанных амигдалином, выявило конденсацию и фрагментацию ядер (рисунок 3B).

Анализ апоптоза с помощью двойного окрашивания клеток HeLa аннексином V-FITC и PI
Клетки HeLa становились апоптотическими после обработки амигдалином. Распределение апоптотических клеток HeLa, измеренное с помощью проточной цитометрии, показало, что количество ранних (Q4) и поздних апоптотических (Q2) клеток HeLa значительно увеличилось по сравнению с контрольной группой (рисунок 4A). Конкретно, увеличение концентраций амигдалина при 0, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл коррелировало с увеличением соотношения апоптотических клеток к общему количеству клеток HeLa следующим образом: 8,8 ± 0,7%, 14,3 ± 1,6%, 15,6 ± 2,9%, 21,4 ± 1,8%, 25,4 ± 2,3% и 33,7 ± 2,6% (рисунок 4B).

Экспрессия белков Bcl-2 и Bax
Экспрессия белка Bax увеличивалась, а экспрессия белка Bcl-2 снижалась в зависимости от дозы в клетках HeLa, обработанных амигдалином. После 24 часов воздействия амигдалина в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл соответствующие соотношения экспрессии белка Bax к экспрессии белка Bcl-2 были следующими: 0,17 ± 0,05, 0,25 ± 0,04, 0,41 ± 0,09, 0,68 ± 0,1, 1,36 ± 0,13 и 1,69 ± 0,11 (рисунок 5A и B).

Влияние амигдалина на активность каспазы-3 в клетках HeLa
Каспаза-3 в клетках HeLa активировалась амигдалином в зависимости от дозы. Увеличение концентраций амигдалина при 0, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл приводило к соответствующим увеличениям активности каспазы-3 следующим образом: 0,139 ± 0,02, 0,149 ± 0,02, 0,164 ± 0,01, 0,29 ± 0,01, 0,394 ± 0,01, 0,482 ± 0,04. Кроме того, ингибитор каспазы-3 DEVD-fmk прекращал активацию каспазы-3, вызванную амигдалином. При концентрации 20 мг/мл амигдалина активность каспазы-3 в клетках HeLa, обработанных DEVD-fmk, составляла только 25,7% от таковой без обработки DEVD-fmk (рисунок 6).

Влияние амигдалина на рост клеток HeLa in vivo
Ксенотрансплантаты опухолей, пересаженные клетками HeLa, использовались для оценки противоопухолевого эффекта амигдалина in vivo. Амигдалин значительно ингибировал рост опухоли. Средний объем опухоли (TV) у контрольных мышей составлял 453,2 ± 132 мм³ через 14 дней после инъекции физиологического раствора. В то время как TV у мышей, которым вводили 300 мг/кг амигдалина или 30 мг/кг 5-FU, составлял 255,4 ± 134,8 или 269,5 ± 101,3 мм³ (рисунок 7A и B). Не было значительных изменений в массе тела между контрольной, 5-FU и амигдалиновой группами (рисунок 7C). Амигдалин ингибировал рост опухоли в модели ксенотрансплантата опухоли через механизм апоптоза. Процент TUNEL-положительных клеток в группах контроля (физиологический раствор), 5-FU (30 мг/кг) и амигдалина (300 мг/кг) составлял 2,1 ± 0,7, 36,3 ± 2,1 и 33,8 ± 3,5 соответственно (рисунок 7D и E).

Обсуждение

Основной целью настоящего исследования было проверить гипотезу о том, что амигдалин индуцирует апоптоз в клеточной линии рака шейки матки человека HeLa, чтобы оценить его как дополнение к текущим методам лечения рака шейки матки. В настоящем исследовании есть три ключевых вывода: (1) жизнеспособность и количество клеток HeLa снижались после обработки амигдалином; (2) индуцированный апоптоз в клетках HeLa может происходить через внутренний путь апоптоза; (3) in vivo введение амигдалина ингибировало рост опухоли клеток HeLa через механизм апоптоза.

МТТ-тест может точно определить количество живых клеток и является незаменимым для оценки цитотоксичности, связанной с скринингом противораковых препаратов. Используя этот тест в настоящем исследовании, мы обнаружили, что амигдалин снижал жизнеспособность клеток HeLa в зависимости от дозы. Эффект амигдалина на жизнеспособность клеток, по-видимому, зависел от типа клеток, так как жизнеспособность клеток FL, обработанных амигдалином, не показала значительных изменений по сравнению с необработанными клетками FL (рисунок 2). Подобное явление было продемонстрировано при наблюдении культивируемых клеток под микроскопом: количество клеток HeLa, обработанных амигдалином (рисунок 3A), было значительно меньше, чем у необработанных контрольных клеток HeLa, тогда как количество клеток FL не изменялось под действием амигдалина. Механизмы, лежащие в основе различий между клетками HeLa и FL в ответ на амигдалин, остаются неясными. Некоторые уникальные особенности клеток HeLa или FL должны способствовать этим различиям. Некоторые исследования предполагают, что раковые клетки богаты β-глюкозидазой, которая может расщеплять амигдалин для высвобождения цианида, оказывая токсическое воздействие на раковые клетки.[^14, 15, 16] Другие исследования предполагают, что роданеза, которая способна детоксифицировать цианид, присутствует в нормальных тканях, но отсутствует в раковых клетках. Совместное действие этих двух ферментов может быть ответственно за индукцию токсичности, связанной с цианидом, в раковых клетках, обработанных амигдалином, в то время как нормальные клетки остаются неповрежденными.[^9, 17] Клеточная линия HeLa происходит из клеток рака шейки матки человека, а клетки FL — из доброкачественных клеток эмбрионального амниона человека. Дальнейшие исследования необходимы для определения, обогащены ли клетки HeLa β-глюкозидазой, а клетки FL — роданезой, и отвечают ли эти особенности за специфичность амигдалина на пролиферацию клеток HeLa по сравнению с клетками FL.

Настоящее исследование продемонстрировало, что амигдалин способен индуцировать апоптоз в клетках HeLa. Поэтому мы считаем, что снижение жизнеспособности клеток HeLa под действием амигдалина происходило через механизм апоптоза. Мы проверили апоптотические эффекты амигдалина на клетки HeLa с помощью различных методов, включая окрашивание DAPI и анализ морфологических изменений ядер под флуоресцентным микроскопом (рисунок 3B). Двойное окрашивание аннексином V-FITC и PI использовалось для измерения количества ранних и поздних апоптотических клеток с помощью проточной цитометрии (рисунок 4).[^19, 20] Активность каспазы-3, которая, как известно, опосредует ключевые части апоптотического пути[^21, 22, 23], и соотношение Bax к Bcl-2 также увеличивались под действием амигдалина. Результаты этих исследований продемонстрировали апоптотический эффект амигдалина на клетки HeLa. Индукция апоптоза амигдалином в нескольких других типах клеток была недавно сообщена, включая клетки рака простаты и клетки промиелоцитарного лейкоза, что согласуется с выводами нашего исследования, за исключением типа клеток. Существует два пути, опосредующих развитие апоптоза: внешний путь и внутренний путь. Внешний путь опосредуется рецепторами смерти. Митохондрии играют центральную роль во внутреннем пути[^28, 29], который регулируется семейством белков Bcl-2.[^30, 31, 32] Результаты настоящего исследования показали, что соотношение белка Bax к белку Bcl-2 увеличивалось в клетках HeLa, обработанных амигдалином, в зависимости от дозы, что предполагает вовлечение внутреннего пути в индуцированный амигдалином апоптоз. Помимо апоптоза, другим механизмом, с помощью которого амигдалин снижал жизнеспособность клеток HeLa, могла быть остановка клеточного цикла. Чтобы проверить возможность вовлечения клеточного цикла, клетки HeLa, обработанные амигдалином, окрашивали, и распределение клеток на фазах G0/G1, S и G2/M измеряли с помощью проточной цитометрии. Было показано, что распределение клеток HeLa, обработанных и не обработанных амигдалином, на фазах G0/G1, S и G2/M оставалось одинаковым, что указывает на отсутствие остановки клеточного цикла в снижении жизнеспособности клеток HeLa под действием амигдалина (данные не показаны). Механизмы, с помощью которых амигдалин снижает жизнеспособность клеток, могут варьироваться в зависимости от типа клеток с различным генетическим фоном: снижение жизнеспособности, вызванное амигдалином в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4, было показано как опосредованное механизмом подавления белков, связанных с клеточным циклом, а не апоптозом.

Результаты настоящего исследования продемонстрировали, что амигдалин значительно ингибировал рост ксенотрансплантата клеток HeLa у голых мышей BALB/c через механизм индукции апоптоза (рисунок 7). Результаты исследования in vivo являются новыми, так как мы не видели подобных отчетов в публикациях до сих пор. Не было обнаружено явных побочных эффектов у голых мышей после введения амигдалина. Это может быть правдой, так как амигдалин является своего рода травой или витамином, встречающимся в природе. Хотя он содержит цианидную группу, которая токсична для живых клеток, он безопасен, пока молекула амигдалина остается неповрежденной без высвобождения цианидной группы ферментативно из молекулы амигдалина.

Заключение

В этом исследовании наши результаты демонстрируют, что амигдалин способен ингибировать рост клеточной линии рака шейки матки человека HeLa как in vitro, так и in vivo через механизм индукции апоптоза. Мы предполагаем, что амигдалин может служить потенциально эффективной терапией для рака шейки матки.

Благодарности

Эта работа частично поддержана грантом Министерства образования КНР (№ 707020).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.