Тэг: Рак

 «Предрак: дихотомия неизбежности и мифа. От патоморфологии к системной биологии онкогенеза»

Автор

Станислав Болотов
Молекулярный онконутрициолог, независимый аналитический исследователь в области метаболической онкологии
Основатель S.A.I.D - Laboratory Solutions

Официальные ресурсы:
Telegram-канал SAID Laboratory Solutions
https://t.me/+Uwpv6OpoO4NjNzNi

Личный Telegram
https://t.me/+_ZhagNcp9TFlZDY6

Яндекс.Дзен
https://dzen.ru/id/641b10685537803555a3e15a

Полная версия на:

Boosty
https://boosty.to/stas403/donate

Аннотация: В статье проводится системный анализ явления «предрака», рассматриваемого как динамический континуум переходных состояний от нормы к малигнизации. На основании синтеза данных современной онкологии, патологической физиологии и эпидемиологии дается критическое разграничение между состояниями с доказанным онкогенным потенциалом («то, что перерождается во врага» -метафора, обозначающая процесс малигнизации) и широким спектром состояний, ошибочно трактуемых как облигатный предрак. Особое внимание уделяется ответу на ключевой клинический вопрос о вероятности трансформации, разбираются детерминанты и переменные этого процесса. Статья предлагает переход от статичной категоризации «предрак/не предрак» к процессуальной модели «онкогенного контекста».

Ключевые слова: предрак, дисплазия, малигнизация, хроническое воспаление, риск онкогенеза, системная биология рака.

1. Введение: Парадигма предрака в эволюции онкологии

Исторически понятие «предрака» было тесно связано с морфологией -обнаружением клеточной атипии и нарушений архитектоники ткани. Однако развитие молекулярной онкологии и системной биологии расширило это понятие до уровня микроокружения, метаболического и иммунного ландшафта организма. Сегодня «предрак» -это не статическая гистологическая картина, а процесс накопления «онкогенных обязательств» на разных уровнях биологической организации: геномном, клеточном, тканевом и организменном. Данная статья ставит целью:

1. Структурировать классические и современные представления о предраковых состояниях.
2. Четко разграничить их от распространенных патологий и мифов, не обладающих самостоятельным онкогенным потенциалом.
3. Дать количественную и качественную оценку риска малигнизации, ответив на вопрос: «Это точно перерастет в рак?».

DCA увеличивает противоопухолевые эффекты капецитабина у мышиного аллографта меланомы B16 и у ксенографта немелкоклеточного рака легкого чел

Авторы

Mao-fa Zheng, Si-yu Shen, Wei-da Huang Школа биологических наук, Фуданьский университет, Китай.
Источник: Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2013

Аннотация (Abstract)

Цель. Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной биодоступностью. В последние годы дихлорацетат натрия (DCA) демонстрирует значительный потенциал как противораковый агент. В настоящем исследовании мы оценили противоопухолевый эффект DCA в сочетании с капецитабином для опухолей, которые умеренно экспрессируют TP (тимидинфосфорилазу).Методы. Были использованы:

• мышиный аллографт меланомы B16;
• ксенографт немелкоклеточного рака легкого человека A549.

Проводились гистологические и иммуногистохимические исследования для выявления апоптоза и пролиферации опухолевых клеток. Методом ПЦР в реальном времени определялась экспрессия TP. Методом вестерн-блотинга — экспрессия каспаз.Результаты. Впервые мы показываем, что DCA усиливает противоопухолевое действие капецитабина у мышиного аллографта B16 и у человеческого ксенографта A549 путем повышения уровня апоптоза в опухолевых клетках. DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP.Заключение. Наши данные говорят о том, что комбинация DCA и капецитабина может представлять собой новую терапевтическую стратегию против некоторых видов рака.Ключевые слова: DCA, капецитабин, комбинация, противоопухолевый эффект.

Введение (Introduction)

Дихлорацетат натрия (DCA) является малой молекулой — солью дихлорацетовой кислоты с молекулярной массой 150 Да. DCA ингибирует активность пируватдегидрогеназной киназы (PDK), тем самым активируя митохондриальный ферментный комплекс пируватдегидрогеназы и переводя метаболический путь от гликолиза к окислительному фосфорилированию.На протяжении последних 40 лет DCA использовался как орфанный препарат при лечении врождённого лактатацидоза у детей и других состояний, сопровождающихся лактоацидозом, и показал высокую эффективность и низкую токсичность как в доклинических, так и в клинических исследованиях.В последние годы DCA проявил большой потенциал как противоопухолевый агент из-за сходных метаболических перестроек в некоторых опухолевых клетках и при лактатацидозе. Обычно раковые клетки, особенно раковые стволовые клетки (CSCs), избегают апоптоза за счёт получения энергии преимущественно через гликолиз и молочнокислое брожение, а не через окислительное фосфорилирование. Это связано с гипоксическим микроокружением опухоли и известно как эффект Варбурга.После перорального приема DCA способен восстанавливать митохондриальную функцию и селективно индуцировать апоптоз опухолевых клеток по митохондриально зависимому пути. Противоопухолевые эффекты DCA при глиобластоме были протестированы в клинических исследованиях (NCT00540176) и показали некоторые положительные результаты.Однако исследование фазы II (NCT01029925), направленное на оценку эффективности перорального DCA у пациентов с рецидивирующим или метастатическим, предварительно леченным раком молочной железы и немелкоклеточным раком легкого, было прекращено из-за более высокого, чем ожидалось, уровня риска и опасений по безопасности. Поэтому клиническая применимость DCA требует осторожной оценки.Как сенситайзер апоптоза, DCA также применялся в сочетании с другими противораковыми методами. Cao и соавт. показали, что DCA сенситизирует клетки рака предстательной железы к радиации in vitro. Xiao и соавт. установили, что DCA усиливает гибель опухолевых клеток в комбинации с онколитическим аденовирусом, экспрессирующим опухолевый супрессор MDA-7/IL-24. Недавно терапия, направленная на метаболические мишени с использованием DCA, была предложена как стратегия улучшения результатов фотодинамической терапии. Tong и соавт. обнаружили, что DCA и 5-фторурацил проявляют синергический противоопухолевый эффект на клетках колоректального рака in vitro.Тем не менее данные о применении DCA, как в монорежиме, так и в комбинации, остаются противоречивыми. Shahrzad и соавт. показали, что DCA уменьшает апоптоз раковых клеток в условиях гипоксии. Heshe и соавт. сообщили, что DCA снижает цитотоксичность некоторых стандартных противораковых препаратов (цисплатина и доксорубицина), хотя не влияет на активность темозоломида в большинстве исследованных линий.Эти противоречия указывают на то, что использование DCA — как отдельно, так и в комбинации — может быть специфично для типа опухоли и конкретного препарата.

Продолжение Introduction

Капецитабин является пероральным пролекарством 5-фторурацила (5-FU). После приема внутрь он сначала превращается в печени в 5’-деокси-5-фторцитидин (5’-DFCR), а затем ферментом цитидиндезаминазой превращается в 5’-деокси-5-фторуридин (5’-DFUR). После этого 5’-DFUR попадает в опухолевые ткани и там превращается в активный 5-FU ферментом тимидинфосфорилазой (TP).Поскольку уровень экспрессии TP во многих опухолях выше, чем в нормальных тканях, капецитабин способен вызывать локальную, преимущественную генерацию 5-FU в опухолевом очаге и обладает высокой избирательностью.В целом, TP играет ключевую роль в активации капецитабина. Высокая экспрессия TP в опухоли связана с лучшими клиническими результатами терапии капецитабином. С другой стороны, низкая экспрессия TP может объяснять слабую чувствительность некоторых опухолей к капецитабину.Несмотря на это, для многих опухолевых линий (например, меланома B16 или рак легкого A549) характерны умеренные уровни TP. И мы предположили, что в таких опухолях DCA может усиливать действие капецитабина независимо от уровня TP.Таким образом, цель нашего исследования заключалась в том, чтобы оценить, может ли DCA усиливать антиопухолевый эффект капецитабина в моделях опухолей с умеренной экспрессией TP.

Материалы и методы (Materials and Methods)

Клеточные линии и культура клеток

Линия мышиной меланомы B16 была получена из Китайского центра типовых культур клеток. Линия человеческого немелкоклеточного рака легкого A549 была получена из Шанхайского института клеточной биологии Академии наук Китая.Обе линии культивировались в RPMI-1640, содержащей 10 процентов фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере 5 процентов CO₂.

Животные и модели опухолей

Самцы мышей C57BL/6 и BALB/c Nude возрастом 4–5 недель были приобретены у Шанхайского центра лабораторных животных. Все животные содержались в стерильных условиях и акклиматизировались в течение одной недели перед экспериментами.

Модель B16

Клетки B16 в количестве 1×10⁶ вводили подкожно в боковую поверхность мышей C57BL/6.

Модель A549

Клетки A549 в количестве 5×10⁶ смешивали с матригелем (1:1) и вводили подкожно мышам Nude.Когда размер опухоли достигал примерно 100 мм³, начинали лечение.

Лекарственные препараты и схемы лечения

Дихлорацетат натрия (DCA) добавлялся в питьевую воду мышей в концентрации 1.4 г/л. На основе суточного потребления воды это соответствовало примерно 100 мг/кг массы тела.Капецитабин (Xeloda) суспендировали в 0.5 процента КМЦ (карбоксиметилцеллюлоза) и вводили перорально один раз в день в дозах от 2.5 до 20 мг.Опухолевый объем рассчитывали по формуле:V = (длина × ширина²) / 2Вес животных также регулярно регистрировали.Лечение продолжалось до достижения контрольной группой критических размеров опухоли.

Гистология и иммуногистохимия

Опухоли фиксировали в формалине и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.Для оценки пролиферации использовали антитела к PCNA. Для выявления апоптоза применяли TUNEL-анализ в соответствии с инструкциями производителя.Позитивные клетки подсчитывали в пяти случайно выбранных полях каждого слайда.

RT-PCR (анализ экспрессии TP)

Общую РНК извлекали из опухолевых тканей с помощью набора TRIzol. Синтез кДНК проводили с использованием набора PrimeScript RT.ПЦР в реальном времени выполняли на аппарате ABI 7500. Использовались специфические праймеры для TP и GAPDH (контроль).Относительная экспрессия рассчитывалась методом 2⁻ΔΔCt.

Western blot (анализ каспаз)

Общий белок выделяли из опухолевых тканей с помощью RIPA-буфера. Равные количества белка подвергали электрофорезу в SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембраны.Мембраны инкубировали с антителами против:

• каспазы 3
• каспазы 8
• каспазы 9
• β-Actin (контроль)

Затем использовали вторичные антитела и выявление методом усиленной хемилюминесценции.

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка (SEM). Для сравнения между группами использовался t-тест Стьюдента. Разница считалась статистически значимой при p < 0.05.

Результаты (Results)

Экспрессия TP в клеточных линиях B16 и A549

Прежде всего мы исследовали экспрессию тимидинфосфорилазы (TP) в клеточных линиях B16 и A549 методом количественной ПЦР в реальном времени (RT-PCR). Обе линии продемонстрировали умеренные уровни экспрессии TP, хотя экспрессия TP в B16 была ниже, чем в A549.Эти данные указывают на то, что обе модели подходят для изучения комбинированного эффекта DCA и капецитабина.

DCA усиливает ингибирующее действие капецитабина на рост опухоли B16 (раннее начало лечения)

В первой серии экспериментов лечение начинали на 3-й день после прививки опухоли B16.Мышам вводили:

• только DCA;
• только капецитабин (10 мг/сут или 20 мг/сут);
• комбинацию DCA и капецитабина.

Рост опухоли

В контрольной группе опухоли увеличивались быстро. DCA в монорежиме давал незначительное торможение роста. Капецитабин в дозе 10 мг/сут также давал умеренный эффект.Однако комбинация DCA и капецитабина в дозе 10 мг/сут приводила к выраженному подавлению роста опухоли, гораздо более сильному, чем каждая терапия по отдельности.

Токсичность

При дозе капецитабина 20 мг/сут наблюдалось заметное снижение массы тела у животных, что указывало на токсичность высокой дозы. Но комбинация DCA + 10 мг была эффективной без потери веса.

DCA усиливает эффект капецитабина в модели B16 при позднем начале лечения

Чтобы оценить эффективность при более крупных опухолях, лечение начинали на 10-й день после прививки B16-клеток.Капецитабин назначали в дозе 7.5 мг/сут, отдельно и в комбинации с DCA.

Рост опухоли

• DCA в монорежиме почти не влияло на рост.
• Капецитабин 7.5 мг/сут давал заметный, но умеренный эффект.
• Комбинация DCA + капецитабин подавила рост опухоли примерно на 75 процентов, что существенно превосходило оба варианта монотерапии.

Токсичность

Ни в одной из групп не наблюдалось значительных изменений массы тела. DCA не усиливал токсичность капецитабина.

Комбинация DCA и капецитабина усиливает эффект в модели A549 (рак легкого человека)

В модель A549 лечение также начинали при размере опухоли около 100 мм³.Капецитабин применяли в дозах:

• 2.5 мг/сут;
• 5 мг/сут;
• 10 мг/сут.

Каждая доза тестировалась отдельно и в комбинации с DCA.

Рост опухоли

• DCA в монорежиме не вызывал значимого подавления роста.
• Капецитабин в дозе 10 мг/сут обладал выраженным эффектом.
• Капецитабин в дозе 5 мг/сут вызывал умеренное подавление.
• Доза 2.5 мг/сут была слабоэффективной.

Комбинация DCA + 5 мг капецитабина приводила к такому же подавлению роста опухоли, как и 10 мг капецитабина в монорежиме.То есть DCA позволял снизить дозу капецитабина в 2 раза без потери эффективности.

Токсичность

Капецитабин в дозе 10 мг/сут вызывал заметное снижение веса. Комбинация DCA + 5 мг/сут имела аналогичную эффективность, но без снижения массы тела, что говорит об отсутствии дополнительной токсичности.

DCA усиливает апоптоз опухолевых клеток в обеих моделях

Апоптоз оценивали методом TUNEL.

Модель B16

• контроль: низкий уровень апоптоза;
• DCA: увеличение до примерно 8%;
• капецитабин: около 17%;
• комбинация: около 30%.

То есть комбинация давала более высокий показатель апоптоза, чем сумма эффектов двух препаратов по отдельности.

Модель A549

• DCA: около 15%;
• капецитабин: около 30%;
• комбинация: около 50%.

Это демонстрирует выраженный синергизм двух препаратов по индукции апоптоза.

DCA не усиливает ингибирование пролиферации (PCNA)

Пролиферацию оценивали иммуногистохимией по уровню PCNA.

• Капецитабин снижал пролиферацию.
• DCA в монорежиме не подавлял пролиферацию.
• Комбинация не снижала PCNA сильнее, чем сам капецитабин.

Это означает, что синергия основана не на подавлении деления, а на усилении апоптоза.

DCA усиливает активацию каспаз 8, 9 и 3 в опухолях A549

Анализ вестерн-блот показал:

• DCA сам по себе почти не активировал каспазы.
• Капецитабин активировал каспазы 3, 8 и 9.
• Комбинация DCA + капецитабин значительно усиливала экспрессию активных (расщепленных) каспаз 8, 9 и 3.

Это подтверждает, что DCA работает как сенситайзер апоптоза, а капецитабин — как основной индуктор.

DCA почти не влияет на экспрессию TP в опухолях B16 и A549

Согласно данным RT-PCR:

• ни DCA, ни комбинация не изменяли уровень TP по сравнению с капецитабином;
• экспрессия TP была стабильной во всех группах.

Следовательно, усиление эффекта не связано с изменением метаболизма капецитабина.

Обсуждение (Discussion)

Впервые мы продемонстрировали, что дихлорацетат натрия (DCA) способен усиливать ингибирующее действие капецитабина на рост опухолей в двух доклинических моделях, экспрессирующих умеренные уровни TP: в мышином аллографте меланомы B16 и в человеческом ксенографте немелкоклеточного рака легкого A549.

Сравнение с предыдущими исследованиями по DCA

Ранее было показано, что:

• DCA восстанавливает митохондриальную функцию,
• уменьшает зависимость опухолевых клеток от гликолитического метаболизма,
• индуцирует апоптоз по митохондриально зависимому пути.

В работах Bonnet и соавт. DCA продемонстрировал противоопухолевые эффекты в клетках глиомы как in vitro, так и in vivo. Тем не менее другие исследования свидетельствовали о противоречивых результатах: DCA снижал цитотоксичность некоторых химиопрепаратов или снижал апоптоз в условиях гипоксии.Наши данные подтверждают, что эффективность DCA может зависеть от конкретного типа опухоли и контекста лечения.

Механизм усиления эффекта капецитабина

Наши результаты показывают, что усиление эффекта капецитабина связано с выраженным увеличением уровня апоптоза, а не с усилением подавления пролиферации.В моделях B16 и A549 комбинация DCA и капецитабина увеличивала число TUNEL-позитивных клеток в значительно большей степени, чем каждый препарат по отдельности.Также было показано, что комбинация:

• усиливает активацию каспазы 9 (внутренний путь апоптоза),
• усиливает активацию каспазы 8 (внешний путь),
• усиливает активацию каспазы 3 (конечный исполнительный путь).

Эти данные указывают на то, что DCA действует как сенситайзер и повышает восприимчивость опухолевых клеток к индуцированному капецитабином апоптозу.

Экспрессия TP и активация капецитабина

Поскольку TP является ключевым ферментом для превращения капецитабина в 5-FU, мы оценили, влияет ли DCA на уровень TP. RT-PCR не показал значимых различий между группами.Эти данные свидетельствуют, что:

• DCA не увеличивает метаболическую активацию капецитабина,
• и что усиление эффекта происходит независимо от TP.

Таким образом, механизм синергии не связан с повышением концентрации 5-FU в опухоли, а связан именно с изменением апоптотического ответа.

Снижение дозы капецитабина

В модели A549 комбинация DCA и капецитабина в дозе 5 мг в сутки давала такой же противоопухолевый эффект, как и 10 мг капецитабина в монорежиме.При этом:

• капецитабин 10 мг/сут вызывал потерю веса,
• комбинация с DCA — нет.

Это позволяет предположить, что применение DCA может:

• позволить снизить дозу капецитабина,
• уменьшить побочные эффекты,
• сохранить противоопухолевую активность.

Возможное клиническое значение

С учетом неоднозначных результатов предыдущих клинических исследований DCA его применение требует осторожности. Тем не менее наши данные предполагают, что DCA может быть перспективным компонентом комбинированной терапии для опухолей, умеренно экспрессирующих TP.Особенно важным является тот факт, что DCA не усиливал токсичность капецитабина в наших моделях.

Заключение (Conclusion)

Мы продемонстрировали, что дихлорацетат натрия значительно усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в моделях B16 и A549. Комбинация DCA и капецитабина приводила к выраженному повышению уровня апоптоза и активации каспаз в опухолевых клетках.Поскольку DCA не изменял экспрессию TP, механизм усиления не связан с изменением метаболизма капецитабина.Наши данные указывают, что комбинация DCA и капецитабина может представлять собой перспективную терапевтическую стратегию для определенных типов рака и заслуживает дальнейшего изучения.

ПЕРЕВОД СПИСКА ЛИТЕРАТУРЫ (References)

Источник: Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2013

1-1DCA~1

1.

Wigfield S. M., Winter S. C., Giatromanolaki A., Taylor J., Koukourakis M. L., Harris A. L.
PDK-1 регулирует продукцию лактата в условиях гипоксии и ассоциирован с плохим прогнозом при плоскоклеточном раке головы и шеи.
British Journal of Cancer, 2008; 98(12): 1975–1984.

2.

Cohen R. D., Iles R. A.
Дихлорацетат и лечение лактатацидоза.
New England Journal of Medicine, 1978; 298(24): 1364.

3.

Agbenyega T., Planche T., Bedu-Addo G., Ansong D., Owusu-Ofori A., Bhattaram V. A., и др.
Популяционная фармакокинетика, эффективность и безопасность дихлорацетата при лактатацидозе вследствие тяжелой малярии у детей.
Journal of Clinical Pharmacology, 2003; 43(4): 386–396.

4.

Michelakis E. D., Webster L., Mackey J. R.
Дихлорацетат (DCA) как потенциальная метаболически направленная терапия рака.
British Journal of Cancer, 2008; 99(7): 989–994.

5.

Warburg O., Wind F., Negelein E.
Метаболизм опухолей в организме.
Journal of General Physiology, 1927; 8(6): 519–530.

6.

Gatenby R. A., Gillies R. J.
Почему у рака высок уровень аэробного гликолиза?
Nature Reviews Cancer, 2004; 4(11): 891–899.

7.

Bonnet S., Archer S. L., Allalunis-Turner J., Haromy A., Beaulieu C., Thompson R., и др.
Ось митохондрия–калиевый канал подавлена в раковых клетках, и ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост опухолей.
Cancer Cell, 2007; 11(1): 37–51.

8.

Pan J. G., Mak T. W.
Метаболическое таргетирование как противораковая стратегия: начало новой эры?
Science’s STKE (Signal Transduction Knowledge Environment), 2007; 381: pe14.

9.

Michelakis E. D., Sutendra G., Dromparis P., Webster L., Haromy A., Niven E., и др.
Метаболическая модуляция глиобластомы с помощью дихлорацетата.
Science Translational Medicine, 2010; 2(31): 31ra34.

10.

Cao W., Yacoub S., Shiverick T. T., Namiki K., Sakai Y., Porvasnik S., Urbanek C., Rosser C. J.
Дихлорацетат (DCA) сенситизирует клетки рака простаты дикого типа и сверхэкспрессирующие Bcl-2 к радиации in vitro.
The Prostate, 2008; 68(11): 1223–1231.

11.

Xiao L., Li X., Niu N., Qian J., Xie G., Wang Y.
Дихлорацетат (DCA) усиливает гибель опухолевых клеток в комбинации с онколитическим аденовирусом, несущим MDA-7/IL-24.
Molecular and Cellular Biochemistry, 2010; 340(1–2): 31–40.

12.

Kwitniewski M., Moan J., Juzeniene A.
Метаболически направленная терапия с использованием DCA как новая стратегия улучшения результатов фотодинамической терапии.
Photochemical & Photobiological Sciences, 2011; 10(1): 25–28.

13.

Tong J., Xie G., He J., Li J., Pan F., Liang H.
Синергический противоопухолевый эффект дихлорацетата в комбинации с 5-фторурацилом при колоректальном раке.
Journal of Biomedical Biotechnology, 2011; Article ID 740564.

14.

Shahrzad S., Lacombe K., Adamcic U., Minhas K., Coomber B. L.
Дихлорацетат натрия (DCA) уменьшает апоптоз при гипоксии в клетках опухоли толстой кишки.
Cancer Letters, 2010; 297(1): 75–83.

15.

Heshe D., Hoogestraat S., Brauckmann C., Karst U., Boos J., Lanvers-Kaminsky C.
Метаболически направленная терапия дихлорацетатом снижает цитотоксичность стандартных противораковых препаратов.
Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2011; 67(3): 647–655.

16.

Mandelblat J., Bashir T., Budman D. R.
Комбинация капецитабин–доцетаксел.
Expert Review of Anticancer Therapy, 2006; 6(9): 1169–1178.

17.

Budman D. R.
Капецитабин.
Investigational New Drugs, 2000; 18(4): 355–363.

18.

Miwa M., Ura M., Nishida M., Sawada N., Ishikawa T., Mori K., и др.
Разработка нового перорального фторпиримидинового карбамата капецитабина, который генерирует 5-фторурацил селективно в опухолях.
European Journal of Cancer, 1998; 34(8): 1274–1281.

19.

Endo M., Shinbori N., Fukase Y., Sawada N., Ishikawa T., Ishitsuka H., Tanaka Y.
Индукция тимидинфосфорилазы и усиление эффективности капецитабина или 5’-деокси-5-фторуридина циклофосфамидом в моделях рака молочной железы.
International Journal of Cancer, 1999; 83(1): 127–134.

20.

Ishikawa T., Sekiguchi F., Fukase Y., Sawada N., Ishitsuka H.
Положительная корреляция эффективности капецитабина и доксифлуридина с отношением активности тимидинфосфорилазы к дегидропиримидиндегидрогеназе в опухолях.
Cancer Research, 1998; 58(4): 685–690.

21.

Kolinsky K., Shen B. Q., Zhang Y. E., Kohles J., Dugan U., Zioncheck T. F., и др.
In vivo активность новых схем капецитабина в монорежиме и в комбинации с бевацизумабом и оксалиплатином в моделях колоректального рака.
Molecular Cancer Therapeutics, 2009; 8(1): 75–82.

22.

Lee D. H., Han J. Y., Yoon S. M., Lee J. J., Lee H. G., Kim H. Y., и др.
Пилотное исследование комбинации гемцитабина, винорелбина и капецитабина у пациентов с местнораспространенным или метастатическим НМРЛ.
American Journal of Clinical Oncology, 2006; 29(2): 143–147.

23.

Lee J. J., Han J. Y., Lee D. H., Kim H. Y., Chun J. H., Lee H. G., и др.
Испытание II фазы комбинации доцетаксела и капецитабина у ранее леченных пациентов с НМРЛ.
Japanese Journal of Clinical Oncology, 2006; 36(12): 761–767.

24.

Kindwall-Keller T., Otterson G. A., Young D., Neki A., Criswell T., Nuovo G., и др.
Оценка II фазы эффективности капецитабина, модулированного доцетакселом, у ранее леченных пациентов с НМРЛ.
Clinical Cancer Research, 2005; 11(5): 1870–1876.

25.

Sawada N., Ishikawa T., Fukase Y., Nishida M., Yoshikubo T., Ishitsuka H.
Индукция активности тимидинфосфорилазы и усиление эффективности капецитабина паклитакселом или доцетакселом в моделях ксенографтов.
Clinical Cancer Research, 1998; 4(4): 1013–1019.

26.

Sawada N., Kondoh K., Mori K.
Усиление эффективности капецитабина оксалиплатином в моделях колоректального и желудочного рака.
Oncology Reports, 2007; 18(4): 775–778.

27.

Sawada N., Ishikawa T., Sekiguchi F., Tanaka Y., Ishitsuka H.
Рентгеновское облучение индуцирует тимидинфосфорилазу и усиливает эффективность капецитабина в моделях ксенографтов человека.
Clinical Cancer Research, 1999; 5(10): 2948–2953.

28.

Kumar A., Kant S., Singh S. M.
Новые молекулярные механизмы противоопухолевого действия дихлорацетата при Т-клеточной лимфоме: влияние на метаболизм глюкозы, гомеостаз pH и регуляцию выживания клетки.
Chemico-Biological Interactions, 2012; 199(1): 29–37.

29.

Milner A. E., Palmer D. H., Hodgkin E. A., Eliopoulos A. G., Knox P. G., Poole C. J., и др.
Индукция апоптоза химиотерапевтическими препаратами: роль FADD в активации каспазы-8 и синергия с лигандом рецептора смерти в клетках рака яичников.
Cell Death and Differentiation, 2002; 9(3): 287–300.

30.

Ehrhardt H., Hacker S., Wittmann S., Maurer M., Borkhardt A., Toloczko A., и др.
Индуцированное цитотоксическими препаратами p53-опосредованное повышение экспрессии каспазы-8 в опухолевых клетках.
Oncogene, 2008; 27(6): 783–793.

31.

Ghotra V. P., Puigvert J. C., Danen E. H.
Микроокружение раковых стволовых клеток и противораковая терапия.
International Journal of Radiation Biology, 2009; 85(11): 955–962.

32.

Kitamura H., Okudela K., Yazawa T., Sato H., Shimoyamada H.
Раковые стволовые клетки: значение для биологии и терапии рака, с особым акцентом на рак легкого.
Lung Cancer, 2009; 66(3): 275–281.

33.

Dylla S. J., Beviglia L., Park I. K., Chartier C., Raval J., Ngan L., и др.
Стволовые клетки колоректального рака обогащаются в ксенографтовых опухолях после химиотерапии.
PLoS One, 2008; 3(6): e2428.

34.

Tao H., Zhu Y.
Стволовые клетки колоректального рака как потенциальная терапевтическая мишень.
Clinical and Translational Oncology, 2011; 13(12): 833–838.

35.

Tang C., Ang B. T., Pervaiz S.
Раковые стволовые клетки: мишень для противораковой терапии.
FASEB Journal, 2007; 21(14): 3777–3785.

36.

Sun X. Y., Nong J., Qin K., Warnock G. L., Dai L. J.
Мезенхимальные стволовые клетки в лечении рака: двухцелевой подход персонализированной медицины.
World Journal of Stem Cells, 2011; 3(11): 96–103.

37.

Sapi E.
Новая терапия, направленная на раковые стволовые клетки.
Cancer Biology & Therapy, 2009; 8(18): 1754–1755.

38.

Shigdar S., Lin J., Li Y., Yang C. J., Wei M., Zhu Y., Liu H., Duan W.
Таргетирование раковых стволовых клеток: новое поколение противораковой терапии и молекулярной визуализации.
Therapeutic Delivery, 2012; 3(2): 227–244.

39.

Ranieri G., Roccaro A. M., Vacca A., Ribatti D.
Тимидинфосфорилаза (фактор роста эндотелиальных клеток, полученных из тромбоцитов) как мишень для капецитабина: от биологии к клинической практике.
Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, 2006; 1(2): 171–183.

Метаболическая терапия рака: мировая практика, мишени и перспективы

Введение

Современная онкология стремительно развивается. За последние два десятилетия внедрение молекулярно-таргетных препаратов, иммунных ингибиторов контрольных точек и персонализированного подбора терапии изменили представления о возможностях лечения злокачественных опухолей. Однако даже самые современные подходы сталкиваются с ограничениями: лекарственная резистентность, токсичность, высокая стоимость.

На этом фоне всё большую известность получает метаболическая терапия рака — направление, которое рассматривает опухоль не только как генетически изменённую ткань, но и как структуру с нарушенным энергетическим обменом. Воздействие на эти особенности открывает новые возможности для замедления прогрессирования болезни и повышения эффективности стандартного лечения.

Почему метаболическая терапия актуальна

Опухолевые клетки обладают метаболическими отличиями от здоровых. Наиболее известное из них — так называемый эффект Варбурга: предпочтение гликолиза как основного источника энергии даже при нормальном поступлении кислорода. Дополнительные особенности включают:

• глутаминовую зависимость — многие опухоли используют глутамин как источник азота и углерода;

• переключение на липидный обмен — некоторые опухоли активно окисляют жирные кислоты;

• повышенное образование активных форм кислорода — опухолевые клетки балансируют на грани прооксидантного стресса;

• сниженную гибкость метаболизма — в отличие от нормальных клеток, опухоль часто «заперта» в одном энергетическом пути.

Эти особенности создают «ахиллесову пяту», на которую можно воздействовать фармакологическими и нутритивными методами.

География применения метаболической терапии

Метаболические подходы активно изучаются и применяются в различных странах:

• Европа — Германия, Австрия и Чехия известны клиническими программами с применением дихлорацетата (DCA), кетогенной диеты, внутривенных высоких доз витамина С и амигдалина для инъекций.

• Северная Америка — в США и Канаде исследуются комбинации метформина, 2-дезоксиглюкозы и кетогенного питания; в онкологических центрах также применяются высокодозные аскорбатные инфузии.

• Южная Америка — в Бразилии и Аргентине используют внутривенный витамин С и амигдалин, а также диетологические программы для контроля уровня глюкозы.

• Азия — Япония, Южная Корея и Китай сосредоточены на растительных метаболических модуляторах (куркумин, ресвератрол, экстракты зелёного чая), а также на митохондриально-направленных препаратах.

Основные направления и их мишени

1. Ингибирование гликолиза

• Препараты: 2-дезоксиглюкоза, дихлорацетат.

• Мишени: ферменты гликолиза, пируват-дегидрогеназная киназа.

• Эффект: снижение потребления глюкозы опухолью, истощение энергетических запасов, повышение чувствительности к радиации и химиотерапии.

2. Влияние на митохондрии и окислительный стресс

• Препараты: метформин, фенформин, высокие дозы аскорбата, амигдалин для внутривенного введения.

• Мишени: дыхательная цепь митохондрий, прооксидантный баланс.

• Эффект: запуск апоптоза, накопление активных форм кислорода, ослабление опухолевых клеток при сохранении жизнеспособности нормальных тканей.

3. Регуляция аминокислотного обмена

• Препараты: ингибиторы глутаминазы (BPTES, CB-839), ограничение глутамина в диете.

• Мишени: зависимость опухоли от глутамина.

• Эффект: блокировка роста глутамин-зависимых опухолей, усиление эффективности иммунотерапии.

4. Модификация липидного метаболизма

• Препараты: этомоксир (ингибитор β-окисления жирных кислот), диетические программы с низким содержанием жиров.

• Мишени: использование жиров в качестве источника энергии.

• Эффект: энергетическое «обеднение» опухолей с липидной зависимостью.

5. Нутритивные стратегии

• Кетогенная диета — перевод организма в состояние кетоза, снижение уровня глюкозы, использование кетоновых тел.

• Ограничение метионина и глутамина — создание неблагоприятных условий для синтеза нуклеотидов и белков опухолевыми клетками.

• Эффект: ослабление роста опухоли при сохранении питания нормальных клеток.

Роль амигдалина

Амигдалин — природный цианогенный гликозид, содержащийся в семенах некоторых растений (например, абрикоса). В ряде стран он применяется в виде внутривенных инъекций как дополнительное средство метаболической терапии.

Предполагаемые механизмы действия включают:

• локальное образование цианидных радикалов в опухолевых тканях, где активны определённые β-глюкозидазы;

• усиление прооксидантного стресса в раковых клетках;

• возможное повышение чувствительности опухоли к классическим видам лечения.

Хотя данные остаются противоречивыми и требуют строгих клинических исследований, амигдалин продолжает использоваться в ряде протоколов как дополнительный метаболический агент.

Перспективы и вызовы

Несмотря на растущий интерес, у метаболической терапии есть свои трудности:

• неравномерность доказательной базы: одни подходы (метформин, кетогенная диета) имеют больше подтверждений, другие (амигдалин, 2-дезоксиглюкоза) требуют дополнительных исследований;

• различия в законодательстве: препараты, разрешённые в одной стране, могут быть под запретом в другой;

• необходимость персонализации: разные опухоли используют разные метаболические пути, поэтому универсального метода не существует;

• вопросы безопасности: избыточное вмешательство в обмен веществ может повлиять и на здоровые клетки.

В то же время возможности огромны. Метаболическая терапия способна усиливать стандартные методы, снижать токсичность лечения, повышать качество жизни пациентов и открывать новые пути для персонализированной медицины.

Заключение

Метаболическая терапия — это не альтернатива классической онкологии, а её дополнение. Она объединяет фармакологию, нутрициологию и молекулярную биологию, создавая условия, в которых опухолевые клетки становятся более уязвимыми.

Применение препаратов вроде дихлорацетата, метформина, высоких доз витамина С, а также амигдалина для внутривенных инъекций демонстрирует, что воздействие на энергетические пути опухоли способно усиливать результаты хирургического, химиотерапевтического и иммунного лечения.

Метаболическая терапия уже сегодня становится важным подспорьем современной онкологии, а в будущем, по мере развития персонализированных подходов, её роль будет только возрастать.

Амигдалинин дуцирует апоптоз через регуляцию экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP

Хён-Кён Чанг, Мал-Сун Шин, Хе-Ян Ян, Джин-Ву Ли, Ён-Сик Ким, Мён-Хва Ли, Джулия Ким, Кхе-Хван Ким и Чанг-Джу Ким*

*Кафедра физиологии, Медицинский колледж, Университет Кён Хи; #1 Хоиги-дон, Донгдэмун-гу, Сеул 130–701, Южная Корея. Получено 8 сентября 2005; принято 1 марта 2006*

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Амигдалин является одним из нитрилозидов, природных веществ, содержащих цианид, в изобилии содержащихся в семенах растений семейства пруназин, которые использовались для лечения раков и облегчения боли. В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. Апоптоз, запрограммированная клеточная смерть, является важным механизмом в лечении рака. В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen (семена абрикоса) и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. В настоящих результатах, клетки DU145 и LNCaP, обработанные амигдалином, проявляли несколько морфологических характеристик апоптоза. Обработка амигдалином увеличивала экспрессию Bax, проапоптотического белка, уменьшала экспрессию Bcl-2, антиапоптотического белка, и увеличивала активность фермента каспазы-3 в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Здесь мы показали, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP путем активации каспазы-3 через down-регуляцию (подавление экспрессии) Bcl-2 и up-регуляцию (усиление экспрессии) Bax. Настоящее исследование показывает, что амигдалин может предложить ценный вариант для лечения раков предстательной железы.

Ключевые слова амигдалин; рак предстательной железы; апоптоз; Bcl-2; Bax; Каспаза-3

Амигдалин (витамин B1717​; ранее называвшийся лаэтрилом) является одним из многих нитрилозидов, которые являются природными веществами, содержащими цианид, в изобилии содержащимися в семенах семейства пруназин, растений, таких как абрикосы, миндаль, персики, яблоки и другие розоцветные растения. Среди пруназинов, Armeniacae semen (семена абрикоса) использовались для лечения астмы, бронхита, эмфиземы, проказы, колоректального рака, витилиго и боли. 1−31−3 Амигдалин состоит из двух молекул глюкозы, одной бензальдегида, который индуцирует анальгезирующее действие, и одной синильной кислоты, которая является противоопухолевым соединением. Помимо вышеуказанных показаний, амигдалин использовался для лечения раков и облегчения боли. 4−64−6 В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. 77

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Эта злокачественная опухоль чаще всего возникает в наружной части предстательной железы, и по мере роста опухоли она метастазирует в ткани вокруг предстательной железы или в семенные пузырьки. 88

Апоптоз, также известный как запрограммированная клеточная смерть, происходит в нескольких патологических ситуациях у многоклеточных организмов и составляет часть общего механизма замены клеток, ремоделирования тканей и удаления поврежденных клеток. Апоптоз представляет собой сложный процесс, характеризующийся сморщиванием клеток, конденсацией хроматина, интернуклеосомной фрагментацией ДНК и образованием «апоптотических тел». 99

Две важные группы белков, вовлеченных в апоптотическую гибель клеток, это члены семейства Bcl-2 1010 и класс цистеиновых протеаз, известных как каспазы. 1111 Семейство Bcl-2 можно классифицировать на две функционально различные группы: антиапоптотические белки и проапоптотические белки. Bcl-2, антиапоптотический белок, как известно, регулирует апоптотические пути и защищает от клеточной смерти. Bax, проапоптотический белок этого семейства, экспрессируется обильно и избирательно во время апоптоза и способствует клеточной смерти. Увеличение соотношения Bcl-2 к Bax обычно использовалось для определения индукции апоптоза в нескольких тканях. 1212 Каспазы являются аспартат-специфичными цистеиновыми протеазами, которые emerged as (проявились как) центральный исполнитель апоптоза. Среди каспаз, активация каспазы-3 рассматривается как первичный механизм апоптоза. 1313 Каспаза-3 может быть активирована через цитозольный выброс цитохрома c белком Bax. 1414

Многочисленные исследования задокументировали, что индукция апоптоза является очень важным механизмом в спонтанном регрессе опухолей и в разработке противоопухолевых агентов. 1515 Апоптоз опухолевых клеток способствует уменьшению опухоли и promotes (способствует) регрессии опухоли. 1616 Более того, известно, что противораковые препараты индуцируют апоптоз опухолевых клеток, повреждая их ДНК, ингибируя синтез ДНК, истощая внутриклеточный пул нуклеотидов и разрушая митотический аппарат. 17,1817,18

В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. Для этого исследования использовались анализ с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ), окрашивание 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), анализ мечения ник-концов dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) (TUNEL-анализ), обратная транскриптаза-полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Вестерн-блоттинг анализ и анализ активности фермента каспазы-3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экстракция амигдалина Armeniacae semen, использованные в этом эксперименте, были получены с рынка Кёндон (Сеул, Корея). 500 г Armeniacae semen, вылущенных из скорлупы, и 10 л 4% раствора лимонной кислоты упаривали в течение 2 ч. После фильтрования в горячем состоянии, фильтрат пропускали через колонку, заполненную HP-20. Вещество, поглощенное в колонке, концентрировали после его элюирования этанолом. Амигдалин (4,2 г для получения выходной скорости 0,84%) был получен путем перекристаллизации экстракта с этанолом. Амигдалин использовали после того, как чистота была

• Кому следует направлять корреспонденцию. e-mail: changju@khu.ac.kr

© 2006 Фармацевтическое общество Японии

===== Страница 2 =====

1598 Vol. 29, No. 8

определена как >99,0% с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ; Shiseido, Токио).

Препараты и реагенты МТТ и DAPI были получены от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, МО, США). TUNEL-анализ был получен от Boehringer Mannheim (Маннхайм, Германия), и набор для анализа каспазы-3 от CLONTECH (Пало-Альто, Калифорния, США).

Культура клеток Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP были purchased (приобретены) из Корейского банка клеточных линий (KCLB, Сеул, Корея). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Jell Biotechservices Inc., Тэгу, Корея) с добавлением 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) при 37°C во влажном клеточном инкубаторе с атмосферой 5% CO22​-95% O22​. Среду меняли каждые 2 дня. Клетки высевали на чашки для культивирования при плотности 2$\times$1044 клеток/см22 за 24 ч до обработок амигдалином.

Анализ цитотоксичности МТТ Клетки рака предстательной железы DU145 и LNCaP выращивали в конечном объеме 100 мкл культуральной среды на лунку в 96-луночных планшетах. Для определения цитотоксичности амигдалина, клетки обрабатывали амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Клетки контрольной группы оставляли необработанными. После добавления 10 мкл меточного реагента МТТ, содержащего 5 мг/мл МТТ в фосфатно-солевом буфере (PBS), в каждую лунку, планшеты инкубировали в течение 4 ч. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора для солюбилизации, содержащего 10% додецилсульфат натрия (SDS) в 0,01 М соляной кислоте (HCl), и клетки инкубировали еще в течение 12 ч. Затем оптическую плотность (ОП) измеряли с помощью микропланшетного ридера (Bio-Tek, Уинуски, Вермонт, США) при тестовой длине волны 595 нм с референсной длиной волны 690 нм. Оптическая плотность (O.D.) рассчитывалась как разница между поглощением на референсной длине волны и наблюдаемым на тестовой длине волны. Процент жизнеспособности рассчитывали как (O.D. обработанного препаратом образца/контрольный O.D.)$\times$100.

Окрашивание DAPI Клетки сначала культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International, Нейпервилл, Иллинойс, США). После обработки амигдалином клетки собирали и фиксировали путем инкубации в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин. После промывки в PBS клетки инкубировали в 1 мкг/мл DAPI в метаноле в течение 30 мин в темноте. Затем клетки наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Zeiss, Оберкохен, Германия).

Окрашивание TUNEL Для in-situ детекции апоптотических клеток, TUNEL-анализ проводили с использованием набора для детекции апоптоза in situ ApoTag® пероксидаза. Клетки культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International) при плотности 2$\times$1044 клеток/камеру. После обработки амигдалином клетки промывали PBS и фиксировали путем инкубации в 4% PFA при 4°C в течение 10 мин. Затем фиксированные клетки инкубировали с конъюгированным с дигоксигенином dUTP в реакции, катализируемой TdT, при 37°C во влажной атмосфере в течение 60 мин и погружали в стоп/промывочный буфер при комнатной температуре на 10 мин. Затем клетки инкубировали с анти-дигоксигениновым антителом, конъюгированным с пероксидазой, в течение 30 мин. Фрагменты ДНК окрашивали с использованием 3,3-диаминобензидина (DAB; Sigma Chemical Co., США) в качестве субстрата для пероксидазы.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР Для идентификации экспрессии мРНК Bcl-2 и Bax, проводили ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли из клеток DU145 и LNCaP с использованием RNAzoI™B (TEL-TEST, Френдсвуд, Техас, США). Два микрограмма РНК и 2 мкл случайных гексамеров (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) добавляли вместе, и смесь нагревали при 65°C в течение 10 мин. Затем один микролитр AMV обратной транскриптазы (Promega), 5 мкл 10 мМ dNTP (Promega), 1 мкл RNasin (Promega) и 5 мкл 10× буфера для AMV RT (Promega) добавляли к смеси, и конечный объем доводили до 50 мкл водой, обработанной диметилпирокарбонатом (DEPC). Затем реакционную смесь инкубировали при 42°C в течение 1 ч.

ПЦР-амплификацию проводили в реакционном объеме 40 мкл, содержащем 1 мкл соответствующей кДНК, 1 мкл каждого набора праймеров в концентрации 10 пМ, 4 мкл 10× ПЦР буфера, 1 мкл 2,5 мМ dNTP и 2 единицы Taq ДНК-полимеразы (TaKaRa, Сига). Для человеческого Bcl-2, последовательности праймеров были 5'-CGAGACTTCTCCGGCGGCTACCGCA-3' (25-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 334) и 5'-CGGCATGTGGGGCCGTACAGTTCC-3' (25-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 628). Для человеческого Bax, последовательности праймеров были 5'-GTGCACAAAGTGGCGGAAAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 375) и 5'-TCAGCCATCTTCTCCAGAT-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 560). Для циклофилина, внутреннего контроля, использованного в этом исследовании, последовательности праймеров были 5'-ACCCCACCGTTCTTCTGAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 52) и 5'-CATTTGCCATGGACAAGATG-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 332). Ожидаемый размер ПЦР-продукта составлял 318 п.н. для Bcl-2, 205 п.н. для Bax и 299 п.н. для циклофилина.

Для Bcl-2 и Bax, процедуры ПЦР проводили с использованием системы ПЦР GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer, Норуолк, Коннектикут, США) в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 30 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 58°C в течение 30 с и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Для циклофилина, процедура ПЦР выполнялась в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 25 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 55°C и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Конечное количество продукта ОТ-ПЦР для каждого вида мРНК рассчитывали денситометрически с использованием Molecular Analyst™ версия 1.4.1 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).

Вестерн-блот анализ Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP лизировали в ледяном буфере для лизиса целых клеток, содержащем 50 мМ HEPES (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 1% Тритон X-100, 1,5 мМ гексагидрат хлорида магния, 1 мМ этиленгликоль-бис-(β-аминоэтиловый эфир)-N,N'-тетрауксусная кислота (EGTA), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 2 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин, 1 мМ ортованадат натрия и 100 мМ фторид натрия. Смесь инкубировали при 4°C в течение 30 мин. Клеточный дебрис удаляли путем микроцентрифугирования, с последующей быстрой заморозкой супернатанта. Концентрацию белка измеряли с использованием колориметрического набора для определения белка Bio-Rad (Bio-Rad). Сорок микрограмм белка разделяли на SDS-полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher & Schuell GmbH, Дассель, Германия). Мышиные анти-актин, анти-Bcl-2 и анти-Bax ан-

===== Страница 3 =====

Август 2006 1599

титела (1:1000; Santa Cruz Biotech, Калифорния, США) использовали в качестве первичных антител. Конъюгированное с пероксидазой хрена кроличье анти-мышиное антитело (1:2000; Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Фрайбург, Германия) использовали в качестве вторичного антитела. Детекцию полос проводили с использованием системы детекции с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech GmbH).

Анализ активности фермента каспазы Активность фермента каспазы измеряли с использованием набора для анализа каспазы-3 ApoAlert® в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, после обработки амигдалином клетки лизировали 50 мкл охлажденного буфера для лизиса клеток. Пятьдесят микролитров 2× реакционного буфера (содержащего DTT) и 5 мкл соответствующего конъюгированного субстрата в концентрации 1 мМ добавляли к каждому лизату. Смесь инкубировали в водяной бане при 37°C в течение 1 ч, и поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера при тестовой длине волны 405 нм.

Статистический анализ Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.). Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим пост-хок тестом Дункана с использованием SPSS. Различия считались статистически значимыми при $p<0,05$.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние амигдалина на жизнеспособность клеток рака предстательной железы Для оценки цитотоксического эффекта амигдалина на клетки рака предстательной железы человека, клетки DU145 и LNCaP культивировали с амигдалином в конечных концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, после чего проводили анализы МТТ. Клетки, культивируемые в средах без амигдалина, использовали в качестве контроля.

Жизнеспособность человеческих клеток DU145, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 82,67±2,22% ($n=8,p<0,05$), 77,25±2,06% ($n=8,p<0,05$), 76,09±1,90% ($n=8,p<0,05$) и 45,63±1,65% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Жизнеспособность человеческих клеток LNCaP, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 96,68±1,11% ($n=8,p<0,05$), 91,33±1,57% ($n=8,p<0,05$), 57,11±0,81% ($n=8,p<0,05$) и 45,02±0,73% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Тенденция к снижению жизнеспособности с увеличением концентрации амигдалина была достоверно observed (наблюдаема) при 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в обоих типах клеток DU145 и LNCaP. Результаты анализа МТТ показали, что амигдалин оказывает дозозависимый цитотоксический эффект на клетки рака предстательной железы.

Морфологические изменения, индуцированные амигдалином Анализ DAPI выявил возникновение конденсации ядра, фрагментации ДНК и перинуклеарных апоптотических тел при обработке амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Апоптотические тельца, один из строгих морфологических критериев апоптоза, характерно присутствовали в обработанных амигдалином клетках DU145 и LNCaP, окрашенных DAPI (Рис. 2).

Разрывы цепей ДНК происходят во время апоптоза, и известно, что ники в молекулах ДНК могут быть обнаружены с помощью TUNEL-анализа. TUNEL-позитивные клетки были окрашены в темно-коричневый цвет при световой микроскопии, и конденсация ядра наблюдалась в клетках, обработанных 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл амигдалина. В настоящем исследовании, TUNEL-позитивные клетки, которые указывали на возникновение апоптоза, наблюдались среди обработанных амигдалином клеток DU145 и LNCaP (Рис. 2).

Влияние амигдалина на экспрессию мРНК Bcl-2 и Bax Анализ ОТ-ПЦР уровней мРНК Bcl-2 и Bax был performed (проведен) для оценки относительных уровней экспрессии этих генов. В настоящем исследовании, уровень мРНК Bcl-2 и Bax в контрольных клетках был установлен как 1,00.

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках DU145, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,89±0,05 ($n=4,p<0,05$), 0,69±0,03 ($n=4,p<0,05$) и 0,21±0,03 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно increased (увеличен) до 1,08±0,07 ($n=4,p<0,05$), 2,07±0,17 ($n=4,p<0,05$) и 2,43±0,15 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках LNCaP, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,78±0,20 ($n=4,p<0,05$), 0,52±0,20 ($n=4,p<0,05$) и 0,48±0,38 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно увеличен до 2,25±0,25 ($n=4,p<0,05$), 2,42±0,27 ($n=4,p<0,05$) и 3,64±0,50 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

Настоящие результаты показали, что амигдалин оказывает снижающее действие на экспрессию мРНК Bcl-2 и ускоряющее действие на экспрессию мРНК Bax дозозависимым образом на обе клеточные линии рака предстательной железы DU145 и LNCaP.

Вестерн-блот анализ белков Bcl-2 и Bax Эф-

===== Страница 4 =====

1600 Vol. 29, No. 8

A B C D
DAPI

TUNEL

A B C D
DAPI

TUNEL

Рис. 2. Морфологические наблюдения клеток, обработанных амигдалином (A) Контрольная группа; (B) группа, обработанная амигдалином 0,1 мг/мл; (C) группа, обработанная амигдалином 1 мг/мл; (D) группа, обработанная амигдалином 10 мг/мл. Эксперименты повторялись по крайней мере четыре раза. Вверху: Влияние амигдалина на клетки DU145, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL. Внизу: Влияние амигдалина на клетки LNCaP, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL.

фекты амигдалина на экспрессию белков Bcl-2 и Bax были исследованы. Уровень экспрессии актина indicated (указывал), что количество образца было загружено одинаково. После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл на клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP, экспрессия белка Bcl-2 (25 кДа) дозозависимо снижалась, тогда как экспрессия белка Bax (26 кДа) дозозависимо увеличивалась (Рис. 4).

Анализ активности фермента каспазы-3 Активность фермента каспазы-3 измеряли с использованием DEVD-пептид-нитроанилида (pNA). После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках DU145 было достоверно increased (увеличено) с контрольного значения 5,25±0,50 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 9,47±0,11 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 11,66±0,67 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 11,62±0,59 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 7,28±0,35 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk. DEVD-fmk является ингибитором каспазы-3 (Рис. 5)

После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках LNCaP было достоверно увеличено с контрольного значения 4,21±0,07 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 6,82±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 7,36±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 7,50±0,24 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 4,26±0,28 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk (Рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Разнообразные сигналы могут запускать апоптотический процесс во время развития опухоли. В некоторых случаях, истощение факторов роста/выживания, гипоксия, радиация, потеря клеточно-матриксных взаимодействий, повреждение ДНК и нарушения теломер могут быть включены в число триггеров апоптоза.20 Исследование действий большинства противоопухолевых агентов было сосредоточено на их внутриклеточных сигналах-мишенях, которые индуцируют гибель опухолевых клеток. Противоопухолевые действия подразумевают клеточные ответы, происходящие во время взаимодействий, которые индуцируют гибель опухолевых клеток.21,22 Индукция апоптоза в раковых клетках нарушает инициацию, прогрессию и метастазирование опухолевых клеток.23

В настоящем исследовании, оценка жизнеспособности клеток с использованием анализа МТТ подтвердила, что амигдалин в высоких концентрациях проявляет дозозависимую цитотоксичность в отношении клеток рака предстательной железы DU145 и LNCaP (Рис. 1). Более того, амигдалин индуцировал характерные апоптотические изменения в морфологии клеток рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Разрывы цепей ДНК, которые происходят во время апоптоза,24 наблюдались как TUNEL-позитивные клетки в обработанных амигдалином клетках. Кроме того, апоптотические тельца были обнаружены с помощью окрашивания DAPI в клетках DU145 и LNCaP, обработанных амигдалином (Рис. 2).

Bcl-2, антиапоптотический белок семейства Bcl-2, как известно, способствует неопластической прогрессии, усиливая выживаемость опухолевых клеток через ингибирование апоптоза.26 В большинстве андроген-независимых раков предстательной железы можно наблюдать сверхэкспрессию Bcl-2.27,28 Экспрессия Bcl-2 также значительно усилена при ранних раках предстательной железы.29 В доклинических моделях рака предстательной железы, ингибирование экспрессии Bcl-2 потенцировало химиотерапевтический эффект путем увеличения апоптоза в

===== Страница 5 =====

клетках рака предстательной железы.[30, 31] В настоящем исследовании, амигдалин подавлял экспрессию мРНК Bcl-2, а также down-регулировал (подавлял) экспрессию белка Bcl-2 в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP дозозависимым образом.

Многочисленные исследования сообщали, что сверхэкспрессия белка Bax вызывает выброс цитохрома c, активацию каспазного пути и апоптоз в большинстве клеточных линий рака предстательной железы.[32, 33] Модуляция экспрессии Bax имеет широкое применение для индукции терапевтического апоптоза в лечении рака. Марчелли и др.[34] сообщили, что сверхэкспрессия Bax может индуцировать апоптотическую гибель клеток в нескольких клетках рака предстательной железы, таких как линии клеток DU145 и PC-3, которые устойчивы к некоторым типам химически индуцированного апоптоза. Более того, Лоу и др.[35] сообщили, что сверхэкспрессия белка Bax с помощью промотора, специфичного для предстательной железы, может индуцировать апоптоз в клетках карциномы предстательной железы человека LNCaP, предполагая, что генная терапия Bax является перспективным подходом для лечения раков предстательной железы. В настоящем исследовании, амигдалин усиливал экспрессию мРНК Bax и up-регулировал (усиливал) экспрессию белка Bax в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP дозозависимым образом.

Каспазы, семейство цистеиновых протеаз, как известно, образуют неотъемлемые части апоптотического пути. В частности, каспаза-3 имеет множество клеточных мишеней, и активация этого белка производит типичные морфологические особенности апоптоза.[11] Активированная каспаза-3 расщепляет свой субстрат, и этот процесс знаменует начало расщепления ДНК.[36] В настоящем исследовании, активность фермента каспазы-3 была increased (увеличена) обработкой амигдалином в клетках DU145 и LNCaP, что позволяет предположить, что амигдалин оказывает противораковый эффект, индуцируя апоптоз в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP.

В настоящем исследовании, обработка высокими концентрациями амигдалина клеток рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP индуцировала апоптотическую гибель клеток. Наиболее сильный апоптотический

Рис. 4: Вестерн-блот анализ уровней белка Bcl-2 и Bax

Рис. 5: Активность фермента каспазы-3

Рис. 3: Результаты анализа ОТ-ПЦР уровней мРНК Bcl-2 и Bax

===== Страница 6 =====

эффект наблюдался при 10 мг/мл амигдалина в этом исследовании. В некоторых клинических исследованиях, $2-9\text{г/кг}$ амигдалина вводили внутривенно для достижения противораковых эффектов у мужчин. Следовательно, возможно, что высокие дозы амигдалина, использованные в этом исследовании, могут совпадать с клиническими дозировками для пациентов. Недавно сообщалось, что \textit{Armeniacae semen}, содержащие abundant (обильное количество) амигдалина, проявляют анальгезирующий и противовоспалительный эффекты, показывая, что низкие дозы амигдалина могут облегчать боль.11 Было предложено много гипотез для объяснения противораковых эффектов амигдалина. Например, амигдалин может быть специфично расщеплен бета-глюкозидазой, которая в изобилии содержится в раковых клетках, и, следовательно, цианид высвобождается на раковые поражения, где он оказывает токсичность на раковые клетки.37−3937−39 Другое предположение заключается в том, что амигдалин усиливает функции панкреатических ферментов, которые могут предотвращать трансформацию первичных зародышевых клеток рака.4,384,38 Третья гипотеза состоит в том, что амигдалин (витамин B1717​) восстанавливает дефицит витаминов, который мог привести к метаболическим нарушениям у больных раком.4040 В частности, Бхатти и др.4141 сообщили, что амигдалин может стимулировать иммунную систему для производства противораковой активности у пациентов с раком предстательной железы.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток путем активации каспазы-3 через down-регуляцию антиапоптотического белка Bcl-2 и up-регуляцию проапоптотического белка Bax в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Основываясь на этих результатах, амигдалин показывает considerable (значительные) перспективы в лечении раков предстательной железы.

Благодарности Это исследование было поддержано грантом проекта по разработке восточной медицины, Министерство здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея. (0405-OD00-0815-В050049)

ЛИТЕРАТУРА

1. Chang H. K., Yang H. Y., Lee T. H., Shin M. C., Lee M. H., Shin M. S., Kim C. J., Kim O. J., Hong S. P., Cho S., \textit{Biol. Pharm. Bull.}, 28, 449—454 (2005).

2. Hwang D. R., Kang Y. S., Kim S. S., Kim D. H., Shin M. K., Song H. J., \textit{Kor. J. Herbol.}, 18, 201—208 (2003).

3. Pak J. U., Moon S. J., Moon K., Won J. H., \textit{J. Kor. Orient. Oncol.}, 5, 137—150 (1999).

4. Ellison N. M., Byar D. P., Newell G. R., \textit{New Engl. J. Med.}, 299, 549—552 (1978).

5. Fukuta T., Ito H., Mukainaka T., Tokuda H., Nishino H., Yoshida T., \textit{Biol. Pharm. Bull.}, 26, 271—273 (2003).

6. Shim B. S., Park J. K., Choi S. H., \textit{J. Kor. Orient. Oncol.}, 6, 19—28 (2000).

7. Koo J. Y., Hwang E. Y., Cho S., Lee J. H., Lee Y. M., Hong S. P., \textit{J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.}, 814, 69—73 (2005).

8. Landis S. H., Murray T., Bolden S., Wingo P. A., \textit{Cd Cancer J. Clin.}, 49, 8—31 (1999).

9. Wylie A. H., Kerr J. F., Currie A. R., \textit{Int. Rev. Cytol.}, 68, 251—306 (1980).

10. Korsmeyer S. J., \textit{Cancer Res.}, 59, 1693—1700 (1999).

11. Cohen G. M., \textit{Biochem. J.}, 326, 1—16 (1997).

12. Oliva Z. N., Milliman C. L., Korsmeyer S. J., \textit{Cell.}, 74, 609—619 (1993).

13. Nagata S., \textit{Cell.}, 88, 355—365 (1997).

14. Communal C., Sumandea M., de Tombe P., Narula J., Solano R. J., Hajjar R. J., \textit{Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.}, 99, 6252—6256 (2002).

15. Thompson C. B., \textit{Science}, 267, 1456—1462 (1995).

16. Lowe S. W., Lin A. W., \textit{Corcinogenesis}, 21, 485—495 (2000).

17. Fisher D. E., \textit{Cell.}, 78, 539—542 (1994).

18. Steller H., \textit{Science}, 267, 1445—1449 (1995).

19. Wright S. C., Wei Q. S., Kinder D. H., Larrick J. W., \textit{J. Exp. Med.}, 183, 463—471 (1996).

20. Raff M. C., \textit{Nature} (London), 356, 397—400 (1992).

21. Dive C., Hickman J. A., \textit{Br. J. Cancer}, 64, 192—196 (1991).

22. Eastman A., \textit{Cancer Cells}, 2, 275—280 (1990).

23. Frisch S. M., Francis H., \textit{J. Cell Biol.}, 124, 619—626 (1994).

24. Qiao L., Hanif R., Sphicas E., Shiff S. J., Rigas B., \textit{Biochem. Pharmacol.}, 55, 53—64 (1998).

25. Eastman A., Barry M. A., \textit{Cancer Invest.}, 10, 229—240 (1992).

26. Tsujimoto Y., Croce C. M., \textit{Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.}, 83, 5314—5218 (1986).

27. Colombel M., Symmans F., Gil S., O’Toole K. M., Chopin D., Benson M., Olsson C. A., Korsmeyer S., Buttyan R., \textit{Am. J. Path.}, 143, 390—400 (1993).

28. McDonnell T. J., Navone N. M., Troncoso P., Pisters L. L., Conti C., von Eschenbach A. C., Brisbay S., Logothetis C. J., \textit{J. Urol.}, 157, 569—574 (1997).

29. McDonnell T. J., Troncoso P., Brisbay S. M., Logothetis C., Chung L. W., Hsieh J. T., Tu S. M., Campbell M. L., \textit{Cancer Res.}, 52, 6940—6944 (1992).

30. Gleave M. E., Tolcher A., Miyake H., Nelson C., Brown B., Beraldi E., Goldie J., \textit{Clin. Cancer Res.}, 5, 2891—2898 (1999).

31. Miyake H., Monia B. P., Gleave M. E., \textit{Int. J. Cancer}, 86, 855—862 (2000).

32. Du C., Fang M., Li Y., Li L., Wang X., \textit{Cell.}, 102, 33—42 (2000).

33. Verdagren A. M., Ekert P. G., Pakusch M., Silke J., Connolly L. M., Reid G. E., Moritz R. M., Simpson R. J., Vaux D. L., \textit{Cell.}, 102, 55—66 (2000).

34. Marcelli M., Marani M., Li X., Sturgis L., Haidacher S. J., Trial J. A., Mannucci R., Nicoletti I., Denner L., \textit{Prostate}, 42, 260—273 (2000).

35. Lowe S. L., Rubinchik S., Honda T., McDonnell T. J., Dong J. Y., Norris J. S., \textit{Gene Therapy}, 8, 1363—1371 (2001).

36. Hoshi T., Sasano H., Kato K., Yabuki N., Ohara S., Konno R., Asaki S., Toyota T., Tateno H., Nagura H., \textit{Anticancer Res.}, 18, 4347—4353 (1998).

37. Dorr R. T., Paxinos J., \textit{Ann. Intern. Med.}, 89, 389—397 (1978).

38. Greenberg D. M., \textit{Cancer}, 45, 799—807 (1980).

39. Herbert V., \textit{Am. J. Clin. Nutr.}, 32, 1121—1158 (1979).

40. Young V. R., Newberne P. M., \textit{Cancer}, 47, S1226—1240 (1981).

41. Bhatti R. A., Ablin R. J., Guinan P. D., \textit{IRCS Med. Sci. Biochem.}, 9, 19 (1981).

Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии

дихлорацетатом натрия (отчет о клиническом случае)

Акбар Хан 1, Дуглас Эндрюс 1, Аннеке С. Блэкберн 1

• PMID: 27803917

• PMCID: PMC5067498

• DOI: 10.12998/wjcc.v4.i10.336

Аннеке С. Блэкберн, Школа медицинских исследований Джона Кертина, Австралийский национальный университет, Канберра, ACT 2601, Австралия 

Вклад авторов: Хан А. лечил пациента и написал большую часть отчета о случае; Эндрюс Д. лечил пациента, разработал протоколы естественной терапии и был соавтором отчета о случае; Блэкберн А.С. выполнил работу in vitro и in vivo, продемонстрировав эффекты DCA как цитостатического средства, и написал части отчета о случае, посвященные исследованию DCA in vitro и in vivo.

Заявление институционального наблюдательного совета: Неприменимо. 

Заявление об информированном согласии: Пациентка, описанная в данной рукописи, дала согласие на публикацию своего случая анонимно. 

Заявление о конфликте интересов: Один из авторов (Хан) проводит терапию дихлорацетатом для онкологических больных через онкологические центры Medicor Cancer Centres за плату и без получения прибыли. Клиника принадлежит члену семьи этого автора. Другим авторам нечего раскрывать.

Открытый доступ: эта статья является статьей открытого доступа, которая была выбрана внутренним редактором и полностью проверена внешними рецензентами. Она распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), которая позволяет другим распространять, перерабатывать, адаптировать, строить на основе этой работы некоммерческие работы и лицензировать свои производные работы на других условиях, при условии, что оригинальная работа должным образом цитируется и использование является некоммерческим. См.: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Адрес для корреспонденции: Акбар Хан, доктор медицины, медицинский директор, 
Medicor Cancer Centres Inc., 4576 Yonge St., Suite 301, Toronto, 
ON M2N 6N4, Canada. akhan@medicorcancer.com
Телефон: +1-416-2270037
Факс: +1-416-2271915

 Получено:  30 апреля 2016 г.
  Начало рецензирования:  3 мая 2016 г.
  Первое решение:  17 июня 2016 г.
  Исправлено:  23 июля 2016 г.
  Принято:  6 августа 2016 г.
  Статья в печати:  8 августа 2016 г.
  Опубликовано онлайн:  16 октября 2016 г.

Абстрактный

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) исследовался как новая метаболическая терапия для различных видов рака с 2007 года на основе данных Боннета и др. о том, что DCA может вызывать апоптоз клеток рака легких, молочной железы и мозга человека. Ответ на терапию в исследованиях на людях измеряется стандартными критериями оценки ответа для определений солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации.

Однако Блэкберн и др. продемонстрировали, что DCA также может действовать как цитостатический агент in vitro и in vivo, не вызывая апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Представлен случай, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины в течение почти 4 лет без серьезной токсичности. Поскольку естественное течение рака толстой кишки 4 стадии представляет собой неуклонное прогрессирование, приводящее к инвалидности и смерти, этот случай демонстрирует новое применение DCA в качестве цитостатического средства с потенциалом поддержания долгосрочной стабильности рака на поздней стадии.

Ключевые слова: Дихлорацетат; Рак; Толстая кишка; Колоректальный; Цитостатик; Стабилизация; Ингибирование роста; Внутривенный

© Автор(ы) 2016. Опубликовано Baishideng Publishing Group Inc. Все права защищены.

Основной совет: Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) был исследован как новая метаболическая терапия для различных видов рака. Ответ на терапию в исследованиях на людях измеряется стандартными критериями оценки ответа для определений солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации.

Однако DCA может также действовать как цитостатический агент, не вызывая апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Представлен случай, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации опухоли рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины на период почти 4 года без серьезной токсичности.

Хан А., Эндрюс Д., Блэкберн А.К. Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии дихлорацетатом натрия. World J Clin Cases 2016; 4(10): 336-343

Доступно по адресу: URL: http://www.wjgnet.com/2307-8960/full/v4/i10/336.htm  
DOI: http://dx.doi.org/10.12998/wjcc.v4.i10.336

ВВЕДЕНИЕ

Препарат дихлорацетат натрия (DCA) исследовался как новая метаболическая терапия для различных видов рака с 2007 года, когда Боннет и др. [1] опубликовали комбинированное исследование in vitro/in vivo на крысах, демонстрирующее эффективность DCA в лечении рака легких, молочной железы и мозга человека путем ингибирования киназы митохондриальной пируватдегидрогеназы. Stacpoole и др . [2-4] ранее опубликовали несколько исследований с использованием DCA для лечения врожденного лактоацидоза, который состоит из набора наследственных митохондриальных заболеваний [5] .

Эти исследования установили профиль безопасности перорального DCA у людей. Было обнаружено, что DCA является безопасным препаратом, не оказывающим токсического воздействия на сердце, легкие, почки или костный мозг [4] . Наиболее серьезным распространенным побочным эффектом является периферическая невропатия, которая является обратимой [6] . Сообщалось о делирии, который является обратимым после прекращения приема DCA [7] . У небольшого процента пациентов было зарегистрировано бессимптомное и обратимое повышение уровня печеночных ферментов [3] .

Предшествующие работы по врожденному лактатацидозу способствовали быстрому прогрессированию DCA в онкологической клинике. В настоящее время опубликовано четыре отчета о клинических испытаниях рака с использованием DCA, что указывает на растущее признание потенциальной полезности DCA [8-11] . Однако эти испытания, в которых лечили пациентов на поздней стадии, смогли сообщить только о лечении в течение относительно коротких периодов времени.

В первоначальной статье 2007 года Боннета и др . [1] сообщалось, что DCA снижает потенциал митохондриальной мембраны, что приводит к избирательному апоптозу в раковых клетках. Выявленный механизм заключается в ингибировании аэробного гликолиза (эффект Варбурга) и активации митохондриальных калиевых ионных каналов [1] .

Дальнейшие исследования DCA подтвердили противораковую активность при нескольких типах рака, включая рак толстой кишки [12] , предстательной железы [13] , яичников [14] , нейробластому [15] , карциноид легких [16] , шейки матки [17] , эндометрия [18] , холангиокарциному [19] , саркому [20] и Т-клеточную лимфому [21] .

Также были предложены другие противоопухолевые действия DCA. Они включают блокаду ангиогенеза [22] , изменения в экспрессии HIF1-α [23] , изменение регуляторов pH V-АТФазы и MCT1, а также других регуляторов выживания клеток, таких как PUMA, GLUT1, Bcl2 и p53 [24] .

Однако в поисках цитотоксической активности многие отчеты in vitro используют концентрации DCA, которые вряд ли будут достигнуты клинически [25] . В некоторых исследованиях использовались ограниченные концентрации и было обнаружено, что DCA является цитостатическим, а не цитотоксическим, но способным усиливать апоптоз с другими агентами [26-28] .

В отчете об успешном лечении рака молочной железы in vivo с помощью DCA Сан и др . [26] обнаружили, что DCA является цитостатическим средством, ингибирующим пролиферацию без увеличения апоптоза. DCA смог значительно снизить метастатическую нагрузку в легких крыс в высокометастатической модели рака молочной железы in vivo. Это предполагает новую роль DCA как стабилизирующего рак агента, аналогичного антиангиогенной терапии.

Однако, насколько известно авторам, пока не опубликовано никаких данных по человеку, подтверждающих использование DCA для долгосрочного поддержания стабильного заболевания. В результате новаторской публикации Боннета о DCA в начале 2007 года Хан начал клиническое использование DCA для лечения онкологических больных с плохим прогнозом или тех, кто не отреагировал на одобренные методы лечения рака.

Протокол натуральных лекарств был разработан для решения проблемы ограничивающей дозу неврологической токсичности в сотрудничестве с врачом-натуропатом (Эндрюс). Разработанный пероральный режим DCA включал три натуральных лекарства: ацетил L-карнитин [29-31] , R-альфа-липоевую кислоту [32-34] и бенфотиамин [35-37] , для основной цели профилактики невропатии.

Данные наблюдений, собранные у более чем 300 онкологических больных с запущенным заболеванием, показали измеримые преимущества терапии DCA в 60%-70% случаев. Риск нейропатии при включении натуральных нейропротекторов составил примерно 20% при дозировке 20-25 мг/кг в день в течение 2 недель приема/1 неделя перерыва. Обратимое повышение уровня печеночных ферментов было отмечено примерно у 2% в этой группе пациентов (данные клинических наблюдений опубликованы онлайн на www.medicorcancer.com).

Представлен случай пациента, иллюстрирующий цитостатические эффекты перорального лечения DCA, поддерживаемые в течение нескольких лет. У этого пациента был плохой прогноз (медианная выживаемость 9-12 месяцев при колоректальном раке 4 стадии с использованием агрессивной традиционной паллиативной химиотерапии) [38] . Пациента лечил Хан в сотрудничестве с врачом-натуропатом Эндрюсом, который разработал протокол, состоящий из натуральных нейропротекторов.

ОТЧЕТ О ДЕЛЕ

Женщина 57 лет обратилась в клинику автора (Khan) в марте 2012 года в поисках терапии метастатического колоректального рака. Первоначально рак прямой кишки был диагностирован у пациентки в середине 2010 года, когда она обратилась к врачу по поводу нового запора и боли в пояснице. Была предпринята попытка провести колоноскопию, но колоноскоп не удалось провести из-за наличия частично перекрывающей ректальную опухоль. Биопсия подтвердила умеренно дифференцированную колоректальную аденокарциному.

Компьютерная томография (КТ) того времени выявила заболевание 4 стадии с множественными метастазами в печени диаметром до 3 см, возможными мелкими метастазами в легких и кольцевидной карциномой прямой кишки, которую было трудно измерить (края рака было трудно отличить от окружающих тканей при КТ).

Пациенту была проведена петлевая илеостомия для обхода обструкции, а опухоль прямой кишки не была удалена. После операции была проведена химиотерапия, состоящая из 5-фторурацила, иринотекана, лейковорина и бевацизумаба (FOLFIRI + бевацизумаб). Первоначально пациент отреагировал на химиотерапию уменьшением метастазов в печени, уменьшением первичного поражения прямой кишки и уменьшением маркера карциноэмбрионального антигена крови (CEA) с 260,9 нг/мл до химиотерапии до 3,5 нг/мл непосредственно перед началом терапии DCA. Затем реакция на химиотерапию начала выходить на плато. К тому времени, как пациент обратился в клинику автора, химиотерапия вызывала минимальное уменьшение заболевания и по сути просто поддерживала стабильность.

Пациентка ранее была здорова и курила в течение 20 лет. Алкоголь употребляла время от времени. В семейном анамнезе был положительный анамнез рака толстой кишки и рака желудка. Лекарства включали текущую химиотерапию, как описано, клизмы с перекисью водорода, пероральный витамин С, иногда пероральный витамин D, гидроморфон замедленного высвобождения 32 мг два раза в день и гидроморфон короткого действия 2-4 мг перорально по мере необходимости при «прорывной» боли. Аллергий не было.

Функциональное обследование выявило несколько легких язв во рту, связанных с продолжающейся химиотерапией, легкую диарею (ожидаемую при илеостомии) и легкое прерывистое ректальное кровотечение. Была ноющая/жгучая боль в пояснице и крестце интенсивностью до 6 из 10, а также легкая боль в правом плече, усугубленная химиотерапией (по ощущениям, это была отраженная боль, связанная с метастазами в печени).

Поскольку химиотерапия все еще была эффективна, и у пациента не наблюдалось серьезных побочных эффектов, первоначальный подход заключался в поддержке существующей терапии пациента, а не в ее замене. Интегративный план был разработан совместно с врачом-натуропатом (Эндрюс).

План состоял из добавления высокой дозы перорального витамина D в размере 10 000 международных единиц в день, замены перорального витамина C на витамин C 50 г внутривенно (iv) еженедельно и добавления дихлорацетата натрия (DCA) 3000 мг внутривенно (49 мг/кг) еженедельно (производитель: Tokyo Chemical Industry, США). Для снижения риска побочных эффектов DCA были назначены 3 натуральные добавки: альфа-липоевая кислота (рацемическая) 500 мг внутривенно с каждой дозой DCA, пероральная R-альфа-липоевая кислота 150 мг 3 раза в день, пероральный ацетил L-карнитин 500 мг 3 раза в день и пероральный бенфотиамин 80 мг два раза в день.

Инфузии планировались вокруг инфузий химиотерапии (отделенных как минимум на 2 дня от химиотерапии), чтобы избежать любых потенциальных помех или лекарственных взаимодействий. Липоевая кислота не вводилась в дни химиотерапии или в течение 1 дня до или после химиотерапии, поскольку она является мощным антиоксидантом и может снижать эффективность химиотерапии. Интегративная терапия началась в марте 2012 года. Побочных эффектов не было отмечено, поэтому DCA была увеличена до 4000 мг внутривенно (66 мг/кг) в неделю. Единственным побочным эффектом, отмеченным при более высокой дозе DCA, была легкая постинфузионная седация.

Таблица 1 Анализ крови до терапии дихлорацетатом натрия

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

Пероральный метформин был добавлен, чтобы помочь сенсибилизировать рак к химиотерапии, начиная с 500 мг перорально один раз в день с титрованием до 500 мг 3 раза в день [39] . Прегабалин был добавлен, чтобы помочь контролировать невропатическую крестцовую боль (начало с 50 мг в день, титрование до 50 мг 3 раза в день). Побочные эффекты химиотерапии включали тошноту и рвоту (до начала приема метформина), и метформин пропускали в дни, когда пациент чувствовал себя плохо, чтобы предотвратить потенциальную токсичность, если у пациента возникнет обезвоживание.

Были получены стандартные базовые анализы крови, включая полный подсчет клеток, стандартную метаболическую панель, ферменты печени и билирубин (таблица 1). Была доступна базовая КТ, которая была выполнена за 2 месяца до начала интегративной терапии с DCA. 

После 4 месяцев интегративной терапии, как описано, было проведено новое КТ-сканирование (рисунок 1), которое было сообщено как «стабильное и неизмененное», но никаких измерений предоставлено не было. Было отмечено случайное обнаружение желчного камня (также стабильного с предыдущего сканирования). Пациент был расстроен тем, что не было отмечено никакого улучшения, и в отчете КТ не было указано никаких подробных измерений. Была предпринята попытка получить позитронно-эмиссионную томографию, чтобы прояснить живые или некротические опухоли, но государственное финансирование получить не удалось, и пациент отказался платить за сканирование в частном порядке.

После некоторого обсуждения пациент решил продолжить терапию и пройти будущие КТ-сканирования в другой больнице. К сентябрю 2012 года были отмечены усиливающиеся побочные эффекты химиотерапии, включая усталость, тошноту и рвоту. Новое КТ-сканирование показало, что все поражения печени были «либо меньше, либо больше не определялись». Однако наибольшее уменьшение опухоли составило всего 2 мм (маркерное поражение 2,5 см в сегменте печени 4a уменьшилось до 2,3 см). Новых поражений не было выявлено.

Рисунок 1. Абдоминальная компьютерная томография через 4 месяца интегративной терапии дихлорацетатом натрия, 5-фторурацилом и натуральными препаратами.  Показаны три среза с различными измеримыми метастазами печени. A: метастаз печени 23 мм × 33 мм; B: метастаз печени диаметром 15 мм; C: метастаз печени 11,2 мм × 25 мм 
.

Таблица 2 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, январь 2013 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

После обзора КТ пациент решил прекратить всю химиотерапию, а также бевацизумаб и метформин. Введение DCA внутривенно было продолжено, и доза была увеличена до 4500 мг внутривенно в неделю. Тошнота и рвота прекратились. Боль оставалась под контролем.

Новое КТ-сканирование было получено через 3 месяца, которое показало остаточную опухоль прямой кишки со стриктурой и проксимальной фекальной нагрузкой (без изменений), а также «метастазы в печени, без существенных изменений». Пациент сообщил о легком онемении пальцев рук и ног. Было отмечено дальнейшее увеличение бессимптомных повышений печеночных ферментов (таблица 2). Оба эти явления были диагностированы как побочные эффекты DCA. Во время терапии до этого момента CEA показывал легкие колебания, но в целом считался стабильным (рисунок 2).
Терапия DCA была прервана на 3 месяца, чтобы разрешить побочные эффекты DCA.

В это время применялись только натуральные методы лечения (прописанные Эндрюсом). Ацетил L-карнитин, бенфотиамин и альфа-липоевая кислота были продолжены для ускорения восстановления нейропатии DCA. Пероральный куркумин [40] и хонокиол (экстракт магнолии) были добавлены в попытке поддерживать контроль над раком [41] . В период, когда DCA был остановлен, CEA увеличился с 4,1 до 5,1 нг/мл (рисунок 2). Легкая нейропатия DCA разрешилась, и печеночные ферменты начали улучшаться.

К марту 2013 года из-за беспокойства о стоимости инфузионной терапии было решено начать оральную терапию DCA. Новое базовое КТ показало увеличение на 1 мм маркерного поражения сегмента печени 7 и увеличение на 1 мм маркерного аортокавального лимфатического узла, но было сообщено как «стабильный вид толстой кишки» и «стабильные метастазы в печени».

Пероральный DCA был начат в дозе 500 мг (8,2 мг/кг) два раза в день, и нейропротекторные добавки, состоящие из перорального ацетил L-карнитина, бенфотиамина и R-альфа-липоевой кислоты, были продолжены. Добавки давались непрерывно, а DCA давался по циклу 2 недели приема/1 неделя отдыха.

В декабре 2013 года в качестве обезболивающего средства был произведен переход с гидроморфона на метадон по 10 мг 3 раза в день для простоты, улучшения контроля боли и экономии средств.

Пациентка продолжила этот режим с регулярными КТ-сканированиями каждые 3–6 месяцев. Пациентка стала менее приверженной регулярным анализам крови из-за плотного рабочего графика. Она оставалась высокофункциональной (уровень ECOG 1) с легкой хронической нейропатией DCA, которая была контролируемой и не влияла на ее повседневную деятельность.

Была сделана попытка увеличить дозу DCA до 500 мг 3 раза в день, но это привело к значительному бессимптомному повышению уровня печеночных ферментов и усилению невропатии. В результате доза DCA 500 мг два раза в день была возобновлена ​​после кратковременного перерыва в терапии.

Продолжающиеся КТ-сканирования продолжали выявлять стабильное заболевание (рисунок 3), без появления новых очагов. Общий CEA существенно не изменился с начала терапии DCA (CEA 3,5 в начале терапии DCA до CEA 3,7 после почти 4 лет терапии). Общий анализ крови также был благоприятным на отметке 3 года (таблица 3) и после отметки 4 года (таблица 4).

Вкратце, после получения обычной химиотерапии в течение приблизительно 18 месяцев пациентка получала внутривенную терапию DCA с сопутствующей химиотерапией в течение приблизительно 6 месяцев, после чего последовала внутривенная и пероральная терапия DCA без сопутствующей обычной терапии рака в течение почти 4 лет. Во время лечения пероральным DCA у пациентки наблюдалась стабильная болезнь по данным КТ и стабильная болезнь по данным измерения опухолевого маркера CEA. Она также была клинически стабильна без эскалации дозы метадона, сохраняла функцию ECOG уровня 1, стабильную легкую нейропатию DCA, и она смогла успешно вести свой собственный бизнес.

Рисунок 2. График карциноэмбрионального антигена в ходе терапии. РЭА: карциноэмбриональный антиген.Рисунок 3. Абдоминальное компьютерное томографическое сканирование после 3 дополнительных месяцев интегративной терапии (дихлорацетат натрия + 5-фторурацил + натуральные лекарства), за которыми последовали почти 4 года дихлорацетата натрия без какой-либо сопутствующей традиционной терапии рака. Сканирование демонстрирует отсутствие повторного роста рака и отсутствие новых метастазов в печени. Показаны те же срезы, что и на рисунке 1. A: метастаз в печени 11,3 мм × 27,5 мм; B: метастазы не видны; C: метастазы не видны.

Таблица 3 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, май 2015 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.

Таблица 4 Анализ крови во время терапии дихлорацетатом натрия, апрель 2016 г.

1 Указывает на аномальное значение. ЛДГ: Лактатдегидрогеназа; ГГТ: Гамма-глутамилтрансфераза; АСТ: Аспартатаминотрансфераза; АЛТ: Аланинаминотрансфераза.ОБСУЖДЕНИЕ

В данном случае применения DCA-терапии у пациента с раком толстой кишки четвертой стадии по клиническим, биохимическим и рентгенологическим критериям продемонстрирована долгосрочная стабильность заболевания.

Продолжительность стабильности при использовании DCA без другой активной химиотерапии в настоящее время составляет 46 месяцев (почти 4 года), а продолжительность жизни с момента первоначальной диагностики колоректального рака 4 стадии составляет 6 лет.

Согласно обзору статистики рака SEER Национального института рака за 1975-2011 гг., 5-летняя относительная выживаемость женщин с диагнозом рак толстой кишки/прямой кишки IV стадии составила 14,4% (http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/). Хотя нельзя сделать окончательный вывод об эффективности DCA, выживаемость в течение этого периода времени при отсутствии постоянной химиотерапии была бы относительно маловероятной.

Было отмечено, что DCA оказывает цитостатическое, а не цитотоксическое действие на колоректальные и другие раковые клетки, что подтверждает этот клинический вывод [ 23 , 27 , 42-44 ] . На сегодняшний день состояние пациентки остается клинически хорошим, и она продолжает получать терапию DCA.

Помимо поддержания стабильного течения заболевания, этот случай демонстрирует переносимость перорального DCA у онкологического пациента в течение гораздо более длительных периодов времени, чем те, о которых в настоящее время сообщают из опубликованных клинических испытаний у онкологических пациентов. Чу и др. [11] сообщили о 24 пациентах, получавших лечение в течение медианного времени 2 месяца в дозе 6,25 или 12,5 мг/кг два раза в день, на непрерывном пероральном DCA без нейропротекторных добавок.

Они пришли к выводу, что рекомендуемая доза для фазы 2 составляет 6,25 мг/кг два раза в день (12,5 мг/кг в день), при этом необходим тщательный мониторинг невропатии. Данбар и др. [9] рекомендовали 5 мг/кг два раза в день в качестве начальной дозы для большинства пациентов, при этом в их исследовании вводили 4, 8 или 12,5 мг/кг два раза в день непрерывно (медианное время на DCA 34 дня), также без нейропротекторных добавок.

Пациент в этом отчете принимал 500 мг два раза в день, что эквивалентно 8,2 мг/кг два раза в день, 2 недели приема/1 неделя перерыва, но не мог переносить эту дозу три раза в день (всего 25 мг/кг в день). Данбар и др. [9] предполагают, что генотипирование полиморфизмов в GSTZ1, ферменте метаболизма DCA в печени, который инактивируется при продолжающемся использовании DCA [45] , следует учитывать при определении начальной дозы для пациентов.

Однако необходима дальнейшая работа для сбора убедительных данных о генотипах и переносимости дозы. В настоящее время проводится клиническое исследование DCA у пациентов с множественной миеломой, чтобы внести вклад в этот пул данных (Реестр клинических испытаний Австралии и Новой Зеландии #ACTRN12615000226505, http://www.anzctr.org.au).

Необходимы дальнейшие исследования для определения оптимального режима дозировки для максимально переносимого острого или хронического лечения с помощью DCA, а также для определения дозы, необходимой для обеспечения эффективности.

Представленный случай показывает, что DCA имеет большие перспективы в качестве терапии рака. Пациентка получила значительную пользу от своей терапии, с легкими побочными эффектами и без гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичности. Наблюдалась некоторая гепатотоксичность (таблица 2), которая легко купировалась прерыванием терапии DCA с последующей корректировкой дозы.

Сообщалось о легкой обратимой периферической нейротоксичности. Натуральные методы лечения, которые сочетались с DCA (ацетил L-карнитин, альфа-липоевая кислота и бенфотиамин), помогли пациенту уменьшить побочные эффекты, но, как известно, не действуют как методы лечения рака.

На момент написания статьи не проводилось активных клинических испытаний, изучающих использование DCA в качестве цитостатического средства у людей. Поскольку DCA не имеет патента, сбор достаточных средств для поддержки крупномасштабных испытаний на людях является серьезной проблемой. Надеемся, что этот случай, иллюстрирующий преимущества перорального DCA, послужит стимулом для дальнейших клинических исследований.

На основании нашего клинического опыта в сочетании с существующими публикациями можно сделать вывод, что терапия DCA не по назначению является вариантом для пациентов с ограниченными возможностями традиционного лечения, если они понимают и принимают риски и преимущества терапии.

Этот отчет о случае показывает, что даже на поздней стадии заболевания DCA имеет потенциал для продления жизни без ущерба для качества жизни пациента по сравнению с химиотерапией с ее частыми изнурительными побочными эффектами или нарушением физиологических функций. Учитывая его разумную стоимость и умеренную токсичность, DCA заслуживает дальнейшего изучения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентку за ее поддержку и согласие опубликовать ее случай.

КОММЕНТАРИИ 

Характеристика случая
Пациентка 57 лет обратилась с жалобами на запор и боли в пояснице.

Клинический диагноз
У пациента диагностирован рак прямой кишки с частичной обструкцией. 

Лабораторная диагностика.
Повышенный уровень раково-эмбрионального антигена, онкомаркера.

Диагностика с помощью визуализации:
опухоль прямой кишки, обнаруженная при колоноскопии толстой кишки.

Патологический диагноз:
Умеренно дифференцированная колоректальная аденокарцинома. 

Лечение
Петлевая илеостомия с последующей химиотерапией, состоящей из 5-фторурацила, иринотекана, лейковорина и бевацизумаба, затем добавление дихлорацетата натрия (ДХА), затем ДХА без химиотерапии в течение почти 4 лет.

Сопутствующие отчеты
Отчеты компьютерной томографии демонстрируют снижение заболеваемости раком при комбинированной химиотерапии + DCA, а затем стабилизацию заболевания в течение почти 4 лет при DCA и отсутствии химиотерапии.

Объяснение термина 
DCA: Дихлорацетат натрия; RECIST: Критерии оценки ответа на солидные опухоли; ECOG: Восточная кооперативная онкологическая группа; SEER: Наблюдение, эпидемиология и конечные результаты.

Опыт и уроки
DCA не только является проапоптотическим препаратом, но и может действовать как цитостатический агент, и, таким образом, может обеспечить долгосрочную стабилизацию запущенного рака без серьезных побочных эффектов, как показано на примере этого случая рака прямой кишки. 

Рецензируемый
DCA, натриевая соль дихлорацетата, является дешевым химическим соединением, которое показало некоторый явный потенциал в качестве альтернативного лечения рака, которое использовалось в ряде испытаний с людьми, страдающими раком мозга или глиобластомой. Это хорошо написанный отчет о случае, в котором пероральная терапия DCA привела к стабилизации опухоли рака толстой кишки 4 стадии у 57-летней женщины на период более 3 лет, без серьезной токсичности. Этот отчет охватывает то, что он обещает.

Авторы проделали солидную работу по объяснению основ терапии DCA и ее роли в различных типах опухолей. Наряду с добавлением механизмов действия против раковых клеток и терапевтического потенциала DCA, авторы предоставляют хороший ресурс для читателей, которые не знакомы с терапией DCA, но также предоставляют детали.

Амигдалин как перспективный противораковый агент 

Оригинал статьи: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37762572/

Мария Спанудаки 1 2, София Стоумпу 1, Соусана К. Пападопулу 1, Димитра Карафиллаки 3, Эвангелос Соловос 4, Константинос Пападопулос 4, Анастасия Джаннакула 1 5, Константинос Гиагинис 6

 PMCID: PMC10531689

 DOI: 10.3390/ijms241814270

Уровень заболеваемости раком растет, и рак является одной из основных причин смерти во всем мире. Амигдалин, также известный как витамин B17 (и синтетическое соединение лаэтрил), представляет собой цианогенное гликозидное соединение, которое в основном содержится в ядрах и мякоти фруктов. Это соединение предлагалось на протяжении десятилетий как многообещающее природное вещество, которое может оказывать противораковое действие. Это всеобъемлющий обзор, который критически суммирует и анализирует имеющиеся исследования, изучающие противораковое действие амигдалина, подчеркивая его потенциальные противораковые молекулярные механизмы, а также необходимость нетоксичной формулы этого вещества. Глубокие исследования проводились с использованием самых точных научных баз данных, например, PubMed, Cochrane, Embase, Medline, Scopus и Web of Science, с применением эффективных, характерных и релевантных ключевых слов. Существует несколько доказательств, подтверждающих идею о том, что амигдалин может оказывать противораковое действие против рака легких, груди, простаты, колоректального рака, рака шейки матки и желудочно-кишечного тракта. Сообщалось, что амигдалин вызывает апоптоз раковых клеток, подавляя пролиферацию раковых клеток и замедляя метастатическое распространение опухоли. Однако было проведено лишь несколько исследований на животных моделях in vivo, а клинических исследований еще меньше. Текущие данные не могут подтвердить рекомендацию использования пищевых добавок с амигдалином из-за его циано-группы, которая вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Предварительные данные показали, что использование наночастиц может быть многообещающей альтернативой для усиления противоракового действия амигдалина при одновременном снижении его неблагоприятных побочных эффектов. Амигдалин, по-видимому, является многообещающим природным агентом против развития и прогрессирования раковых заболеваний. Однако существует большая потребность в исследованиях на животных in vivo, а также в клинических исследованиях на людях для изучения потенциальной эффективности профилактики и/или лечения амигдалином рака. Более того, амигдалин может быть использован в качестве ведущего соединения путем эффективного применения последних разработок в процессах разработки лекарств.

Ключевые слова: амигдалин; противораковые эффекты; противораковые молекулярные механизмы; апоптоз; рак; пролиферация раковых клеток; открытие лекарств; лаэтрил; наночастицы; пищевые добавки; витамин B17.

Влияние дихлорацетата натрия как отдельного препарата, так и в составе комбинированной терапии на рост и метастазирование опухолей легких

оригинал статьи: https://www.academia.edu/65113034/Impact_of_Sodium_Dichloroacetate_Alone_and_in_Combination_Therapies_on_Lung_Tumor_Growth_and_Metastasis?email_work_card=title

Айя Аль-Азави

1, Шахразада Сулейман

1, Холуд Арафат

1, Джавед Ясин 2

, Абдеррахим Неммар 3,4

и Самир Аттуб 1,4,5,*

• Кафедра фармакологии и терапии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных

Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; 201870001@uaeu.ac.ae (AA-A.); sharazadjeffy@uaeu.ac.ae (SS); kholoud.arafat@uaeu.ac.ae (KA)

• Кафедра медицины, Колледж медицины и медицинских наук, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; yasin@uaeu.ac.ae Кафедра
• физиологии, Колледж медицины и медицинских наук, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты; anemmar@uaeu.ac.ae Центр
• медицинских наук имени Заида, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские
• Эмираты Национальный институт здравоохранения и медицинских исследований (INSERM), 75013 Париж,

Франция * Адрес для корреспонденции: samir.attoub@uaeu.ac.ae

Комбинированная терапия легких Рост опухоли и метастазы. Int. J. Молекулярные науки 2021, 22, 12553. https:// doi.org/10.3390/ijms222212553

Получено: 24 октября 2021 г.

Принято: 17 ноября 2021 г.

Опубликовано: 21 ноября 2021 г.

Аннотация: Метаболическое перепрограммирование признано важнейшим признаком нового рака. Сообщалось, что дихлорацетат (DCA), ингибитор киназы пируватдегидрогеназы (PDK), обладает противораковыми эффектами, обращая вспять гликолиз, связанный с опухолью. Это исследование было проведено с целью изучения противоракового потенциала DCA при раке легких как отдельно, так и в сочетании с химиотерапией и таргетной терапией с использованием двух клеточных линий немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), а именно A549 и LNM35.

DCA заметно вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности и роста колоний клеток A549 и LNM35 in vitro. DCA также снижал рост опухолевых ксенотрансплантатов как в хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, так и в моделях голых мышей in vivo. Кроме того, DCA снижал ангиогенную способность эндотелиальных клеток пупочной вены человека in vitro. С другой стороны, DCA не ингибировал клеточную миграцию и инвазию in vitro , а также заболеваемость и рост метастазов подмышечных лимфатических узлов in vivo у голых мышей. Лечение DCA не показало никакой токсичности у куриных эмбрионов и голых мышей. Наконец, мы продемонстрировали, что DCA значительно усиливал противораковый эффект цисплатина в LNM35. Кроме того, сочетание DCA с гефитинибом или эрлотинибом приводит к аддитивным эффектам на ингибирование роста колоний LNM35 после семи дней лечения и к синергетическим эффектам на ингибирование роста колоний A549 после 14 дней лечения. В совокупности это исследование демонстрирует, что DCA является безопасным и перспективным терапевтическим средством для лечения рака легких.

Рак легких является вторым по частоте встречаемости видом рака с самым высоким уровнем смертности в мире, составив 2,2 миллиона случаев и 1,8 миллиона смертей в 2020 году. Прогнозируется, что заболеваемость и смертность продолжат расти примерно на 60%, до предполагаемых 3,6 миллиона и 3 миллионов соответственно в 2040 году [1]. Большинство случаев рака легких — это НМРЛ, на которые приходится 80–85% всех случаев рака легких [2]. Развитие таргетной и иммунотерапии произвело революцию в лечении НМРЛ. Однако побочные эффекты, резистентность и эффективность в небольшой терапевтически чувствительной группе пациентов создают неравенство в доступе к таким агентам [3–5]. Таким образом, это подчеркивает необходимость более безопасных и эффективных агентов. Метаболическое перепрограммирование является одним из признаков рака, который является многообещающей целью для разработки эффективных терапевтических подходов [6]. По сравнению с

Нормальные клетки, которые в основном полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) в аэробных условиях, раковые клетки отклоняются от этого нормального метаболического фенотипа, полагаясь в основном на цитозольный гликолиз и молочную ферментацию, даже в присутствии кислорода, чтобы удовлетворить потребности высокой пролиферации [7]. Это явление известно как эффект Варбурга, который использовался в качестве терапевтической мишени для подавления роста опухоли PDK входит в число основных ферментов, контролирующих гликолиз и OXPHOS [9]. Он отключает митохондриальный OXPHOS, фосфорилируя и ингибируя пируватдегидрогеназу (PDH), ключевой фермент, катализирующий окислительное превращение пирувата в ацетилкофермент А в митохондриях [10]. DCA — это препарат с небольшой молекулярной массой, который использовался при лактоацидозе, врожденных митохондриальных дефектах и диабете [11]. Интересно, что DCA продемонстрировал способность переключать метаболизм опухоли с цитозольного аэробного гликолиза на митохондриальный OXPHOS путем ингибирования PDK и повышения активности PDH [12]. Следовательно, сообщалось, что DCA оказывает противораковое действие за счет увеличения оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, а также повышения уровня ROS с последующей гибелью раковых клеток [11,13 15]. Однако в клинических исследованиях профиль безопасности DCA вызывал беспокойство. Тем не менее, Гарон и др. (2014), которые провели клиническое исследование с DCA на пациентах с раком легких, пришли к выводу, что: «в отсутствие более крупного контролируемого исследования четкие выводы относительно связи между неблагоприятными событиями у пациента и DCA неясны». Они рекомендовали рассматривать DCA с химиотерапией на основе платины при гипоксических опухолях, а не как единственный агент при распространенном немелкоклеточном раке легких [16]. Считается, что DCA является мощной молекулой , которая требует дальнейшего изучения ее противоракового потенциала при НМРЛ. Целью данного исследования было изучение влияния DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ, рост колоний, миграцию и инвазию клеток in vitro, а также на рост опухоли, метастазирование и токсичность in vivo. Кроме того, непосредственное влияние DCA на ангиогенез оценивалось in vitro. Кроме того, мы исследовали влияние DCA в комбинированной терапии с химиотерапией и первым поколением ингибиторов тирозинкиназы EGFR (EGFR-TKi). 2. Результаты 2.1 Влияние DCA на жизнеспособность клеток и рост колоний линий клеток НМРЛ Эффект увеличения концентрации DCA (3,125–100 мМ) был исследован на двух линиях клеток NSCLC, а именно A549 и LNM35. Как показано на рисунке 1, DCA снижал жизнеспособность A549 (рисунок 1A) и LNM35 (рисунок 1B) в зависимости от концентрации и времени. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC50) DCA через 48 ч составляет приблизительно 25 мМ для обеих линий клеток. Для дальнейшей оценки противоракового эффекта DCA было исследовано его влияние на рост предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. Для этого обе клеточные линии выращивали при определенной плотности в течение 1 недели для формирования колоний, а затем обрабатывали возрастающей концентрацией DCA в течение 1 недели. Как показано на рисунке 1, DCA вызывал зависимое от концентрации сокращение числа колоний для обеих клеточных линий, с более высокой чувствительностью, показанной в колониях LNM35 (рисунок 1D,E) по сравнению с колониями A549 (рисунок 1C,E). Эти результаты подтверждают противораковый эффект DCA in vitro

Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие A549 (A) и LNM35 (B)

Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие раковые клетки A549 (A) и LNM35

(B) инкубировали в отсутствие или в присутствии увеличивающихся концентраций DCA (3,125–100 мМ) в течение 24, 48 и 72 ч. Жизнеспособность клеток оценивали, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее трех раз. Формы представляют средние значения, столбцы представляют SEM. Раковые клетки A549 (C) и LNM35 (D) выращивали в течение 7 дней для формирования колоний, которые обрабатывали различными концентрациями DCA (6,25–50 мМ) в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». (E) Репрезентативные фотографии контрольных и обработанных DCA колоний показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Результаты представлены в виде процента колоний (среднее значение ± SEM) обработанных клеток по сравнению с контролем. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.

• Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухоли НМРЛ в курином эмбрионе CAM и голых мышах in vivo

Для подтверждения фармакологической значимости наших результатов in vitro противораковый эффект DCA оценивали in vivo с использованием анализа CAM куриного эмбриона.

Ксенотрансплантированные опухоли A549 и LNM35 на CAM обрабатывали 50 мМ DCA каждые 48 ч в течение 1 На E17 опухоли были извлечены из верхней части CAM и взвешены. Как показано на рисунке 2, 50 мМ

DCA значительно снизили рост ксенотрансплантатов опухоли A549 примерно на 40% (рисунок 2A), в то время как не показали значительного снижения роста ксенотрансплантатов опухоли LNM35 (рисунок 2B). Поэтому 100 мМ DCA были исследованы на ксенотрансплантатах опухоли LNM35, и они значительно снизили рост примерно на 40% (рисунок 2C). Токсичность также оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах. На E17 DCA не показал цитотоксичности, поскольку процент живых эмбрионов был схож с контрольной и обработанной DCA (рисунок 2D–F).

Рисунок 2. Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухолей A549 и LNM35 в CAM куриного эмбриона in vivo. (A)

Масса опухоли раковых клеток A549, ксенотрансплантированных на CAM с плотностью 1 миллион клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ) в течение 1 недели. (B, C) Масса опухоли раковых клеток LNM35, ксенотрансплантированных на CAM с плотностью 0,3 миллиона клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ и 100 мМ). (D) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах A549. (E, F) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах LNM35. Столбцы — средние значения; полосы — SEM *** Значительно отличается при <0,001. **** Значительно отличается при <0,0001. ns — незначимо.

Влияние DCA на опухолевые ксенотрансплантаты также оценивалось in vivo с использованием бестимусных мышей, инокулированных клетками A549 и LNM35. Сообщалось, что средние летальные дозы (LD50) DCA составляли 4,5 г/кг и 5,5 г/кг у крыс и мышей соответственно [17]. Поэтому мыши с опухолевыми ксенотрансплантатами A549 получали перорально ежедневно (5 дней в неделю) 50 мг/кг и 200 мг/кг DCA в течение 38 последовательных дней. Лечение DCA (50 мг/кг) не вызвало значительного уменьшения объема опухолевых ксенотрансплантатов A549, в то время как DCA (200 мг/кг) значительно

уменьшил объем примерно на 45% (рисунок 3A). Аналогичная разница наблюдалась также в весе опух Не было выявлено никаких явных признаков токсичности или каких-либо проявлений нежелательного воздействия DCA на поведение животных, массу тела (рисунок 3C), компоненты крови, функцию

печени и почек (рисунок 3D).

Рисунок 3. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата A549, привитого голым мышам in vivo. (A) Объем опухоли ксенотрансплантата A549, привитого подкожно голым мышам и леченного DCA (50 и 200 мг/кг) перорально или только контрольным раствором- носителем в течение 38 дней. (B) Вес опухоли, полученный от тех же контрольных и обработанных DCA голых мышей. (C) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. (D) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции

печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. * Значительно отличается при <0,05.

** Значимое различие при <0,01. ns — несущественно.

С другой стороны, наблюдался рост ксенотрансплантатов опухоли LNM35, и мыши получали перорально 200 мг/кг и 500 мг/кг DCA каждый день (5 дней в неделю) в течение 10 и 24 дней соответственно. Лечение DCA (200 мг/кг) вызвало незначительное уменьшение объема ксенотрансплантатов опухоли LNM35 (рисунок 4A), в то время как DCA (500 мг/кг) значительно уменьшил объем опухоли почти на 75% (рисунок 4B). Почти такие же различия были замечены в весе опухоли в конце экспериментов (рисунок 4C). Никаких признаков токсичности не наблюдалось в поведении животных или не было обнаружено по весу мышей (рисунок 4D,E), компонентам крови, печени и функции почек (рисунок 4F)

Рисунок 4. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата LNM35, привитого голым мышам in vivo. (A, B) Объем опухоли ксенотрансплантата LNM35, привитого подкожно голым мышам и обработанного соответственно DCA (200 и 500 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем ежедневно в течение 10 и 24 дней. (C) Вес опухоли, полученный от контрольных и голых мышей, получавших DCA в дозе 500 мг/кг. (D, E) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. (F) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение

± SEM для 9–11 мышей/группу. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при

<0,001. ns — статистически незначимо.

• Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур и прорастание HUVEC in vitro

Ангиогенез является одним из признаков рака, который обеспечивает поставку питательных веществ и кислорода для роста и распространения раковых клеток. Влияние DCA на ангиогенез было исследовано in vitro с использованием HUVEC, которые могут образовывать капилляроподобные структуры при засевании

на Матригель. Как показано на рисунке 5A, HUVEC образовали организованные капилляроподобные структуры

структуры в отсутствие DCA, и эта организация была нарушена после добавления DCA.

Длины трубок измеряли вручную (рисунок 5B) и с помощью анализа изображений Wimasis (рисунок 5C), и было обнаружено, что 25 мМ DCA способны значительно ингибировать способность HUVEC формировать нитевидные структуры примерно на 30–40%. Это ингибирование наблюдалось при концентрациях

Рисунок 5. Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур HUVEC in vitro. (A) Формы ангиогенеза , индуцированные в HUVEC, культивируемых на матрице Matrigel в 96-луночном планшете в отсутствие и в присутствии различных концентраций DCA. Для контрастной фотографии использовался инвертированный микроскоп (4×) , а для уточнения изображений использовалось программное обеспечение Wimasis. (B,C) Количественная оценка тубулярного ангиогенеза, индуцированного в клетках HUVEC, культивируемых в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–

25 мМ) вручную и с использованием программного обеспечения Wimasis соответственно. (D) Жизнеспособность клеток HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы», в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ). Эксперименты повторяли не менее 3 раз.

Столбцы представляют средние значения; полосы представляют SEM *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.

В анализе прорастания сфероиды HUVECs были встроены в 3D коллагеновую матрицу в присутствии и отсутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или комбинации VEGF и DCA. Рисунок 6A показывает в репрезентативном эксперименте, что проростки, образованные в

присутствии VEGF, были ингибированы DCA, 25 мМ. Были измерены общие длины проростков, и было обнаружено, что общая длина была значительно увеличена в присутствии VEGF, а

DCA значительно уменьшил длину проростков, индуцированных VEGF (Рисунок 6B). Это ингибирование наблюдалось при концентрации, которая не показала никакого снижения жизнеспособности HUVECs (Рисунок 6C).

Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование ангиогенеза в опухолях может быть потенциальным механизмом, выходящим за рамки противоракового действия DCA.

Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков встроенными сфероидами HUVECs in vitro. (A) Представитель Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков встроенными сфероидами HUVECs in vitro. (A) Представительные изображения предварительно окрашенных

сфероидов HUVEC через 24 часа после встраивания в коллагеновую матрицу в присутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или VEGF + DCA. Использовался инвертированный микроскоп с 20-кратным увеличением. (B) Среднее значение общей длины ростков различных сфероидов для каждого условия из одного представительного эксперимента. (C) Жизнеспособность HUVECs определялась, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты были повторены 2 раза. Столбцы представляют средние значения 12 сфероидов; столбцы представляют SEM **** Значительно отличается при <0,0001. #### Значимое отличие при <0,0001. ns: незначимо.

• Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro

Метастазирование — многоступенчатый процесс, включающий отделение клеток от первичной опухоли, миграцию клеток в соседние ткани с последующей инвазией клеток в кровь или лимфатическую систему до колонизации этих клеток в отдаленных органах. Влияние DCA на метастазирование у мышей, которым ксенотрансплантировали клетки рака легких с высокой степенью метастазирования, а именно LNM35, оценивали путем проверки веса и частоты подмышечных лимфатических узлов в контрольной и обработанной DCA группах. DCA снижает рост метастазов в лимфатических узлах, не достигая статистической значимости (рисунок 7A).

Кроме того, он не влияет на частоту метастазов в лимфатических узлах (рисунок 7B).

Для оценки способности DCA инвазировать и миграцию клеток A549 и LNM35 in vitro использовались анализ инвазии в камере Бойдена и анализ миграции при заживлении ран. Чтобы убедиться, что потенциальное влияние DCA на миграцию и инвазию не обусловлено гибелью клеток, мы использовали более низкие концентрации DCA. В этих условиях 6,25 мМ и

12,5 мМ DCA не смогли ингибировать клеточную инвазию LNM35 (рисунок 7C) и A549 (рисунок 7D). Аналогичным образом, эти концентрации не смогли ингибировать клеточную миграцию обеих клеточных линий (рисунок 7E–H).

1. Обсуждение

Несмотря на недавние достижения в скрининге, диагностике и лечении рака легких, в дополнение к замечательному прогрессу в понимании его молекулярной биологии, рак легких является вторым наиболее часто диагностируемым видом рака с самым высоким уровнем смертности во всем мире в 2020 году [1].

Поэтому прилагаются различные усилия для разработки эффективных агентов и подходов с хорошими запасами безопасности для воздействия на рак легких в попытке обеспечить излечение или улучшить общую выживаемость пациента. Целью данного исследования было изучение влияния метаболического препарата DCA на рост, миграцию, инвазию и ангиогенез рака легких in vitro и рост опухоли и метастазы in vivo, а также влияние целевого метаболизма DCA на цитотоксический эффект одобренной химиотерапии и таргетной терапии в качестве шага к достижению лучшей эффективности и лучшего профиля безопасности.

Настоящее исследование показало, что DCA (3,125–100 мМ) вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности клеток и роста предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. IC50 DCA через 48 ч составлял приблизительно 25 мМ в обеих

клеточных линиях. Наши результаты согласуются с другими отчетами, в которых DCA (10–90 мМ) ингибировал

жизнеспособность клеток линий колоректального рака (КРР), а именно, SW620, LS174t, LoVo и HT-29, в зависимости от концентрации через 48 ч с диапазоном IC50 30–50 мМ в зависимости от типа клеточной линии [18]. Аналогичным образом, DCA (20 мМ) значительно снизил жизнеспособность клеток КРР, а именно, SW480, LoVo и HT-29 через 48 ч, с большим эффектом на плохо дифференцированные клетки SW480 и метастатические клетки LoVo по сравнению с хорошо дифференцированными клетками HT-29 [19]. С другой стороны, более высокая IC50 была зарегистрирована в клетках рака шейки матки, клетках Hela и SiHa [20], в то время как DCA (20 мМ) не смог ингибировать жизнеспособность клеток линии клеток рака молочной железы MCF-7 [21].

Наши данные in vitro были подтверждены путем тестирования влияния DCA на прогрессирование опухоли in vivo с использованием моделей CAM куриного эмбриона и бестимусных мышей. Во-первых, мы продемонстрировали, что значительное снижение роста было достигнуто в A549 и LNM35, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона, при использовании доз DCA 50 мМ и 100 мМ соответственно. Во время написания этой рукописи было опубликовано исследование, в котором изучалось

влияние натрия DCA на линии клеток глиобластомы U87 MG и PBT24, ксенотрансплантированных на CAM куриного Авторы сообщили об изменении роста опухолей U87 MG и PBT24 в ответ на различные концентрации натрия DCA. Сообщалось, что 10 мМ натрия DCA были эффективны в снижении роста опухоли PBT24,

но не роста опухоли U87, что отражает некоторые различия в биологии двух клеточных линий [22]. Во-вторых, мы продемонстрировали, что лечение DCA в дозах 200 мг/кг ежедневно (5 дней в неделю) вызвало значительное снижение роста ксенотрансплантированной опухоли A549 на 40%, в то время как для значительного снижения роста ксенотрансплантированной опухоли LNM35 требовалась более высокая доза DCA (500 мг/кг) . В этом контексте ранее сообщалось, что DCA (100 мг/кг) увеличил время удвоения опухолей A549 и H1975 NSCLC примерно с 3 до 6,5 дней [15], но не оказал значительного ингибирующего эффекта на мышей с опухолью MDA-MB-231 [23]. С другой стороны, значительная задержка роста также наблюдалась в ксенотрансплантатах HT-29, обработанных пероральным DCA (200 мг/кг) ежедневно в течение четырех дней [24].

Исследование токсичности потенциальных противораковых препаратов так же важно, как и исследование их эффективности, поскольку тяжелая токсичность может помешать их использованию в клинике. DCA не показал цитотоксичности для куриных эмбрионов и бестимусных мышей. Процент живых эмбрионов был одинаковым в группах, получавших DCA, и контрольных группах. Кроме того, DCA не повлиял на поведение мышей, вес, общий анализ крови, параметры функции печени и почек по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с предыдущими доклиническими и клиническими отчетами, которые не показали никаких доказательств тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности при лечении DCA [13,14]. Немногие пациенты, получавшие лечение DCA, жаловались на общие желудочно-кишечные эффекты. Кроме того, наиболее распространенным ограничением для введения DCA является обратимая периферическая невропатия, которую можно свести

к минимуму путем снижения дозы или дополнительного введения антиоксидантов [11]. Включение DCA в системы доставки лекарств (СДЛ), такие как наночастицы, является перспективным подходом для сохранения противораковой активности DCA с минимальными побочными эффектами [25–27].

Сообщалось, что противораковый эффект DCA частично обусловлен индукцией апоптоза, как это наблюдалось в клетках колоректального рака [19] и клетках НМРЛ [15] , или ингибированием ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза, такие как антитело к VEGF бевацизумаб и блокатор рецепторов VEGF рамуцирумаб, были клинически одобрены для лечения рака легких [28]. Несмотря на их подтвержденную эффективность, их скромные общие терапевтические эффекты с сопутствующими побочными эффектами подчеркивают очевидную необходимость в более эффективном подходе, нацеленном на ангиогенез [28]. Наше исследование показало, что DCA (25 мМ) является перспективным антиангиогенным средством, поскольку он способен значительно ингибировать образование и прорастание эндотелиальных клеток in vitro. Кроме того, более низкие концентрации DCA (6,25 и 12,5 мМ) не влияли на образование трубок HUVEC. Эти результаты согласуются с отчетом Шунджанса и его коллег, которые продемонстрировали, что 5 мМ и 10 мМ DCA не повлияли на формирование трубок HUVEC in vitro [29]. В соответствии с нашими данными, DCA вызвал снижение плотности микрососудов опухоли у обработанных крыс, у которых также было отмечено подавление HIF1α в опухолевых клетках [30]. С другой стороны, Чжао и его коллеги

Недавно сообщалось, что DCA стимулирует ангиогенез в модели сосудистой деменции у крыс за счет улучшения функции эндотелиальных клеток-предшественников [31].

Примерно у 30–40% пациентов с НМРЛ на момент постановки диагноза наблюдалось метастатическое заболевание . Отдаленные метастазы отрицательно влияют на варианты лечения, ответ и выживаемость

[32] и являются основной причиной смерти от рака легких [33]. Метастазирование — это многоступенчатый процесс, включающий отсоединение раковых клеток, миграцию, инвазию и колонизацию в отдаленных участках. Поэтому терапевтические агенты и схемы, уменьшающие такой отличительный признак рака, имеют большое значение в терапии рака. Несмотря на продемонстрированную антиангиогенную активность DCA, это исследование не показало влияния DCA на метастазирование клеток LNM35, ксенотрансплантированных бестимусным мышам, получавшим перорально эффективную дозу. В этом исследовании клетки LNM35, ксенотрансплантированные путем подкожной инокуляции бестимусным мышам, вызвали 90% случаев метастазов в подмышечных лимфатических узлах, и DCA не смог снизить частоту и рост этих метастазов в лимфатических узлах. Линия клеток LNM35 была создана в 2000 году как первая линия клеток рака легких человека, имеющая лимфогенные метастатические свойства со 100% частотой после подкожной инъекции в боковой бок голых мышей [34]. Кроме того, DCA не показал никаких ингибирующих эффектов на миграционные и инвазивные свойства клеток LNM35 и A549 in vitro. Аналогичным образом сообщалось, что монотерапия DCA не была эффективна в снижении метастазов в легких из метастатических клеток рака молочной железы, ксенотрансплантированных голым мышам [23].

Комбинированная терапия является фундаментальным подходом в лечении рака. Объединение различных противораковых препаратов позволяет воздействовать на различные основные сигнальные пути для усиления терапевтических преимуществ, избегания приобретенной резистентности и снижения тяжести побочных эффектов [35]. Химиотерапия играет неотъемлемую роль в лечении пациентов с НМРЛ. Обычно используется схема с платиной (цисплатин или карбоплатин) плюс паклитаксел, гемцитабин , доцетаксел, винорелбин, иринотекан или пеметрексед [36]. Неселективные характеристики химиотерапевтических агентов приводят к скромному увеличению выживаемости при значительной токсичности для пациента [37]. Это подчеркивает необходимость в более эффективных стратегиях для улучшения результатов лечения пациентов с минимальными побочными эффектами. В настоящем

исследовании DCA не удалось усилить противораковый эффект камптотецина и гемцитабина в обеих линиях клеток Н Кроме того, DCA не смог значительно усилить противораковые эффекты цисплатина в клеточной линии

A549 in vitro, но он усилил цитотоксический эффект цисплатина в клеточной линии LNM35, что отражает роль генетического фона раковых клеток в определении пути гибели клеток, вызванного препаратами. Ким и др. сообщили, что клетки A549 имеют более низкую скорость аэробного гликолиза по сравнению с клетками H460 из-за дифференциальной экспрессии некоторых метаболических ферментов [38]. Аэробный

гликолиз при раке был связан с химиорезистентностью, и ингибирование связанных путей было предложено в качестве механизма преодоления такой резистентности. Например, сверхэкспрессия PDK4 при раке мочевого пузыря высокой степени злокачественности заставляет совместное введение DCA с цисплатином вызывать резкое снижение роста опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [39].

Аналогичным образом, введение DCA с паклитакселом было описано как успешный подход к преодолению резистентных к паклитакселу клеток НМРЛ из-за сверхэкспрессии PDK2 [40]. Кроме того, Галгамува и др. заявили, что предварительное лечение DCA значительно ослабило нефротоксичность, вызванную цисплатином у мышей, сохранив противораковые эффекты цисплатина [41].

Открытие таргетной терапии помогло врачам адаптировать варианты лечения для пациентов с НМРЛ. Было разработано много таргетных препаратов, которые стали частью первой линии лечения НМРЛ, например, гефитиниб и эрлотиниб, которые считаются первым поколением EGFR-TKi [42]. Гефитиниб и эрлотиниб были одобрены более 10 лет назад для лечения пациентов с прогрессирующим мутантным EGFR НМРЛ, не получавших химиотерапию, в качестве первой линии лечения. Они также используются в качестве второй линии терапии после неудачи химиотерапии [43]. Некоторые отчеты показали, что эрлотиниб имеет хорошую эффективность у пациентов с EGFR - диким типом НМРЛ [44]. Поддерживающая доза может принести пользу этим пациентам после химиотерапии на основе платины, которая считается основной терапией при диком типе EGFR НМРЛ [45]. Несмотря на замечательные преимущества, многие пациенты приобрели терапевтическую резистентность через 10–14 месяцев лечения из-за вторичной мутации в гене EGFR [46].

В этом исследовании мы стремились изучить способность DCA сенсибилизировать линии клеток NSCLC дикого типа EGFR при сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. DCA значительно усилил ингибирующий эффект гефитиниба и эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35. Это исследование также показало аддитивные эффекты на рост колоний LNM35 при сочетании DCA с гефитинибом или эрлотинибом в течение семи дней лечения. Более того, эта комбинация оказала синергическое действие на рост колоний A549 после четырнадцати дней лечения. Кроме того, все эти протоколы комбинирования привели к существенному снижению клеточной плотности отдельных колоний как A549, так и LNM35. В этом контексте сообщалось, что DCA с гефитинибом или эрлотинибом синергически подавляет жизнеспособность и способность к образованию колоний мутантных клеток EGFR (NCI-H1975 и NCI-H1650) из-за синергического эффекта в продвижении апоптоза. В клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI- H460) они показали, по сравнению с индивидуальными обработками, что комбинация вызывала повышенное значение фракции, затронутой (Fa), в жизнеспособности клеток, не достигая уровня синергизма в клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460), и эта комбинация не подавляла значительно образование колоний этих линий клеток [47]. Различия в экспериментальных условиях между вышеупомянутым отчетом и нашим исследованием могут объяснить такие переменные результаты. В своем клоногенном анализе исследователи обрабатывали отдельные клетки в течение трех последовательных дней, а затем инкубировали в среде без лекарственных средств в течение 15 дней для формирования колоний; Однако в наших экспериментах клетки сначала инкубировали в течение десяти дней для формирования колоний, а затем подвергали обработке в течение семи и четырнадцати дней.

Подводя итог, можно сказать, что это исследование продемонстрировало, что DCA является перспективным противораковым средством для лечения НМРЛ, подавляя жизнеспособность клеток и рост колоний клеток НМРЛ in vitro , а также рост опухолей у эмбрионов цыплят CAM и голых мышей, в которых также оценивалась безопасность этого средства. DCA подавляет способность эндотелиальных клеток образовывать капилляроподобные структуры и прорастать in vitro, что позволяет предположить ингибирование ангиогенеза как потенциальный механизм противоракового эффекта. Это исследование также выявило потенциальную ценность DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro.

Результаты этого исследования прокладывают путь для подтверждения влияния комбинации DCA с гефитинибом или эрлотинибом на рост опухоли in vivo, в дополнение к исследованию влияния DCA в сочетании с EGFR-TKi второго и третьего поколения.

1. Материалы и методы 4.1.Клеточная культура и реагенты

Клетки NSCLC, A549 и LNM35, поддерживались в среде RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) в увлажненном инкубаторе при температуре 37  C и 5% CO2. Среда была дополнена 1% раствора пенициллина- стрептомицина (Hyclone, Cramlington, UK) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Cramlington, UK). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) поддерживались в полном наборе сред EndoGROTM-VEGF (Merck Millipore, Massachusetts, USA) в увлажненном инкубаторе при температуре 37 C и 5% CO2 в колбах , покрытых 0,2% желатином. Культуральную среду всех клеток меняли каждые 3 дня, а клетки пересевали один раз в неделю, когда культура достигала 95% конфлюэнтности для раковых клеток и 80% для HUVEC.

Натрий DCA, цисплатин, камптотецин, гемцитабин HCl, эрлотиниб HCl и гефитиниб были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). DCA был свежерастворен в воде HyPure (Hyclone, Крамлингтон, Великобритания) перед началом любого эксперимента для приготовления исходного раствора 1 М, который затем был разбавлен до требуемых концентраций для лечения.

4.2. Жизнеспособность

клеток Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночный планшет.

Через 24 часа клетки обрабатывали возрастающей концентрацией DCA (3,125–100 мМ) в двух повторностях в течение 24, 48 и 72 часов, тогда как контрольные клетки обрабатывали лекарственным средством ( вода Hypure), смешанным со средой. В указанные временные точки использовали анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) для определения

влияния DCA на жизнеспособность клеток путем количественной оценки АТФ, которая будет пропорциональна

к числу метаболически активных клеток. Люминесцентный сигнал измеряли с помощью люминометра GloMax® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность клеток представляли в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности клеток, обработанных DCA, с контрольными клетками, жизнеспособность которых предполагалась равной 100%.

Во втором наборе экспериментов клетки обрабатывали в течение 48 ч возрастающей концентрацией гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ). Кроме того, клетки обрабатывали в течение 48 ч комбинацией DCA и других противораковых агентов, а именно цисплатина, камптотецина,

гемцитабина , гефитиниба и эрлотиниба. Жизнеспособность клеток определяли с помощью CellTiter-Glo® Анализ люминесцентной жизнеспособности клеток и люминометр GloMax® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность была представлена в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности обработанных лекарством клеток с контрольными клетками.

4.3. Клоногенный анализ

В 6-луночный планшет высевали клетки A549 и LNM35, соответственно, по 50 и 100 клеток на лунку. Клетки выдерживали для роста в колонии в течение 7–10 дней во влажной атмосфере при 37  C и 5% CO2, при этом среду меняли каждые три дня. Образованные колонии обрабатывали каждые 3 дня в течение 7 дней возрастающими концентрациями DCA (6,25–50 мМ). После этого колонии промывали три раза 1× PBS, фиксировали и окрашивали в течение 2 часов 0,5% кристаллическим фиолетовым, растворенным в 50% метаноле (об./об.). Наконец, колонии промывали 1× PBS и фотографировали, и подсчитывали колонии с более чем 50 клетками . Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных DCA, с контрольными колониями. Плотность клеток колоний оценивали путем фотографирования колоний в каждой группе с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа (4×).

Во втором наборе экспериментов сформированные колонии обрабатывались каждые 3 дня в течение 7 или 14 дней комбинацией DCA и гефитиниба или DCA и эрлотиниба. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных препаратом, с контрольными колониями.

4.4 Анализ роста опухоли in ovo

Оплодотворенные яйца леггорнов инкубировали в инкубаторе для яиц, установленном на температуру 37,5  C и влажность 50% в течение первых 3 дней после оплодотворения. На 3-й день эмбрионального развития (E3) САМ был удален путем просверливания небольшого отверстия в яичной скорлупе напротив круглого, широкого конца с последующей аспирацией ~1,5–2 мл альбумина с помощью шприца объемом 5 мл с иглой 18G. Затем в яичной скорлупе над САМ было вырезано небольшое окно с помощью тонких ножниц, которое было заклеено полупроницаемой клейкой пленкой (Suprasorb® F). Яйца снова содержались в инкубаторе до 9-го дня эмбрионального развития (E9), на котором раковые клетки были трипсинизированы, центрифугированы и суспендированы в 80% матрице Matrigel® (Corning, Bedford, UK) для получения 1 × 106 клеток/100 мкл для A549 и 0,3 ×

106 клеток/100 мкл для LNM35. 100 мкл инокулята добавляли на САМ каждого яйца, в общей сложности 10–13 я

На 11-й день эмбрионального развития (E11) образовавшиеся опухоли обрабатывали местно, капая 100 мкл DCA, приготовленного на 0,9% NaCl для первой группы, или лекарственного носителя для контрольной группы. Обработку повторяли на E13 и E15. Все описанные шаги выполняли в асептических условиях.

Наконец, на 17-й день эмбрионального развития (E17) эмбрионы гуманно умерщвляли путем местного добавления 10–30 мкл пентобарбитона натрия (300 мг/мл, Jurox, Окленд, Новая Зеландия). Опухоли осторожно извлекали из нормальных верхних тканей CAM, промывали 1× PBS и взвешивали для определения влияния DCA на рост опухолей. Данные представлены в виде сравнений среднего веса опухолей в контрольной группе и группе, обработанной DCA. Токсичность препарата оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах в конце эксперимента.

Живость эмбрионов определялась путем проверки их произвольных движений, а также целостности и пульсации кровеносных сосудов.

Этот анализ представляет собой рандомизированный открытый анализ, который был проведен в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных в Университете Объединенных Арабских Эмиратов . Согласно Европейской директиве 2010/63/EU о защите животных, используемых

Для проведения научных экспериментов с использованием куриных эмбрионов на E18 и ранее не требуется одобрения со стороны Комитета по уходу и использованию животных (IACUC).

4.5 Анализ роста опухоли и метастазирования

Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, утвержденным

комитетом по этике работы с животными Университета ОАЭ в марте 2019 года (код протокола ERA_2019_5872).

Шести-восьминедельных бестимусных мышей-самцов линии NMRI nude (nu/nu, Charles River,

Германия) содержали в ламинарных шкафах с фильтруемым воздухом и соблюдали асептические условия.

Клетки A549 (5 × 106 клеток/200 мкл PBS) и клетки LNM35 (0,4 × 106 клеток/200 мкл PBS) вводили

подкожно в боковой бок голых мышей. Спустя десять дней, когда опухоли достигли объема приблизительно 50 мм3, животные с ксенотрансплантатами A,549 были случайным образом

разделены на три группы по 9–10 мышей в каждой. Эти группы получали перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 50 мг/кг или 200 мг/кг или лекарственный носитель в течение 38 дней. С другой стороны, животные с ксенотрансплантатами LNM35 получали перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 200 мг/кг или лекарственный носитель в течение 10 дней и DCA 500 мг/кг или лекарственный носитель в течение 24 дней. Размеры опухолей и вес животных проверяли каждые три или четыре дня. Кроме того, физические признаки и поведение проверялись каждый день. Объем опухоли рассчитывался по формуле V = L × W2 ×

0,5, где L представляет собой длину , а W — ширину опухоли. В конце экспериментов животных анестезировали и умерщвляли путем смещения шейных позвонков, а опухоли удаляли и взвешивали. Влияние DCA на рост опухоли было представлено путем сравнения среднего веса опухоли в конце эксперимента между контрольной группой и группой, получавшей DCA. Его также оценивали путем сравнения объема опухоли между контрольной и группой, получавшей DCA, на протяжении всего эксперимента. Образцы крови собирали у каждой мыши и анализировали с помощью счетчика крови животных SCIL VET ABC™ Animal Blood Counter для полного анализа крови. Кроме того, плазму крови отделяли центрифугированием для биохимического анализа. Для изучения влияния DCA на метастазирование подмышечные

лимфатические узлы были вырезаны и взвешены у животных с ксенотрансплантатами LNM35 в конце

• Анализ формирования

сосудистых трубок Матрикс Matrigel® (Corning, Bedford, UK) размораживали и добавляли 40– 50 мкл в лунки 96-луночного планшета для покрытия. Для того чтобы Матригель затвердел, планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37                                                                                    C и 5% CO2 в течение 1 ч. HUVEC

трипсинизировали и высевали на покрытый планшет с плотностью 2,5 × 104 клеток/100 мкл/ лунку в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA. Через 8 ч инкубации сети

трубок в разных лунках фотографировали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Влияние DCA на способность HUVEC формировать капилляроподобные структуры оценивали путем измерения общей длины сформированных трубок в контрольных и обработанных DCA лунках. Общая длина трубок измерялась вручную и с помощью программного обеспечения для онлайн-анализа изображений, разработанного Wimasis (https://www.wimasis.com/ en/products/13/WimTube - дата доступа 1 марта 2019 г.). Влияние различных концентраций DCA

на жизнеспособность HUVEC определялось с помощью анализа жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), как ранее описано в разделе о жизн

• Анализ прорастания сфероидов HUVEC

Сфероиды HUVEC были приготовлены путем первого окрашивания клеток путем инкубации 190 000 клеток с 2 мкМ раствором красителя CellTrackerTM Green CMFDA (Invitrogen Molecular probes, Paisley, UK) в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе, установленном на 37  C и 5% CO2, с последующим центрифугированием в течение 5 мин и удалением супернатанта. Осадок HUVEC был суспендирован в дополненной среде HUVEC (5 мл), смешанной с раствором метоцела (1,25 мл), который должен быть приготовлен ранее [48]. Затем 25 мкл клеточной суспензии пипеткой наносили на крышку чашки Петри. Примерно 50 капель пипеткой наносили в каждую чашку Петри.

Наконец, капли держали перевернутыми в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе, установленном на 37

Образованные сфероиды в каждой чашке (~50 сфероидов) собирали отдельно с 1× PBS и центрифугировали при 150× g в течение 5 мин. Тем временем рабочий раствор коллагена I готовили на льду путем осторожного смешивания исходного коллагена I из хвоста крысы (1500 мкл) (Millipore, MA, США) с 10× средой 199 (150 мкл) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, США) и ледяным стерильным 1N NaOH (34 мкл), который приобрел красный цвет. Каждый сфероидный осадок покрывали слоем раствора метоцела, содержащего 4% FBS (0,25 мл), рабочего раствора коллагена I (0,25 мл) и 60 мкл базальной среды или VEGF 30 нг/мл или DCA 25 мМ или их комбинации.

Сразу после осторожного перемешивания смесь добавляли в предварительно нагретый 24-луночный планшет и инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37  C и 5% CO2 в течение 24 часов, что позволяло полимеризовать коллаген и прорасти сфероидам. Через 24 часа сфероиды были захвачены с помощью инвертированного микроскопа с 20-кратным увеличением. Длина проростков в 12 сфероидах в каждом состоянии была измерена с помощью ImageJ.

• Анализ подвижности при

заживлении ран Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 1 × 106 клеток/лунку в 6-луночный планшет. Через 24 часа с помощью наконечника объемом 200 мкл делали царапину в сливающемся монослое . После этого клетки дважды промывали 1× PBS с последующим добавлением свежей среды с добавлением лекарственного носителя или DCA. В верхней части планшета были отмечены два места для мониторинга уменьшения размера раны с течением времени с использованием инвертированного микроскопа при объективе 4× (Olympus 1X71, Токио, Япония). Планшеты инкубировали во влажной атмосфере при 37  C и 5% CO2 , а ширину раны измеряли через 0, 2, 6 и 24 часа после инкубации.

Расстояние миграции выражалось как среднее значение разницы между измерениями в нулевой момент времени и в периоды времени 2, 6 и 24 часа.

• Анализ камер инвазии в матригеле

Согласно протоколу производителя (Corning, Bedford, MA, USA), в нижние камеры добавляли 0,5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS. После этого раковые клетки высевали с плотностью 1 × 105 клеток/ 0,5 мл в верхние камеры в среде без FBS в присутствии и отсутствии DCA. Планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37  C и 5% CO2 в течение 24 часов. Инвазивные клетки разрушают матригель и проходят через поры вставки размером 8 мкм. Непроникающие клетки верхних камер удаляли, осторожно протирая область ватным тампоном. Затем полупроницаемую мембрану удаляли с помощью очень тонких ножниц.

Инвазивные клетки были обнаружены с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), ранее описанного в разделе жизнеспособности клеток. Влияние DCA на клеточную инвазию было представлено в процентах (%) путем сравнения инвазирующих клеток в присутствии DCA с контролем.

• Статистический анализ

Помимо анализа in ovo и экспериментов на голых мышах, каждый эксперимент проводился не менее трех раз. Данные выражены как среднее значение ± SEM Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 8.3.1 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния,

США). Для оценки разницы между двумя группами использовался непарный t-тест . Для сравнения 3 или более групп с контрольной группой использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Даннетта . Кроме того, для комбинированных экспериментов

использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного*сравнения Тьюки. p

** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001 указывают на значимые различия.

Вклад авторов: Концептуализация, SA; методология, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; валидация, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; формальный анализ, SA и AA-A.; расследование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; курирование данных, SA; написание — подготовка первоначального черновика, SA и AA-A.; написание — рецензирование и редактирование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; визуализация, SA, AA-A. и AN; руководство, SA; администрирование проекта, SA; получение финансирования, SA Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование: Это исследование частично финансировалось за счет гранта Центра медицинских наук имени Зайеда, Университета Объединенных Арабских Эмиратов, № 31R136.

Заявление институционального наблюдательного совета: Исследование на голых мышах проводилось в соответствии с руководящими принципами Хельсинкской декларации и протоколом, одобренным Комитетом по этике обращения с животными Университета Объединенных Арабских Эмиратов (код протокола ERA_2019_5872).

Заявление об информированном согласии: Неприменимо.

Заявление о доступности данных: Неприменимо.

Благодарности: Авторы выражают благодарность Такаши Такахаши за предоставление клеток LNM35.

Конфликты интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не принимали участия в разработке исследования, в сборе, анализе или интерпретации данных, в написании рукописи или в решении опубликовать результаты.

Оригинал статьи: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25362214/

Новая форма терапии дихлорацетатом для пациентов с запущенными стадиями рака: описание 3 случаев

Абстрактный

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) в настоящее время исследуется как монотерапия и как вспомогательное средство для лечения различных видов рака. Одним из факторов, ограничивающих его клиническое использование в непрерывном пероральном режиме, является дозозависимая, обратимая нейротоксичность, включая периферическую нейропатию и энцефалопатию. Внутривенный (IV) путь имеет ряд потенциальных преимуществ, включая (1) импульсное дозирование для достижения более высоких концентраций, чем это возможно при пероральном применении, (2) более длительный период вымывания для снижения потенциальной нейротоксичности и (3) обход пищеварительной системы, что особенно важно для пациентов с раком на поздней стадии. Были доступны данные о высоких дозах IV DCA (до 100 мг/кг/доза), которые подтвердили его безопасность как у здоровых добровольцев, так и у пациентов в критическом состоянии, что позволило авторам начать нестандартное лечение онкологических больных. У нескольких своих пациентов, получавших IV DCA, авторы наблюдали клинические, гематологические или радиологические ответы. В этой статье представлены 3 случая пациентов с рецидивирующим раком, у которых все традиционные методы лечения оказались неэффективными: (1) 79-летний мужчина с раком толстой кишки и метастазами в печень, (2) 43-летний мужчина с ангиосаркомой и метастазами в поджелудочную железу и кости, и (3) 10-летний мужчина с нейроэндокринной карциномой поджелудочной железы и метастазами в печень. (Altern Ther Health Med. 2014;20(suppl 2):21-28.)

Пероральный дихлорацетат натрия (DCA) — это препарат, который в настоящее время исследуется как монотерапия и дополнительное лечение рака. 1 На момент написания этой статьи в Университете Альберты проходит текущее исследование фазы I перорального DCA для рецидивирующих или метастатических солидных опухолей, а в Стэнфордском университете проводятся 2 испытания перорального DCA для лечения рака головы и шеи.
DCA был широко изучен Стэкпулом 2-5 для лечения врожденного лактоацидоза, который включает группу наследственных митохондриальных заболеваний. Профиль безопасности использования перорального DCA у людей был установлен в ходе этой работы. Было обнаружено, что препарат относительно безопасен, не имеет гематологической, сердечной, легочной или почечной токсичности. 6 Основная токсичность — неврологическая, в первую очередь периферическая невропатия, и это состояние обратимо . 7 Наблюдался делирий, вызванный DCA, который быстро обращался после отмены препарата. 8 Бессимптомное, но обратимое повышение уровня печеночных ферментов может наблюдаться у небольшого процента пациентов. 9
В январе 2007 года Боннет и др. 10 опубликовали новаторскую работу, в которой продемонстрировали, что DCA эффективен при лечении рака груди, легких и мозга человека in vitro и in vivo (у крыс) с помощью новых метаболических путей, включающих ингибирование киназы пируватдегидрогеназы митохондрий. Исследователи сообщили, что DCA селективно запускает апоптоз в раковых клетках, снижая потенциал митохондриальной мембраны, блокируя аэробный гликолиз (эффект Варбурга) и активируя митохондриальные калиевые каналы. Впоследствии DCA был дополнительно изучен и обнаружен противораковый эффект в отношении многих типов рака, включая рак толстой кишки11, предстательной железы12, яичников13 , нейробластому14 , карциноид легких15 , рак шейки матки16 , эндометрия17, холангиокарциному18 , саркому19 и Т -клеточную лимфому20. Также были предложены другие механизмы действия DCA против раковых клеток . Эти методы включают (1) ингибирование ангиогенеза21, ( 2) изменение экспрессии фактора 1-α, индуцируемого гипоксией (HIF1-α), 21 и (3) изменение регуляторов pH вакуолярного типа H + -АТФазы (V-АТФазы) и монокарбоксилатного транспортера 1 (MCT1) и других регуляторов выживания клеток, таких как p53-активируемый модулятор апоптоза (PUMA), транспортер глюкозы 1 (GLUT1), белок В-клеточной лимфомы 2 (BCL2) и клеточный опухолевый антиген p53 (p53) .20
Однако некоторые исследования дали иные результаты, показав снижение апоптоза в определенных линиях раковых клеток в условиях гипоксии22,23. Также
было показано, что DCA in vitro увеличивает цитотоксичность выбранных соединений платины, что предполагает потенциал для клинического применения при резистентном к платине мелкоклеточном раке легких; саркоме Юинга; и раке яичников24. Другое исследование in vitro обнаружило значительные, синергические, антипролиферативные эффекты при использовании линий клеток рака шейки матки с комбинацией DCA и цисплатина25. Основная часть литературы ясно показывает потенциал для дальнейших исследований и разработок DCA.
Основываясь на оригинальной работе Бонне и др.10 , один из нынешних авторов начал использовать пероральный DCA в 2007 году в качестве лечения не по назначению для онкологических больных, у которых был плохой прогноз или которые не отреагировали на традиционную терапию рака. Было отмечено, что периферическая невропатия26 является основным фактором, ограничивающим клиническую полезность. Этот автор разработал протокол DCA для лечения невропатии в сотрудничестве с другим автором, врачом-натуропатом. Результатом этой работы стал режим перорального приема DCA, который включал натуральные нейропротекторные препараты ацетил-L-карнитин, 27-30 R-α-липоевую кислоту, 31-34 и бенфотиамин. 35-37 Клиническое наблюдение за более чем 300 пациентами с запущенным раком, лечившимися по этому режиму, показало, что 60–70 % продемонстрировали измеримые преимущества от DCA. Приблизительный риск невропатии составил 20 % при дозе DCA 20–25 мг/кг/день, которая была в цикле 2 недели приема/1 неделя перерыва, в сочетании с 3 натуральными добавками.
Внутривенный (IV) путь имеет ряд терапевтических преимуществ, включая (1) более высокие уровни в крови, поскольку импульсное IV дозирование может достигать более высокой концентрации, чем это возможно при пероральном приеме, (2) более длительный период вымывания для снижения потенциальной нейротоксичности и (3) обход пищеварительной системы, что особенно важно для пациентов с поздней стадией рака. Были доступны данные о высокой дозе IV DCA до 100 мг/кг/доза, которые подтвердили ее безопасность как для здоровых добровольцев38, так и для пациентов в критическом состоянии39. Авторы Элиаз и Хан разработали протокол лечения IV-DCA и внедрили его в клиническую практику. У Хана был предыдущий опыт, начиная с 2007 года, с IV DCA, он использовал его для лечения пациентов с полной непроходимостью кишечника. Однако при более раннем использовании IV DCA Ханом, датируемом 2007 годом, не было возможности оценить долгосрочные ответы, поскольку лечение проводилось у пациентов на конечной стадии с прогнозом продолжительности жизни от 4 до 6 недель.
В этой статье представлены 3 случая, иллюстрирующих эффекты лечения IV-DCA. Все пациенты и/или опекуны пациентов дали согласие на публикацию своих случаев. У этих пациентов был очень плохой прогноз и/или они не отреагировали на традиционную терапию. Все пациенты получили существенные преимущества от терапии DCA с минимальными побочными эффектами, без миелосупрессии и без токсичности для органов. Пациенты в этих исследованиях случаев лечились в сотрудничестве с 3 авторами, которые являются врачами-натуропатами. Они разработали индивидуальные протоколы, которые включали натуральные адъюванты, такие как лечение внутривенной аскорбиновой кислотой/витамином C (IVC) и натуральными нейропротекторами.

СЛУЧАЙ 1: РАК ТОЛСТОЙ КИШКИ

Мужчина 79 лет обратился за лечением метастатического рака толстой кишки с первоначальным диагнозом аденокарциномы сигмовидной кишки T3N1M0, которая была умеренно дифференцированной. Сопутствующие заболевания включали анамнез стенокардии, инфаркта миокарда, четырехкратного коронарного шунтирования, гипертонии, гиперхолестеринемии и дивертикулеза. Первоначально его лечили левой гемиколэктомией и колостомией, затем химиотерапией 5-фторурацилом (5-ФУ) и иринотеканом в течение примерно 6 месяцев и последующей отменой колостомии.
Пациент оставался здоровым в течение примерно 3 лет, после чего начал расти раково-эмбриональный антиген (CEA), а компьютерная томография (КТ) показала новые метастазы в печени и легких. Его снова лечили химиотерапией 5-ФУ и иринотеканом в течение 3 циклов, которые были неэффективны и осложнились крайней усталостью и недомоганием. Химиотерапию прекратили, и пациента направили на паллиативную помощь.
Пациент решил пройти натуропатическое лечение в клинике одного автора, начиная с декабря 2010 года. Терапия включала гомеопатические средства и IVC в дозе 75 г два раза в неделю с последующим повышением уровня энергии и набора веса. Лекарствами и добавками в то время были пантопразол, альфузозин, метопролол, рамиприл, симвастатин, амлодипин, клопидогрель, витамин D, комплекс витаминов группы B, ацидофилус и α-липоевая кислота. Пациент продолжал лечение до 2011 года с хорошим контролем симптомов; однако его CEA продолжал расти. КТ в ноябре 2011 года показало обширное, диффузное, метастатическое заболевание печени и многочисленные увеличивающиеся легочные узелки, соответствующие интервальному прогрессированию заболевания. Затем пациент решил пройти пробный курс IV DCA. Базовые анализы крови, включая CEA и ферменты печени, были получены 19 декабря 2011 года. Первая доза 3000 мг (41 мг/кг) IV DCA была введена 22 декабря 2011 года вместе с 50 г IVC. Тест CEA был запланирован на 4 недели позже, но был ошибочно повторен через 1 день после инфузии вместе с измерением ферментов печени. Было отмечено быстрое снижение ферментов печени и CEA. (См. Рисунок 1 и Рисунок 2.)

Рисунок 1. Раково-эмбриональный антиген
На рисунке показано постепенное увеличение раково-эмбрионального антигена (РЭА) во время натуропатического лечения и его резкое снижение после внутривенного введения дихлорацетата натрия (ДХА).Рисунок 2.
Сокращения ферментов печени: АСТ = аспартатаминотрансфераза; АЛТ = аланинаминотрансфераза; ГГТ = γ-глутамилтранспептидаза; АЛКП = щелочная фосфатаза.
На рисунке показано немедленное резкое падение и продолжающееся снижение ферментов печени при введении внутривенного DCA.

Вторая инфузия DCA была сделана через 6 дней в дозе 3500 мг (48 мг/кг) вместе с 35 г IVC. После инфузии пациент отметил новые симптомы: озноб, потливость и усталость. Третья инфузия DCA в дозе 3700 мг (50 мг/кг) и 50 г IVC была сделана через 8 дней после второй дозы, и последующие анализы крови показали дальнейшее улучшение (рисунок 2).
Однако пациент снова отметил кратковременный период усталости и недомогания после инфузии и, вопреки совету врачей, решил прекратить лечение на основании этих побочных эффектов. Новое УЗИ брюшной полости было сделано через 1 месяц после лечения DCA. В отчете говорилось: «Учитывая различия в методах визуализации, внешний вид метастазов печени существенно не изменился по сравнению с предыдущей КТ брюшной полости от 10 ноября 2011 года». Метастазы в легких не оценивались, поскольку респираторные симптомы не были очевидны.

СЛУЧАЙ 2: АНГИОСАРКОМА

43-летний мужчина обратился за лечением метастатической ангиосаркомы правой бедренной кости. У пациента в анамнезе была остеосаркома правой большеберцовой кости, диагностированная в возрасте 27 лет в 1995 году и пролеченная резекцией и реконструкцией опухоли-протеза, за которой последовала химиотерапия доксорубицином и цисплатином. Этот рак считался излеченным.
В возрасте 39 лет в 2007 году он обратился к врачу с болью и отеком над правым коленом. После магнитно-резонансной томографии (МРТ) и биопсии был поставлен диагноз ангиосаркомы. Этот рак считался потенциальной вторичной злокачественной опухолью, вызванной предыдущей химиотерапией. Пациент получил химиотерапию доксорубицином и ифосфамидом, но предполагаемый курс был сокращен из-за инфекции и последующего повреждения почек, вторичного по отношению к лечению антибиотиком ванкомицином. Затем в 2008 году ему провели резекцию опухоли и реконструкцию.
В 2009 году, через год после этой операции, у него развились метастазы в легких, которые были удалены хирургическим путем с помощью резекции клина легкого. Впоследствии развились дальнейшие метастазы в легких, по поводу которых пациент перенес 2 дополнительные резекции легких в период с 2009 по 2011 год. В августе 2011 года был обнаружен метастаз в левом подвздошном крыле, который был вылечен путем иссечения и лучевой терапии. В октябре 2011 года в результате КТ был диагностирован новый метастаз в хвосте поджелудочной железы размером 6,1 × 5,7 см, который был немедленно вылечен лучевой терапией. На КТ также был обнаружен увеличивающийся метастаз в левой верхней доле легкого размером 12 мм.
В ноябре 2011 года пациент обратился за консультацией к одному из авторов, врачу-натуропату. Пациенту было назначено внутривенное введение Viscum album (экстракт омелы) и IVC. Дозы были увеличены до 300 мг вискума белого и 75 г IVC 3 раза в неделю. Он также получал добавки, включая витамин D, модифицированный цитрусовый пектин, пищеварительные ферменты, омега-3 жирные кислоты, биоперин и артемизинин.
В январе 2012 года еще одно КТ-сканирование выявило новые небольшие метастазы в позвоночнике, несмотря на агрессивную натуропатическую терапию. Масса хвоста поджелудочной железы увеличилась до 7,6 × 5,6 см через 2 месяца после лучевой терапии. Было обнаружено несколько новых небольших узелков в легких. Были обнаружены новые литические метастазы в костях, включающие C3, T9, L2 и рукоятку.
На основании прогрессирования заболевания пациент решил начать терапию IV DCA в феврале 2012 года. Исходные результаты анализа крови были значительными для анемии (гемоглобин 101 г/л), легкой почечной недостаточности (мочевина 12,6 ммоль/л и креатинин 195 мкмоль/л) и легкого повышения γ-глутамилтранспептидазы (ГГТ) (77 ЕД/л). Его щелочная фосфатаза (ALKP) была в норме. Перед началом DCA в качестве исходного уровня была проведена МРТ позвоночника.
IV DCA была начата с дозы 3000 мг (47 мг/кг) еженедельно и увеличена в течение 2 недель до 5000 мг (47 мг/кг) дважды в неделю. Побочных эффектов не наблюдалось. Одновременно с началом DCA пациент также получил стереотаксическую радиотерапию позвоночника. После 2 месяцев IV DCA в сочетании с продолжающимся натуропатическим лечением КТ показала стабильность всех метастазов в легких и уменьшение метастаза поджелудочной железы с 7,6 × 5,6 см до 5,9 × 5,2 см. Была обнаружена едва заметная новая область просветления на уровне T12 с небольшим увеличением просветления всех других метастазов в костях. Сканирование костей с технецием в апреле 2012 года не показало соответствующей активности ни в одной из областей просветления, обнаруженных на КТ. Новая МРТ позвоночника подтвердила смешанный ответ, при этом наибольший рост метастазов в костях составил 1–2 мм.
После 4 месяцев терапии IV DCA МРТ продемонстрировала стабильность почти всех метастазов в позвоночнике, 2 из которых были немного больше, без указания измерений. Новых метастазов в позвоночнике отмечено не было. КТ месяц спустя, после 5 месяцев IV DCA, показало, что все легочные узелки стабильны, а масса поджелудочной железы еще больше уменьшилась в размерах с 5,9 × 5,2 см до 4,4 × 4,4 см. Новых интраторакальных или интраабдоминальных метастазов не было. Многие из существующих костных метастазов продемонстрировали небольшое увеличение прозрачности. ALKP оставался нормальным, и не произошло ухудшения количества клеток или функции почек. Хотя он продолжал терапию IV DCA, пациент начал поиск более агрессивных вариантов лечения с целью достижения полной ремиссии. За исключением спинальной стереотаксической радиотерапии, никакая сопутствующая традиционная терапия не проводилась одновременно с IV DCA.
Пациент оставался клинически стабильным до сентября 2012 года, когда он прервал лечение IV DCA после 8 месяцев терапии, чтобы поехать в частную клинику в Германии для низкодозной химиотерапии с общей гипертермией тела и потенцированием инсулина.

СЛУЧАЙ 3: НЕЙРОЭНДОКРИННАЯ КАРЦИНОМА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Десятилетний мальчик с метастатической нейроэндокринной карциномой поджелудочной железы был привезен из Португалии его родителями в клинику одного автора в Канаде для лечения DCA после неэффективности традиционной химиотерапии. Сначала он обратился к своему врачу в Португалии с жалобами на усталость и анорексию. Диагноз был поставлен с помощью УЗИ и биопсии, которые выявили массу поджелудочной железы с метастазами в брюшные лимфатические узлы и обширные метастазы в печень, занимающие всю паренхиму печени. Сцинтиграфия рецепторов соматостатина показала поражение поджелудочной железы с высоким поглощением, но показала низкое поглощение во всех поражениях печени. На основании многопрофильного обсуждения случая с детской онкологической группой в региональном онкологическом центре в Лиссабоне, Португалия, в качестве первичного лечения были выбраны 6 циклов цисплатина и этопозида. КТ после 2 циклов химиотерапии показала уменьшение метастазов и первичной опухоли. К пятому циклу онколог отметил ухудшение ответа на основе новых КТ-сканов и маркеров крови, и у пациента началось клиническое ухудшение с потерей веса, тошнотой и рвотой. Возможность высокодозной химиотерапии и трансплантации печени были исключены командой трансплантологов. Терапия была прекращена после полного лечения цисплатином в дозе 600 мг/м 2 и этопозидом в дозе 1800 мг/м 2 .
Пациент прибыл в Канаду для оценки относительно терапии DCA через 2 месяца. В то время его лекарства включали метоклопрамид, ондансетрон, флуконазол, лоперамид, эзомепразол, налтрексон (4,5 мг) перед сном и парацетамол (ацетаминофен). DCA в дозе 2500 мг внутривенно (74 мг/кг) и октреотид в дозе 100 мкг внутривенно были начаты дважды в неделю в условиях клиники. Октреотид был добавлен с надеждой на усиление действия только против основной опухоли поджелудочной железы; он показал высокое поглощение при предыдущем сканировании рецепторов соматостатина. Терапия была начата в течение 2 недель после последнего КТ-сканирования. Поддерживающее внутривенное лечение проводилось одновременно и состояло из R-α-липоевой кислоты в дозе 250 мг, аминокислот, IVC, кальция, магния, комплекса витаминов B и многокомпонентных минералов без меди. После 2 инфузий IVC был увеличен с 5 до 20 г после того, как безопасность была подтверждена нормальным уровнем сывороточной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD). Октреотид был увеличен до 100 мкг внутривенно ежедневно.
Пациент испытывал временное усиление боли в животе и новую боль в левом плече через 1 день после инфузий. Он также сообщил об увеличении своего уровня энергии. Он продолжал испытывать временное усиление боли после каждой инфузии, которое хорошо купировалось пероральным морфином после прекращения приема налтрексона. Он проходил лечение дважды в неделю в течение 2 недель в условиях офиса. Новые анализы крови после 4 внутривенных процедур показали снижение аланинаминотрансферазы (АЛТ), стабильной аспартатаминотрансферазы (АСТ) и ГГТ, значительное увеличение дегидрогеназы молочной кислоты (ЛДГ) и падение гемоглобина (таблица 1). Затем он был выписан под наблюдение своих врачей в Португалии, которые продолжили внутривенную терапию DCA вместе с поддерживающей внутривенной терапией и внутривенной α-липоевой кислотой без осложнений.

Таблица 1. Нейроэндокринная карцинома поджелудочной железы, сводка анализа крови
Сокращения: ЛДГ = дегидрогеназа молочной кислоты; ГГТ = γ-глутамилтранспептидаза; АСТ = аспартатаминотрансфераза; АЛТ = аланинаминотрансфераза.

КТ после 6 недель терапии показало уменьшение самого крупного метастаза в печени на 2 см (рисунки 3А и 3Б). Второй по величине метастаз также уменьшился почти на 2 см (рисунки 4А и 4Б).

Рисунки 3А и 3Б. Результаты КТ-сканирования самого большого метастаза печени после 6 недель терапии
Рисунок 3А показывает самый большой метастаз до начала терапии с помощью IV DCA. Рисунок 3Б показывает уменьшение этой опухоли на 2 см после терапииРисунки 4А и 4Б. Результаты КТ второго по величине метастаза после 6 недель терапии
Рисунок 4А показывает второй по величине метастаз до начала терапии с помощью внутривенного введения DCA. Рисунок 4Б показывает уменьшение этой опухоли почти на 2 см.

Новое сканирование соматостатина (позитронно-эмиссионная томография с галлием-68), проведенное через неделю после КТ, не выявило «никаких признаков опухолевых поражений с повышенной экспрессией рецепторов соматостатина 2, 3 или 5». На основании этого открытия внутривенный октреотид был прекращен, а терапия DCA была продолжена. Пациент оставался клинически стабильным без каких-либо изменений в терапии в течение еще 3 месяцев. В этот момент он попросил прекратить терапию, поскольку его личной целью было достижение функционального статуса уровня ECOG 0 (полностью активный без ограничений физических возможностей), и эта цель считалась недостижимой.

ОБСУЖДЕНИЕ

Было представлено три случая терапии IV DCA для пациентов с запущенным раком, в которых авторы наблюдали благоприятные клинические, биохимические или радиологические ответы.
Случай 1 иллюстрирует биохимический ответ метастатического рака толстой кишки на IV DCA в сочетании с высокой дозой IVC. Ранее CEA пациента неуклонно повышался при использовании IVC только в течение 10 месяцев. Таким образом, снижение CEA можно отнести к терапии DCA. Поскольку в литературе сообщается о возможности снижения CEA более чем на 50% в течение 10 часов после метастатэктомии печени, 40 большое падение CEA на 1 день после любой другой терапии является правдоподобным, если рак быстро отреагировал, и не должно считаться ошибочным результатом. Более того, быстрое снижение печеночных ферментов согласуется с уменьшением повреждения печени в результате гибели раковых клеток или ингибирования роста.
Ультразвуковое исследование после лечения DCA не показало никаких изменений в размерах опухоли; Однако непосредственно перед началом лечения DCA не было базового сканирования, а сравнительное КТ было выполнено за 2 месяца до начала терапии. Таким образом, нельзя сделать выводов о том, произошло ли уменьшение размера опухоли. В рамках ограничений времени сканирования и сравнения КТ с УЗИ авторы, по крайней мере, наблюдали стабильность опухоли. Нельзя сделать выводов о длительности ответа, поскольку пациент прекратил терапию очень рано. Авторы пришли к выводу, что IV DCA, по-видимому, обладает активностью у людей против аденокарциномы толстой кишки.
Случай 2 иллюстрирует частичный ответ метастатической ангиосаркомы на IV DCA в сочетании с естественной терапией. Несмотря на уже имеющуюся анемию и хроническую почечную недостаточность, эффективное лечение было возможно, поскольку DCA не является миелосупрессивным или нефротоксичным. У этого пациента наблюдалось уменьшение большого метастаза поджелудочной железы, который не реагировал на предыдущую лучевую терапию. Уменьшение размера более чем на 30% соответствует определению частичного ответа в соответствии с Критериями оценки ответа при солидных опухолях (RECIST). Результатом стала стабильность множественных метастазов в легких и почти полная стабильность существующих метастазов в костях. Ответ метастазов в костях можно было бы отнести к сопутствующей стереотаксической спинальной радиотерапии, но ответ других метастазов нельзя. Крошечные новые метастазы в костях появились во время начального 5-месячного курса терапии DCA. Никаких новых интраторакальных или интраабдоминальных метастазов не появилось во время терапии DCA, тогда как метастазы в легких и поджелудочной железе выросли до этой терапии. У пациента не было никаких существенных побочных эффектов, связанных с лечением.
Смешанные ответы можно ожидать из-за гетерогенности опухоли. Другим возможным объяснением усиленного ответа метастазов поджелудочной железы по сравнению с метастазами легких является то, что DCA может быть более эффективным в предварительно облученных опухолях. Этот результат был зарегистрирован ранее. 41 Частичный ответ обнадеживает, учитывая плохой прогноз для пациента, особенно потому, что лечение хорошо переносилось без гематологической, почечной или неврологической токсичности. При более мягкой, нетоксичной терапии частичный ответ может быть полностью приемлемым и от него не нужно отказываться. Авторы пришли к выводу, что IV DCA, по-видимому, обладает активностью у людей против ангиосаркомы.
Случай 3 иллюстрирует уменьшение опухоли с помощью IV DCA в сочетании с высокой дозой IVC. Этот результат классифицируется как стабильное заболевание в соответствии с определением RECIST, поскольку уменьшение опухоли было ниже 30%. Наблюдались минимальные побочные эффекты. На основании сканирования октреотида до и после лечения, уменьшение крупных метастазов печени не может быть отнесено к терапии октреотидом; Ни одно сканирование не показало рецепторов октреотида в метастазах печени. Кроме того, исчезновение рецепторов октреотида из опухоли поджелудочной железы еще больше подчеркивает отсутствие пользы, связанной с терапией октреотидом. Таким образом, ответ можно отнести к введению DCA в сочетании с натуральными лекарствами. Временное обострение боли, связанной с опухолью, иногда отмечается при внутривенном введении DCA и может быть признаком ответа опухоли с последующим воспалением. Внезапное увеличение сывороточного ЛДГ пациента согласуется с этим эффектом. Из-за короткой продолжительности оценки нельзя сделать вывод о длительности ответа. Авторы пришли к выводу, что внутривенный DCA, по-видимому, обладает активностью у людей против нейроэндокринной карциномы поджелудочной железы. Представленные
случаи указывают на то, что внутривенный DCA является многообещающей терапией рака. Все пациенты получили значимую пользу от своей терапии с минимальными субъективными побочными эффектами и без гематологической, почечной или неврологической токсичности, несмотря на позднюю стадию заболевания во всех случаях. Такие методы лечения, как высокодозный IVC, которые сочетались с DCA, были поддерживающими с точки зрения качества жизни и могли иметь синергетический эффект с IV DCA. Однако было ясно, что эти методы лечения сами по себе не объясняли реакции опухоли. Интересно отметить, что все пациенты в этой серии случаев использовали IVC с IV DCA. Считается, что IVC может оказывать противораковое действие посредством иммуномодуляции 42,43 или посредством индукции аутофагии, опосредованной генерацией H 2 O 2 и истощением АТФ. 44-46 Было показано, что IVC действует как адъювант в других методах лечения рака, таких как гемцитабин при карциноме поджелудочной железы. 47-49Таким образом, IVC может играть важную роль в качестве вспомогательного средства к IV DCA при лечении запущенных форм рака.
На момент написания этой статьи 4 активных клинических испытания изучают роль перорального DCA в качестве терапии рака, но ни одно из испытаний в настоящее время не изучает способ введения IV. Из-за непатентованного статуса DCA исследователям сложно собрать средства в масштабах, необходимых для проведения испытаний на людях. Есть надежда, что эти случаи, иллюстрирующие преимущества IV DCA, побудят к более формальным клиническим исследованиям. Необходимы дальнейшие исследования in vitro и in vivo, чтобы помочь определить механизмы действия DCA и особенности типа опухоли и микросреды, которые благоприятно реагируют на этот препарат. Клинические испытания с участием пациентов, у которых уже известно, что опухоли благоприятно реагируют на DCA, необходимы для лучшей оценки преимуществ препарата и оптимизации схемы лечения. DCA показал себя многообещающим в сочетании с некоторыми традиционными химиотерапевтическими средствами, преимущество, которое также следует изучить подробнее.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании литературы и клинического опыта авторов, не по назначению IV DCA является многообещающим вариантом лечения для пациентов, которые полностью понимают и принимают его риски и преимущества, особенно тех, у кого нет доступных традиционных вариантов лечения. Эти исследования случаев показывают, что DCA имеет потенциал для продления жизни без снижения качества жизни пациентов с изнурительными побочными эффектами или ухудшением физиологических функций, даже при заболевании на очень поздней стадии. В представленных случаях терапия IV DCA была ограниченной продолжительности, что затрудняет оценку степени преимущества для выживания. Однако, основываясь на опыте авторов хронического использования перорального DCA, причем самым долгоживущим на данный момент является 48-летний мужчина с глиобластомой, который был стабилен в течение 6 лет при пероральном DCA без традиционной терапии, авторы полагают, что препарат обладает потенциалом для долгосрочной стабилизации и/или регрессии, а также существенного повышения выживаемости. Учитывая его доступность и низкую токсичность, DCA заслуживает дальнейшего изучения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентов за их поддержку и согласие на публикацию их случаев.

ЗАЯВЛЕНИЕ АВТОРА О РАСКРЫТИИ

В своих клиниках авторы применяли индивидуальные, интегративные, дополнительные протоколы к пациентам с раком за плату, включающую стоимость одного или нескольких лекарств, перечисленных в этой публикации. Клиники принадлежат авторам и/или членам их семей. Авторы не получали никаких других грантов или финансовой поддержки для этого исследования.

ССЫЛКИ

1 1. Результаты поиска «Дихлорацетатный рак». Веб-сайт ClinicalTrials.gov. http:// clinicaltrials.gov/ct2/results?term=dichloroacetate+cancer. Доступ 22 июля 2014 г.
2 Stacpoole PW, Harman EM, Curry SH, Baumgartner TG, Misbin RI. Лечение лактоацидоза дихлорацетатом. N Engl J Med. 1983;309(7):390-396.
3 Stacpoole PW, Lorenz AC, Thomas RG, Harman EM. Дихлорацетат в лечении лактоацидоза. Ann Intern Med. 1988;108(1):58-63.
4 Stacpoole PW, Wright EC, Baumgartner TG и др. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения лактоацидоза у взрослых: группа по изучению дихлорацетата и лактоацидоза. N Engl J Med. 1992;327(22):1564-1569.
5 Stacpoole PW, Kurtz TL, Han Z, Langaee T. Роль дихлорацетата в лечении генетических митохондриальных заболеваний. Adv Drug Deliv Rev. 2008;60(13- 14):1478-1487.
6 Stacpoole PW, Kerr DS, Barnes C и др. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактоацидоза у детей. Pediatrics. 2006;117(5):1519-1531.
7 Kaufmann P, Engelstad K, Wei Y и др. Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование. Neurology. 2006;66(3):324-330.
8 Brandsma D, Dorlo TP, Haanen JH, Beijnen JH, Boogerd W. Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом. J Neurol. 2010;257(12):2099-2100.
9 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE и др. Оценка долгосрочного лечения детей с врожденным лактоацидозом с помощью дихлорацетата. Pediatrics. 2008;121(5):e1223-e1228.
10 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J и др. Ось митохондриального-K+ канала подавляется при раке, и ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака. Cancer Cell. 2007;11(1):37-51.
11 Madhok BM, Yeluri S, Perry SL, Hughes TA, Jayne DG. Дихлорацетат индуцирует апоптоз и остановку клеточного цикла в клетках колоректального рака. Br J Cancer. 2010;102(12):1746-1752.
12 Cao W, Yacoub S, Shiverick KT и др. Дихлорацетат (DCA) сенсибилизирует как дикие, так и сверхэкспрессирующие Bcl-2 клетки рака предстательной железы in vitro к облучению. Prostate. 2008;68(11):1223-1231.
13 Saed GM, Fletcher NM, Jiang ZL, Abu-Soud HM, Diamond MP. Дихлорацетат индуцирует апоптоз эпителиальных клеток рака яичников посредством механизма, включающего модуляцию окислительного стресса. Reprod Sci. 2011;18(12):1253-1261.
14 Vella S, Conti M, Tasso R, Cancedda R, Pagano A. Дихлорацетат ингибирует рост нейробластомы, специфически действуя против злокачественных недифференцированных клеток. Int J Cancer. 2012;130(7):1484-1493.
15Fiebiger W, Olszewski U, Ulsperger E, Geissler K, Hamilton G. In vitro цитотоксичность новых препаратов на основе платины и дихлорацетата против линий клеток карциноида легких. Clin Transl Oncol. 2011;13(1):43-49.
16 Liu D, Liu S, Jing X, Li X, Li W, Huang Y. Некроз карциномы шейки матки дихлорацетатом, выделяемым из электропряденых полилактидных матов. Biomaterials. 2012;33(17):4362-4369.
17 Wong JY, Huggins GS, Debidda M, Munshi NC, De Vivo I. Дихлорацетат индуцирует апоптоз в клетках рака эндометрия. Gynecol Oncol. 2008;109(3):394-402.
18 Ishiguro T, Ishiguro R, Ishiguro M, Iwai S. Co-treatment of dichloroacetate, omeprazole and tamoxifen displayed synergistically antiproliferative effect on malignant tumors: in vivo experimentals and a case report. Гепатогастроэнтерология. 2012;59(116):994-996.
19 Sorokina LV, Pyatchanina TV, Didenko GV, Kaplia AA, Khyzhnyak SV. Влияние дихлорацетата натрия на окислительные процессы при саркоме 37. Exp Oncol. 2011;33(4):216-221.
20 Kumar A, Kant S, Singh SM. Новые молекулярные механизмы противоопухолевого действия дихлорацетата против Т-клеточной лимфомы: влияние измененного метаболизма глюкозы, гомеостаза pH и регуляции выживания клеток. Chem Biol Interact. 2012;199(1):29-37.
21 Sutendra G, Dromparis P, Kinnaird A и др. Активация митохондрий путем ингибирования PDKII подавляет сигнализацию HIF1a и ангиогенез при раке. Oncogene. 2013;32(13):1638-1650.
22 Shahrzad S, Lacombe K, Adamcic U, Minhas K, Coomber BL. Дихлорацетат натрия (DCA) снижает апоптоз при гипоксии колоректальных опухолей. Cancer Lett. 2010;297(1):75-83.
23 Anderson KM, Jajeh J, Guinan P, Rubenstein M. In vitro эффекты дихлорацетата и CO2 на гипоксические клетки HeLa. Anticancer Res. 2009;29(11):4579-4588.
24 Olszewski U, Poulsen TT, Ulsperger E, Poulsen HS, Geissler K, Hamilton G. In vitro цитотоксичность комбинаций дихлорацетата с противораковыми соединениями платины. Clin Pharmacol. 2010;2:177-183.
25 Xie J, Wang BS, Yu DH и др. Дихлорацетат переключает метаболизм с гликолиза на окисление глюкозы и проявляет синергическое ингибирование роста с цисплатином в клетках HeLa. Int J Oncol. 2011;38(2):409-417.
26 Данные наблюдений за лечением DCA онкологическим центром Medicor. Веб-сайт онкологических центров Medicor. http://medicorcancer.com/dca_therapy/dca-therapy-datajuly-2009/. Обновлено 1 июля 2009 г. Доступ 22 июля 2014 г.
27 Де Грандис Д. Ацетил-L-карнитин для лечения периферической нейропатии, вызванной химиотерапией: краткий обзор. Препараты для лечения ЦНС. 2007;21(suppl 1):39-43.
28Maestri A, De Pasquale Ceratti A, Cundari S, Zanna C, Cortesi E, Crino L. Пилотное исследование эффекта ацетил-L-карнитина при периферической нейропатии, вызванной паклитакселом и цисплатином. Tumori. 2005;91(2):135-138.
29 Evans JD, Jacobs TF, Evans EW. Роль ацетил-L-карнитина в лечении диабетической периферической нейропатии. Ann Pharmacother. 2008;42(11):1686-1691.
30 Di Cesare Mannelli L, Ghelardini C, Toscano A, Pacini A, Bartolini A. Защитный агент от нейропатии ацетил-L-карнитин активирует протеинкиназу C-гамма и MAPK в модели нейропатической боли у крыс. Neuroscience. 2010;165(4):1345-1352.
31 Mijnhout GS, Kollen BJ, Alkhalaf A, Kleefstra N, Bilo HJ. Альфа-липоевая кислота при симптоматической периферической нейропатии у пациентов с диабетом: метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. Int J Endocrinol. 2012;2012:456279.
32 Vallianou N, Evangelopoulos A, Koutalas P. Альфа-липоевая кислота и диабетическая нейропатия. Rev Diabet Stud. 2009;6(4):230-236.
33 Liu F, Zhang Y, Yang M и др. Лечебный эффект альфа-липоевой кислоты на периферическую нейропатию при диабете 2 типа: клиническое исследование [на китайском языке]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2007;87(38):2706-2709.
34 Ziegler D, Hanefeld M, Ruhnau KJ и др. Лечение симптоматической диабетической периферической нейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой: 3-недельное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN). Diabetologia. 1995;38(12):1425-1433.
35 Winkler G, Kempler P. Патомеханизм диабетической нейропатии: предпосылки патогенез-ориентированной терапии [на венгерском языке]. Orv Hetil. 2010;151(24):971-981.
36 Ang CD, Alviar MJ, Dans AL и др. Витамин B для лечения периферической нейропатии. Cochrane Database Syst Rev. 2008;(3):CD004573.
37 Winkler G, Pal B, Nagybeganyi E, Ory I, Porochnavec M, Kempler P. Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии. Arzneimittelforschung. 1999;49(3):220-224.
38 Savasi I, Evans MK, Heigenhauser GJ, Spriet LL. Метаболизм скелетных мышц не зависит от инфузии DCA и гипероксии после начала интенсивных аэробных упражнений. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002;283(1):E108-E115.
39 Shangraw RE, Lohan-Mannion D, Hayes A, Moriarty RM, Fu R, Robinson ST. Дихлорацетат стабилизирует интраоперационный кислотно-щелочной баланс во время трансплантации печени. Liver Transpl. 2008;14(7):989-998.
40. Lokich J, Ellenberg S, Gerson B, Knox WE, Zamcheck N. Очищение плазмы от карциноэмбрионального антигена после гепатоцеллюлярной метастатэктомии. J Clin Oncol. 1984;2(5):462-465.
41Khan A. Использование перорального дихлорацетата для облегчения боли в ноге, возникающей при метастатической низкодифференцированной карциноме: отчет о случае. J Palliat Med. 2011;14(8):973-977.
42 См. D, Mason S, Roshan R. Повышение фактора некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и функции естественных клеток-киллеров (NK) с использованием интегративного подхода при поздних стадиях рака. Immunol Invest. 2002;31(2):137-153.
43 Mikirova N, Casciari J, Rogers A, Taylor P. Влияние высоких доз внутривенного витамина C на воспаление у онкологических пациентов. J Transl Med. Сентябрь 2012;10:189.
44 Chen P, Yu J, Chalmers B, et al. Фармакологический аскорбат вызывает цитотоксичность в клетках рака простаты через истощение АТФ и индукцию аутофагии. Противораковые препараты. 2012;23(4):437-444.
45 Чен П., Стоун Дж., Салливан Г., Дриско Дж. А., Чен К. Противораковый эффект фармакологического аскорбата и его взаимодействие с дополнительным парентеральным глутатионом в доклинических моделях рака. Free Radic Biol Med. 2011;51(3):681-687.
46 Дойбзер Б., Майер Ф., Кучи З. и др. Цитотоксичность фармакологических концентраций аскорбата, опосредованная H(2)O(2), по отношению к клеткам нейробластомы: потенциальная роль лактата и ферритина. Cell Physiol Biochem. 2010;25(6):767-774.
47 Welsh JL, Wagner BA, van't Erve TJ и др. Фармакологический аскорбат с гемцитабином для контроля метастатического и лимфоположительного рака поджелудочной железы (PACMAN): результаты клинического исследования фазы I. Cancer Chemother Pharmacol. 2013;71(3):765-775.
48 Monti DA, Mitchell E, Bazzan AJ и др. Фаза I оценки внутривенной аскорбиновой кислоты в сочетании с гемцитабином и эрлотинибом у пациентов с метастатическим раком поджелудочной железы. PloS One. 2012;7(1):e29794.
49 Cullen JJ, Spitz DR, Buettner GR. Комментарий к «Фармакологический аскорбат синергизирует с гемцитабином в доклинических моделях рака поджелудочной железы», т. е. все, что мы говорим, это дать шанс C. Свободные радикалы Биол. Мед. 2011;50(12):1726-1727.

Определение цитотоксического эффекта амигдалина в клеточной линии DLD-1 и антицитотоксического эффекта в клеточной линии CCD-18CO

 Год 2022 , Том: 44 Выпуск: 4, 377 - 383, 31.12.2022

Альпаслан Озтюрк  , Айбюке Афра Кескинер , Берна Коджаман , Эдже Авулоглу Йылмаз

https://doi.org/10.7197/cmj.1185366

Абстрактный

Цель: Амигдалин, который является частью ароматической цианогенной гликозидной группы, содержится в семенах растений, таких как абрикос, персик, слива, яблоко, груша и вишня. Было показано, что амигдалин обладает противоопухолевыми свойствами против многих видов рака, таких как рак толстой кишки, молочной железы и легких. Целью данного исследования было определение цитотоксического и антицитотоксического действия амигдалина на клетки рака толстой кишки человека (DLD-1) и нормальный эпителий толстой кишки (CCD-18Co) с использованием теста MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-YL)-2,5-дифенилтетразолий бромид).
Материалы и методы: Клетки DLD-1 и CCD-18Co выращивали в колбах, содержащих Roswell Park Memorial Institute-1640 и минимальную необходимую среду Игла соответственно. Обе группы клеток обрабатывали концентрациями амигдалина 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 и 1,56 мМ в течение 24 часов. Затем в лунки аспирированных планшетов добавляли 20% красителя МТТ и инкубировали в течение 3 часов. После остановки реакции чистым диметилсульфоксидом (ДМСО) в конце периода значения поглощения планшетов считывали спектрофотометрически при длине волны 570 нм.
Результаты: значения процента жизнеспособности для линии клеток DLD-1 были обнаружены в диапазоне 48,3–71,6%, а значение IC50 было рассчитано как 74,03 мМ. Значения жизнеспособности для линии клеток CCD-18Co после обработки амигдалином варьировались от 101,6 до 117,9%.
Заключение: В то время как амигдалин показал цитотоксический эффект в клеточной линии DLD-1, он показал антицитотоксический эффект в клеточной линии CCD-18Co. В нашем исследовании было установлено, что амигдалин снизил жизнеспособность раковых клеток DLD-1 дозозависимым образом и не показал цитотоксического эффекта на нормальные эпителиальные клетки CCD18-Co. Необходимы более комплексные контролируемые клинические испытания, чтобы продемонстрировать возможность использования амигдалина в сочетании с другими противоопухолевыми препаратами и разработать искусственный синтез активных ингредиентов в амигдалине с целью повышения противоопухолевой активности этих препаратов.

Ключевые слова

Амигдалин, Лечение рака, Культура клеток, Рак толстой кишки, Витамин В17, Амигдалин, Лечение рака, Клеточная культура, Рак толстой кишки, Витамин B17

Ссылки

• 1. Herbst MC. Ассоциация по борьбе с раком Южной Африки (CANSA). Информационный бюллетень о десяти основных видах рака в каждой группе населения. 2015 г. https://www.compcom.co.za/wp-content/uploads/2020/03/Fact-Sheet-on-Cancer-of-an-Unknown-Primary-CUP.pdf.
• 2. Африн С., Джампьери Ф., Гаспаррини М., Форбс-Эрнандес Т.Й., Варела-Лопес А. и др. Химиопрофилактические и терапевтические эффекты съедобных ягод: фокус на профилактике и лечении рака толстой кишки. Molecules. 2016; 21(169):1 – 41.
• 3. Хаксли Р.Р., Ансари-Могаддам А., Клифтон П., Чернихов С., Парр К.Л. и др. Влияние факторов риска, связанных с питанием и образом жизни, на риск колоректального рака: количественный обзор эпидемиологических данных. Int J Cancer. 2009;125(1):171 – 80.
• 4. Котеча Р., Таками А., Эспиноза Дж. Л. Фитохимические вещества в рационе и химиопрофилактика рака: обзор клинических данных. Oncotarget 2016; 7(32):52517–29. Doi: 10.18632/oncotarget.9593.
• 5. Ван Дж., Цзян Й. Ф. Природные соединения как противораковые агенты: экспериментальные данные. World J Exp Med 2012; 2(3):45–57.
• 6. Аббуд ММ, Аль Авайда В, Альхатиб ХХ, Абу-Айяд А.Н. Противоопухолевое действие амигдалина на клетки рака молочной железы человека путем селективной сенсибилизации к окислительному стрессу. Nutr Cancer. 2019;71(3):483-490. doi: 10.1080/01635581.2018.1508731.
• 7. Сириша Д., Редди Б.С., Реджинальд БА, Самата М., Камал Ф. Влияние амигдалина на линию клеток рака полости рта: исследование in vitro. J Oral Maxillofac Pathol. 2019; 23(1): 104–107.
• 8. Santos Pimenta LP, Schilthuizen M, Verpoorte R, Choi YH. Количественный анализ амигдалина и пруназина в Prunus serotina Ehrh. с использованием (1) спектроскопии ЯМР-Н. Phytochem Anal 2014; 25:122–126. https://doi.org/10.1002/pca.2476.
• 9. Owa C, Messina ME, Halaby R, Halaby R. Триптолид индуцирует лизосомально-опосредованную запрограммированную клеточную смерть в клетках рака груди MCF-7. Int J Womens Health 2013; 5:557–569. doi.org/10.2147/IJWH.S44074.
• 10. Ши Дж., Чэнь Цюй, Сюй М., Ся Цюй, Чжэн Т. и др. Последние обновления и будущие перспективы относительно амигдалина как потенциального противоракового средства: обзор. Cancer Medicine 2019; 8(6), 3004-3011.
• 11. Lea MA, Koch MR. Влияние цианата, тиоцианата и амигдалина на поглощение метаболитов в нормальных и опухолевых тканях крыс. J Natl Cancer Inst. 1979;63(5):1279‐1283.
• 12. Шаки Ф., Сабери-Хасанабади П. Фармакологическая активность и токсикологические эффекты амигдалина: обзор. Фармацевтические и биомедицинские исследования 2022; 8(1), 1-12.
• 13. Сюй С, Сун З. Расширенные исследования противоопухолевых эффектов амигдалина. J Cancer Res Ther 2014; 1:3-7. doi.org/10.4103/0973-1482.139743.
• 14. Keydar I, Chen L, Karby S, Weiss FR, Delarea J, et al. Создание и характеристика линии клеток происхождения человеческой карциномы молочной железы. Eur J Cancer 1979; 15, 659–670.
• 15. Chang HK, Shin MS, Yang HY, Lee JW, Kim YS и др. Амигдалин индуцирует апоптоз посредством регуляции экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака простаты человека DU145 и LNCaP. Biol Pharm Bull 2006; 8: 1597–1602.
• 16. Пак Х.Дж., Юн Ш.Х., Хан Л.С., Чжэн Л.Т., Юнг К.Х. и др.: Амигдалин ингибирует гены, связанные с клеточным циклом в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4. World J Gastroenterol 2005; 11: 5156–5161.
• 17. El-Kholy WB, Abdel-Rahman SA, Abd El-Hady El-Safti FEN, Issa NM. Влияние витамина B17 на экспериментально вызванный рак толстой кишки у взрослых самцов белых крыс. Folia Morphol (Warsz) 2021; 80(1): 158–169 DOI: 10.5603/FM.a2020.0021.
• 18. Cassiem W, Kock M. Антипролиферативное действие экстрактов абрикосовых и персиковых косточек на клетки рака толстой кишки человека in vitro. BMC Complement Altern Med. 2019; 19(1): 32. doi: 10.1186/s12906-019-2437-4.
• 19. Димитров М., Илиев И., Бардаров К., Георгиева Д., Тодорова Т. Фитохимическая характеристика и биологическая активность экстракта абрикосовых косточек в тестах на основе дрожжевых клеток и клеточных линиях гепатоцеллюлярной и колоректальной карциномы. J Ethnopharmacol. 2021 28 октября; 279:114333. https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.114333.
• 20. Макаревич Дж., Рутц Дж., Юнгель Э., Каульфусс С., Цаур И. и др.: Амигдалин влияет на адгезию и инвазию клеток рака мочевого пузыря in vitro. PLoS One 2014; 9: e110244.
• 21. Квон ХЙ, Хонг СП, Хан ДХ и Ким ДЖХ: Индукция апоптоза экстракта семени персика в клетках промиелоцитарного лейкоза человека (HL-60). Arch Pharm Res 2003; 26: 157–161.
• 22. Qian L, Xie B, Wang Y, Qian J. Амигдалин-опосредованное ингибирование инвазии клеток немелкоклеточного рака легких in vitro. Int J Clin Exp Pathol 2015; 8:5363–5370
• 23. Кадир М., Фатима К. Обзор фармакологической активности амигдалина. Arch Cancer Res 2017; 5: 10–12.
• 24. Jucaa M, Bandeira B, Carvalho D, Leal AT. Сравнительное исследование 1,2-диметилгидразина и азоксиметана по индукции колоректального рака у крыс. J Coloproctol. 2014; 34(3): 167–173. doi: 10.1016/j.jcol.2014.06.003.
• 25. Chari KY, Polu PR, Shenoy RR. Оценка экстракта семян тыквы при раке толстой кишки, вызванном 1,2-диметилгидразином у крыс Wistar. J Toxicol. 2018; 6086490, doi: 10.1155/2018/6086490.
• 26. Chen Y, Ma J, Wang F, Hu J, Cui A и др. Амигдалин индуцирует апоптоз в клетках линии HeLa рака шейки матки человека. Immunopharmacol Immunotoxicol 2013; 35(1): 43–51. doi: 10.3109/08923973.2012.738688.
• 27. Newmark J, Brady RO, Grimley PM, Gal AE, Waller SG и др. Амигдалин (Laetrile) и пруназин бетаглюкозидазы: распределение в безмикробных крысах и в опухолевой ткани человека. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 6513-6516.

Показать меньше ссылок

Влияние дихлорацетата натрия как отдельного препарата, так и в составе комбинированной терапии на рост и метастазирование опухолей легких

Кафедра фармакологии и терапии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты2Медицинский факультет, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты3Кафедра физиологии, Колледж медицины и наук о здоровье, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты4Центр медицинских наук имени Зайеда, Университет Объединенных Арабских Эмиратов, Аль-Айн 17666, Объединенные Арабские Эмираты5Национальный институт здоровья и медицинских исследований (INSERM), 75013 Париж, Франция*Автор, которому следует адресовать корреспонденцию.

Международный журнал молекулярных наук 2021 , 22 (22), 12553; https://doi.org/10.3390/ijms222212553Получено: 24 октября 2021 г. / Пересмотрено: 14 ноября 2021 г. / Принято: 17 ноября 2021 г. / Опубликовано: 21 ноября 2021 г.(Эта статья относится к разделу Биохимия )

Абстрактный

Метаболическое перепрограммирование было признано важнейшим признаком нового рака. Сообщалось, что дихлорацетат (DCA), ингибитор пируватдегидрогеназной киназы (PDK), обладает противораковыми эффектами, обращая вспять гликолиз, связанный с опухолью. Это исследование было проведено для изучения противоракового потенциала DCA при раке легких отдельно и в сочетании с химио- и таргетной терапией с использованием двух линий клеток немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), а именно A549 и LNM35. DCA заметно вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности и роста колоний клеток A549 и LNM35 in vitro. DCA также снижал рост опухолевых ксенотрансплантатов как в хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, так и в моделях голых мышей in vivo. Кроме того, DCA снижал ангиогенную способность эндотелиальных клеток пупочной вены человека in vitro. С другой стороны, DCA не ингибировал in vitro клеточную миграцию и инвазию, а также in vivo заболеваемость и рост метастазов подмышечных лимфатических узлов у голых мышей. Лечение DCA не показало никакой токсичности у куриных эмбрионов и голых мышей. Наконец, мы продемонстрировали, что DCA значительно усилил противораковый эффект цисплатина в LNM35. Кроме того, сочетание DCA с гефитинибом или эрлотинибом приводит к аддитивным эффектам на ингибирование роста колоний LNM35 после семи дней лечения и к синергетическим эффектам на ингибирование роста колоний A549 после 14 дней лечения. В совокупности это исследование демонстрирует, что DCA является безопасным и перспективным терапевтическим средством для лечения рака легких.Ключевые слова:рак легких ; дихлорацетат ; ингибитор киназы пируватдегидрогеназы ; рост опухоли ; ангиогенез ; гефитиниб ; эрлотиниб

1. Введение

Рак легких является вторым по частоте встречаемости видом рака с самым высоким уровнем смертности в мире, составив 2,2 миллиона случаев и 1,8 миллиона смертей в 2020 году. Прогнозируется, что заболеваемость и смертность продолжат расти примерно на 60%, до предполагаемых 3,6 миллиона и 3 миллионов соответственно в 2040 году [ 1 ]. Большинство случаев рака легких — это НМРЛ, на которые приходится 80–85% всех случаев рака легких [ 2 ]. Развитие таргетной и иммунотерапии произвело революцию в лечении НМРЛ. Однако побочные эффекты, резистентность и эффективность в небольшой терапевтически чувствительной группе пациентов создают неравенство в доступе к таким агентам [ 3 , 4 , 5 ]. Таким образом, это подчеркивает необходимость в более безопасных и эффективных агентах.Метаболическое перепрограммирование является одним из отличительных признаков рака, который является многообещающей целью для разработки эффективных терапевтических подходов [ 6 ]. По сравнению с нормальными клетками, которые в основном полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS) в аэробных условиях, раковые клетки отклоняются от этого нормального метаболического фенотипа, полагаясь в основном на цитозольный гликолиз и молочнокислое брожение, даже в присутствии кислорода, чтобы удовлетворить потребности высокой пролиферации [ 7 ]. Это явление известно как эффект Варбурга, который использовался в качестве терапевтической цели для ингибирования роста опухоли [ 8 ]. PDK является одним из основных ферментов, контролирующих гликолиз и OXPHOS [ 9 ]. Он отключает митохондриальный OXPHOS путем фосфорилирования и ингибирования пируватдегидрогеназы (PDH), ключевого фермента, катализирующего окислительное превращение пирувата в ацетилкофермент А в митохондриях [ 10 ].DCA — это препарат с небольшой молекулярной массой, который использовался при лактоацидозе, врожденных митохондриальных дефектах и ​​диабете [ 11 ]. Интересно, что DCA продемонстрировал способность переключать метаболизм опухоли с цитозольного аэробного гликолиза на митохондриальный OXPHOS путем ингибирования PDK и повышения активности PDH [ 12 ]. Таким образом, сообщалось, что DCA оказывает противораковое действие за счет увеличения оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, а также повышения уровня ROS с последующей гибелью раковых клеток [ 11 , 13 , 14 , 15 ]. Однако в клинических исследованиях профиль безопасности DCA вызывал беспокойство. 

2. Результаты

2.1 Влияние DCA на жизнеспособность клеток и рост колоний линий клеток НМРЛ

Эффект увеличения концентрации DCA (3,125–100 мМ) был исследован на двух линиях клеток NSCLC, а именно, A549 и LNM35. Как показано на рисунке 1 , DCA снижал жизнеспособность A549 ( рисунок 1 A) и LNM35 ( рисунок 1 B) в зависимости от концентрации и времени. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC 50 ) DCA через 48 ч составляет приблизительно 25 мМ для обеих линий клеток.Рисунок 1. Влияние DCA на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие раковые клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) инкубировали в отсутствие или в присутствии увеличивающихся концентраций DCA (3,125–100 мМ) в течение 24, 48 и 72 ч. Жизнеспособность клеток оценивали, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее трех раз. Формы представляют средние значения, столбцы представляют SEM. Раковые клетки A549 ( C ) и LNM35 ( D ) выращивали в течение 7 дней для формирования колоний, которые обрабатывали различными концентрациями DCA (6,25–50 мМ) в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E ) Репрезентативные фотографии контрольных и обработанных DCA колоний показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Результаты представлены в виде процента колоний (среднее значение ± SEM) обработанных клеток по сравнению с контролем. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Для дальнейшей оценки противоракового эффекта DCA было исследовано его влияние на рост предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. Для этого обе клеточные линии выращивали при определенной плотности в течение 1 недели для формирования колоний, а затем обрабатывали возрастающей концентрацией DCA в течение 1 недели. Как показано на рисунке 1 , DCA вызывал зависимое от концентрации сокращение числа колоний для обеих клеточных линий, с более высокой чувствительностью, показанной в колониях LNM35 ( рисунок 1 D,E) по сравнению с колониями A549 ( рисунок 1 C,E). Эти результаты подтверждают противораковый эффект DCA in vitro.

2.2 Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухоли НМРЛ в курином эмбрионе CAM и голых мышах in vivo

Для подтверждения фармакологической значимости наших результатов in vitro противораковый эффект DCA оценивали in vivo с использованием анализа CAM на курином эмбрионе. Ксенотрансплантированные опухоли A549 и LNM35 на CAM обрабатывали 50 мМ DCA каждые 48 ч в течение 1 недели. На E17 опухоли извлекали из верхней части CAM и взвешивали. Как показано на рисунке 2 , 50 мМ DCA значительно снизили рост ксенотрансплантатов опухоли A549 примерно на 40% ( рисунок 2 A), в то время как не показали значительного снижения роста ксенотрансплантатов опухоли LNM35 ( рисунок 2 B). Поэтому 100 мМ DCA исследовали на ксенотрансплантатах опухоли LNM35, и это значительно снизило рост примерно на 40% ( рисунок 2 C). Токсичность также оценивали путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах. На E17 DCA не проявил цитотоксичности, поскольку процент живых эмбрионов был аналогичен контрольной группе и группе DCA ( рисунок 2 D–F).Рисунок 2. Влияние DCA на рост ксенотрансплантатов опухолей A549 и LNM35 в CAM куриного эмбриона in vivo. ( A ) Масса опухоли раковых клеток A549, ксенотрансплантированных на CAM при плотности 1 миллион клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ) в течение 1 недели. ( B , C ) Масса опухоли раковых клеток LNM35, ксенотрансплантированных на CAM при плотности 0,3 миллиона клеток после обработки лекарственным раствором (0,9% NaCl) или DCA (50 мМ и 100 мМ). ( D ) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах A549. ( E , F ) Процент живых эмбрионов в контрольных и обработанных DCA ксенотрансплантатах LNM35. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Влияние DCA на опухолевые ксенотрансплантаты также оценивалось in vivo с использованием бестимусных мышей, инокулированных клетками A549 и LNM35. Сообщалось, что средние летальные дозы (LD50) DCA составляли 4,5 г/кг и 5,5 г/кг у крыс и мышей соответственно [ 17 ]. Поэтому мыши с опухолевыми ксенотрансплантатами A549 получали перорально ежедневно (5 дней в неделю) 50 мг/кг и 200 мг/кг DCA в течение 38 последовательных дней. Лечение DCA (50 мг/кг) не вызвало значительного уменьшения объема опухолевых ксенотрансплантатов A549, в то время как DCA (200 мг/кг) значительно уменьшил объем примерно на 45% ( Рисунок 3 A). Аналогичная разница также наблюдалась в весе опухоли в конце эксперимента ( Рисунок 3 B). Не было выявлено никаких явных признаков токсичности или каких-либо проявлений нежелательного воздействия DCA на поведение животных, массу тела ( рисунок 3 C), компоненты крови, функцию печени и почек ( рисунок 3 D).Рисунок 3. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата A549, инокулированного голым мышам in vivo. ( A ) Объем опухоли ксенотрансплантата A549, инокулированного подкожно голым мышам и леченного DCA (50 и 200 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем в течение 38 дней. ( B ) Вес опухоли, полученный от тех же контрольных и обработанных DCA голых мышей. ( C ) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. ( D ) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. * Значительно отличается при <0,05. ** Значительно отличается при <0,01. ns — незначимо.С другой стороны, наблюдался рост ксенотрансплантатов опухоли LNM35, и мышам вводили перорально 200 мг/кг и 500 мг/кг DCA каждый день (5 дней в неделю) в течение 10 и 24 дней соответственно. Лечение DCA (200 мг/кг) вызвало незначительное уменьшение объема ксенотрансплантатов опухоли LNM35 ( Рисунок 4 A), в то время как DCA (500 мг/кг) значительно уменьшило объем опухоли почти на 75% ( Рисунок 4 B). Почти такие же различия наблюдались в весе опухоли в конце экспериментов ( Рисунок 4 C). Никаких признаков токсичности не наблюдалось в поведении животных или не было обнаружено по весу мышей ( Рисунок 4 D,E), компонентам крови, печени и функции почек ( Рисунок 4 F).Рисунок 4. Влияние DCA на рост ксенотрансплантата LNM35, инокулированного голым мышам in vivo. ( A , B ) Объем опухоли ксенотрансплантата LNM35, инокулированного подкожно голым мышам и леченного, соответственно, DCA (200 и 500 мг/кг) перорально или только контрольным раствором-носителем ежедневно в течение 10 и 24 дней. ( C ) Вес опухоли, полученный от контрольных и голых мышей, получавших 500 мг/кг DCA. ( D , E ) Средний вес тела мышей в течение дней лечения. ( F ) Образцы крови мышей анализировались на общий анализ крови, параметры функции печени и почек. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–11 мышей/группу. * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. ns — недостоверно.

2.3 Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур и прорастание HUVEC in vitro

Ангиогенез является одним из признаков рака, который обеспечивает поставку питательных веществ и кислорода для роста и распространения раковых клеток. Влияние DCA на ангиогенез было исследовано in vitro с использованием HUVEC, которые могут образовывать капилляроподобные структуры при посеве на Матригель. Как показано на рисунке 5 A, HUVEC образовывали организованные капилляроподобные структуры в отсутствие DCA, и эта организация была нарушена после добавления DCA. Длины трубок измеряли вручную ( рисунок 5 B) и с помощью анализа изображений Wimasis ( рисунок 5 C), и было обнаружено, что 25 мМ DCA были способны значительно ингибировать способность HUVEC образовывать нитевидные структуры почти на 30–40%. Это ингибирование наблюдалось при концентрациях, которые не показывали никакого снижения жизнеспособности HUVEC ( рисунок 5 D).Рисунок 5. Влияние DCA на формирование капилляроподобных структур HUVEC in vitro. ( A ) Формы ангиогенеза, индуцированного в HUVEC, культивируемых на матрице Matrigel в 96-луночном планшете в отсутствие и в присутствии различных концентраций DCA. Для контрастной фотографии использовался инвертированный микроскоп (4×), а для уточнения изображений использовалось программное обеспечение Wimasis. ( B , C ) Количественная оценка канальцевого ангиогенеза, индуцированного в клетках HUVEC, культивируемых в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ) вручную и с помощью программного обеспечения Wimasis соответственно. ( D ) Жизнеспособность клеток HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы», в отсутствие и в присутствии DCA (6,25–25 мМ). Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Столбцы представляют средние значения; полосы представляют SEM *** Значительно отличается при <0,001. **** Значимое отличие при <0,0001. ns — незначимо.В анализе прорастания сфероиды HUVECs были встроены в 3D коллагеновую матрицу в присутствии и отсутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или комбинации VEGF и DCA. Рисунок 6A показывает в репрезентативном эксперименте, что проростки, образованные в присутствии VEGF, были ингибированы DCA, 25 мМ. Были измерены общие длины проростков, и было обнаружено, что общая длина была значительно увеличена в присутствии VEGF, а DCA значительно уменьшил длину проростков, индуцированных VEGF ( Рисунок 6B ). Это ингибирование наблюдалось при концентрации, которая не показывала никакого снижения жизнеспособности HUVECs ( Рисунок 6C ).Рисунок 6. Влияние DCA на образование ростков внедренными сфероидами HUVEC in vitro. ( A ) Представительные изображения предварительно окрашенных сфероидов HUVEC через 24 часа внедрения в коллагеновую матрицу в присутствии VEGF 30 нг/мл, DCA 25 мМ или VEGF + DCA. Использовался инвертированный микроскоп с 20-кратным увеличением. ( B ) Среднее значение общей длины ростков различных сфероидов для каждого условия из одного представительного эксперимента. ( C ) Жизнеспособность HUVEC определялась, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты были повторены 2 раза. Столбцы представляют средние значения 12 сфероидов; полосы представляют SEM **** Значительно отличается при <0,0001. #### Значительно отличается при <0,0001. ns: незначимо.Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование ангиогенеза в опухолях может быть потенциальным механизмом, выходящим за рамки противоракового действия DCA.

2.4 Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro

Метастазирование — многоступенчатый процесс, включающий отделение клеток от первичной опухоли, миграцию клеток в соседние ткани с последующей инвазией клеток в кровь или лимфатическую систему до колонизации этих клеток в отдаленных органах. Влияние DCA на метастазирование у мышей, которым ксенотрансплантировали клетки рака легких с высокой степенью метастазирования, а именно LNM35, оценивали путем проверки веса и частоты подмышечных лимфатических узлов в контрольной и обработанной DCA группах. DCA снижает рост метастазов в лимфатических узлах, не достигая статистической значимости ( рисунок 7 A). Кроме того, он не влияет на частоту метастазов в лимфатических узлах ( рисунок 7 B).Рисунок 7. Влияние DCA на метастазы НМРЛ in vivo и инвазию и миграцию in vitro. ( A ) Вес подмышечных лимфатических узлов с метастазами LNM35 в контрольной группе и группе, получавшей DCA (500 мг/кг перорально). ( B ) Процент мышей с метастазами в лимфатических узлах LNM35 в контрольной группе и группе, получавшей DCA. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM для 9–10 мышей/группу. Используя анализ в камере инвазии Бойдена, клетки LNM35 ( C ) и A549 ( D ) инкубировали в течение 24 ч в отсутствие и в присутствии DCA (6,25, 12,5 мМ). Клетки, которые проникли в Матригель и пересекли поры 8 мкм, определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». Царапины были нанесены на сливающиеся монослои клеток LNM35 ( E ) и A549 ( F ), культивируемых в 6-луночном планшете в отсутствие и в присутствии DCA (6,25, 12,5 мМ). Инвертированный микроскоп с 4-кратным увеличением использовался для измерения среднего расстояния, на которое клетки мигрировали от края соскобленной области в течение 2, 6 и 24 ч. Фотографии индуцированных царапин на сливающихся монослоях клеток LNM35 ( G ) и клеток A549 ( H ) в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA через 0, 2, 6 и 24 ч. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы или формы являются средними значениями; столбцы являются SEM * Значительно отличается при <0,05. ** Значительно отличается при <0,01. ns — незначимо.Для оценки способности DCA инвазии и миграции клеток A549 и LNM35 in vitro использовались анализ инвазии в камере Бойдена и анализ миграции при заживлении ран. Чтобы убедиться, что потенциальное влияние DCA на миграцию и инвазию не обусловлено гибелью клеток, мы использовали более низкие концентрации DCA. В этих условиях 6,25 мМ и 12,5 мМ DCA не смогли ингибировать клеточную инвазию LNM35 ( Рисунок 7 C) и A549 ( Рисунок 7 D). Аналогично, эти концентрации не смогли ингибировать клеточную миграцию обеих клеточных линий ( Рисунок 7 E–H).

2.6 Влияние DCA в сочетании с EGFR-TKi на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний

Влияние 48-часовой инкубации с увеличивающимися концентрациями гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ) было исследовано на раковых клетках A549 и LNM35. Гефитиниб вызывал зависимое от концентрации снижение жизнеспособности раковых клеток A549 и LNM35 ( Рисунок 9 A,B); аналогично, эрлотиниб показал ту же картину снижения в двух клеточных линиях ( Рисунок 9 C,D). Количество 20 мкМ гефитиниба и эрлотиниба обладает способностью в обеих клеточных линиях ингибировать клеточную жизнеспособность A549 и LNM35 примерно на 40%, и эта концентрация использовалась в комбинированных экспериментах с DCA.Рисунок 9. Влияние EGFR-Tki на жизнеспособность клеток НМРЛ. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A , C ) и LNM35 ( B , D ) обрабатывали лекарственным носителем, гефитинибом или эрлотинибом (5–80 мкМ) в течение 48 ч. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo, как описано в разделе «Материалы и методы». Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Столбцы — средние значения; полосы — SEM * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Обработка клеток в течение 48 ч 25 мМ DCA значительно усилила эффект гефитиниба на жизнеспособность клеток A549 ( Рисунок 10 A) и LNM35 ( Рисунок 10 B). Затем был проведен клоногенный анализ для оценки эффекта комбинации на рост предварительно сформированных колоний обеих клеточных линий после семи дней обработки. Концентрация 20 мкМ гефитиниба вызвала 20–40%-ное снижение количества колоний A549 ( Рисунок 10 C) и LNM35 ( Рисунок 10 D). По сравнению с индивидуальными обработками, комбинация DCA с гефитинибом приводит к значительному снижению количества колоний обеих клеточных линий ( Рисунок 10 C, D), вызывая аддитивный эффект в LNM35 по сравнению с расчетным аддитивным значением отдельных обработок (86% против 90%). Кроме того, эта комбинация показывает значительное снижение плотности клеток отдельных колоний обеих клеточных линий ( рисунок 10 E,F).Рисунок 10. Влияние DCA в сочетании с гефитинибом на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) обрабатывали, соответственно, DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo. ( C , D ) Обработка предварительно сформированных колоний клеток A549 и LNM35, соответственно, DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E , F ) Репрезентативные изображения колоний для контрольной и обработанной групп показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM * Значимо отличается при <0,05. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Аналогично, DCA усиливает ингибирующее действие эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35 ( Рисунок 11 A, B). Количество колоний A549 и LNM35 было значительно снижено при применении эрлотиниба на 30–40% ( Рисунок 11 C, D), и это снижение было усилено DCA в LNM35 ( Рисунок 11 D), но не в A549 ( Рисунок 11 C). Комбинация вызвала аддитивные эффекты в LNM35, уменьшив количество колоний на 76 ± 2,8%, что статистически незначимо по сравнению с расчетным аддитивным значением отдельных обработок (91 ± 5,8%). Несмотря на незначительное снижение количества колоний A549 при использовании комбинации по сравнению с обработкой одним препаратом, плотность клеток каждой колонии была значительно снижена по сравнению с отдельными обработками ( Рисунок 11 E). Аналогичным образом, плотность клеток колоний LNM35 была снижена в группе, получавшей комбинированную терапию ( рисунок 11 F).Рисунок 11. Влияние DCA в сочетании с эрлотинибом на жизнеспособность клеток НМРЛ и рост колоний. Экспоненциально растущие клетки A549 ( A ) и LNM35 ( B ) обрабатывали, соответственно, DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа CellTiter-Glo. ( C , D ) Обработка предварительно сформированных колоний клеток A549 и LNM35, соответственно, DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ в течение 7 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( E , F ) Репрезентативные изображения колоний для контрольной и обработанной групп показаны для раковых клеток A549 и LNM35. Все эксперименты были повторены не менее 3 раз. Столбцы представляют собой средние значения; Столбцы — это SEM. ** Значимо отличается при <0,01. *** Значимо отличается при <0,001. **** Значимо отличается при <0,0001. ns — незначимо.Для изучения различий между двумя клеточными линиями в воздействии комбинированной терапии на рост колоний была исследована более длительная продолжительность лечения DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом на рост колоний A549. Как показано на рисунке 12 , комбинация DCA с гефитинибом приводит к значительному сокращению числа колоний ( рисунок 12 A,B). Эта комбинация вызвала большее ингибирование числа колоний по сравнению с рассчитанными аддитивными эффектами препаратов, используемых по отдельности ( рисунок 12 C). Аналогичное наблюдение было отмечено при комбинации DCA и эрлотиниба ( рисунок 12 D–F). В заключение следует отметить, что увеличение продолжительности лечения с семи до четырнадцати дней приводит к синергетическим эффектам предлагаемых комбинированных протоколов.Рисунок 12. Влияние более длительного лечения DCA в сочетании с гефитинибом и эрлотинибом на рост колоний A549. Обработка предварительно сформированных колоний A549 DCA (25 мМ) ± гефитиниб 20 мкМ ( A , B ) и DCA (25 мМ) ± эрлотиниб 20 мкМ ( D , E ) в течение 14 дней, после чего колонии фиксировали, окрашивали и подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». ( C , F ) Влияние комбинаций DCA и гефитиниба или эрлотиниба на рост колоний по сравнению с рассчитанными аддитивными эффектами двух препаратов по отдельности. Все эксперименты были повторены 3 раза. Столбцы представляют собой средние значения; полосы представляют собой SEM ** Значительно отличается при <0,01. *** Значительно отличается при <0,001. **** Значительно отличается при <0,0001.

3. Обсуждение

Несмотря на недавние достижения в скрининге, диагностике и лечении рака легких, в дополнение к замечательному прогрессу в понимании его молекулярной биологии, рак легких является вторым наиболее часто диагностируемым видом рака с самым высоким уровнем смертности во всем мире в 2020 году [ 1 ]. Поэтому прилагаются различные усилия для разработки эффективных агентов и подходов с хорошими пределами безопасности для воздействия на рак легких в попытке обеспечить излечение или улучшить общую выживаемость пациента. Целью данного исследования было изучение влияния метаболического препарата DCA на рост, миграцию, инвазию и ангиогенез рака легких in vitro и рост опухоли и метастазы in vivo, а также влияние целевого метаболизма DCA на цитотоксический эффект одобренной химиотерапии и таргетной терапии в качестве шага к достижению лучшей эффективности и лучшего профиля безопасности.Настоящее исследование показало, что DCA (3,125–100 мМ) вызывал зависящее от концентрации и времени снижение жизнеспособности клеток и роста предварительно сформированных колоний клеточных линий A549 и LNM35. IC50 DCA через 48 ч составлял приблизительно 25 мМ в обеих клеточных линиях. Наши результаты согласуются с другими отчетами, в которых DCA (10–90 мМ) подавлял жизнеспособность клеток линий колоректального рака (КРР), а именно SW620, LS174t, LoVo и HT-29, в зависимости от концентрации через 48 ч с диапазоном IC50 30–50 мМ в соответствии с типом клеточной линии [ 18 ]. Аналогично, DCA (20 мМ) значительно снизил жизнеспособность клеток CRC, а именно SW480, LoVo и HT-29 через 48 ч, с большим эффектом на слабодифференцированные клетки SW480 и метастатические клетки LoVo по сравнению с хорошо дифференцированными клетками HT-29 [ 19 ]. С другой стороны, более высокий IC50 был зарегистрирован в клетках рака шейки матки, клетках Hela и SiHa [ 20 ], в то время как DCA (20 мМ) не смог ингибировать жизнеспособность клеток линии рака молочной железы MCF-7 [ 21 ].Наши данные in vitro были подтверждены путем тестирования влияния DCA на прогрессирование опухоли in vivo с использованием моделей CAM куриного эмбриона и бестимусных мышей. Во-первых, мы продемонстрировали, что значительное снижение роста было достигнуто в A549 и LNM35, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона, при использовании доз DCA 50 мМ и 100 мМ соответственно. Во время написания этой рукописи было опубликовано исследование, в котором изучалось влияние натрия DCA на линии клеток глиобластомы U87 MG и PBT24, ксенотрансплантированных на CAM куриного эмбриона [ 22 ]. Авторы сообщили об изменении роста опухолей U87 MG и PBT24 в ответ на различные концентрации натрия DCA. Сообщалось, что 10 мМ натрия DCA были эффективны в снижении роста опухоли PBT24, но не опухоли U87, что отражает некоторые различия в биологии двух линий клеток [ 22 ]. Во-вторых, мы продемонстрировали, что лечение DCA в дозах 200 мг/кг ежедневно (5 дней в неделю) вызвало значительное снижение роста ксенотрансплантированной опухоли A549 на 40%, в то время как для значительного снижения роста ксенотрансплантированной опухоли LNM35 потребовалась более высокая доза DCA (500 мг/кг). В этом контексте ранее сообщалось, что DCA (100 мг/кг) увеличил время удвоения опухолей A549 и H1975 NSCLC примерно с 3 до 6,5 дней [ 15 ], но не оказал значительного ингибирующего эффекта у мышей с опухолью MDA-MB-231 [ 23 ]. С другой стороны, значительная задержка роста также наблюдалась у ксенотрансплантатов HT-29, леченных пероральным DCA (200 мг/кг) ежедневно в течение четырех дней [ 24 ].Исследование токсичности потенциальных противораковых препаратов так же важно, как и исследование их эффективности, поскольку тяжелая токсичность может помешать их использованию в клинике. DCA не показал цитотоксичности для куриных эмбрионов и бестимусных мышей. Процент живых эмбрионов был одинаковым в группах, получавших DCA, и контрольных группах. Кроме того, DCA не повлиял на поведение мышей, вес, общий анализ крови, параметры функции печени и почек по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с предыдущими доклиническими и клиническими отчетами, которые не показали никаких доказательств тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности при лечении DCA [ 13 , 14 ]. Немногие пациенты, получавшие лечение DCA, жаловались на общие желудочно-кишечные эффекты. Кроме того, наиболее распространенным ограничением для введения DCA является обратимая периферическая невропатия, которую можно свести к минимуму путем снижения дозы или дополнительного введения антиоксидантов [ 11 ]. Включение DCA в системы доставки лекарств (СДЛ), такие как наночастицы, является многообещающим подходом для сохранения противораковой активности DCA с минимальными побочными эффектами [ 25 , 26 , 27 ].Сообщалось, что противораковый эффект DCA частично обусловлен индукцией апоптоза, как это наблюдалось в клетках колоректального рака [ 19 ] и клетках НМРЛ [ 15 ] или ингибированием ангиогенеза. Ингибиторы ангиогенеза, такие как антитело к VEGF бевацизумаб и блокатор рецепторов VEGF рамуцирумаб, были клинически одобрены для лечения рака легких [ 28 ]. Несмотря на их подтвержденную эффективность, их скромные общие терапевтические эффекты с сопутствующими побочными эффектами подчеркивают очевидную необходимость в более эффективном подходе, нацеленном на ангиогенез [ 28 ]. Наше исследование показало, что DCA (25 мМ) является перспективным антиангиогенным средством, поскольку он способен значительно ингибировать образование и прорастание эндотелиальных клеток in vitro. Кроме того, более низкие концентрации DCA (6,25 и 12,5 мМ) не влияли на образование трубок HUVEC. Эти результаты согласуются с отчетом Шунджанса и его коллег, которые продемонстрировали, что 5 мМ и 10 мМ DCA не повлияли на формирование трубок HUVEC in vitro [ 29 ]. В соответствии с нашими данными, DCA вызвал снижение плотности микрососудов опухоли у обработанных крыс, у которых также было отмечено подавление HIF1α в опухолевых клетках [ 30 ]. С другой стороны, Чжао и его коллеги недавно сообщили, что DCA стимулирует ангиогенез в модели сосудистой деменции у крыс за счет улучшения функции эндотелиальных клеток-предшественников [ 31 ].Примерно у 30–40% пациентов с НМРЛ на момент постановки диагноза наблюдалось метастатическое заболевание. Отдаленные метастазы отрицательно влияют на варианты лечения, ответ и выживаемость [ 32 ] и являются основной причиной смерти от рака легких [ 33 ]. Метастазирование — это многоступенчатый процесс, включающий отсоединение раковых клеток, миграцию, инвазию и колонизацию в отдаленных участках. Поэтому терапевтические агенты и схемы, уменьшающие такой отличительный признак рака, имеют большое значение в терапии рака. Несмотря на продемонстрированную антиангиогенную активность DCA, это исследование не показало влияния DCA на метастазирование клеток LNM35, ксенотрансплантированных бестимусным мышам, получавшим перорально эффективную дозу. В этом исследовании клетки LNM35, ксенотрансплантированные путем подкожной инокуляции бестимусным мышам, вызвали 90% случаев метастазов в подмышечных лимфатических узлах, и DCA не смог снизить частоту и рост этих метастазов в лимфатических узлах. Линия клеток LNM35 была создана в 2000 году как первая линия клеток рака легких человека, имеющая лимфогенные метастатические свойства со 100% частотой после подкожной инъекции в боковой бок голых мышей [ 34 ]. Кроме того, DCA не показал никаких ингибирующих эффектов на миграционные и инвазивные свойства клеток LNM35 и A549 in vitro. Аналогичным образом сообщалось, что монотерапия DCA не была эффективна в снижении метастазов в легких из метастатических клеток рака груди, ксенотрансплантированных голым мышам [ 23 ].Комбинированная терапия является фундаментальным подходом в лечении рака. Сочетание различных противораковых препаратов позволяет воздействовать на различные основные сигнальные пути для усиления терапевтических преимуществ, избегания приобретенной резистентности и снижения тяжести побочных эффектов [ 35 ]. Химиотерапия играет неотъемлемую роль в лечении пациентов с НМРЛ. Обычно используется схема с платиной (цисплатин или карбоплатин) плюс паклитаксел, гемцитабин, доцетаксел, винорелбин, иринотекан или пеметрексед [ 36 ]. Неселективные характеристики химиотерапевтических агентов приводят к скромному увеличению выживаемости при значительной токсичности для пациента [ 37 ]. Это подчеркивает необходимость в более эффективных стратегиях для улучшения результатов лечения пациентов с минимальными побочными эффектами. В настоящем исследовании DCA не удалось усилить противораковый эффект камптотецина и гемцитабина в обеих линиях клеток НМРЛ. Кроме того, DCA не смог значительно усилить противораковые эффекты цисплатина в клеточной линии A549 in vitro, но он усилил цитотоксический эффект цисплатина в клеточной линии LNM35, что отражает роль генетического фона раковых клеток в определении пути гибели клеток, вызванного препаратами. Ким и др. сообщили, что клетки A549 имеют более низкую скорость аэробного гликолиза по сравнению с клетками H460 из-за дифференциальной экспрессии некоторых метаболических ферментов [ 38 ]. Аэробный гликолиз при раке был связан с химиорезистентностью, и ингибирование связанных путей было предложено в качестве механизма преодоления такой резистентности. Например, сверхэкспрессия PDK4 при раке мочевого пузыря высокой степени злокачественности заставляет совместное введение DCA с цисплатином вызывать резкое снижение роста опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [ 39 ]. Аналогичным образом, введение DCA с паклитакселом было описано как успешный подход к преодолению резистентных к паклитакселу клеток НМРЛ из-за сверхэкспрессии PDK2 [ 40 ]. Кроме того, Галгамува и др. заявили, что предварительное лечение DCA значительно ослабило нефротоксичность, вызванную цисплатином у мышей, сохранив противораковые эффекты цисплатина [ 41 ].Открытие таргетной терапии помогло врачам адаптировать варианты лечения для пациентов с НМРЛ. Было разработано много таргетных препаратов, которые стали частью первой линии лечения НМРЛ, например, гефитиниб и эрлотиниб, которые считаются первым поколением EGFR-TKi [ 42 ]. Гефитиниб и эрлотиниб были одобрены более 10 лет назад для лечения пациентов с прогрессирующим мутантным EGFR НМРЛ, не получавших химиотерапию, в качестве первой линии лечения. Они также используются в качестве второй линии терапии после неудачи химиотерапии [43]. Некоторые отчеты показали, что эрлотиниб имеет хорошую эффективность у пациентов с НМРЛ с диким типом EGFR [ 44 ]. Поддерживающая доза может принести пользу этим пациентам после химиотерапии на основе платины, которая считается основной терапией при НМРЛ с диким типом EGFR [ 45 ]. Несмотря на значительные преимущества, у многих пациентов после 10–14 месяцев лечения развилась терапевтическая резистентность из-за вторичной мутации в гене EGFR [ 46 ].В этом исследовании мы стремились изучить способность DCA сенсибилизировать линии клеток NSCLC дикого типа EGFR при сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. DCA значительно усилил ингибирующий эффект гефитиниба и эрлотиниба на жизнеспособность клеток A549 и LNM35. Это исследование также показало аддитивные эффекты на рост колоний LNM35 при сочетании DCA с гефитинибом или эрлотинибом в течение семи дней лечения. Более того, эта комбинация оказала синергическое действие на рост колоний A549 после четырнадцати дней лечения. Кроме того, все эти протоколы комбинирования привели к существенному снижению клеточной плотности отдельных колоний как A549, так и LNM35. В этом контексте сообщалось, что DCA с гефитинибом или эрлотинибом синергически подавляет жизнеспособность и способность к образованию колоний мутантных клеток EGFR (NCI-H1975 и NCI-H1650) из-за синергического эффекта в продвижении апоптоза. В клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460) они показали, по сравнению с индивидуальными обработками, что комбинация вызывала повышенное значение фракции, затронутой (Fa), в жизнеспособности клеток, не достигая уровня синергизма в клетках дикого типа EGFR (A549 и NCI-H460), и эта комбинация не подавляла значительно образование колоний этих линий клеток [ 47 ]. Различия в экспериментальных условиях между вышеупомянутым отчетом и нашим исследованием могут объяснить такие переменные результаты. В своем клоногенном анализе исследователи обрабатывали отдельные клетки в течение трех последовательных дней, а затем инкубировали в среде без лекарственных средств в течение 15 дней для формирования колоний; Однако в наших экспериментах клетки сначала инкубировали в течение десяти дней для формирования колоний, а затем подвергали обработке в течение семи и четырнадцати дней.Подводя итог, можно сказать, что это исследование продемонстрировало, что DCA является перспективным противораковым средством для лечения НМРЛ, подавляя жизнеспособность клеток и рост колоний клеток НМРЛ in vitro, а также рост опухолей у эмбрионов цыплят CAM и голых мышей, в которых также оценивалась безопасность этого средства. DCA подавляет способность эндотелиальных клеток образовывать капилляроподобные структуры и прорастать in vitro, что позволяет предположить ингибирование ангиогенеза как потенциальный механизм противоракового эффекта. Это исследование также выявило потенциальную ценность DCA в сочетании с гефитинибом или эрлотинибом in vitro. Результаты этого исследования прокладывают путь для подтверждения влияния комбинации DCA с гефитинибом или эрлотинибом на рост опухоли in vivo, в дополнение к исследованию влияния DCA в сочетании с EGFR-TKi второго и третьего поколения.

4. Материалы и методы

4.1. Культура клеток и реагенты

Клетки NSCLC, A549 и LNM35, поддерживались в среде RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 . Среда была дополнена 1% раствора пенициллина-стрептомицина (Hyclone, Cramlington, UK) и 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Cramlington, UK). Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) поддерживались в полном наборе сред EndoGRO TM -VEGF (Merck Millipore, Massachusetts, USA) в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в колбах, покрытых 0,2% желатином. Культуральную среду всех клеток меняли каждые 3 дня, а клетки пересевали один раз в неделю, когда культура достигала 95% конфлюэнтности для раковых клеток и 80% для HUVEC.Натрий DCA, цисплатин, камптотецин, гемцитабин HCl, эрлотиниб HCl и гефитиниб были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). DCA был свежерастворен в воде HyPure (Hyclone, Крамлингтон, Великобритания) перед началом любого эксперимента для приготовления исходного раствора 1 М, который затем был разбавлен до требуемых концентраций для лечения.

4.2 Жизнеспособность клеток

Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночный планшет. Через 24 часа клетки обрабатывали возрастающей концентрацией DCA (3,125–100 мМ) в двух повторностях в течение 24, 48 и 72 часов, тогда как контрольные клетки обрабатывали лекарственным средством (вода Hypure), смешанным со средой. В указанные временные точки использовали анализ жизнеспособности люминесцентных клеток CellTiter-Glo ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США) для определения влияния DCA на жизнеспособность клеток путем количественной оценки АТФ, которая будет пропорциональна количеству метаболически активных клеток. Люминесцентный сигнал измеряли с помощью люминометра GloMax ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность клеток была представлена ​​в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности клеток, обработанных DCA, с контрольными клетками, жизнеспособность которых предполагалась равной 100%.Во втором наборе экспериментов клетки обрабатывали в течение 48 ч возрастающей концентрацией гефитиниба и эрлотиниба (5–80 мкМ). Кроме того, клетки обрабатывали в течение 48 ч комбинацией DCA и других противораковых агентов, а именно цисплатина, камптотецина, гемцитабина, гефитиниба и эрлотиниба. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа люминесцентной жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® и люминометра GloMax ® (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США). Жизнеспособность представляли в процентах (%) путем сравнения жизнеспособности обработанных лекарством клеток с контрольными клетками.

4.3 Клоногенный анализ

В 6-луночный планшет высевали клетки A549 и LNM35, соответственно, по 50 и 100 клеток на лунку. Клетки выдерживали для роста в колонии в течение 7–10 дней во влажной атмосфере при 37 °C и 5% CO2 , при этом среду меняли каждые три дня. Образованные колонии обрабатывали каждые 3 дня в течение 7 дней возрастающими концентрациями DCA (6,25–50 мМ). После этого колонии промывали три раза 1× PBS, фиксировали и окрашивали в течение 2 часов 0,5% кристаллическим фиолетовым, растворенным в 50% метаноле ( об. / об. ). Наконец, колонии промывали 1× PBS и фотографировали, и подсчитывали колонии с более чем 50 клетками. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных DCA, с контрольными колониями. Плотность клеток колоний оценивали путем фотографирования колоний в каждой группе с использованием инвертированного фазово-контрастного микроскопа (4×).Во втором наборе экспериментов сформированные колонии обрабатывались каждые 3 дня в течение 7 или 14 дней комбинацией DCA и гефитиниба или DCA и эрлотиниба. Данные представлены в виде процента колоний (%) путем сравнения колоний, обработанных препаратом, с контрольными колониями.

4.4 Анализ роста опухоли in ovo

Оплодотворенные яйца леггорнов инкубировались в инкубаторе для яиц, установленном на температуру 37,5 °C и влажность 50% в течение первых 3 дней после оплодотворения. На 3-й день эмбрионального развития (E3) САМ удалялся путем просверливания небольшого отверстия в яичной скорлупе напротив круглого, широкого конца с последующей аспирацией ~1,5–2 мл альбумина с помощью шприца объемом 5 мл с иглой 18G. Затем в яичной скорлупе над САМ вырезалось небольшое окно с помощью тонких ножниц и заклеивалось полупроницаемой клейкой пленкой (Suprasorb ® F). Яйца снова содержались в инкубаторе до 9-го дня эмбрионального развития (E9), на котором раковые клетки были трипсинизированы, центрифугированы и суспендированы в 80% матрице Matrigel ® (Corning, Bedford, UK) для получения 1 × 10 6 клеток/100 мкл для A549 и 0,3 × 10 6 клеток/100 мкл для LNM35. 100 мкл инокулята добавляли на САМ каждого яйца, в общей сложности 10–13 яиц на состояние. На 11-й день эмбрионального развития (E11) образовавшиеся опухоли обрабатывали местно, капая 100 мкл DCA, приготовленного на 0,9% NaCl для первой группы или лекарственного носителя для контрольной группы. Лечение повторяли на E13 и E15. Все описанные шаги выполняли в асептических условиях. Наконец, на 17-й день эмбрионального развития (E17) эмбрионы были гуманно умерщвлены путем нанесения 10–30 мкл пентобарбитона натрия (300 мг/мл, Jurox, Окленд, Новая Зеландия). Опухоли были осторожно извлечены из нормальных верхних тканей CAM, промыты 1× PBS и взвешены для определения влияния DCA на рост опухоли. Данные представлены в виде сравнений среднего веса опухолей в контрольной группе и группе, обработанной DCA. Токсичность препарата оценивалась путем сравнения процента живых эмбрионов в контрольной и обработанной DCA группах в конце эксперимента. Живые эмбрионы определялись путем проверки произвольных движений эмбрионов в дополнение к целостности и пульсации кровеносных сосудов.Этот анализ представляет собой рандомизированный открытый анализ, который был проведен в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных в Университете Объединенных Арабских Эмиратов. Согласно Европейской директиве 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях, эксперименты с использованием куриных эмбрионов на E18 и до нее не требуют одобрения со стороны Комитета по уходу и использованию институциональных животных (IACUC).

4.5 Анализ роста опухоли и метастазирования

Эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколом, одобренным комитетом по этике животных университета ОАЭ в марте 2019 года (код протокола ERA_2019_5872). Шести-восьминедельные бестимусные самцы мышей NMRI nude (nu/nu, Charles River, Германия) содержались в ламинарных шкафах с фильтрованным воздухом и обрабатывались в асептических условиях. Клетки A549 (5 × 10 6 клеток/200 мкл PBS) и клетки LNM35 (0,4 × 10 6 клеток/200 мкл PBS) вводились подкожно в боковой бок мышей nude. Через десять дней, когда опухоли достигли объема приблизительно 50 мм 3 , животные с ксенотрансплантатами A549 были случайным образом разделены на три группы по 9–10 мышей в каждой. Эти группы лечились перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 50 мг/кг или 200 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 38 дней. С другой стороны, животные с ксенотрансплантатами LNM35 лечились перорально каждый день (5 дней в неделю) DCA 200 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 10 дней и DCA 500 мг/кг или лекарственным растворителем в течение 24 дней. Размеры опухолей и вес животных проверялись каждые три или четыре дня. Кроме того, физические признаки и поведение проверялись каждый день. Объем опухоли рассчитывался по формуле V = L × W 2 × 0,5, где L представляет собой длину, а W - ширину опухоли. В конце экспериментов животных анестезировали и умерщвляли путем смещения шейных позвонков, а опухоли удаляли и взвешивали. Влияние DCA на рост опухоли было представлено путем сравнения среднего веса опухоли в конце эксперимента между контрольной группой и группой, получавшей DCA. Его также оценивали путем сравнения объема опухоли между контрольной и обработанной DCA группами на протяжении всего эксперимента. Образцы крови собирали у каждой мыши и анализировали с помощью SCIL VET ABC™ Animal Blood Counter для полного анализа крови. Кроме того, плазму крови отделяли центрифугированием для биохимического анализа. Для изучения влияния DCA на метастазирование подмышечные лимфатические узлы вырезали и взвешивали у животных с ксенотрансплантатами LNM35 в конце эксперимента.

4.6 Анализ формирования сосудистой трубки

Matrigel ® Matrix (Corning, Bedford, UK) размораживали и добавляли 40–50 мкл в лунки 96-луночного планшета для покрытия. Для того чтобы Matrigel затвердел, планшет держали во влажном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч. HUVEC трипсинизировали и высевали на покрытый планшет с плотностью 2,5 × 104 клеток /100 мкл/лунку в присутствии и в отсутствие различных концентраций DCA. Через 8 ч инкубации сети трубок в разных лунках фотографировали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Влияние DCA на способность HUVEC образовывать капилляроподобные структуры оценивали путем измерения общей длины сформированных трубок в контрольных и обработанных DCA лунках. Общая длина трубок измерялась вручную и с помощью программного обеспечения для онлайн-анализа изображений, разработанного Wimasis ( https://www.wimasis.com/en/products/13/WimTube - дата доступа 1 марта 2019 г.). Влияние различных концентраций DCA на жизнеспособность HUVEC определялось с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), как ранее описано в разделе о жизнеспособности клеток.

4.7. Анализ прорастания сфероидов HUVEC

Сфероиды HUVEC были приготовлены путем первого окрашивания клеток путем инкубации 190 000 клеток с 2 мкМ раствором красителя CellTracker TM Green CMFDA (Invitrogen Molecular probes, Paisley, UK) в течение 30 мин в увлажненном инкубаторе, установленном на 37 °C и 5% CO2 , с последующим центрифугированием в течение 5 мин и удалением супернатанта. Осадок HUVEC был суспендирован в дополненной среде HUVEC (5 мл), смешанной с раствором метоцела (1,25 мл), который должен быть приготовлен ранее [ 48 ]. Затем 25 мкл клеточной суспензии пипеткой наносили на крышку чашки Петри. Примерно 50 капель пипеткой наносили в каждую чашку Петри. Наконец, капли держали перевернутыми в течение 24 ч в увлажненном инкубаторе, установленном на 37 °C и 5% CO2 .Образованные сфероиды в каждой чашке (~50 сфероидов) собирали отдельно с 1× PBS и центрифугировали при 150× g в течение 5 мин. Тем временем рабочий раствор коллагена I готовили на льду путем осторожного смешивания исходного коллагена I из хвоста крысы (1500 мкл) (Millipore, MA, США) с 10× средой 199 (150 мкл) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, США) и ледяным стерильным 1N NaOH (34 мкл), который приобрел красный цвет. Каждый сфероидный осадок покрывали слоем раствора метоцела, содержащего 4% FBS (0,25 мл), рабочего раствора коллагена I (0,25 мл) и 60 мкл базальной среды или VEGF 30 нг/мл или DCA 25 мМ или их комбинации. Сразу после осторожного перемешивания смесь добавляли в предварительно нагретый 24-луночный планшет и инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов, что позволяло полимеризовать коллаген и прорасти сфероидам. Через 24 часа сфероиды были захвачены с помощью инвертированного микроскопа с 20-кратным увеличением. Длина проростков в 12 сфероидах в каждом состоянии была измерена с помощью ImageJ.

4.8. Анализ подвижности при заживлении ран

Клетки A549 и LNM35 высевали с плотностью 1 × 10 6 клеток/лунку в 6-луночный планшет. Через 24 часа с помощью наконечника объемом 200 мкл делали царапину через сливающийся монослой. После этого клетки дважды промывали 1× PBS с последующим добавлением свежей среды с лекарственным носителем или DCA. В верхней части планшета отмечали два места для мониторинга уменьшения размера раны с течением времени с использованием инвертированного микроскопа при объективе 4× (Olympus 1X71, Токио, Япония). Планшеты инкубировали во влажной атмосфере при 37 °C и 5% CO 2 , а ширину раны измеряли через 0, 2, 6 и 24 часа после инкубации. Расстояние миграции выражали как среднее значение разницы между измерениями в нулевой момент времени и в периоды времени 2, 6 и 24 часа.

4.9. Анализ камеры вторжения Матригеля

Следуя протоколу производителя (Corning, Bedford, MA, USA), в нижние камеры добавляли 0,5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS. После этого раковые клетки высевали с плотностью 1 × 10 5 клеток/0,5 мл в верхние камеры в среде без FBS в присутствии и отсутствии DCA. Планшет держали в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO 2 в течение 24 часов. Инвазивные клетки разрушают Матригель и проходят через 8 мкм поры вставки. Непроникающие клетки верхних камер удаляли, осторожно протирая область ватным тампоном. Затем полупроницаемую мембрану удаляли с помощью очень тонких ножниц. Инвазивные клетки были обнаружены с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США), ранее описанного в разделе жизнеспособности клеток. Влияние DCA на клеточную инвазию было представлено в процентах (%) путем сравнения инвазирующих клеток в присутствии DCA с контролем.

4.10 Статистический анализ

За исключением анализа in ovo и экспериментов на голых мышах, каждый эксперимент проводился не менее трех раз. Данные выражены как среднее значение ± SEM Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 8.3.1 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Для оценки разницы между двумя группами использовался непарный t -тест. Для сравнения 3 или более групп с контрольной группой использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Даннетта. Кроме того, для комбинированных экспериментов использовался однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Тьюки. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 и **** p < 0,0001 указывают на значимые различия.

Вклады авторов

Концептуализация, SA; методология, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; валидация, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; формальный анализ, SA и AA-A.; расследование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; курирование данных, SA; написание — подготовка первоначального черновика, SA и AA-A.; написание — рецензирование и редактирование, SA, AA-A., SS, KA, JY и AN; визуализация, SA, AA-A. и AN; руководство, SA; администрирование проекта, SA; получение финансирования, SA Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование

Это исследование частично финансировалось за счет гранта Центра медицинских наук имени Зайеда при Университете Объединенных Арабских Эмиратов, № 31R136.