Тэг: Рак

DCA усиливает противоопухолевое действие капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 мыши и ксенотрансплантате немелкоклеточного рака легкого A549 человека

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1007/s00280-013-2281-z

Кафедрабиохимии, факультет наук о жизни, Фуданьский университет, Хандан Роуд 220, Шанхай, 200433, Китай.
Электронная почта: e-mail: whuang@fudan.edu.cn


Получено: 16 мая 2013 г.
Принято: 27 августа 2013 г.
Опубликовано: 17 сентября 2013 г

Аннотация

Цель: Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью. Недавно дихлорацетат натрия (ДХА) показал большой потенциал в качестве противоракового агента. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином при раке со скромной экспрессией TP.

Методы: Для оценки эффекта комбинированного лечения DCA и капецитабином использовали аллотрансплантат меланомы мыши B16 и ксенотрансплантат немелкоклеточного рака легкого человека A549. Гистология и иммуногистохимия использовались для выявления апоптоза и пролиферации раковых клеток. ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот проводились для определения экспрессии TP и каспаз, соответственно.

Результаты: Впервые мы сообщаем, что DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в мышином аллотрансплантате B16 и человеческом ксенотрансплантате A549, способствуя апоптозу опухолевых клеток. DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP.

Выводы: Наши результаты свидетельствуют о том, что DCA в комбинации с капецитабином может стать потенциально новым терапевтическим режимом против некоторых видов рака.

Ключевые слова: DCA, капецитабин, комбинация, противоопухолевый эффект

ВВЕДЕНИЕ

Дихлорацетат натрия (ДХА) — это маленькая молекулярная соль дихлоруксусной кислоты с молекулярной массой 150 Да. DCA ингибирует активность киназы пируватдегидрогеназы, тем самым активируя митохондриальный ферментный комплекс пируватдегидрогеназы [1] и переводя гликолитический путь метаболизма на окислительное фосфорилирование. В течение последних 40 лет DCA использовался в качестве сиротского препарата для лечения врожденного молочнокислого ацидоза у детей и молочнокислого ацидоза, осложненного другими заболеваниями [2], и показал высокую эффективность и низкую токсичность как в доклинических, так и в клинических испытаниях [3]. Недавно DCA продемонстрировал большой потенциал в качестве противоракового средства из-за сходства метаболического ремоделирования некоторых опухолевых клеток с процессами, происходящими при молочнокислом ацидозе [4]. Раковые клетки, особенно раковые стволовые клетки (РСК), сопротивляются апоптозу, производя энергию путем гликолиза и молочнокислого брожения, а не окислительного фосфорилирования, из-за гипоксической природы опухолевой микросреды — явления, известного как эффект Варбурга [5,6]. Было показано, что после перорального приема DCA восстанавливает функцию митохондрий и избирательно способствует апоптозу опухолевых клеток по митохондриально-зависимому пути [7,8]. Терапевтическая активность DCA против глиобластомы была проверена в клинических испытаниях (NCT00540176) и показала некоторые положительные результаты [9]. Однако исследование II фазы NCT01029925 по определению частоты ответа на пероральный прием дихлорацетата у пациентов с рецидивирующим и/или метастатическим и предварительно леченным раком молочной железы и немелкоклеточным раком легкого было прекращено из-за более высокого, чем ожидалось, риска и проблем с безопасностью. Таким образом, клиническая польза DCA для борьбы с раком нуждается в более тщательной оценке.

Как сенсибилизатор апоптоза, DCA также использовался в комбинации с другими методами лечения рака. Cao и другие [10] сообщили, что DCA сенсибилизировал клетки рака простаты к радиации in vitro. Сяо и др. [11] установили, что DCA усиливает гибель опухолевых клеток в сочетании с онколитическим аденовирусом, экспрессирующим опухолевый супрессор MDA-7/IL-24. Недавно метаболическая таргетная терапия с использованием DCA была продемонстрирована как новая стратегия лечения для улучшения результатов фотодинамической терапии [12]. Тонг и др. [13] обнаружили, что DCA и 5-фторурацил проявляют синергетический противоопухолевый эффект в клетках колоректального рака in vitro. Однако до сих пор существуют противоречивые результаты и сомнения относительно применения DCA отдельно или в комбинации с другими препаратами. Шахрзад и др. [14] показали, что DCA снижает апоптоз раковых клеток в гипоксических условиях как in vitro, так и in vivo. Хеше и др. [15] предупредили, что DCA снижает цитотоксичность некоторых стандартных противораковых препаратов, таких как цисплатин и доксорубицин, но не влияет на активность темозоломида в 7 из 10 клеточных линий в их исследовании. Эти противоречивые результаты означают, что применение DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения может зависеть от типа рака и конкретного агента.

Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью и лицензирован в качестве первой линии лечения метастатического рака прямой кишки или альтернативного лечения метастатического рака молочной железы в сочетании с доцетакселом [16,17]. Капецитабин является пролекарством 5-фторурацила (5-ФУ) и требует 3 ферментативных реакций для окончательного превращения в 5-ФУ в опухолевых клетках. Последняя реакция катализируется тимидинфосфорилазой (TP), которая в некоторых опухолях выражена в большей степени, чем в нормальных тканях [18]. Поэтому цитотоксический 5-ФУ образуется в большей степени в опухолевых клетках, чем в тканях вне опухоли, что делает капецитабин малотоксичным химиотерапевтическим препаратом [18]. Уровни экспрессии TP различны в разных типах опухолей [18]; это ограничивает применение капецитабина только несколькими типами рака. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином для раковых опухолей со скромной экспрессией TP. Мы предположили, что DCA усиливает противораковый эффект и снижает эффективную дозу капецитабина. Комбинация DCA с капецитабином может дать хорошую схему лечения, поскольку оба агента можно принимать перорально при хорошей приверженности пациентов. Кроме того, генерические формы DCA могут снизить эффективную дозу капецитабина, тем самым уменьшая побочные эффекты и стоимость лечения рака.

Материалы и методы

Материалы
Дихлорацетат натрия (ДХА, CSA:2156-56-1), чистота 99 %, был получен от компании Shanghai Jieshi Chemical Co. (Китай). 5-фторурацил (5-FU) и 5′-дезокси-фторуридин (5DFUR) были получены от Sigma-Aldrich (США). МТТ был получен от Shanghai Biological Engineering Co. (Китай). Таблетки капецитабина (Xeloda) были получены от Roche (США). Мышиная меланома B16 и человеческая немелкоклеточная линия клеток рака легкого A549 были получены из Американской коллекции клеточных культур (ATCC, США).

Исследования на животных моделях

Модель аллотрансплантата

Мыши C57BL/6, самки, возраст 6-8 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Один миллион одиночных клеток B16 был подкожно (s.c.) инокулирован в правый фланг мышей C57BL/6. Мышей разбили на случайные группы, по 6 мышей на группу в клетке. Было две группы мышей. DCA и капецитабин вводили этим двум группам мышей через 3 и 10 дней после инокуляции, соответственно. DCA добавляли в стерильную питьевую воду до конечной концентрации 1,4 г/л. Измерение объема потребленной воды показало, что количество ДКА, введенного каждой мыши, было приблизительно равно 100 мг/кг/день. Таблетки капецитабина измельчали и суспендировали в стерильной воде с 4 % карбоксиметилцеллюлозы для получения различных концентраций. Двести микролитров суспензии капецитабина вводили внутрижелудочно каждой мыши. Каждые 2 дня длинный (a) и короткий (b) диаметры опухолей измеряли с помощью штангенциркуля, а также регистрировали массу тела. Объем опухоли рассчитывали по формуле V = 0,5ab2. Через 22 дня после инокуляции мышей умертвили, опухоли удалили и взвесили.

Модель ксенотрансплантата

Мыши BALB/c-nu, самцы, возраст 5-6 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Приблизительно 2 × 2 мм срезы только что измельченных опухолевых тканей A549, полученных от мышей BALB/c-nu, ранее инокулированных клетками A549, были введены внутривенно в область правого фланга самцов мышей BALB/c-nu. DCA и капецитабин вводили мышам, когда объем опухоли достигал ~0,2 см3. Через тридцать-тридцать пять дней после лечения мышей умерщвляли, опухоли удаляли и взвешивали. Другие методы были такими же, как описанные в эксперименте с аллотрансплантацией.

Исследования на животных были одобрены группой по благополучию животных и этике факультета лабораторных животных Фуданьского университета.

Гистология и иммуногистохимия
Гистологическое исследование опухолевых узлов проводили с использованием дополнительных животных (по 3 мыши в каждой группе), которые не рассматривались для мониторинга роста опухоли. Ткани фиксировали в 4 % (w/v) параформальдегиде, после фиксации в течение ночи при комнатной температуре образцы обезвоживали в градуированном этаноле и встраивали в парафин. После этого различные части опухоли произвольно вырезали для получения 4-мкм срезов на микротоме Leica. После депарафинизации и регидратации три среза из разных частей каждого образца были отобраны для последующих операций. Терминальное дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованное никелирование концевого участка ДУТФ (TUNEL) и окрашивание 4′6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) проводили в соответствии с инструкциями производителей наборов TUNEL и DAPI (Beyotime, Китай). Срезы анализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Olympus, Япония). Выявление ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) проводили после депарафинизации срезов и инкубации при 96-100 °C в течение 20 мин. Активность эндогенной пероксидазы гасили 0,3 % (v/v) перекисью водорода в 60 % (v/v) метаноле в течение 30 мин. Неспецифическую адсорбцию минимизировали путем инкубации срезов в 2 % (v/v) нормальной козьей сыворотке в PBS в течение 20 мин. Участки тканей инкубировали в течение ночи с кроличьим поликлональным антителом анти-PCNA (Abcam; 1:100 в PBS), промывали PBS 3 раза, по 30 мин каждый раз, и инкубировали с биотин-конъюгированным козьим антирабическим IgG в течение 2 ч при 37 °C и авидин-биотин-пероксидазным комплексом в течение 1 ч при 37 °C. Срезы контрастировали гематоксилином (Sigma-Aldrich) и анализировали с помощью световой микроскопии (Olympus, Япония). Для анализа иммуногистохимии использовали по три опухоли на группу. Один или два среза на опухоль были слепо отобраны для измерения PCNA- или TUNEL-позитивных клеток. Пять случайных полей на слайде при увеличении 400× измеряли вслепую (n = 250 клеток на группу). При проведении количественного анализа TUNEL-позитивных клеток, возможные некротические клетки исключались путем наблюдения за ядерной морфологией с помощью окрашивания DAPI. Для обеспечения точности результатов проводили как положительный, так и отрицательный контроль.

Выделение белка и вестерн-блоттинг
Опухолевые ткани из каждой группы (3 дополнительные мыши в каждой группе) были объединены вместе и измельчены под жидким азотом, а затем лизированы в 150

мкл

буфера для лизиса тканей (Beyotime, Китай). Пробирки энергично встряхивали в течение 1 мин, помещали на лед на 20 мин и центрифугировали при 5 000g в течение 5 мин при 4 °C. Концентрацию общего белка определяли с помощью набора для определения белка BCA (BioRad). Тридцать микрограммов общего белка из каждого образца разделяли методом SDS-PAGE на 10 % геле, переносили на PVDF мембрану, блокировали, инкубировали в течение ночи с первичным антителом, инкубировали в течение 1 ч с вторичным антителом и окрашивали хромогенным субстратом NBT/BCIP. Мышиное моноклональное антитело против антикаспазы 3 (1:500), антитело против антикаспазы 9 (1:1 000), анти-β-актин (1:2 000) и кроличье поликлональное антитело против антикаспазы 8 (1:1 000) были получены от Beyotime (Нанкин, Китай). Мышиное моноклональное антитело анти-ТФ (1:2,000) было получено от Abcam (Великобритания). в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Плотность полос вестерн-блота анализировали с помощью программы Clinx Gel Analysis V2.02 (Clinx Science, Китай).

ПЦР в реальном времени
Опухоли B16 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши C57BL/6, ранее инокулированной клетками B16 (использовали 3 мышей, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Colo205/A549 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши BALB/c-nu, ранее инокулированной клетками Colo205/A549 (3 мыши были использованы, соответственно, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Для анализа экспрессии TP после лечения образцы опухолей объединяли из 3 опухолевых тканей одинакового веса в каждой группе. Тотальную РНК выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США) и подвергали обратной транскрипции с помощью набора реагентов PrimeScript® RT (Takara, Япония). кДНК нормировали на β-актин. ПЦР в реальном времени проводили трехэтапным методом с использованием набора SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takata, Япония) с температурой отжига 55 °C и 40 циклами амплификации. Отдельный тест проводили в трех экземплярах. в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Относительное количество каждой кДНК анализировали с помощью2-△△Ct. Праймеры для ПЦР в реальном времени: β-актин F: 5′-TCAAGATCATTGCTC CTCCTG-3′ и β-актин R: 5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′, hTP F: 5′-TGGCTCAGTCGGGACAGCAG-3′ и hTP R: 5′-TCCGCTGATCATTG GCACCT-3′, mTP F: 5′-GCCTAGCTAAAGCATTGTGCTC-3′ и mTP R: 5′-AAGGGTGCT CGATCTGATAGCA-3′.

Статистика
Мы использовали множественные сравнения ANOVA с post hoc анализом (тест Тьюки), используя программное обеспечение SPSS 16.0 (SPSS Inc., США). Данные представлены как среднее ± SEM, значимым считалось P < 0,05.

Результаты

Экспрессия TP в меланоме мыши B16 и опухолях человека A549 NSCLC
Экспрессия TP в опухолях B16 и A549, удаленных у мышей, была проанализирована методом ПЦР в реальном времени. Печень человека экспрессирует относительно больше TP, чем другие нормальные ткани [18]. В типичных типах рака, подходящих для лечения капецитабином, экспрессия TP в опухоли близка или выше, чем в печени, например, в колоректальном раке и раке молочной железы [18,19]. В ксенотрансплантатах рака человека раковые опухоли с высокой активностью TP были более восприимчивы к лечению капецитабином, чем раковые опухоли с низкой активностью TP [20]. Клеточная линия колоректального рака Colo205 была выбрана в качестве эталона на основании ее умеренной экспрессии TP и умеренной чувствительности к капецитабину [21]. Как показано на рис. 1a, уровень транскрипции TP в Colo205 был немного выше, чем в печени мыши BALB/c-nu. Как показано на рис. 1б, в, уровни транскрипции TP в опухолях B16 и A549 были близки к таковым в печени мышей. Таким образом, B16 и A549 также являются умеренно экспрессирующими TP клеточными линиями. Мы можем сделать вывод, что B16 и A549 будут в определенной степени реагировать на лечение капецитабином, не перекрывая эффект DCA. Таким образом, модели аллотрансплантата B16 и ксенотрансплантата A549 были пригодны для изучения противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина в комбинации.

Рисунок 1. По сравнению с печенью мыши, опухоли B16 и A549 скромно экспрессируют TP ПЦР в реальном времени Анализ уровня транскрипции TP. Использовались праймеры, специфически нацеленные на ТП мыши и человека. Праймер на β-актин подходит как для мышей, так и для человека. a Уровень транскрипции TP в опухоли Colo205 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. b Уровень транскрипции TP в опухоли A549 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. c Уровень транскрипции TP в опухоли B16 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей C57BL/6. В каждой группе использовались образцы от 3 мышей

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате мышиной меланомы B16 без дополнительной токсичности
Поскольку гипоксическая природа опухолевой микросреды является критической для оптимальной активности DCA, противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин был протестирован на животных моделях вместо клеточных линий. Тридцать шесть мышей C57BL/6 были инокулированы 1 ×106 клетками меланомы B16 и случайным образом разделены на 6 групп (n = 6): контрольная группа, не получавшая лекарств, группа, получавшая только DCA, группа, получавшая только капецитабин 10 мг/день, и три группы, получавшие DCA плюс капецитабин 5, 10 или 20 мг/день. Через три дня после инокуляции опухолевых клеток мышам вводили DCA в питьевой воде и перорально (p.o.) капецитабин в качестве отдельных агентов или в комбинации с возрастающими концентрациями капецитабина. Как показано на верхней панели рис. 2a, как DCA, так и капецитабин в дозе 10 мг/день в одиночку незначительно подавляли рост опухолей меланомы B16 по сравнению с контрольной группой. Напротив, DCA плюс 10 мг/день капецитабина значительно усиливали ингибирование роста опухоли (P < 0,05). Противоопухолевый эффект DCA плюс 20 мг/день капецитабина был аналогичен тому, который наблюдался при использовании DCA плюс 10 мг/день капецитабина; рост опухоли был почти полностью подавлен. Примечательно, что у мышей, получавших DCA плюс 20 мг/день капецитабина, наблюдалось резкое снижение массы тела (рис. 2а, нижняя панель), в то время как DCA плюс 10 мг/день капецитабина практически не влиял на массу тела по сравнению с контролем.

Рисунок 2. DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 у мышей без дополнительной токсичности. a Через три дня после инокуляции мышам вводили DCA и капецитабин (CAP) по отдельности или в комбинации. Вводили эскалированные дозы [5, 10 и 20 мг/день (мг/день)] капецитабина в комбинации с постоянной дозой DCA. Показаны кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель). b Через 10 дней после прививки мышам вводили DCA и 7,5 мг/день капецитабина отдельно или в комбинации. Представлены кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель)

Для оценки противоопухолевого эффекта DCA плюс капецитабин против пальпируемых, обнаруживаемых опухолей, через 10 дней после инокуляции опухолевых клеток, DCA и капецитабин отдельно или в комбинации вводили второй группе из 36 мышей C57BL/6, инокулированных 1 ×106 клетками меланомы B16. Мыши с пальпируемыми опухолями были случайным образом разделены на 4 группы (n = 9, 3 мыши использовались для анализа иммуногистохимии): контроль, только DCA, только капецитабин в дозе 7,5 мг/день и DCA плюс капецитабин в дозе 7,5 мг/день. Как показано на верхней панели рис. 2б, DCA плюс капецитабин 7,5 мг/день значительно подавляли рост опухоли по сравнению с DCA или капецитабином (P < 0,05). Через 22 дня после инокуляции DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина подавляли рост опухоли на 75 % (P < 0,05), в то время как только DCA и капецитабин подавляли рост только на 25 % и 35 %, соответственно (P < 0,05). DCA не вызывал резкой потери массы тела по сравнению с лечением только капецитабином (рис. 2b, нижняя панель). Эти результаты показывают, что DCA и капецитабин могут оказывать синергетический противоопухолевый эффект в опухолях меланомы B16.

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели НСКЛ человека A549 без дополнительной токсичности
Ранее сообщалось, что НСКЛ человека можно лечить либо DCA [7], либо капецитабином [22-24]. В настоящем исследовании мы изучили противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин в модели ксенотрансплантата НСКЛ A549 человека. Шестьдесят шесть самцов мышей BALB/c-nu с опухолями человека NSCLC A549 (~2 × 2 мм), привитыми внутривенно в правый фланг, были случайным образом разделены на 9 групп: контроль; только DCA; 2,5, 5, 7,5 или 10 мг/день только капецитабина; или DCA плюс 2,5, 5 или 7.5 мг/день капецитабина (n = 6, кроме контроля, только DCA, 7,5 мг/день капецитабина и DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина; в этих группах n = 9, 3 мыши были использованы для иммуногистохимического анализа и анализа Вестерн-блот или ПЦР в реальном времени). Капецитабин в дозе 10 мг/день был установлен в качестве контроля высокой дозы. Когда объем опухоли достигал 0,15-0,2 см3, мышам вводили препараты. Капецитабин вводили внутривенно по схеме 14 дней в день/7 дней в день. Как показано на левой панели рис. 3a, b и c, только DCA оказывал незначительное ингибирующее действие на опухоли A549; этот результат не согласуется с данными предыдущих отчетов [7], в которых только DCA проявлял больший противоопухолевый эффект. Только капецитабин в дозе 10 мг/день значительно подавлял рост опухолей A549, но при этом отмечалось резкое снижение массы тела, что указывает на сильную токсичность (рис. 3a, b, c, правые панели). Как показано на левой панели рис. 3а, 2,5 мг/день только капецитабина значительно уменьшали рост опухолей A549; комбинация DCA плюс 2,5 мг/день капецитабина усиливала ингибирование роста. Кривая увеличения объема опухоли при лечении только DCA предполагает, что капецитабин оказывает доминирующее противоопухолевое действие при комбинированном лечении. Эффект DCA плюс 5 мг/сут капецитабина был немного лучше, чем DCA плюс 2,5 мг/сут капецитабина, хотя и хуже, чем 10 мг/сут капецитабина, и не наблюдалось значительного снижения массы тела (рис. 3б, правая панель). Примечательно, что DCA плюс 5 мг/сут капецитабина значительно усилили ингибирование роста опухоли по сравнению с 5 мг/сут только капецитабина (рис. 3б, левая панель). Противоопухолевый эффект комбинации был близок к лечению капецитабином 10 мг/день, но без значительной потери массы тела (рис. 3б, правая панель). Эффект только капецитабина 7,5 мг/сут (рис. 3c) был немного лучше, чем капецитабина 5 мг/сут; однако при сочетании с ДКА не было значительной разницы между ДКА плюс капецитабин 7,5 мг/сут и ДКА плюс капецитабин 5 мг/сут. Эти результаты означают, что DCA может снизить дозу капецитабина без потери противоопухолевого эффекта или увеличения токсичности.

Рисунок 3. DCA увеличивает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели NSCLC A549 человека без дополнительной токсичности. a DCA плюс 2,5 мг/день (мг/день) капецитабина. b DCA плюс 5 мг/день капецитабина. c DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. Группа лечения капецитабином 10 мг/день использовалась в качестве контроля больших доз. Показаны кривые роста опухоли(левые панели) и кривые массы тела(правые панели). Объем опухоли представлен на логарифмической оси

DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина на клетки B16 и A549 in vivo
Гистологическое исследование опухолей меланомы B16 проводилось через 7 дней после начала лечения. Окрашивание TUNEL показало, что лечение опухолей меланомы B16 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало клеточный апоптоз на 8 и 17 %, соответственно. В комбинации DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина индуцировали апоптоз примерно на 30 %, что больше, чем сумма отдельных препаратов вместе взятых (рис. 4a, c, левая панель). Окрашивание PCNA в опухолях меланомы B16 показало, что только DCA оказывал незначительное влияние на пролиферацию, в то время как капецитабин 7,5 мг/день значительно снижал пролиферацию. DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина не усиливали ингибирование пролиферации только капецитабином в опухолевых клетках B16 (рис. 4b, c, правая панель).

Рисунок 4. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях меланомы B16. a Иммунофлуоресцентное окрашивание TUNEL образцов опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Иммуногистохимический анализ антигена пролиферации PCNA в образцах опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. c Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток(слева) и PCNA-позитивных клеток(справа). *P < 0.05

Подобно опухолям меланомы B16, лечение опухолей NSCLC A549 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало апоптоз на 15 и 30 %, соответственно. При совместном применении DCA плюс 7,5 мг/сут капецитабина индуцировали апоптоз на 50 %, что больше, чем сумма лечения одним агентом вместе взятым (рис. 5a, b). Эти результаты позволяют предположить, что DCA и капецитабин оказывают синергетическое действие на апоптоз опухолевых клеток NSCLC A549. DCA не усиливал ингибирование пролиферации капецитабином в опухолевых клетках NSCLC A549 (данные не показаны).

Рисунок 3. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях NSCLC A549. a Иммуногистохимический анализ TUNEL образцов опухолей NSCLC A549 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток. c Вестерн-блот активации каспаз в опухолях NSCLC A549. Активация инициаторных каспаз (каспазы 8 и каспазы 9) и эффекторных каспаз (каспазы 3) была обнаружена в опухолях NSCLC A549, инокулированных мышам BALB/c-nu, получавшим DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. d Плотный анализ расщепленных каспаз (C. caspase). Нормализовано по β-актину. *P < 0.05

Вестерн-блот показал, что DCA не оказывает значительного влияния на экспрессию и активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3 в опухолях NSCLC A549 по сравнению с контролем на 7-й день после лечения (рис. 5c, d). Только капецитабин в дозе 7,5 мг/день увеличивал активацию всех трех прокаспаз (рис. 5c, d). Интересно, что хотя DCA сам по себе не оказывал значительного влияния на экспрессию и активацию трех прокаспаз, DCA плюс капецитабин повышали экспрессию прокаспазы 8 и прокаспазы 3 по сравнению с лечением только капецитабином и усиливали активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3.

DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP в опухоли
Мы проанализировали экспрессию TP в образцах опухоли из ксенотрансплантата A549 на 7-й день после лечения. ПЦР в реальном времени (рис. 6a) и Вестерн-блот (рис. 6b) показали, что DCA как отдельный агент или в комбинации с капецитабином мало влияет на экспрессию TP, что означает, что механизм действия DCA и капецитабина в комбинации отличается от других синергистов капецитабина, о которых сообщалось ранее [19,25-27]. ПЦР в реальном времени также показала, что DCA не влияет на экспрессию других ферментов метаболизма капецитабина (тимидилат синтазы, оротат фосфорибозилтрансферазы, дигидропиримидин дегидрогеназы, тимидин киназы 1 и цитидин деаминазы, данные не показаны). Полученные результаты позволяют предположить, что DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не приведет к повышению токсичности капецитабина.

Рисунок 6. Транскрипция и экспрессия TP в опухоли A549 после лечения. a Анализ транскрипции TP методом ПЦР в реальном времени. Нормализовано по β-актину. b Вестерн-блот анализ экспрессии TP. в качестве внутреннего контроля использовался β-актин. Опухоли A549 резецировали у мышей BALB/c-nu через 7 дней после лечения DCA, 7,5 мг/день капецитабина, DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина или контрольной группы. Образцы из трех опухолей каждой группы были объединены вместе

Обсуждение

DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения был протестирован в клинических испытаниях; однако нет сообщений о противоопухолевом действии DCA в комбинации с капецитабином. Мы предположили, что стимулирующее апоптоз действие DCA на клетки солидных опухолей сделает их более чувствительными к капецитабину. В настоящем исследовании только 1,4 г/л DCA не оказывал значительного влияния на рост опухоли NSCLC A549 у мышей. Однако совместное введение DCA и капецитабина позволило снизить эффективную дозу капецитабина на 50 %. DCA усиливал противоопухолевый эффект капецитабина in vivo через сенсибилизацию апоптоза. DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не увеличивает токсичность капецитабина.

Поскольку были получены как положительные, так и отрицательные результаты (как показано в разделе «Введение»), до сих пор существуют разногласия по поводу использования DCA в качестве противоракового агента. Это расхождение может быть связано с различными экспериментальными условиями, особенно между результатами in vivo и in vitro. Клеточные анализы, использованные в настоящем исследовании, показали, что опухолевые клетки нечувствительны к DCA при культивировании in vitro, IC50 превышает 50 мМ. (данные не показаны). Действие DCA на раковые клетки не связано с прямой цитотоксичностью, а зависит от метаболического паттерна раковых клеток [7, 28]. Клеточные линии, культивируемые in vitro, не могут воспроизвести микроокружение опухоли и могут утратить «эффект Варбурга». Поэтому клеточные анализы in vitro могут быть не самыми подходящими модельными системами для определения применения DCA. Поэтому в настоящем исследовании комбинированный противоопухолевый эффект DCA и капецитабина был оценен на мышиных моделях опухолей in vivo. Мы также обнаружили, что эффект DCA на ксенотрансплантат NSCLC A549 в настоящем исследовании был меньше, чем в работе Bonnet et al. [7], даже несмотря на использование большей дозы DCA. Это может быть связано с разницей в метаболической способности ДКА у мышей и крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что на эффект ДКА может влиять состояние раковых клеток и состояние пациентов, что требует тщательного изучения при клиническом использовании ДКА в лечении рака.

В настоящем исследовании на животных моделях было показано, что DCA сам по себе проявляет слабый противоопухолевый эффект против установленных опухолей. Но в сочетании с капецитабином DCA резко усиливал противоопухолевый эффект капецитабина, что видно как из исследований на животных моделях, так и из результатов иммуногистохимии апоптоза. В соответствии с этим, анализ вестерн-блотов показал, что DCA сам по себе оказывает незначительное влияние на экспрессию и расщепление прокаспаз. Но в сочетании с капецитабином DCA значительно увеличивает экспрессию и расщепление прокаспаз 8, 9 и 3. Сообщается, что цитотоксический агент, такой как 5-Fu, может привести к увеличению экспрессии и активации каспазы 8 [29,30]. Причина, по которой капецитабин приводит к увеличению экспрессии и активации каспазы 9, до сих пор не ясна. Возможно, это связано с антиангиогенетическим действием капецитабина. Сообщается, что DCA может нормализовать ось митохондрий-K+ каналов и действовать как сенсибилизатор апоптоза [7]. Мы предполагаем, что DCA может деполяризовать митохондриальный потенциал раковых клеток, нормализуя эту ось, и тем самым усиливать активацию каспазы 8 и каспазы 9 капецитабином. Повышенная активация каспазы 8 и каспазы 9 приводит к повышенной активации каспазы 3.

Недавно был подчеркнут критический вклад CSCs с их повышенной опухолеродной способностью и устойчивостью к радио- и химиотерапии в злокачественное поведение [31]. Сообщается, что CSCs в солидных опухолях играют важную роль в антихимиотерапевтических и антирадиотерапевтических характеристиках опухолей [32, 33]. Обсуждается множество методов лечения, направленных на CSCs [34, 35], а комбинированные методы лечения, направленные как на CSCs, так и на «нормальные» раковые клетки, вызывают большой интерес [36-38]. Сообщается, что DCA индуцирует апоптоз в предполагаемых стволовых клетках глиобластомы как in vitro, так и in vivo [9]. В нашем исследовании после 7 дней лечения DCA количество CD133-положительных клеток в опухолевых срезах A549, определенных с помощью иммуногистохимии, уменьшилось до 0,5 % по сравнению с 6 % в контрольной группе (данные не показаны), что позволяет предположить, что DCA может также влиять на индуцирование апоптоза в КСК рака легких. Мы предполагаем, что DCA может сенсибилизировать опухолевые клетки, особенно КСК, к капецитабину. Комбинация DCA и капецитабина действует против опухолевых клеток двумя способами: капецитабин нацелен на «нормальные» раковые клетки, щадя CSCs, а DCA нацелен на CSCs и способствует апоптозу капецитабина. Другой вероятный сценарий объяснения эффекта комбинации заключается в том, что DCA подавляет ангиогенез рака in vivo [9], при котором DCA не проявляет прямого действия на раковые клетки. В дополнение к своей классической противоопухолевой активности, капецитабин может действовать как антиангиогенетическая молекула, согласно последним исследованиям [39]. DCA может усиливать антиангиогенный эффект капецитабина, что объясняет противоопухолевый эффект комбинации. Для определения подробного механизма будут проведены углубленные исследования.

В заключение, мы использовали модели опухолей, привитых сингенетически, и ксенотрансплантированных опухолей для изучения комбинированного противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина и обнаружили, что DCA впервые потенцировал противоопухолевый эффект капецитабина. Мы определили, что DCA обладает способностью сенсибилизировать раковые клетки и усиливать апоптотическое действие капецитабина. При комбинированном применении DCA позволял снизить эффективную дозу капецитабина без увеличения токсичности. Недорогой, непатентованный и пероральный DCA в сочетании с пероральным капецитабином может стать хорошей терапевтической схемой против рака.

Благодарности

Мы очень благодарны Венлонг Рену из Шанхайского института фармацевтической промышленности за помощь в подготовке мышиных опухолевых моделей.

Конфликт интересов

Нет.

Амигдалин задерживает прогрессирование клеточного цикла и блокирует рост клеток рака простаты in vitro

оригинал статьи: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S002432051630039X

Ясмина Макаревич а 1,Игорь Цаур а 1,Ева Юнгель а,Хендрик Боргманн а,Карен Нельсон б,Кристиан Томас а,Георг Барч а,Аксель Хаферкамп а 2,Роман А. Блахета а 2

Кафедра урологии, Университет Гёте, Франкфурт-на-Майне, ГерманиябКафедра сосудистой и эндоваскулярной хирургии, Университет Гёте, Франкфурт-на-Майне, Германия

Получено 10 августа 2015 г., пересмотрено 22 января 2016 г., принято 26 января 2016 г., доступно онлайн 29 января 2016 г., версия записи 10 февраля 2016 г.

Цели

Несмотря на впечатляющие преимущества в выживании от новых препаратов для лечения метастазирующего рака простаты (РПЖ), прогрессирующая лекарственная устойчивость препятствует долгосрочному ответу и ограничивает эффективность последующей терапии. В связи с зарегистрированной противоопухолевой активностью амигдалина и растущей популярностью комплементарной и альтернативной медицины был оценен потенциал этого природного, широко используемого вещества для оказания противоопухолевого воздействия на клетки рака простаты.

Основные методы

Клетки LNCaP (чувствительные к кастрации), DU-145 и PC3 (устойчивые к кастрации) подвергались воздействию различных концентраций амигдалина в течение 24  ч или 2 недель. Рост клеток измерялся с помощью теста МТТ, клонирование — с помощью клоногенного анализа . Проточная цитометрия служила для исследования апоптоза и фаз клеточного цикла . Белки, регулирующие клеточный цикл, и сигнальная ось mTOR–akt анализировались с помощью вестерн-блоттинга . 

Основные выводы

Амигдалин дозозависимо уменьшал рост опухолевых клеток с максимальным эффектом при 10 Белки клеточного цикла cdk 1, cdk 2 и cdk 4, а также циклин A , циклин B и циклин D3 модулировались амигдалином как через 24 часа, так и через 2 недели. Отчетливое влияние на экспрессию p19 и p27, а также на активацию Akt, Rictor и Raptor стало очевидным только через 2 недели. мг/мл. Апоптоз клеток PC3 и LNCaP , но не DU-145, был снижен, тогда как образование колоний было подавлено во всех клеточных линиях. Было зарегистрировано снижение числа клеток G2/M- и S-фазы наряду с повышенным числом клеток G0/G1-фазы.   

Значение

Амигдалин проявляет значительную противоопухолевую активность как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-резистентных линиях клеток РПЖ и заслуживает дальнейшей оценки в терапевтических целях.

Введение

 В 2015 году в США было зарегистрировано 220 800 новых случаев рака предстательной железы (РПЖ), в то время как 27  540 мужчин умрут, что делает РПЖ, помимо рака кожи, наиболее часто диагностируемой злокачественной опухолью и второй по значимости причиной смерти от рака у мужчин [1]. Исключительная клиническая и экономическая значимость РПЖ способствовала проведению множества исследований, способствуя быстрому расширению возможностей лечения метастатического РПЖ [2]. Таким образом, значительное улучшение выживаемости на кастрационно-резистентной стадии было достигнуто за счет клинического применения новых препаратов для биосинтеза андрогенов и рецепторного таргетирования, радиофармацевтических препаратов, циторедуктивных и иммунотерапевтических агентов [3]. Предварительные данные также указывают на многообещающий результат ранней химиотерапии доцетакселом при кастрационно-чувствительном РПЖ, хотя для этой терапевтической концепции необходимы дальнейшие исследования [4]. Несмотря на обнадеживающие результаты новых протоколов, первичная или приобретенная лекарственная резистентность исключает долгосрочный ответ. Перекрестная резистентность часто ограничивает эффективность последующей терапии [5]. Кроме того, побочные эффекты, требующие тщательного наблюдения за пациентами и даже прерывания лечения, могут ограничивать клиническое применение [6].Чтобы избежать токсичности, укрепить иммунную систему и, возможно, предотвратить рецидив РПЖ [7], наблюдается рост популярности комплементарной и альтернативной медицины (КАМ), несмотря на скудную доказательную эффективность [8]. Около трети пациентов с РПЖ, и даже больше с запущенным заболеванием, используют КАМ в форме натуральных продуктов для здоровья, таких как витамин Е, пальма сереноа, селен и ликопин [9], [10]. Из-за зарегистрированной противоопухолевой активности цианогенное вещество, диглюкозид амигдалин ( d -манделонитрил-β-гентиобиозид), использовалось в качестве синергического партнера с известными средствами для лечения РПЖ. Предполагается, что это вещество, в изобилии встречающееся в косточках плодов видов Rosaceae, поможет предотвратить негативные эффекты химиотерапии [11]. Однако воздействие амигдалина на РПЖ и его молекулярный механизм активности еще предстоит выяснить.Целью настоящего исследования было изучение влияния амигдалина на способность к росту и молекулярные механизмы в трех линиях клеток РПЖ.

Культура клеток

Клеточные линии рака простаты человека PC3, DU-145 (устойчивые к кастрации) и LNCaP (чувствительные к кастрации) были получены из DSMZ (Брауншвейг, Германия). Опухолевые клетки выращивали и субкультивировали в RPMI 1640 (Gibco/Invitrogen; Карлсруэ, Германия). Среда содержала 10% сыворотки плода теленка (FCS), 2% буфера HEPES (1  М, pH  7,4), 2% глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина.

Лечение амигдалином

Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток (1–10  мг/мл) и

Анализ зависимости реакции от дозы

Воздействие амигдалина на опухолевые клетки PC3, DU-145 и LNCaP в течение 24  ч привело к зависимому от концентрации снижению числа опухолевых клеток, причем наиболее выраженные эффекты были очевидны в присутствии 10  мг/мл (рис. 1А, 24  -часовая инкубация). Тот же ответ наблюдался, когда опухолевые клетки хронически обрабатывались амигдалином в течение 2  недель (рис. 1А, 2-недельная инкубация). Тест исключения трипанового синего не выявил токсических эффектов на линии опухолевых клеток после воздействия  амигдалина в концентрации 10 мг/мл (данные не показаны). Поскольку

Обсуждение

Это исследование показывает, что лечение амигдалином значительно снижает скорость роста как кастрационно-чувствительных (LNCaP), так и кастрационно-устойчивых (PC3, DU-145) клеточных линий и ослабляет образование клонов во всех трех клеточных линиях без токсических эффектов. Эти результаты согласуются с отчетами, показывающими ингибирующее рост, антипролиферативное и проапоптотическое действие амигдалина на промиелоцитарный лейкоз [12], рак толстой кишки [13], рак шейки матки [14] и клетки рака мочевого пузыря [15]. В настоящее время

Заключение

Эти результаты указывают на заслуживающую внимания противоопухолевую активность природного соединения, амигдалина, как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-устойчивых клетках РПЖ. Дальнейшая проверка этих предварительных данных необходима in vitro и in vivo, чтобы выяснить, заслуживает ли амигдалин оценки в надлежащим образом спланированных будущих клинических испытаниях.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана « Фондом Бригитты и Норберта Мут » и « Vereinigung von Freunden und Förderern der Goethe-Universität ».

Амигдалин как химиопротекторное средство при совместном лечении с цисплатином

оригинал статьи: https://www.frontiersin.org/journals/pharmacology/articles/10.3389/fphar.2022.1013692/full

ОРИГИНАЛЬНАЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ статья

Фронт. Фармакол. , 20 сентября 2022 г.Секция Экспериментальная фармакология и открытие лекарствТом 13 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fphar.2022.1013692

Панайота Христодулу1,2 *Панайотис Буцикос1Кристиана М. Неофиту3Теодора-Кристина Кириаку1,3Мария-Иоанна Христодулу2Панайотис Папагеоргис3Анастасис Стефану1Иоаннис Патрикиос1

• 1 Медицинский факультет Европейского университета Кипра, Никосия, Кипр
• 2 Лаборатория иммунологии опухолей и биомаркеров, Центр фундаментальных и трансляционных исследований рака, Факультет наук о жизни, Европейский университет Кипра, Никосия, Кипр
• 3 Лаборатория микроокружения опухоли, метастазирования и экспериментальной терапии, Центр фундаментальных и трансляционных исследований рака, Факультет наук о жизни, Европейский университет Кипра, Никосия, Кипр

Амигдалин — это природный гликозид, используемый в традиционной китайской медицине, который, как известно, обладает противораковыми свойствами. Несмотря на то, что противораковые свойства амигдалина хорошо известны, его воздействие на нормальные клетки не было тщательно изучено. Целью настоящего исследования было изучение возможной химиопротекторной роли амигдалина против цитотоксических эффектов химиотерапии для нормальных клеток человека. В частности, он был протестирован в сочетании с сильным химиотерапевтическим препаратом цисплатином. Человеческая неканцерогенная эпителиальная клеточная линия MCF12F, клетки человеческих фибробластов, клетки человеческого рака молочной железы MCF7 и MDA-MB-231 были обработаны цисплатином в зависимости от дозы и времени в отсутствие или в присутствии амигдалина. Когда клетки MCF12F и фибробласты подвергались предварительной обработке амигдалином с последующей обработкой цисплатином (24 ч амигдалин + 24 ч цисплатин), жизнеспособность клеток увеличивалась (22%, p < 0,001), как показано с помощью анализа МТТ. Как подтверждается проточной цитометрией, комбинированное лечение было связано с уменьшением процента поздних апоптотических клеток по сравнению с монотерапией (кратность изменения снижения = 1,6 и 4,5 для 15 и 20 мкМ соответственно). Кроме того, экспрессия белков PUMA, p53, фосфо-p53 и Bax снижалась, когда использовалась комбинированная обработка по сравнению с одним цисплатином, в то время как проапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL демонстрировали повышенную тенденцию в присутствии амигдалина. Более того, уровни проапоптотических генов PUMA , p53 и мРНК BAX были значительно снижены (∼83%, ∼66% и ∼44% соответственно) по сравнению с одним цисплатином, в то время как уровни мРНК антиапоптотических генов BCl-2 и Bcl-XL были повышены (∼44,5% и ∼51% соответственно) по сравнению с одним цисплатином после 24 ч комбинированного лечения. Исследование анализа индекса комбинации (CI) показало, что амигдалин, возможно, можно рассматривать как антагонист цисплатина (2,2 и 2,3) для клеток MCF12F и фибробластов соответственно. Напротив, для клеток рака молочной железы MCF7 и MDA-MB-231 амигдалин и цисплатин показали синергический эффект (0,8 и 0,65) соответственно. Наши текущие результаты показывают, что амигдалин оказывает химиомодулирующее действие при совместном лечении с цисплатином и способен защищать нормальные клетки молочной железы, а также фибробласты во время химиотерапии, что указывает на сильную селективную химиопротекторную способность и может способствовать улучшению качества жизни онкологических больных.

Введение

Рак является второй по значимости причиной смерти в мире, после сердечно-сосудистых заболеваний ( Nagai and Kim, 2017 ). Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным видом рака среди женщин во всем мире и представляет собой серьезную проблему для общественного здравоохранения [Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), 2021]. Химиотерапия является наиболее эффективным и часто используемым методом лечения большинства злокачественных новообразований ( Huang et al., 2017 ). Несмотря на многочисленные достижения за последнее десятилетие в области адъювантной терапии РМЖ, остаются нерешенными многочисленные проблемы, включая неблагоприятные побочные эффекты, вызываемые химиотерапевтическими препаратами, такие как тошнота, выпадение волос, рвота, усталость и в тяжелых случаях даже смерть ( Waris and Ahsan, 2006 ; Ye et al., 2017 ). Управление по контролю за продуктами и лекарствами США одобрило в общей сложности 132 химиотерапевтических препарата, из которых 56, как сообщается, вызывают окислительный стресс ( Chen et al., 2018 ). Многие классы химиотерапевтических препаратов, такие как таксаны и производные платины, могут вызывать окислительный стресс ( Cauli, 2021 ).

Цис-диаммининдихлорплатина (II) (цисплатин) — неорганическое соединение, «алкилирующий агент», используемый в качестве основного лечебного препарата, способного уменьшать рост раковых клеток, против различных видов рака человека, включая рак молочной железы, яичек, яичников и легких ( Dasari and Tchounwou, 2014 ). Цисплатин образует внутри- и межцепочечные аддукты с ДНК и, таким образом, является мощным индуктором остановки клеточного цикла, приводящей к апоптозу для большинства типов раковых клеток. Сшивающие взаимодействия цисплатина с ДНК способствуют ингибированию репликации, транскрипции и других ядерных функций, которые могут останавливать пролиферацию раковых клеток и рост опухоли ( Zwelling et al., 1979 ; Dasari and Tchounwou, 2014 ). Эффективность цисплатина зависит от способности клеток либо восстанавливать повреждения ДНК, либо приступать к гибели ( Mirmalek et al., 2016 ). Таким образом, сигнальные пути, регулирующие апоптоз, играют ключевую роль в том, как клетки будут реагировать на цисплатин ( Истман, 1990 ).

Амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид) — это цианогенный диглюкозид, который естественным образом содержится в косточках многочисленных фруктов и растений семейства розоцветных, таких как Prunus armeniaca (абрикос) и Prunus persica (персик). Все больше доказательств подтверждают, что амигдалин (также известный как «лаэтрил») может действовать как противораковый агент, вызывая остановку клеточного цикла и апоптоз ( Guo et al., 2013 ; Makarevic et al., 2014 ; Lee and Moon, 2016 ; Saleem et al., 2018 ). Амигдалин проявляет синергический эффект в сочетании с другими соединениями, такими как синильная кислота (противоопухолевое вещество) и бензальдегид (обезболивающее соединение); вызывая гибель раковых клеток ( Song and Xu, 2014 ). Кроме того, in vitro сообщалось, что амигдалин связан с противораковой активностью в отношении клеток рака молочной железы, главным образом, посредством окислительного стресса; он способствует дифференциальному ингибированию пролиферации клеток MCF7 и T470 ( Abboud et al., 2019 ).

Амигдалин может быть расщеплен ферментом, известным как β -глюкозидаза, высвобождающим цианистый водород, бензальдегид и глюкозу. Бензальдегид является обезболивающим, который может быть преобразован в бензойную кислоту кислородом в нормальных/здоровых тканях. Цианистый водород может вызывать токсичность цианида и, следовательно, убивать раковые клетки ( Blaheta et al., 2016 ). С другой стороны, другой фермент, роданеза, который присутствует только в нормальных тканях, а не в раковых, по-видимому, обладает способностью детоксифицировать цианид и, следовательно, защищать нормальные ткани ( Newmark et al., 1981 ). Эти два вышеупомянутых фермента, вероятно, могут способствовать избирательной токсичности амигдалина, контролируя рост и метастазирование раковых клеток.

Теперь мы намерены изучить влияние амигдалина, цисплатина и их комбинированной терапии на жизнеспособность клеток с использованием как нормальных, так и раковых клеточных линий, а также оценить потенциальную химиопротекторную роль амигдалина.

Материалы и методы

Культура клеток

Амигдалин был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США) и растворен в воде (концентрат 1М). Концентрат цисплатина 1 мг/мл для приготовления раствора для инфузий был приобретен у Accord. Клеточные линии MCF12F, MCF7 и MDA-MB-231 были приобретены у American Type Culture Collection (ATCC, Роквилл, Мэриленд). Фибробласты, извлеченные из ткани поджелудочной железы, были любезно предоставлены Университетом Кипра. Клетки MCF12F и фибробласты культивировались в модифицированной среде Дульбекко с питательной смесью Ham's F-12 (DMEM/F12), содержащей 5% лошадиной сыворотки, обработанной Chelex, приобретенной Sigma-Aldrich, эпидермальный фактор роста (EGF, 10 мкг/500 мл), холерный токсин (50 мкг/500 мл), инсулин (5 мг/500 мл) и гидрокортизон (250 мкг/500 мл) вместе с 1% антибиотиков и антимикотиков. Клетки MCF7 и MDA-MB-231 культивировались в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотика, приобретенного Sigma-Aldrich. Клетки инкубировались при 37°C в увлажненной камере при 95% O2 / 5% CO2 . Bcl-2, фосфо-p53, p53, Bax, GAPDH, каспаза-9, антитела были приобретены в Cell Signalling Technology (Дэнверс, Массачусетс, США). β -Актин и каспаза-8 были приобретены в Santa Cruz Biotechnology Inc. Реагенты для культивирования клеток (DMEM, FBS, HS, антибиотик/противогрибковый препарат и трипсин) были приобретены в Gibco, Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США).

Анализ комбинированного индекса

Анализ индекса комбинации (CI) является самым простым способом оценки фармакологических взаимодействий препаратов и в нашем случае использовался для количественной оценки синергизма или антагонизма. Синергизм используется для описания улучшения ответа опухоли, тогда как антагонизм используется, когда эффект комбинации менее токсичен, чем результат индивидуальных эффектов.

Результаты анализа индекса комбинации основаны на теории Chou-Talalay ( Chou, 2010 ). CompuSyn — это компьютерная программа для количественной оценки синергизма и антагонизма в комбинациях лекарственных средств и определения значений IC50 и ED50. Когда этот конкретный анализ дает CI = 1, это означает, что реагирующие вещества имеют аддитивный эффект, CI < 1 означает, что реагирующие вещества имеют синергический эффект, а CI > 1 означает, что реагирующие вещества имеют антагонистический эффект ( таблица 1 и дополнительный материал 2 ) ( Chou, 2010 ).

ТАБЛИЦА 1

ТАБЛИЦА 1. Значения IC50 различных линий клеток.

МТТ-тест

Для оценки жизнеспособности клеток был проведен анализ пролиферации клеток с использованием МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромида, M2128 от Sigma-Aldrich] ( Gasparini et al., 2017 ). После трипсинизации и подсчета с помощью гемоцитометра клетки MCF12F и MCF7 были высеяны в 96-луночный планшет ( Green and Sambrook, 2019 ). После проверки адгезии (примерно через 18 ч после высевания) клетки инкубировали с 10 мМ амигдалина и через 24 ч добавляли 15 мкМ цисплатина еще на 24 ч. После обработки клеток 20 мкл красителя МТТ в течение 4 ч, а затем инкубации с 150 мкл ДМСО (диметилсульфоксид, D8418 от Sigma-Aldrich) в течение 15 мин. Поглощение при 595 нм измеряли с помощью микропланшетного ридера (ThermoFisher Scientific).

синтез кДНК

Общая РНК из каждой популяции клеток была выделена с помощью набора RNeasy Micro Kit (50), а концентрация, а также чистота были измерены с помощью поглощения в λ = 280 и 260 нм/280 нм соответственно. кДНК каждого образца синтезирована с помощью набора primeScript first strand cDNA Synthesis kit (Takara) для смеси 1 и 2. Смесь 1 инкубировали при 65°C в течение 10 мин, а затем во льду в течение 3 мин перед добавлением смеси 2 до конечного объема 20 мкл. Последним шагом была инкубация смесей при определенных температурах в машине RT-qPCR (Bio-Rad) ( Neophytou et al., 2019 ).

ОТ-ПЦР в реальном времени

Для измерения экспрессии мРНК была проведена ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) с использованием набора KAPA SYBR FAST qPCR (KK4610). Были использованы следующие праймеры: Bax, прямой: 5′-ACA​TGG​AGC​TGC​AGA​GGA​TG-3′, обратный: 5′-CCA​GTT​GAA​GTT​GCC​GTC​AG-3′; p53, прямой: 5′-CCT​CAG​CAT​CTT​ATC​CGA​GTG​G-3′, обратный: 5′-TGG​ATG​GTG​GTA​CAG​TCA​GAG​C-3′; PUMA, прямой: 5′-ACG​ACC​TCA​ACG​CAC​AGT​ACG​A-3′, обратный: 5′-GTA​AGG​GCA​GGA​GTC​CCA​TGA​T-3′; Bcl-2, прямой: 5′-GGA​TAA​CGG​AGG​CTG​GGA​TG-3′, обратный: 5′-GGC​CAA​ACT​GAG​CAG​AGT​CT-3′; Bcl-xL, прямой: 5′-AGA​GCC​TTG​GAT​CCA​GGA​GA-3′, обратный: 5′-TCA​GGA​ACC​AGC​GGT​TGA​AG-3′; GADPH, прямой: 5′-GTC​TCC​TCT​GAC​TTC​AAC​AGC​G-3′, обратный: 5′-ACC​ACC​CTG​TTG​CTG​TAG​CCA​A-3′. GADPH использовали в качестве гена домашнего хозяйства. В конце реакции регистрировали значения Ct, и среднее значение трехкратных повторов использовали для расчета кратности изменения экспрессии гена с использованием метода 2[-Delta Delta C(T)] ( Livak and Schmittgen, 2001 ), как описано ранее ( Papageorgis et al., 2010 ). Для оценки эффекта лечения использовали данные по крайней мере трех независимых биологических повторов.

Извлечение белка

Среду удаляли из 6-луночного планшета и добавляли 1 мл PBS для промывки лунок, а затем аспирировали. После этого добавляли 150 мкл RIPA для лизиса клеток. Гомогенизированные образцы переносили в пробирки Eppendorf на льду на 30 мин с частым встряхиванием. Образцы центрифугировали при 10 000 об/мин/10 мин/4°C ( Ngoka, 2008 ). Образцы хранили при температуре –80 до дальнейшего использования ( Дополнительные материалы 1 и 3).

вестерн-блоттинг

Для определения уровня белка мы провели анализ вестерн-блоттинга. Смеси белков инкубировали при 98°C в течение 5 минут, а затем переносили на мембрану PVDF и блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в первичном антителе в течение ночи при 4°C, а затем добавляли вторичное антитело в течение 60 минут при комнатной температуре. MCF12F обрабатывали цисплатином и амигдалином по отдельности или в комбинации в течение 48 часов. Белки экстрагировали и разделяли с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и зондировали с помощью антител против Bcl-2, фосфо-p53, p53, Bax, PUMA, PARP-1 и каспазы-9. Bcl-2 (CST 15071, 1:1000), PARP-1 (CST 9542, 1:1000), Bax (CST 2772, 1:1000), каспаза-9 (CTS 9502, 1:1000), фосфо-p53 (CST 9286 (Ser15), 1:1000), p53 (CST 9282, 1:1000), PUMA (CST 12450, 1:1000) были приобретены для Cell Signalling Technology (Дэнверс, Массачусетс, США), а Bcl-2 (sc-783, 1:1000), GAPDH (sc-25778, 1:1000) были приобретены у Santa Cruz Biotechnology Inc. Мы визуализировали полосы белков с использованием субстрата вестерн-блоттинга с улучшенной хемилюминесценцией (ECL) (Thermo Fisher Scientific) и машины Chemidoc от Biorad. Значения интенсивности из денситометрического анализа вестерн-блотов были нормализованы относительно GAPDH или β -актина с использованием программного обеспечения для анализа ImageJ. Значения интенсивности были выражены как кратное изменение по сравнению с контролем ( Ngoka, 2008 ).

Оценка апоптоза/некроза методом проточной цитометрии

Исследование индукции апоптоза/некроза оценивалось с помощью проточного цитометрического анализа при двойном окрашивании Annexin-V-FITC/пропидиум йодидом (PI). Клетки высевали в концентрации 1 × 10 5 клеток на лунку в 6-луночные планшеты для культивирования тканей и обрабатывали цисплатином (15 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ) и/или амигдалином (10 мМ), как указано. Клетки, обработанные только цисплатином, использовали в качестве положительного контроля, а необработанные клетки — в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали и окрашивали с помощью набора Annexin V/Dead Cell Apoptosis (Life Technologies, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Апоптоз и некроз клеток анализировали с помощью проточного цитометра Attune NxT (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) и программного обеспечения FlowJo v10 (BD Biosciences, США) ( Steensma et al., 2003 ).

Статистический анализ

Все результаты были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка между самой низкой и самой высокой точками измерения. Непарные t -тесты были применены для исследования возможных различий в непрерывных переменных для двух групп. p -значения представлены как двусторонние с доверительными интервалами 95%. Статистический тест и анализ были проведены с использованием программного обеспечения Prism версии 5.0 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США). Для взаимодействия лекарств использовался метод Chou-Talalay (индекс комбинации) для оценки эффекта комбинированного лечения на основе данных о концентрации-эффекте ( Chou, 2010 ). Этот метод для комбинации лекарств основан на уравнении медианы-эффекта, которое исходит из принципа закона действия масс, который связывает один объект и несколько объектов, а также динамику первого и более высокого порядка ( Chou, 2011 ). Для результатов программного обеспечения уравнения индекса комбинации используется программа CompuSyn ( Chou, 2010 ).

Результаты

Оценка жизнеспособности нормальных и раковых клеток молочной железы после однократного лечения цисплатином или амигдалином

Чтобы определить влияние лечения амигдалином и цисплатином на нормальные (MCF12F) и раковые (MCF7, MDA-MB-231) клетки молочной железы, а также на фибробласты (FBS), мы использовали анализ MTT для оценки жизнеспособности клеток в зависимости от дозы в различные моменты времени. Во-первых, влияние амигдалина и цисплатина оценивалось по отдельности. Когда была указана идеальная концентрация (цисплатин 15 мкМ, амигдалин 10 мМ) для обоих видов лечения, была проведена комбинированная терапия с использованием цисплатина и амигдалина вместе для оценки разницы в количестве клеток.

Клетки MCF12F, MCF7, MDA-MB-231 и FBS обрабатывали 1, 10, 15, 20 и 30 мкМ цисплатина, а жизнеспособность клеток оценивали через 24, 48 и 72 ч ( рисунок 1A ). Цисплатин повлиял на все клеточные линии, уменьшив количество жизнеспособных клеток. Клетки рака молочной железы были поражены цисплатином больше, чем нормальные клетки молочной железы, а также фибробласты. Однако обе клеточные линии были значительно затронуты цисплатином.

РИСУНОК 1

РИСУНОК 1. Эффект цисплатина и амигдалина в линиях клеток молочной железы, а также в фибробластах. (A) Анализ МТТ использовался для оценки цитотоксичности (% жизнеспособности клеток) возрастающих концентраций цисплатина (1, 10, 15, 20 и 30 мкМ) в i) MCF-12F, ii) FBS, iii) MCF-7 и iv) MDA-MB-231 в течение 24, 48, 72 ч и (B) возрастающих концентраций амигдалина (10, 25, 50, 75 и 100 мМ) в i) MCF-12F, ii) FBS, iii) MCF-7 и iv) MDA-MB-231 в течение 24, 48, 72 ч лечения. Звездочки указывают на силу статистической значимости между столбцами [* (0,05) < ** (0,01) < ***(0,001)].

Кроме того, клетки MCF12F, MCF7, MDA-MB-231 и FBS обрабатывали 10, 25, 50, 75 и 100 мМ амигдалина в течение 24, 48 и 72 ч ( Рисунок 1B ). Во всех клеточных линиях количество жизнеспособных клеток уменьшалось с увеличением концентрации амигдалина. Однако при использовании 10 мМ обработки амигдалином существенных различий не наблюдалось, поскольку уровень жизнеспособности клеток составлял >90% во всех временных точках. IC 50 цисплатина был определен равным 23,8 мкМ в MCF12F и 21,7 мкМ в MCF7, тогда как IC 50 амигдалина был равен 85,4 мМ в MCF12F и 64,5 мМ в MCF7 после 24, 48 и 72 ч обработки соответственно ( таблица 1 ).

Комбинированное лечение демонстрирует химиопротекторный эффект в нормальных клетках молочной железы

Комбинированное лечение применялось к клеткам MCF12F с использованием 10 мМ амигдалина и 1, 10, 15, 20 и 30 мкМ цисплатина. Сначала клетки обрабатывали амигдалином в течение 24 ч, а затем добавляли цисплатин на 24, 48 и 72 ч ( рисунки 2Ai–iii ). Затем мы предварительно обработали клетки 10 мМ амигдалином в течение 24 ч и наиболее подходящей концентрацией цисплатина, 15 мкМ в течение 24, 48 и 72 ч. Концентрация цисплатина основывалась на жизнеспособности клеток, которая составляла >50% при лечении одним агентом. Результаты показывают, что комбинированное лечение повышает жизнеспособность клеток во всех временных точках по сравнению с лечением одним цисплатином ( рисунок 2B ). Наиболее значительное увеличение жизнеспособности клеток ( ∼ 22%) наблюдалось через 48 ч при комбинированном лечении (24 ч амигдалин + 24 ч цисплатин). Анализ индекса комбинации, указывающий на синергизм или антагонизм амигдалина с цисплатином, представлен в таблице 1 .

РИСУНОК 2

РИСУНОК 2. Эффект цисплатина отдельно и в сочетании с амигдалином в нормальных клетках молочной железы, MCF12F. Клетки были предварительно обработаны 10 мМ амигдалином, а затем цисплатин (1, 10, 15, 20 и 30 мкМ) был добавлен в течение (A) i) 24 ч, ii) 48 ч и iii) 72 ч. Анализ МТТ был применен для измерения жизнеспособности клеток в этих условиях. (B) Амигдалин (10 мМ) снижает цитотоксичность цисплатина (15 мкМ) и увеличивает выживаемость во всех временных точках с пиком на 48 ч общей обработки. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM трех различных повторов и являются репрезентативными по крайней мере для трех различных экспериментов [* (0,05) < ** (0,01) < ***(0,001)].

Оценка апоптоза, опосредованного комбинированным лечением

Окрашивание аннексином V/PI использовалось для оценки апоптотического эффекта возрастающих концентраций цисплатина 15 и 20 мкМ с 10 мМ амигдалином или без него в течение 48 часов лечения.

Как показано на рисунке 3 , в клетках MCF12F процент поздних апоптотических клеток (двойной положительный результат по аннексину-V/PI) после 48-часовой комбинированной обработки (% среднего ± SE; цисплатин 15 мкМ + 10 мМ амигдалин: 5,8 ± 1,2 или цисплатин 20 мкМ + 10 мМ амигдалин: 4,3 ± 0,6) был значительно ниже по сравнению с обработкой цисплатином (15 мкМ: 9,5 ± 1,8; кратность изменения снижения = 1,6 или 20 мкМ: 19,3 ± 2,4; кратность изменения снижения = 4,5). Более того, % живых клеток при комбинированном лечении был увеличен (цисплатин 15 мкМ + 10 мМ амигдалин: 90,1 ± 1,2 или цисплатин 20 мкМ + 10 мМ амигдалин: 90,2 ± 0,5) по сравнению с применением только цисплатина (15 мкМ: 86,8 ± 0,5; p = 0,05 или 20 мкМ: 74,4 ± 1,9; p = 0,03 соответственно). Процент живых, ранних, поздних апоптотических и некротических клеток для всех условий лечения представлен на рисунке 3B . Была использована концентрация 30 мкМ, поскольку было обнаружено, что это самая высокая концентрация, способная убить более 50% обработанных клеток. Кроме того, 30 мкМ использовали в качестве положительного контроля для остальных экспериментов.

РИСУНОК 3

РИСУНОК 3. Влияние амигдалина на апоптоз, вызванный цисплатином в клетках MCF-12F. (A) Окрашивание аннексином V/PI использовалось для оценки апоптотического эффекта (% по сравнению с контролем) 15 и 20 мкМ цисплатина с 10 мМ амигдалином или без него в течение 48 ч. Приведены диаграммы зебра % живых (Q4), ранних (Q3), поздних апоптотических (Q2) и некротических клеток (Q1) при каждой стимуляции. (B) Сложенные столбчатые диаграммы, изображающие изменения в вышеупомянутых популяциях. Показаны данные трех независимых экспериментов.

Амигдалин и цисплатин регулируют белки, связанные с апоптозом

Комбинация цисплатина и амигдалина снизила уровни проапоптотических BAX, фосфо-p53, p53 и PUMA, медиаторов апоптотических ответов ( Рисунок 4 ). Напротив, уровни антиапоптотического BCl-2, известного ингибитора процесса проницаемости митохондриальной наружной мембраны (MOMP), были повышены ( Рисунок 4A ). PARP-1, фермент репарации ДНК, который расщепляется во время апоптоза, не представил свою расщепленную форму во время комбинированного лечения ( Рисунок 4B ). Расщепленная каспаза-9, мишень проапоптотических белков, высвобождаемых из митохондрий, была обнаружена в клетках, обработанных цисплатином, но не в группе комбинированного лечения ( Рисунок 4C ). Расщепленная каспаза-9 является активной формой, которая расщепляется от прокаспазы-9 (полной длины), показывая инициацию апоптотического пути. Эти результаты показывают, что комбинированное лечение с амигдалином подавляло апоптоз по сравнению с лечением только цисплатином.

РИСУНОК 4

РИСУНОК 4. Влияние амигдалина и цисплатина на уровни и локализацию апоптотических белков в нормальных клетках. (A) Сочетание 10 мМ амигдалина и 15 мкМ цисплатина снизило уровни белков Bax, phosho-p53, p53, PUMA и увеличило уровни белков Bcl-2 после 48 ч обработки в MCF12F. (B) Показана экспрессия расщепленного PARP при обработке цисплатином. Цисплатин сам по себе вызывал расщепление каспазы-9, тогда как (C) амигдалин (10 мМ) снижал этот эффект. Значения интенсивности из денситометрического анализа вестерн-блотов показаны в верхней части каждого блота и были нормализованы по GAPDH с помощью программного обеспечения ImageJ. Результаты являются репрезентативными по крайней мере для трех независимых экспериментов.

Влияние амигдалина и цисплатина на экспрессию мРНК про- и антиапоптотических генов

После комбинированной обработки в течение 48 ч на клетках MCF12F уровни мРНК PUMA , p53 и Bax были значительно снижены на ∼83%, ∼66% и ∼44% соответственно по сравнению с обработкой только цисплатином. Напротив, уровни мРНК Bcl-2 и Bcl-xL были повышены на ∼44,5% и ∼51% соответственно при комбинированной обработке по сравнению с обработкой только цисплатином. Кроме того, уровни мРНК соотношения BAX/Bcl-2 были снижены на ∼81% при комбинированной обработке по сравнению с обработкой только цисплатином ( Рисунок 5 ). Более того, комбинированная обработка не показала никакого химиопротекторного эффекта на основе уровней экспрессии мРНК про- и антиапоптотических генов в клетках MCF7 и MDA-MB-231. ( Рисунок 5 ). Амигдалин сам по себе показал увеличение мРНК p53 в клетках MCF12F ( Рисунок 5 ), однако на уровне белка p53 ( Рисунок 4 ) он остался неизменным, и это может означать, что уровень мРНК не всегда коррелирует с уровнем белка. Аналогично, амигдалин не способствовал гибели клеток, как было оценено с помощью проточной цитометрии в клетках MCF12F ( Рисунок 3 ).

РИСУНОК 5

РИСУНОК 5. Влияние амигдалина и цисплатина на экспрессию мРНК проапоптотических и антиапоптотических генов. В MCF12F экспрессия мРНК проапоптотических генов PUMA, p53 и Bax , а также соотношение BAX/Bcl-2 были снижены при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), тогда как экспрессия мРНК антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-xL была повышена при комбинированном лечении. В MCF7 экспрессия мРНК проапоптотических генов PUMA, p53 и Bax , а также соотношение BAX/Bcl-2 были увеличены при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), в то время как экспрессия мРНК антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-xL была снижена при комбинированном лечении. В MDA-MB-231 экспрессия мРНК проапоптотического гена p 53 была увеличена при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), в то время как экспрессия мРНК антиапоптотического гена Bcl-2 была снижена. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM трех различных повторов и являются репрезентативными по крайней мере для трех различных экспериментов, ∗ значение p < 0,05, ∗∗ значение p < 0,01, ∗∗∗ значение p < 0,001.

Обсуждение

Наиболее широко используемыми методами лечения рака являются хирургия, радиотерапия и химиотерапия, однако их эффективный терапевтический результат остается ограниченным из-за их неблагоприятных побочных эффектов, которые часто могут быть серьезными, что подчеркивает необходимость альтернативных или адъювантных методов лечения. Следовательно, стратегии, включающие фитохимические вещества, могут помочь в снижении этих побочных эффектов и улучшении качества жизни. Химиопротекторное лечение является многообещающим подходом, направленным на смягчение химиотерапевтических побочных эффектов в организме ( Maier et al., 2010 ). Фитохимические вещества, по-видимому, участвуют в профилактике и лечении рака из-за их относительно безопасного профиля цитотоксичности ( Duthie, 2007 ; Jagtap et al., 2009 ). В последнее десятилетие исследования направлены на выявление потенциала комбинированных стратегий с использованием одного или нескольких натуральных продуктов вместе с эффективным химиотерапевтическим средством для улучшения традиционной терапии рака ( Krzyzanowska et al., 2010 ; Kaminski et al., 2011 ; Saldanha and Tollefsbol, 2012 ).

В этом исследовании мы исследовали химиопротекторное и терапевтическое действие амигдалина в сочетании с обычным химиотерапевтическим средством цисплатином. Чтобы определить дифференциальную цитотоксичность по отношению к нормальным и раковым клеткам молочной железы, а также к фибробластам, эффект различных концентраций цисплатина и амигдалина, по отдельности, оценивался на клеточных линиях MCF12F, MCF7, MDA-MB-231, а также на фибробластах. Цисплатин и амигдалин снижали жизнеспособность клеток всех клеточных линий в зависимости от дозы и времени. Важно отметить, что обработка амигдалином в концентрации 10 мМ как нормальных, так и раковых клеток не показала статистически значимой разницы в жизнеспособности клеток, и этот показатель составлял более 90% во всех временных точках. Это подтверждает предыдущие выводы, указывающие на то, что многие фитохимические вещества, включая амигдалин, куркумин и сульфорафан, малотоксичны для нераковых, нормальных клеток ( Ravindran et al., 2009 ; Sharma et al., 2011 ).

На основании результатов IC50 концентрация амигдалина была установлена ​​на уровне 10 мМ (не повлияла на жизнеспособность клеток ни в одной из клеточных линий в течение 24 ч). Концентрация цисплатина была установлена ​​на уровне 15 мкМ для всех клеточных линий, чтобы иметь более 50% жизнеспособности клеток (для лучшей оценки эффекта комбинированного лечения в нормальных клетках).

Цисплатин является хорошо известным химиотерапевтическим препаратом для лечения широкого спектра злокачественных новообразований человека, но он связан с серьезными побочными эффектами и неспецифической цитотоксичностью, которая приводит к повреждению нормальных клеток и развитию лекарственной устойчивости ( McWhinney et al., 2009 ; Gopal et al., 2012 ). Предыдущие исследования продемонстрировали цитотоксический синергизм цисплатина и других агентов, таких как пчелиный яд, производное тиазоло[5,4-b] хинолина D3CLP и препарат AT-101 по отношению к различным линиям раковых клеток ( Alizadehnohi et al., 2012 ; Gonzalez-Sanchez et al., 2012 ; Mazumder et al., 2012 ; Karaca et al., 2013 ). Другое исследование продемонстрировало синергетическую активность фитохимического эпигаллокатехин галлата (EGCG) в сочетании с цисплатином и опухолеактивными соединениями палладия при раке яичников, что позволяет предположить, что комбинации платиновых препаратов, включая цисплатин и разработанные транс-палладии вместе с выбранными фитохимическими веществами, могут опосредовать преодоление лекарственной устойчивости в будущем. В нашем исследовании мы использовали комбинированную обработку 15 мкМ цисплатина и 10 мМ амигдалина как в нормальных клетках MCF12F, так и в FBS, чтобы дополнительно оценить безопасность амигдалина на нормальных клетках, а также его цитопротекторные способности в присутствии противораковых методов лечения. Также изучалась способность амигдалина сенсибилизировать эффекты, вызывающие смерть, в раковых клетках.

Проточная цитометрия подтвердила химиопротекторный эффект амигдалина, снижающий процент поздних апоптотических клеток до 4,5 раз ( рисунок 3 ). Как показано, амигдалин способен снижать цитотоксическое действие цисплатина на нормальные клетки молочной железы. Это подтверждается индексом комбинации (CI), который показал антагонизм между амигдалином и цисплатином при использовании в нормальных клетках и синергизм против раковых клеток.

Амигдалин приобрел широкую популярность благодаря своей противораковой активности и другим полезным эффектам на различные системы организма, таким как подавление фиброза почек, противоастматическое действие и улучшение иммунной функции ( Syrigos et al., 1998 ). Однако химиопротекторный потенциал амигдалина на нормальных эпителиальных клетках молочной железы ранее не исследовался.

Как показали наши результаты ( Рисунок 5 ), уровень мРНК проапоптотических PUMA, p53, BAX был значительно снижен, в то время как мРНК антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-xL были повышены после комбинированного лечения по сравнению с лечением только цисплатином в нормальных клетках. Это конкретное наблюдение и открытие подтверждают основное обоснование механизма действия через апоптотический путь. Напротив, уровень мРНК проапоптотических PUMA, p53, BAX был повышен, в то время как мРНК антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-xL были снижены после комбинированного лечения по сравнению с лечением только цисплатином в раковых клетках. Результаты ОТ-ПЦР в клетках рака молочной железы (MCF7 и MDA-MB-231) предполагают возможный синергический эффект амигдалина с цисплатином и подчеркивают его противораковую активность. Из предварительных отчетов известно, что возможным механизмом этого токсического эффекта является наличие β -глюкозидазы в раковых клетках, но не в нормальных клетках, которая способна расщеплять и высвобождать цианит из основной молекулы амигдалина. С другой стороны, нормальные клетки содержат фермент роданезу, который не может приводить к расщеплению и высвобождению цианида ( Newmark et al., 1981 ).

Похожая картина про- и антиапоптотической экспрессии также наблюдалась на уровнях белков. Экспрессия белков PUMA, p53, фосфо-p53 и Bax ( Рисунок 4 ) также снижалась при использовании комбинированного лечения по сравнению с одним цисплатином. С другой стороны, проапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL демонстрировали повышенную тенденцию в присутствии амигдалина. Кроме того, при использовании комбинированного лечения были получены сниженные уровни расщепленной формы каспазы 9 и PARP, что указывает на ингибирование апоптотического пути. Мы поясняем, что даже несмотря на то, что можно наблюдать некоторую непоследовательность в отношении результата уровня GAPDH, учитывая полученный результат во всех других белках, запущенных для эксперимента по сравнению с GAPDH, непоследовательность нельзя считать проблемной. Более того, разница в расщеплении каспазы-9 между дорожкой 1 (контроль) и дорожкой 3 (15 мкМ цисплатин) очень слабая, но это обычное явление в ситуациях, когда наблюдается повышенный апоптотический результат.

Эти результаты могут указывать на то, что комбинированное лечение способно подавлять апоптоз по сравнению с лечением цисплатином.

Учитывая предыдущие изменения как в экспрессии мРНК, так и в экспрессии белка, мы можем сделать вывод, что комбинированное лечение цисплатином и амигдалином, возможно, может способствовать нормальному выживанию клеток выборочно, ингибируя апоптоз только в нормальных клетках. Эти наблюдения и выводы подтверждают нашу первичную и основную гипотезу и совместимы с другими исследованиями, которые указали на аналогичный механизм действия амигдалина в различных клеточных линиях или в моделях животных ( Kwon et al., 2003 ; Chang et al., 2006 ; Chen et al., 2013 ; Makarevic et al., 2014 ; Su et al., 2014 ).

В раковых клетках мы показали, что цисплатин способствует активации p53, что приводит к апоптозу посредством снижения уровня антиапоптотического белка Bcl-2 и повышения уровня проапоптотического белка Bax. Про- и антиапоптотические белки семейства Bcl-2 активируют процесс MOMP, который, в свою очередь, активирует апоптоз. MOMP приводит к высвобождению цитохрома c из митохондрий в цитозоль, вызывая активацию каспазы и последующий апоптоз ( Рисунок 6 ). С другой стороны, амигдалин оказывает цитопротекторное действие на нераковые клетки, способствуя эффективной экспрессии антиапоптотического гена.

РИСУНОК 6

РИСУНОК 6. Потенциальный механизм действия амигдалина и цисплатина в нормальных клетках молочной железы против рака молочной железы. При лечении цисплатином индуцируется повреждение ДНК с последующей активацией фосфо-p53, приводящей к апоптозу. Фосфо-p53 может индуцировать апоптоз посредством снижения регуляции Bcl-2 и повышения регуляции Bax, что приводит к MOMP и активации каспазы-9.

Рак груди известен как одно из самых смертельных злокачественных новообразований среди женщин во всем мире и является серьезной проблемой общественного здравоохранения. Более того, известно, что существующие методы химиотерапии рака связаны с серьезными побочными эффектами, влияющими на качество жизни пациентов и продолжительность жизни. Таким образом, существует острая необходимость в новых терапевтических подходах. Это делает наши нынешние результаты важными для открытия новых горизонтов и направлений в области лечения рака.

Это исследование может быть расширено в будущем за счет использования экспериментов in vivo с использованием животных для оценки эффективности амигдалина при лечении рака. Предыдущие исследования показали, что они лечили мышей амигдалином с использованием 200, 100 и 50 мг/кг веса тела ( Albogami et al., 2020 ). Это правда, что используемые дозы концентрации (10–100 мМ) можно считать очень высокими для будущих исследований на животных. Тем не менее, тот факт, что они не были токсичными, дает нам уверенность в том, что они не будут способствовать возникновению побочных или токсических эффектов при использовании на животных. Кроме того, мы уточняем, что будут проведены новые исследования по оптимизации дозы, включая исследования ФК для обнаружения амигдалина в плазме перед использованием на животных.

Понимание цитопротекторного действия амигдалина во время химиотерапии может позволить разработать новые методы лечения, позволяющие снизить неблагоприятные побочные эффекты и, следовательно, улучшить качество и продолжительность жизни онкологических больных.

Заявление о доступности данных

Исходные данные, подтверждающие выводы настоящей статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

Вклад автора

Задумал, разработал, контролировал и предоставил финансирование для исследования, IP, AS и PC; Обзор литературы и эксперименты, PC и PB; Проанализировал данные, PC, M-IC и CN; Сгенерировал и предоставил реагенты/материалы/инструменты анализа, CN и PP; Статистический анализ, PC и CN; Составил черновик рукописи: PC и IP; Отредактировал рукопись: AS и PP. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить благодарность доценту Панайотису Политису за его любезную поддержку и предоставление использованных учебников.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все заявления, высказанные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют заявления их аффилированных организаций или заявления издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не гарантируется и не одобряется издателем.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.1013692/full#supplementary-material

Совместное введение амигдалина и дезоксиниваленола нарушило регуляторные белки, связанные с пролиферацией клеток свиных яичников in vitro

Оригинал статьи: https://www.researchgate.net/publication/318430770_Co-administration_of_amygdalin_and_deoxynivalenol_disrupted_regulatory_proteins_linked_to_proliferation_of_porcine_ovarian_cells_in_vitro

Дезоксиниваленол (ДОН) представляет собой один из наиболее распространенных трихотеценовых микотоксинов, вырабатываемых видами Fusarium, вызывая экономические и медицинские последствия. С другой стороны, было показано, что амигдалин обладает как профилактическими, так и лечебными свойствами, поэтому он использовался в качестве традиционного лекарства из-за его широкого спектра медицинских преимуществ, включая лечение или профилактику рака, снятие лихорадки, подавление кашля и утоление жажды. Целью этого исследования in vitro была оценка потенциального воздействия натурального продукта амигдалина в сочетании с микотоксином дезоксиниваленолом (ДОН) на ключевые регуляторы пролиферации клеток и апоптоза в гранулезных клетках яичников свиней. Клетки гранулезы яичников инкубировали в течение 24 ч с амигдалином (1, 10, 100, 1000, 10 000 мкг.мл⁻¹) в сочетании с дезоксиниваленолом (1 мкг.мл⁻¹), в то время как контрольная группа оставалась необработанной. Наличие пролиферативных (циклин B1, PCNA) и апоптотических маркеров (каспаза-3) в клетках гранулезы яичников свиней после обработки амигдалином (1, 10, 100, 1000, 10 000 мкг.мл⁻¹) в сочетании с дезоксиниваленолом (1 мкг.мл⁻¹) было обнаружено с помощью иммуноцитохимии. Присутствие пролиферативных (циклин B1, PCNA) и апоптотических маркеров (каспаза-3) в гранулезных клетках яичников свиней было обнаружено с помощью иммуноцитохимии. Совместное введение амигдалина и ДОН значительно (p < 0,05) увеличило количество гранулезных клеток, содержащих циклин B1 и PCNA во всех протестированных концентрациях по сравнению с контролем. Однако процент гранулезных клеток, содержащих основной апоптотический маркер каспазу-3, не отличался после совместного введения амигдалина и ДОН. Подводя итог, результаты этого исследования in vitro указывают на то, что совместное воздействие амигдалина и дезоксиниваленола может стимулировать пептиды, связанные с пролиферацией, в гранулезных клетках яичников свиней и, таким образом, изменять пролиферацию клеток и нормальное развитие фолликулов.

Амигдалин блокирует рост клеток рака мочевого пузыря in vitro, уменьшая циклин А и cdk2

Оригинал статьи:

https://neue-krebstherapie.com/wp-content/uploads/2015/03/Amygdalin_PlosOne_Wachstum_Blase.pdf

Аннотация

Амигдалин, природное соединение, использовалось многими онкологическими больными в качестве альтернативного подхода к лечению их болезни. Однако, действительно ли это вещество оказывает противоопухолевое действие, так и не было установлено. Было начато исследование in vitro для изучения влияния амигдалина (1,25-10 мг/мл) на рост панели линий клеток рака мочевого пузыря (UMUC-3, RT112 и TCCSUP). Были исследованы рост опухоли, пролиферация, клональный рост и прогрессирование клеточного цикла. Были исследованы белки, регулирующие клеточный цикл cdk1, cdk2, cdk4, циклин A, циклин B, циклин D1, p19, p27, а также сигналы, связанные с мишенью рапамицина млекопитающих (mTOR), phosphoAkt, phosphoRaptor и phosphoRictor. Амигдалин дозозависимо снижал рост и пролиферацию во всех трех линиях клеток рака мочевого пузыря, что отражалось в значительной задержке прогрессирования клеточного цикла и остановке G0/G1. Молекулярная оценка выявила снижение phosphoAkt, phosphoRictor и потерю компонентов Cdk и циклина. Поскольку наиболее выдающиеся эффекты амигдалина наблюдались на оси cdk2-циклин A, были проведены исследования по снижению siRNA, выявившие положительную корреляцию между уровнем экспрессии cdk2/циклин A и ростом опухоли. Таким образом, амигдалин может блокировать рост опухоли путем снижения модуляции cdk2 и циклина A. Для оценки практической ценности амигдалина как противоопухолевого препарата необходимо провести исследование in vivo.

Дихлорацетат (ДХА) и рак: обзор клинического применения

Лаборатория доклинических и трансляционных исследований, IRCCS-CROB, Реферальный онкологический центр Базиликаты, Рионеро-ин-Вультуре (Pz), 85028, Италия
2 Кафедра клинической и экспериментальной медицины, Университет Фоджи, Фоджа 71121, Италия

Корреспонденцию следует направлять Тициане Татарани; tiziana.tataranni@crob.it

Приглашенный редактор: Канхайя Сингх

Авторские права © 2019 Тициана Татаранни и Клаудия Пикколи. Это статья открытого доступа, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.

Получено:  24 июля 2019 г.
Изменено:  12 сентября 2019 г.
Принято:  11 октября 2019 г.
Опубликовано онлайн:  14 ноября 2019 г.

Обширный объем литературы описывает противораковые свойства дихлорацетата (DCA), но его эффективное клиническое применение в терапии рака по-прежнему ограничивается клиническими испытаниями. Возникновение побочных эффектов, таких как нейротоксичность, а также подозрение на канцерогенность DCA по-прежнему ограничивают клиническое применение DCA. Однако в последние годы число отчетов, поддерживающих использование DCA против рака, возросло также из-за большого интереса к нацеливанию на метаболизм опухолевых клеток. Анализ механизма действия DCA помог понять основы его селективной эффективности против раковых клеток. Успешное совместное введение DCA с традиционной химиотерапией, радиотерапией, другими препаратами или природными соединениями было протестировано на нескольких моделях рака. Новые системы доставки лекарств и многофункциональные соединения, содержащие DCA и другие препараты, по-видимому, улучшают биодоступность и кажутся более эффективными благодаря синергетическому действию нескольких агентов. Распространение отчетов, поддерживающих эффективность DCA в терапии рака, побудило провести дополнительные исследования, которые позволили найти другие потенциальные молекулярные мишени DCA. Интересно, что DCA может существенно влиять на фракцию стволовых клеток рака и способствовать искоренению рака. В совокупности эти результаты дают весомое обоснование для новых клинических трансляционных исследований DCA в терапии рака.

ВВЕДЕНИЕ

Рак является одной из основных причин смерти во всем мире. Несмотря на значительный прогресс в диагностических и терапевтических подходах, его искоренение по-прежнему представляет собой проблему. Слишком много факторов ответственны за неудачу терапии или рецидив, поэтому существует острая необходимость в поиске новых подходов к его лечению. Помимо типичных известных свойств, характерных для злокачественных клеток, включая аномальную пролиферацию, дерегуляцию апоптоза и клеточного цикла [1, 2] , раковые клетки также демонстрируют особую метаболическую машину, которая предлагает еще один многообещающий подход к терапии рака [3–5] . Наша группа уже предположила важность метаболической характеристики раковых клеток для прогнозирования эффективности метаболического лечения [6] . Лекарства, способные влиять на метаболизм рака, уже рассматриваются, показывая обнадеживающие результаты с точки зрения эффективности и переносимости [7] . В последнее десятилетие малая молекула DCA, уже используемая для лечения острого и хронического лактоацидоза, врожденных ошибок митохондриального метаболизма и диабета [8] , в основном предназначалась в качестве противоракового препарата. DCA представляет собой водорастворимую молекулу кислоты массой 150 Да, аналог уксусной кислоты, в которой два из трех атомов водорода метильной группы заменены атомами хлора (рисунок 1(a)) [9] . Введение DCA в дозах от 50 до 200 мг/кг/умер связано с уменьшением объема опухолевой массы, скорости пролиферации и распространения метастазов в нескольких доклинических моделях [10] . Наша группа уже наблюдала обратную корреляцию между способностью DCA убивать раковые клетки и их митохондриальной дыхательной способностью в карциномах ротовых клеток [11] . Более того, недавно мы описали способность DCA влиять на митохондриальную функцию и замедлять прогрессирование рака в модели рака поджелудочной железы [12] . На сегодняшний день доступны последовательные данные клинических испытаний и отчеты о случаях, описывающие введение DCA у онкологических больных [13–16] , но, несмотря на растущий объем литературы, подтверждающей эффективность DCA против рака, он пока не используется в клинической практике. Целью этого обзора является обобщение последних отчетов, предполагающих использование DCA в терапии рака в сочетании с химиотерапевтическими агентами, радиотерапией и другими химическими или природными соединениями, демонстрирующими противораковые свойства. Кроме того, мы описали данные о новых целевых фармакологических формулах DCA, способных избегать побочных эффектов и улучшать биодоступность и эффективность препарата, что еще больше поощряет его возможное клиническое применение. Наконец, мы рассмотрели последние результаты, предполагающие другие потенциальные механизмы действия DCA, включая новые данные о его способности влиять на фракцию стволовых клеток рака.

Рисунок 1: (a) Химическая структура DCA. (b) Механизм действия DCA: PDK: пируватдегидрогеназная киназа; PDH: пируватдегидрогеназа. Черные пунктирные линии — биохимические процессы, ингибируемые DCA; Красные стрелки — метаболические пути, активируемые DCA.

DCA и рак: механизм действия

Потенциальная эффективность DCA в терапии рака обусловлена ​​метаболическими свойствами раковых клеток, которые обычно характеризуются повышенной гликолитической активностью и сниженным митохондриальным окислением независимо от доступности кислорода, хорошо известный эффект Варбурга [17] . Чрезмерный гликолиз и возникающее в результате перепроизводство лактата вызывают состояние метаболического ацидоза в микроокружении опухоли [ 18] . Лактат, образующийся в результате гликолиза, поглощается окружающими клетками для поддержки роста опухоли и ингибирует механизмы апоптотической гибели клеток [19, 20] . Несколько ферментов, участвующих в гликолизе, регулируют апоптоз, и их сверхэкспрессия в раковых клетках способствует подавлению апоптоза [21] . В этой ситуации соли DCA избирательно воздействуют на раковые клетки, переключая их метаболизм с гликолиза на окислительное фосфорилирование путем ингибирования киназы пируватдегидрогеназы (PDK), ингибитора пируватдегидрогеназы (PDH) [10] . Активация PDH способствует митохондриальному окислению пирувата и нарушает метаболическое преимущество раковых клеток. Мутации митохондриальной ДНК, часто возникающие при опухолеобразовании и приводящие к дисфункции дыхательной цепи [22, 23] , делают злокачественные клетки неспособными поддерживать клеточную потребность в энергии. Кроме того, снижая выработку лактата, DCA противодействует ацидозному состоянию микроокружения опухоли, способствуя ингибированию роста опухоли и ее распространению [24] . Доставка пирувата в митохондрии вызывает ремоделирование органелл, что приводит к увеличению оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, и повышению уровня ROS с последующим снижением жизнеспособности раковых клеток [9] (рисунок 1(b)).

Побочные эффекты и ограничения при использовании DCA

Клиническое применение DCA доступно как в пероральных, так и в парентеральных формулах, а дозы варьируются от 10 до 50 мг/кг/смерть [25] . Никакие доказательства тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности не подтверждают безопасность DCA [26] . Распространенные желудочно-кишечные побочные эффекты часто возникают у определенного процента пациентов, получавших лечение DCA [15] . Наиболее известным ограничением для введения DCA, наблюдавшимся как в доклинических, так и в клинических исследованиях, является периферическая невропатия [27] . Избирательность повреждения нервной системы, вызванного DCA, может быть связана с отсутствием хорошо оснащенного аппарата, способного справиться с более устойчивым окислительным фосфорилированием в клетках, продуцирующих АТФ в основном посредством гликолиза [28] . Возникающая в результате перегрузка митохондрий ставит под угрозу эффективность антиоксидантных систем, неспособных противостоять чрезмерному количеству ROS. В этой ситуации современное введение антиоксидантов должно представлять собой дополнительную стратегию для минимизации невропатии, вызванной DCA [27] . Экспрессия и активность глутатионтрансферазы zeta1 (GSTZ1), первого фермента, ответственного за клиренс DCA, могут влиять на сущность повреждения. Несинонимичные функциональные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в гене человека GSTZ1 приводят к появлению различных гаплотипов, которые отвечают за различную кинетику и динамику DCA. Была продемонстрирована четкая связь между гаплотипом GSTZ1 и клиренсом DCA. На этой основе персонализированная дозировка DCA, основанная не только на массе тела, может минимизировать или предотвратить побочные эффекты у пациентов, хронически принимающих этот препарат [29] . Возникновение нейропатии связано с хроническим пероральным приемом DCA и является обратимым эффектом, ограниченным временем лечения [30] . Внутривенный путь снижает, OH Cl Cl O (a) Раковые клетки Раковые клетки Смерть раковых клеток Лактат Опухоль Микросреда Лактат Пируват Гликолиз PDK DCA PDH Окислительное фосфорилирование Апоптоз восстановление Цитохром c Глюкоза (b) Рисунок 1: (a) Химическая структура DCA. (b) Механизм действия DCA: PDK: пируватдегидрогеназная киназа; PDH: пируватдегидрогеназа. Черные пунктирные линии, биохимические процессы, ингибируемые DCA; Красные стрелки, метаболические пути, активируемые DCA. 2 Окислительная медицина и клеточная продолжительность жизни, следовательно, потенциал нейротоксичности и позволяют достижению более высоких концентраций препарата обойти пищеварительную систему [13] .
Поскольку DCA входит в число побочных продуктов дезинфекции воды, обнаруженных в низких концентрациях в питьевой воде, его потенциальная канцерогенность находится на стадии оценки. Исследования, проведенные на мышах, связывают воздействие DCA в раннем возрасте с увеличением частоты возникновения гепатоцеллюлярных опухолей [31]. Вполне возможно, что постоянные изменения в метаболизме клеток, вызванные DCA, могут вызывать эпигенетические эффекты. Длительная индукция PDH и других окислительных путей, связанных с метаболизмом глюкозы, может способствовать увеличению активных форм кислорода и митохондриального стресса [27] . Однако в клинических исследованиях не сообщается о каких-либо доказательствах канцерогенного эффекта при введении DCA в терапии рака.

Синергетический эффект DCA и химиотерапевтических агентов

Комбинирование различных препаратов является общепринятой стратегией для получения синергического полезного эффекта в терапии рака, снижения дозировки препаратов, минимизации рисков токсичности и преодоления лекарственной устойчивости. Совместное введение DCA и традиционных химиотерапевтических агентов было предназначено и протестировано на нескольких моделях рака (таблица 1). Лечение DCA, по-видимому, повышает эффективность химиотерапии, вызывая биохимические и метаболические изменения, что приводит к значительным изменениям энергетического баланса раковых клеток. Исследование, проведенное при немелкоклеточном раке легких (НМРЛ), показало как in vitro, так и in vivo, что совместное введение DCA с паклитакселом повышает эффективность гибели клеток за счет ингибирования аутофагии [32] . Эффективная комбинация DCA и доксорубицина (DOX) была протестирована на клетках HepG2, продемонстрировав способность DCA нарушать клеточную антиоксидантную защиту, тем самым способствуя окислительному повреждению, в свою очередь, вызванному лечением DOX [33] . Существует сильная связь между сверхэкспрессией PDK и химиорезистентностью; таким образом, можно предположить, что ингибирование PDK может помочь повторно сенсибилизировать раковые клетки к препаратам. Сверхэкспрессия изоформы PDK2 была связана с резистентностью к паклитакселу при НМРЛ. Интересно, что комбинация DCA с паклитакселом была более эффективна в уничтожении резистентных клеток, чем лечение паклитакселом или DCA по отдельности [34] . Подобно НМРЛ, интересное исследование in vivo, проведенное при распространенном раке мочевого пузыря, показало повышенную экспрессию изоформы PDK4 при высокой степени злокачественности по сравнению с раком низкой степени злокачественности, а совместное лечение DCA и цисплатином значительно уменьшило объемы опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [35]. Недавнее исследование подтвердило способность DCA устранять химиорезистентность, связанную с PDK4, также при гепатоцеллюлярной карциноме человека (ГЦК) [36] .

Таблица 1: Список отчетов, предполагающих положительный эффект совместного применения DCA и химиотерапии при нескольких типах рака.

Синергетический эффект DCA и других потенциальных противораковых препаратов

Последовательный объем литературы предполагает положительные эффекты совместного введения DCA с соединениями, которые в настоящее время используются для лечения других заболеваний, но демонстрируют противораковые свойства в нескольких моделях рака (таблица 2). Современное введение DCA и антибиотика салиномицина, недавно заново открытого за его цитотоксические свойства как потенциального противоракового препарата, было протестировано на линиях клеток колоректального рака. Их лечение, по-видимому, оказывает синергический цитотоксический эффект, ингибируя экспрессию белков, связанных с множественной лекарственной устойчивостью [37] . Раковые клетки, лишенные метаболических ферментов, участвующих в метаболизме аргинина, могут привести к чувствительности к лечению аргиназой. Интересно, что совместное введение рекомбинантной аргиназы и DCA оказывает антипролиферативный эффект при тройном негативном раке молочной железы из-за активации p53 и индукции остановки клеточного цикла [38] . Ингибиторы COX2, в основном используемые в качестве противовоспалительных препаратов, недавно были предложены в качестве противоопухолевых препаратов из-за их антипролиферативной активности. Интригующее исследование, проведенное на клетках рака шейки матки, показало неспособность DCA убивать клетки рака шейки матки, сверхэкспрессирующие COX2, и продемонстрировало, что ингибирование COX2 целекоксибом делает клетки рака шейки матки более чувствительными к DCA как в экспериментах in vitro, так и in vivo [39] . Поскольку DCA способствует окислительному фосфорилированию за счет снижения гликолитической активности, сочетание DCA с другими препаратами, усиливающими состояние зависимости от глюкозы, может быть многообещающей стратегией. Такой подход был опробован при раке головы и шеи, при котором введение пропранолола, неселективного бета-блокатора, способного влиять на митохондриальный метаболизм опухолевых клеток, вызывало гликолитическую зависимость и энергетический стресс, делая клетки более уязвимыми для лечения DCA [40] . Аналогичные результаты были получены в клетках меланомы, в которых введение ингибиторов рецептора ретиноевой кислоты β (RARβ) вызывало сенсибилизацию к DCA [41] . Положительный эффект совместного введения DCA с метформином, гипогликемическим препаратом, широко используемым для лечения диабета, был продемонстрирован в доклинической модели глиомы [42] , а также в низкометастатическом варианте карциномы легких Льюис (LLC) [43] . Цзян и его коллеги исследовали эффекты фенформина, аналога метформина, и DCA в глиобластоме, продемонстрировав, что одновременное ингибирование комплекса I и PDK фенформином и DCA, соответственно, снижало самообновление и жизнеспособность стволовых клеток глиомы (GSC), что предполагает их возможное использование для воздействия на фракцию стволовых клеток рака [44] .

Таблица 2: Список препаратов, основная функция которых была протестирована в сочетании с DCA на нескольких моделях рака.

Совместное использование DCA и натуральных соединений

Клиническое применение природных соединений представляет собой многообещающий новый подход к лечению ряда заболеваний [45] . Все больше литературы подтверждает обнаружение среди природных соединений биологически активных веществ, выделенных растениями, грибами, бактериями или морскими организмами, которые оказывают благотворное воздействие на здоровье человека [46–48] . Предположение о природных соединениях или их производных, по-видимому, представляет собой обнадеживающий подход к предотвращению возникновения или рецидива рака, и это обычно называется химиопрофилактикой [49] . Более того, природные вещества оказывают благотворное воздействие при терапии рака при совместном введении с другими препаратами, демонстрируя их способность преодолевать лекарственную устойчивость, увеличивать противораковый потенциал и снижать дозы лекарств и токсичность [50, 51] . Интересно, что недавно было предложено совместное введение DCA и природных соединений. В исследовании изучалось комбинированное действие DCA с куркумином, смешанным с эфирным маслом, соединением с полезными свойствами как для профилактики, так и для лечения рака [52] , демонстрирующим противораковый потенциал против HCC [53] . В частности, сочетание обоих соединений синергически снижало выживаемость клеток, способствуя апоптозу клеток и вызывая внутриклеточную генерацию ROS. Бетулин, природное соединение, выделенное из бересты, уже известно своим антипролиферативным и цитотоксическим действием против нескольких линий раковых клеток [54–56] . Исследование противоопухолевой активности производных бетулина in vitro при НМРЛ подтвердило его способность ингибировать in vivo и in vitro рост клеток рака легких, блокируя фазу G2/M клеточного цикла и вызывая активацию каспазы и фрагментацию ДНК. Интересно, что производное бетулина Bi-L-RhamBet было способно нарушать митохондриальную электрон-транспортную цепь (ETC), вызывая выработку ROS. Учитывая свойство DCA увеличивать общее окисление глюкозы в митохондриях через цикл Кребса и ETC, авторы объединили Bi-L-RhamBet с DCA, продемонстрировав его значительную потенцированную цитотоксичность [57] .

DCA и радиосенсибилизация

Радиотерапия представляет собой еще одну стратегию лечения рака и обеспечивает локальный подход путем введения высокоэнергетических лучей [58] . Основным эффектом облучения является индукция ROS с последующим повреждением ДНК, хромосомной нестабильностью и гибелью клеток путем апоптоза [59] . Однако некоторые опухоли демонстрируют или развивают радиорезистентность, которая является причиной неудачи радиотерапии и высокого риска рецидива опухоли или метастазирования [60] . Несколько факторов могут быть ответственны за радиорезистентность [61] . Среди них гипоксия, распространенное состояние микросреды опухоли, характеризующееся низким уровнем кислорода и сниженной генерацией видов ROS, может блокировать эффективность ионизирующего излучения [62] . Поэтому увеличение оксигенации опухоли таким образом, чтобы способствовать значительному количеству ROS [63] или напрямую индуцировать выработку ROS, может представлять собой стратегию повышения радиосенсибилизации [64 , 65] . В этой ситуации введение DCA, которое, как известно, индуцирует выработку ROS [11, 66] , может представлять собой стратегию преодоления радиорезистентности опухоли. Более того, известно, что метаболические изменения, характерные для развития рака, влияют на радиочувствительность [67, 68] . Следовательно, нацеливание на промежуточные продукты метаболизма рака может представлять собой стратегию улучшения селективного ответа рака на облучение [69] . Эффективность DCA для повышения радиочувствительности уже была продемонстрирована как на клетках глиобластомы [70] , так и на плоскоклеточной карциноме пищевода [71] . Совсем недавно было продемонстрировано, что DCA повышает радиочувствительность в клеточной модели медуллобластомы, смертельной опухоли мозга у детей, вызывая изменения метаболизма ROS и функции митохондрий и подавляя способность к восстановлению ДНК [72] . Поскольку роль иммунотерапии в восстановлении иммунной защиты против прогрессирования опухоли и метастазирования привлекает большое внимание в последние годы [73] , Гупта и Двараканат представили современное состояние возможных эффектов гликолитических ингибиторов, включая DCA, на радиосенсибилизацию опухоли, сосредоточив свое внимание на взаимодействии между метаболическими модификаторами и иммунной модуляцией в процессах радиосенсибилизации [74] . Интересно, что они сообщили о способности DCA способствовать иммунной стимуляции посредством ингибирования накопления лактата, что еще больше поддерживает его использование в качестве адъюванта радиотерапии.

DCA и новые лекарственные формы

Растет интерес к разработке новых лекарственных форм для улучшения доставки лекарств, повышения эффективности и снижения доз и, следовательно, нежелательных эффектов. В этой ситуации системы доставки лекарств (СДЛ) представляют собой новый рубеж в современной медицине [75] . СДЛ предлагают возможность создания гибрида металлоорганических каркасов (МОФ), сочетающего биосовместимость органической системы с высокими нагрузками неорганической фракции [76] . Несколько линий доказательств предполагают эффективную функционализацию наночастиц с помощью ДКА. Лазаро и коллеги [77] исследовали различные протоколы для функционализации ДКА наночастиц терефталата циркония (Zr) (UiO-66). Они продемонстрировали цитотоксичность и селективность тех же СДЛ против различных линий раковых клеток. Более того, они исключили возможную реакцию иммунной системы на ДКА-МОФ in vitro. Та же группа позже показала возможность загрузки Zr MOF вторым противораковым препаратом, таким как 5-фторурацил (5-FU), чтобы воспроизвести синергический эффект двух препаратов [78] . MOF на основе циркония, загруженный DCA, также был предназначен в качестве привлекательной альтернативы UiO-66, показывая селективную цитотоксичность in vitro по отношению к нескольким линиям раковых клеток и хорошую переносимость иммунной системой нескольких видов [79] . Недавно Štarha et al. [80] впервые синтезировали и охарактеризовали полусэндвич-комплексы, содержащие рутений или осмий и DCA (рисунок 2(a)). Оба комплекса Ru-dca и Os-DCA были проверены на линиях клеток карциномы яичников, продемонстрировав большую цитотоксичность, чем цисплатин в отдельности. Оба комплекса были способны индуцировать высвобождение цитохрома c (Cytc) из митохондрий, косвенный показатель активации апоптосомы, и, по-видимому, были менее токсичными по отношению к здоровым первичным гепатоцитам человека, что указывает на селективность в отношении рака по сравнению с нераковыми клетками. Многообещающие результаты были также получены в клетках рака молочной железы с тройным негативом [81] . Конъюгат рения (I)-DCA продемонстрировал эффективное проникновение в раковые клетки и селективное накопление в митохондриях, вызывая митохондриальную дисфункцию и метаболические нарушения [82] . В последние годы было разработано несколько многоактивных препаратов для современного нацеливания на различные внутриклеточные пути с использованием одной формулы. Безопасная, простая, воспроизводимая наноформула комплекса доксорубицинDCA (рисунок 2(b)) была успешно испытана на модели меланомы у мышей, показав увеличение способности к загрузке препарата, снижение побочных эффектов и усиление терапевтического эффекта [83] . Были синтезированы противоопухолевые пролекарства Pt (IV) двойного действия китеплатина с аксиальными лигандами DCA (рисунок 2(c)), охарактеризованы и протестированы на различных линиях опухолевых клеток и in vivo [84]. Для преодоления резистентности рака были предложены тройные производные Pt (IV) цисплатина в качестве новых мощных противораковых агентов, способных конъюгировать действие цисплатина, ингибиторов циклооксигеназы и DCA (рисунок 2(d)) [85] . Новый комплекс, содержащий DCA, платину и биотин (DPB), был успешно испытан, демонстрируя многогранные противоопухолевые свойства (рисунок 2(e)). Авторы продемонстрировали способность такого пролекарства влиять на энергетический метаболизм, способствовать апоптозу и взаимодействовать с ДНК. Высокая селективность биотина в отношении раковых клеток сводит к минимуму пагубное воздействие на нормальные клетки и улучшает лечебный эффект на опухоли [86] . Характеристики и экспериментальные доказательства основных классов соединений обобщены в таблице 3.

Таблица 3: Свойства основных классов лекарственных форм DCA, протестированные на линиях раковых клеток и моделях in vivo с соответствующими экспериментальными доказательствами.

Рисунок 2: Новые лекарственные формы, содержащие DCA. (a) Схематическое изображение комплексов Os-DCA и Ru-DCA [81]. (b) Комплекс доксорубицин (DOX)-DCA [83]. (c) Пролекарства Pt двойного действия китеплатина и DCA [84]. (d) Примеры производных Pt(IV) тройного действия цисплатина, содержащих DCA (красный), производные цисплатина (черный) и ингибиторы COX (зеленый) [85]. (e) Химическая структура DPB, содержащего DCA (красный), биотин (синий) и комплекс платины (Pt) (черный) [86].

Другие предлагаемые механизмы действия DCA

Метаболический сдвиг от гликолиза к окислению глюкозы из-за ингибирования PDK и последующей активации PDH является наиболее известным и общепринятым молекулярным эффектом введения DCA. Последующие биохимические изменения, включая увеличение ROS и изменение потенциала митохондриальной мембраны, могут быть ответственны за остановку пролиферации и гибель раковых клеток, тем самым объясняя полезный потенциал DCA в лечении рака [9] . Однако молекулярные промежуточные продукты, активируемые после введения DCA, до сих пор неизвестны. Вполне возможно, что такая малая молекула может напрямую или косвенно влиять на другие клеточные и молекулярные мишени (рисунок 3), демонстрируя другие механизмы действия, чтобы объяснить ее эффективность также в клеточных моделях, где она не производит ожидаемого метаболического сдвига [12] . Протеомный подход, примененный к клеткам рака легких, продемонстрировал способность DCA увеличивать концентрацию каждого промежуточного продукта TCA, при этом он не влиял на поглощение глюкозы или гликолитический процесс от глюкозы до пирувата [87] . В попытке пролить свет на механизм действия DCA, Дюбуа и коллеги использовали подход, основанный на метаболомике, на нескольких линиях клеток рака яичников, обработанных DCA, и обнаружили общее заметное истощение внутриклеточного пантотената, предшественника CoA, а также сопутствующее увеличение CoA, что предполагает способность DCA увеличивать биосинтез CoA de novo. Поскольку высокие концентрации CoA оказались токсичными для клеток, этот метаболический эффект может быть ответственен за токсичность раковых клеток, опосредованную DCA [88] . Совсем недавно работа Эль Сайеда и соавторов представила новую основанную на доказательствах гипотезу, предполагающую, что эффективность DCA против рака может быть обусловлена ​​его способностью противодействовать ацетату [89] , который, как известно, является энергетическим субстратом для глиобластомы и метастазов в мозг, способным усиливать синтез ДНК, РНК и белка, а также посттрансляционные модификации, тем самым способствуя пролиферации клеток и прогрессированию рака. Более того, высокие уровни ацетата связаны с устойчивостью к противораковым препаратам [90] . Было показано, что DCA способен обращать вспять метаболические изменения, вызванные ацетатом, восстанавливая физиологические уровни сывороточного лактата и свободных жирных кислот, а также концентрацию калия и фосфора. По мнению авторов, благодаря структурному сходству с ацетатом, DCA может ингибировать метаболические эффекты, вызванные ацетатом, ответственные за рост раковых клеток и химиорезистентность [89] . Другим возможным дополнительным эффектом DCA может быть модуляция pH. Известно, что модуляция уровня pH влияет на процессы пролиферации и апоптоза [91] , а также на чувствительность к химиотерапии [92].Обработка DCA может как увеличивать, так и уменьшать внутриклеточный pH. Вторичным эффектом перенаправления пирувата в митохондрии с помощью DCA будет снижение лактата и последующее увеличение внутриклеточного pH. С другой стороны, DCA способен уменьшать экспрессию монокарбоксилатных транспортеров и V-АТФазы с последующим снижением pH, и это особенно происходит в опухолевых клетках, экспрессирующих большее количество этих переносчиков по сравнению с нормальными аналогами [93] . Учитывая способность вызывать быстрое внутриклеточное закисление опухоли, Albatany et al. [94] предположили о возможном использовании DCA в качестве трекера при визуализации in vivo мышиной модели глиобластомы и поддержали терапевтическое использование DCA, поскольку известно, что внутриклеточное закисление вызывает активацию каспазы и фрагментацию ДНК раковых клеток [95] . Животные модели позволяют идентифицировать возможную дополнительную молекулярную мишень DCA. Эксперименты, проведенные на крысах, подчеркнули способность DCA ингибировать экспрессию почечного котранспортера Na-K-2Cl (NKCC) в почках крыс [96] . Поскольку NKCC является важным биомаркером регуляции внеклеточного и внутриклеточного ионного гомеостаза и участвует в прогрессировании клеточного цикла, он играет важную роль в пролиферации раковых клеток, апоптозе и инвазии. Белкахла и др. [97] исследовали взаимодействие между таргетингом метаболизма и экспрессией транспортеров ABC, ответственных за экспорт лекарств из клеток и последующую множественную лекарственную устойчивость, и обнаружили, что лечение DCA способно снизить экспрессию генов и белков транспортеров ABC в нескольких опухолевых клетках, экспрессирующих дикий тип p53, как in vitro, так и in vivo [98] . Уже была продемонстрирована способность DCA вызывать дифференциацию посредством модуляции взаимодействия PKM2/Oct4 в клетках глиомы [99] . Полученное снижение уровней транскрипции Oct4 было связано с уменьшением фенотипа стволовости и значительным повышением чувствительности к клеточному стрессу. Это наблюдение позволяет предположить потенциальную роль DCA против раковых стволовых клеток (CSC).

Рисунок 3: Другие предлагаемые механизмы действия DCA. Основной механизм действия DCA заключается в ингибировании пируватдегидрогеназной киназы (PDK), что приводит к активации пируватдегидрогеназы (PDH) и содействует окислительному фосфорилированию (1). DCA также увеличивает концентрацию промежуточных продуктов каждого цикла Кребса (2) [87]. DCA вызывает токсичность клеток посредством синтеза CoA de novo (3) [88]. DCA может противодействовать ацетату (4) [90]. DCA модулирует внутриклеточное закисление (5) [93, 94]. DCA ингибирует котранспортер Na-K-2Cl (6) [96]. DCA подавляет экспрессию генов и белков транспортеров ABC (7) [97]. DCA снижает экспрессию генов, связанных с самообновлением, и влияет на фракцию стволовых клеток рака (8) [99].

DCA и раковые стволовые клетки

Растет интерес к таргетированию раковых стволовых клеток (CSC), которые, по-видимому, являются основной причиной рецидива опухоли [100] . CSC обладают способностью к самообновлению с нормальными стволовыми клетками и могут давать начало дифференцирующимся клеткам, ответственным за возникновение опухоли, а также злокачественную прогрессию [101] . Низкая скорость пролиферации и специфический метаболический профиль способствуют тому, что CSC становятся устойчивыми к традиционной химиотерапии [102] . Возникла острая необходимость в разработке новых терапевтических средств, способных влиять на жизнеспособность раковых стволовых клеток [103] с целью полного уничтожения опухолевой массы. Обширный объем литературы фокусирует внимание на метаболическом фенотипе CSC, которые, по-видимому, отличаются от дифференцированных раковых клеток и могут представлять собой терапевтическую мишень [104–108] . В этой ситуации была выдвинута гипотеза о возможной чувствительности фракции CSC к DCA, которая была протестирована на различных моделях рака. Эмбриональные стволовые клетки карциномы представляют собой одну из наиболее подходящих моделей для изучения поддержания и дифференциации CSC, а также идентификации препаратов и молекул, способных модулировать эти процессы [109] . Исследования, проведенные на эмбриональных стволовых клетках (ESC), представляют собой предварительные важные доказательства, подтверждающие возможную эффективность DCA [110] . Интересно, что обработка ESC DCA способствует потере плюрипотентности и сдвигает их в сторону более активного окислительного метаболизма, что сопровождается значительным снижением экспрессии HIF1a и p53 [111] . Вега-Наредо и др. [112] описали важность митохондриального метаболизма в управлении стволовостью и дифференциацией в такой модели. Они охарактеризовали метаболический профиль фракции стволовых клеток и предположили меньшую восприимчивость фенотипа ствола к митохондриально-направленной терапии. Принуждение CSC к окислительному метаболизму путем обработки DCA позволило перейти от стволовости к дифференциации. Несколько отчетов подтверждают существование CSC в глиоме [113, 114] , и эффективность DCA для поражения CSC была широко оценена при таком типе рака, который так трудно лечить обычными методами и который характеризуется низкими показателями выживаемости. Еще в 2010 году Микелакис и коллеги предположили, как in vitro, так и in vivo, способность DCA вызывать апоптоз фракции стволовых клеток рака [26] . Модель глиомы на крысах, повторяющая несколько особенностей человеческой глиобластомы, подтвердила эффективность DCA для потенцирования апоптоза CSC глиомы, характеризующегося значительной сверхстимуляцией гликолитического пути по сравнению с нормальными стволовыми клетками [115]. Кроме того, Цзян и др. исследовали влияние DCA на небольшую популяцию стволовых клеток глиомы (GSC), выделенных из глиобластомы, продемонстрировав снижение свойств самообновления и увеличение процента гибели клеток [44] . Более того, тест in vivo на мышах с ксенотрансплантатами, полученными из GSC, обработанных DCA, показал значительное увеличение общей выживаемости. Лечение DCA также было протестировано на фракции стволовых клеток меланомы, и полученная биоэнергетическая модуляция смогла противодействовать протуморогенному действию ингибитора c-Met [116] . Совсем недавно проведенная работа на гепатоцеллюлярной карциноме человека выявила сверхэкспрессию PDK4 в сферах, происходящих из раковых клеток, с определенным фенотипом, подобным стволовому. Интересно, что лечение DCA смогло снизить жизнеспособность как раковых дифференцированных клеток, так и раковых стволовых клеток и обратить вспять химиорезистентность к традиционной терапии [36] . Наша группа недавно испытала способность DCA снижать экспрессию маркеров стволовых клеток рака CD24/CD44/EPCAM в клеточной линии рака поджелудочной железы, а также нарушать образование и жизнеспособность сфероидов [12] , что дополнительно подтверждает данные, полученные в других моделях рака. Наряду с химиорезистентностью, радиорезистентность также представляет собой ограничение эффективного лечения рака, и CSC, по-видимому, ответственны за такую ​​рефрактерность [117] . Сан и др. продемонстрировали способность DCA повышать радиочувствительность клеток медуллобластомы, влияя на стволоподобные клоны, снижая процент экспрессии CD133-позитивных клеток и уменьшая образование сфер [72] . Более того, в той же клеточной модели они показали измененный механизм репарации ДНК, вызванный DCA, способный объяснить повышенную эффективность радиотерапии.

Выводы

Нацеливание на метаболизм раковых клеток представляет собой новый фармакологический подход к лечению рака. Способность DCA переключать метаболизм с гликолиза на окислительное фосфорилирование увеличила интерес к этому препарату, уже известному своими противораковыми свойствами. Накопленные за последние годы доказательства подтверждают способность DCA преодолевать химио- и радиорезистентность при нескольких типах рака и позволяют выдвинуть гипотезу о дополнительных клеточных мишенях, способных объяснить его способность убивать раковые клетки. Необходимо разработать дальнейшие клинические исследования, которые в настоящее время ограничены пациентами с плохим прогнозом и запущенными рецидивирующими новообразованиями, уже не поддающимися другим традиционным методам лечения. Его потенциальная эффективность против раковых стволовых клеток, а также разработка новых лекарственных форм приближают нас к достижению эффективного клинического применения DCA.

Конфликты интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана Текущими исследовательскими фондами Министерства здравоохранения Италии в IRCCS-CROB, Рионеро-ин-Вультуре, Потенца, Италия.

Амигдалин подавляет рост клеток почечно-клеточной карциномы in vitro

• Авторы: 
  • Ева Юнгель
   
  • Анита Томас
  
  

Аннотация

Хотя амигдалин используется многими онкологическими больными в качестве противоопухолевого средства, отсутствует информация об эффективности и токсичности этого природного соединения. В настоящем исследовании изучалось ингибирующее действие амигдалина на рост клеток почечно-клеточной карциномы (ПКР). Амигдалн (10 мг/мл) применялся к линиям клеток ПКР, Caki-1, KTC-26 и A498, в течение 24 часов или 2 недель. Необработанные клетки служили в качестве контроля. Рост и пролиферацию опухолевых клеток определяли с помощью тестов MTT и BrdU, а также оценивали фазы клеточного цикла. Экспрессия активирующих клеточный цикл белков cdk1, cdk2, cdk4, циклина A, циклина B, циклина D1 и D3, а также ингибирующих клеточный цикл белков p19 и p27 изучалась с помощью вестерн-блоттинга. Также исследовалась поверхностная экспрессия маркеров дифференциации E- и N-кадгерина. Функциональная блокада siRNA использовалась для определения влияния нескольких белков на рост опухолевых клеток. Лечение амигдалином вызвало значительное снижение роста и пролиферации клеток RCC. Этот эффект коррелировал с уменьшением процента клеток RCC в фазе G2/M и увеличением процента клеток в фазе G0/1 (Caki-1 и A498) или остановкой клеточного цикла в S-фазе (KTC-26). Кроме того, амигдалин вызвал заметное снижение белков, активирующих клеточный цикл, в частности cdk1 и циклина B. Функциональное блокирование cdk1 и циклина B привело к значительному снижению роста опухолевых клеток во всех трех линиях клеток RCC. Помимо ингибирующего воздействия на рост, амигдалин также модулировал маркеры дифференциации, E- и N-кадгерин. Следовательно, воздействие амигдалина на клетки RCC подавляло прогрессирование клеточного цикла и рост опухолевых клеток за счет нарушения экспрессии cdk1 и циклина B. Более того, мы отметили, что амигдалин влияет на маркеры дифференциации. Таким образом, мы предполагаем, что амигдалин оказывает противоопухолевое действие на ПКР in vitro.

Введение

Почечно-клеточная карцинома (ПКР) является наиболее распространенным раком почки и самой агрессивной урологической опухолью, и ее заболеваемость растет ( 1 ). Примерно у 15-20% пациентов с ПКР уже есть метастазы на момент постановки диагноза, в то время как у 30% пациентов метастазы развиваются во время терапии. После метастазирования прогноз для пациентов неблагоприятный. Расширение знаний о молекулярных механизмах действия ПКР способствовало разработке таргетной терапии в течение последнего десятилетия, тем самым улучшая прогноз для пациентов на поздних стадиях заболевания. Однако, несмотря на терапевтические достижения, прогноз для пациентов с ПКР остается неблагоприятным, 5-летняя выживаемость остается между 5 и 12% ( 2 , 3 ).

Большинство пациентов с прогрессирующим раком почки хотят активно участвовать в борьбе с раком и/или избегать неблагоприятных побочных эффектов, которые часто возникают при традиционной терапии. Поэтому многие пациенты обращаются к комплементарной и альтернативной медицине (КАМ). Более 50% онкологических больных в Европе ( 4 ) и до 80% онкологических больных в Соединенных Штатах ( 5 ) используют КАМ вместе с традиционной терапией или вместо нее.

Амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид) — это природное соединение, которое часто используют онкологические больные. Он содержится в косточках абрикосов, персиков, яблок и горького миндаля ( 6–8 ). Первые исследования по использованию амигдалина онкологическими больными были проведены в России в 1840-х годах ( 9 ). В 1920-х годах амигдалин также назначали онкологическим больным в Соединенных Штатах ( 10 ). В 1950-х годах был представлен полусинтетический , химически иной производный амигдалина, лаэтрил. После появления лаэтрила термины амигдалин и лаэтрил часто использовались как синонимы, что затрудняло выводы из исследований, в которых не делалось различий между этими двумя соединениями ( 11 ) . В 1970-х годах амигдалин/леатрил стал одним из самых популярных нетрадиционных методов лечения рака. К 1978 году около 70 000 онкологических больных в США использовали амигдалин ( 12 ) . Национальный институт рака (NCI) инициировал несколько исследований ( 13–16 ) с отрезвляющими результатами. В резюме единственного испытания фазы II не было приписано существенной пользы амигдалину, в то время как было описано несколько пациентов с симптомами отравления цианидом (HCN) ( 13 ) . Однако качество этого исследования сомнительно, поскольку использовалась гетерогенная когорта пациентов, не были включены контрольные группы, а для внутривенной терапии использовался рацемат вместо чистого амигдалина. Все официальные суждения относительно амигдалина были основаны на этом испытании, поскольку никаких других клинических испытаний с амигдалином не доступно. Немецкий федеральный институт лекарственных средств и медицинских приборов (BfArM) ( http://www.bfarm.de/DE/Home/home_node.html ) также классифицировал амигдалин как сомнительный препарат, как и коллеги в других странах. Несмотря на противоречия и отсутствие научно обоснованных данных о пользе и рисках амигдалина, многие онкологические пациенты используют амигдалин ( 11 , 17 ). Таким образом, чтобы прояснить многие вопросы, на которые еще предстоит ответить относительно влияния амигдалина на рост и пролиферацию опухоли, в настоящем исследовании были определены прогрессия клеточного цикла и основные молекулярные режимы действия в клетках почечно-клеточного рака.

Материалы и методы

Клеточные культуры и лечение амигдалином

Линии клеток карциномы почки Caki-1, KTC-26 и A498 были приобретены у LGC Promochem (Wesel, Германия). Клетки выращивали и субкультивировали в среде RPMI-1640 (полученной у Seromed, Берлин, Германия) с добавлением 10% FCS, 20 мМ HEPES-буфера, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в инкубаторе. Субкультуры из пассажей 5–24 были отобраны для использования в экспериментах. Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток и затем добавлен к опухолевым клеткам в концентрации 10 мг/мл [ранее оцененной как оптимальная концентрация ( 18 )] на 24 часа или 2 недели (три раза в неделю) для оценки острого и хронического лечения. Контрольные группы оставались необработанными. Во всех экспериментах в настоящем исследовании обработанные культуры опухолевых клеток сравнивались с необработанными культурами опухолевых клеток. Для изучения токсического действия амигдалина жизнеспособность клеток определялась с помощью трипанового синего (Gibco/Invitrogen, Дармштадт, Германия).

Измерение роста, пролиферации и апоптоза опухолевых клеток

Рост клеток оценивали с помощью анализа восстановления красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) (Roche Diagnostics, Пенцберг, Германия). Клетки Caki-1 (50 мкл , 1×10 5 клеток/мл) высевали на 96-луночные планшеты для культивирования тканей. Через 24, 48 и 72 часа добавляли 10 мкл МТТ (0,5 мг/мл) еще на 4 часа. После этого клетки лизировали в буфере, содержащем 10% SDS в 0,01 М HCl. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO 2 . Поглощение при 550 нм определяли для каждой лунки с помощью микропланшетного иммуноферментного анализа (ELISA). После вычитания фонового поглощения результаты выражались как среднее количество клеток.

Пролиферацию клеток измеряли с помощью набора для определения пролиферации клеток BrdU ELISA (Calbiochem/Merck Biosciences, Дармштадт, Германия). Опухолевые клетки, посеянные на 96-луночных планшетах, инкубировали с 20 мкл раствора для маркировки BrdU на лунку в течение 8 ч, фиксировали и детектировали с помощью анти-BrdU mAb в соответствии с инструкциями производителя. Поглощение измеряли при 450 нм с помощью ридера для микропланшетов ELISA.

Для оценки того, был ли рост опухолевых клеток нарушен или уменьшен из-за апоптоза, экспрессия аннексина V/пропидиум йодида (PI) была оценена с помощью набора Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия). Опухолевые клетки были дважды промыты PBS и затем инкубированы с 5 мкл Annexin V-FITC и 5 мкл PI в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки были проанализированы методом проточной цитометрии с использованием FACSCalibur (BD Biosciences, Гейдельберг, Германия). Процент апоптотических клеток (ранних и поздних) в каждом квадранте был рассчитан с помощью программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences).

Процент клеток в разных фазах клеточного цикла

Анализ клеточного цикла проводился на субконфлюэнтных клеточных культурах. Популяции опухолевых клеток окрашивались PI с использованием набора реагентов CycleTEST PLUS DNA, а затем подвергались проточной цитометрии с использованием FACScan (оба от Becton-Dickinson, Гейдельберг, Германия). Из каждого образца было собрано 10 000 событий. Сбор данных проводился с использованием программного обеспечения CellQuest, а распределение клеточного цикла рассчитывалось с использованием программного обеспечения ModFit (Becton-Dickinson). Количество клеток с гейтированием в фазах G1, G2/M или S выражается в процентах.

Экспрессия белков, регулирующих клеточный цикл

Белки, регулирующие клеточный цикл, исследовали с помощью вестерн-блоттинга. Лизаты опухолевых клеток наносили на 7-15% полиакриламидный гель (в зависимости от размера белка) и подвергали электрофорезу в течение 90 мин при 100 В. Затем белок переносили на нитроцеллюлозные мембраны (1 ч, 100 В). После блокирования обезжиренным сухим молоком в течение 1 часа мембраны инкубировали в течение ночи с моноклональными антителами, направленными против следующих белков клеточного цикла, которые все были от BD Biosciences: cdk1 (IgG1, клон 1, разведение 1:2500; #610038), cdk2 (IgG2a, клон 55, разведение 1:2500; #610146), cdk4 (IgG1, клон 97, разведение 1:250; #610148), циклин A (IgG1, клон 25, разведение 1:250; #611269), циклин B (IgG1, клон 18, разведение 1:1000; #610220), циклин D1 (IgG1, клон G124-326, разведение 1:250; #554181), циклин D3 (IgG2b, клон 1, разведение 1:1000; #610280), p19 (IgG1, клон 52/p19, разведение 1:5000; #610530), p27 (IgG1, клон 57, разведение 1:500; #610244). Конъюгированные с HRP козьи антимышиные IgG (разведение 1:5000; #12-349; Merck Millipore, Темекула, Калифорния, США) служили в качестве вторичных антител. Мембраны ненадолго инкубировали с реагентом для обнаружения ECL (ECL™; Amersham/GE Healthcare, Мюнхен, Германия) для визуализации белков, а затем анализировали с помощью системы Fusion FX7 (Peqlab, Эрланген, Германия). В качестве внутреннего контроля служил β-актин (разведение 1:1000; #A5441; Sigma, Тауфенкирхен, Германия).

Поверхностная экспрессия E- и N-кадгерина

Опухолевые клетки промывали в блокирующем растворе (PBS, 0,5% BSA), а затем инкубировали в течение 60 мин при 4°C с моноклональными антителами (mAB), конъюгированными с фикоэритрином (PE), направленными против следующих антител: анти-человеческий E-кадгерин-PE (мышиный IgG2b, клон 180224; #FAB18381P) и анти-человеческий N-кадгерин-PE (крысиный IgG2a, клон 401408; #IC1388P) (оба от R&D Systems, Висбаден, Германия). Затем поверхностную экспрессию E- и N-кадгерина клеток RCC измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием FACscan [анализ гистограммы канала FL-2H (log); 1×10 4 клеток/сканирование; BD Biosciences] и выражали в виде средних единиц флуоресценции. В качестве изотипического контроля служили крысиный IgG2a-PE (клон RG7/1.30; № 558067) или мышиный IgG2b-PE (клон 27-35; № 555743) (оба от BD Biosciences).

Блокировка экспериментов

Чтобы определить, влияют ли cdk1 и циклин B на рост опухолевых клеток в клеточных линиях Caki-1, KTC-26 и A498, клетки были трансфицированы. Опухолевые клетки (3×10 5 /6-луночные) были трансфицированы малой интерферирующей РНК (siRNA), направленной против cdk1 (Hs_CDC2_10, идентификатор гена: 983, целевая последовательность: AAGGGGTTCCTAGTACTGCAA) или циклина B (Hs_CCNB1_6, идентификатор гена: 891, целевая последовательность: AATGTAGTCATGGTAAATCAA) (оба от Qiagen, Хильден, Германия), с реагентом siRNA/трансфекции (реагент трансфекции HiPerFect; Qiagen) в соотношении 1:6. Необработанные клетки и клетки, обработанные 5 нМ контрольной siRNA (AllStars Negative Control siRNA; Qiagen), служили в качестве контролей. Затем рост опухолевых клеток определяли, как указано выше.

Статистический анализ

Все эксперименты проводились 3–6 раз. Статистическая значимость определялась с помощью U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Значение p < 0,05 считалось указывающим на статистически значимую разницу.

Результаты

Рост и пролиферация опухолевых клеток блокируются амигдалином

Воздействие амигдалина (10 мг/мл) в течение 24 ч или 2 недель привело к значительной и схожей степени ингибирования роста в течение 72 ч во всех трех линиях клеток почечно-клеточного рака, Caki-1, KTC-26 и A498, по сравнению с необработанными контрольными клетками ( рис. 1 ). Пролиферация клеток Caki-1, KTC-26 и A498 также была значительно снижена после 24 ч или 2 недель воздействия амигдалина по сравнению с контрольными клетками ( рис. 2 ). Противоопухолевые эффекты в клетках почечно-клеточного рака были сопоставимы после 24 ч и 2 недель лечения амигдалином ( рис. 2 ).

Рисунок 1 Рост клеток почечно-клеточной карциномы (RCC), (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498. Клетки обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные клетки оставались необработанными. Количество клеток было установлено на уровне 100% после 24 ч инкубации. Полоски указывают на среднее значение ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значительное отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Рисунок 2 Пролиферация клеток почечно-клеточной карциномы (RCC). Клетки (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498 обрабатывали 10 мг/мл амигдалина в течение 24 ч или 2 недель. Контрольные группы оставались без обработки. Полоски указывают средние значения ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значимое отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Ни апоптоз, ни некроз не индуцируются амигдалином.

После введения амигдалина не было выявлено ни значительного раннего или позднего апоптоза, ни индукции некроза (данные не представлены).

Амигдалин изменяет процент клеток почечно-клеточного рака в фазах G0/1, S и G2/M

Амигдалин значительно увеличил процент клеток Caki-1 и A498 в фазе G0/G1 и уменьшил количество клеток в фазе S и G2/M через 24 ч и 2 недели ( рис. 3 ) воздействия по сравнению с необработанными контролями. В клетках KTC-26 амигдалин вызвал значительное снижение процента клеток в фазе G2/M, в то время как клетки в фазе S увеличились (24 ч, <2 недель). Не было измерено значительного увеличения процента клеток в фазе G0/G1 после 24-часовой обработки амигдалином в клетках KTC-26. Через 2 недели обработки амидалином в клетках KTC-26, сопровождавшейся увеличением S-фазы, количество клеток в фазе G0/G1 значительно снизилось ( рис. 3 ) по сравнению с контролем.

Рисунок 3 Влияние амигдалина на распределение клеток почечно-клеточной карциномы (ПКР) в различных фазах клеточного цикла. Указан процент клеток Caki-1 (Caki), KTC-26 (KTC) и A498 в фазах G01/1, S и G2/M. Клетки ПКР, обработанные амигдалином в течение 24 ч или 2 недель, сравнивались с необработанными контрольными клетками. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Амигдалин вызывает снижение экспрессии белка, активирующего клеточный цикл

Мы отметили, что изменения в прогрессии клеточного цикла сопровождались модуляцией белков, регулирующих клеточный цикл ( рис. 4 ). Во всех трех клеточных линиях, Caki-1, KTC-26 и A498, обработка амигдалином в течение 24 ч и 2 недель способствовала снижению регуляции активирующих клеточный цикл белков cdk1, cdk2 и cdk4, а также циклинов A и B, причем самые сильные эффекты были отмечены в отношении экспрессии cdk1 и циклина B. Циклин D1 также был снижен в Caki-1 и KTC-26 через 24 ч ( рис. 4 , левая панель) и в Caki-1 и A498 после 2 недель применения амигдалина ( рис. 4 , правая панель). Не было обнаружено выраженных изменений для циклина D3 ни в одной клеточной линии. В отличие от белков, активирующих клеточный цикл, экспрессия белка p19, ингибирующего клеточный цикл, была усилена после воздействия амигдалина в клеточных линиях Caki-1 (24 ч и 2 недели) и A498 (24 ч). p27 также был повышен в клетках A498 (24 ч) ( рис. 4 , левая панель). Однако p19 и p27 были снижены в клетках KTC-26, а снижение p27 было отмечено в клетках Caki-1 через 24 ч.

Рисунок 4 Профиль экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл, в клетках почечно-клеточной карциномы (RCC). Клетки Caki-1, KTC-26 и A498 после 24 ч (левая панель) или 2 недель (правая панель) воздействия амигдалина и необработанные контроли. −, контроль; +, амигдалин. β-актин служил внутренним контролем. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Снижение уровня cdk1 и циклина B связано с ингибированием роста, вызванным амигдалином.

В связи с тем, что в настоящем исследовании наиболее яркое ингибирующее действие амигдалина было отмечено в отношении экспрессии cdk1 и циклина B, влияние этих двух белков на рост опухолевых клеток оценивалось путем блокирования их функции с помощью siRNA. Нокдаун cdk1 и циклина B привел к значительному ингибированию роста клеток во всех трех клеточных линиях по сравнению с необработанным и имитированным контролем ( рис. 5A–C ). Во всех трех клеточных линиях RCC блокирование экспрессии белков cdk1 и циклина B было подтверждено с помощью вестерн-блоттинга ( рис. 5D ).

Рисунок 5 Рост опухолевых клеток почечно-клеточного рака (RCC). (A) Caki-1, (B) KTC-26 и (C) A498 после функциональной блокировки с помощью siRNA, нацеленной на cdk1 и циклин B. AllStars отрицательный контроль siRNA служил в качестве контроля трансфекции (макет). Контроли оставались необработанными. Полоски указывают стандартное отклонение (SD). * p≤0,05, значимое различие с контролем. n=5 экспериментов. (D) Профиль экспрессии белка регулирующих клеточный цикл белков клеток Caki-1, KTC-26 и A498 после функциональной блокировки с помощью siRNA, нацеленной на cdk1 и циклин B. AllStars отрицательный контроль siRNA служил в качестве контроля трансфекции (макет). Контроли оставались необработанными. β-актин служил в качестве внутреннего контроля. Показан один представитель из трех отдельных экспериментов.

Маркеры дифференциации модулируются обработкой амигдалином

Дедифференцировка опухолевых клеток сопровождается потерей E-кадгерина и повышенной экспрессией N-кадгерина. Экспрессия этих двух маркеров дифференцировки была определена для того, чтобы оценить, влияет ли амигдалин на дифференцировку опухолевых клеток. После 24 ч обработки амигдалином мы отметили значительное снижение поверхностного N-кадгерина в трех клеточных линиях ( рис. 6 ). После 2 недель обработки амигдалином было отмечено заметное увеличение экспрессии E-кадгерина на поверхности клеток Caki-1 и KTC-26 ( рис. 6A и B ). В клетках KTC-26 повышение E-кадгерина было связано со значительным снижением поверхностного N-кадгерина ( рис. 6B ). Однако экспрессия N-кадгерина в клетках Caki-1 значительно увеличилась после 2 недель воздействия амигдалина, хотя MFU все еще была ниже, чем для E-кадгерина ( рис. 6A ). Никакого существенного влияния на Е-кадгерин в клетках А498 после 2 недель применения амигдалина отмечено не было.

Рисунок 6 Поверхностная экспрессия маркеров дифференциации E- и N-кадгерина на клетках почечно-клеточной карциномы (RCC). (A) Клетки Caki-1, (B) KTC-26 и (C) Клетки A498 через 24 часа и 2 недели применения амигдалина. Поверхностная экспрессия указана как средние относительные единицы флуоресценции [MFU (%)]. Контрольные значения были установлены на уровне 100% (пунктирная линия). Полоски указывают средние значения ± стандартное отклонение (SD). *p≤0,05 указывает на значимое отличие от контроля. n=5 экспериментов.

Обсуждение

В настоящем исследовании мы отметили, что обработка линий клеток почечно-клеточного рака Caki-1, KTC-26 и A498 амигдалином вызвала значительное ингибирование роста и пролиферации клеток. Подобное снижение роста после применения амигдалина было отмечено в клетках немелкоклеточного рака легких ( 19 ) и рака мочевого пузыря ( 18 ) in vitro , а также в клетках рака шейки матки in vivo ( 20 ). На основании наших данных мы приходим к выводу, что ингибирование роста, вызванное амигдалином, не связано с апоптозом или некрозом. Другие раковые клетки, такие как клетки рака шейки матки, мочевого пузыря и простаты, реагируют на амигдалин апоптозом, что приводит к ингибированию роста ( 18 , 20 , 21 ). Таким образом, способ действия амигдалина, по-видимому, зависит от типа рака.

Хотя ингибирование роста во всех трех линиях клеток RCC сопровождалось изменениями в процентном содержании клеток в различных фазах клеточного цикла, изменения не были однородными. Обработка клеток Caki-1 и A498 амигдалином вызвала увеличение клеток в фазе G0/G1 за счет снижения S- (Caki-1 и A498) и G2/M-фаз (Caki-1). Обработка амигдалином вызвала увеличение клеток в фазе S в клетках KTC-26, в то время как фазы G2/M и G0/G1 были снижены через 2 недели. Повышение количества клеток в фазе S в KTC-26 после применения амигдалина, вероятно, свидетельствует об остановке клеточного цикла в S-фазе. В различных линиях клеток рака мочевого пузыря также была отмечена блокада роста, вызванная амигдалином, которая осуществлялась путем различного влияния на прогрессирование клеточного цикла, увеличивая процент клеток в фазе G0/G1 в одной линии клеток и повышая количество клеток в фазе S в другой ( 18 ).

Изменение процентного содержания фаз клеточного цикла коррелировало с модуляцией экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл. Во всех трех линиях клеток RCC большинство белков, активирующих клеточный цикл, были снижены после лечения амигдалином, в частности cdk1 и циклин B. Известно, что Cdk1 является ключевой киназой для митотического входа ( 22 ). Было показано, что ось cdk1-циклин B в опухолевых клетках участвует в продвижении митоза и преодолении остановки клеточного цикла, зависящей от химиотерапии ( 23 ). Во всех трех линиях клеток RCC снижение cdk1 и циклина B было связано с ингибирующим эффектом, оказываемым амигдалином, что доказано с помощью нокдауна siRNA. Наряду с осью cdk1-циклин B, ось cdk2-циклин A также была отчетливо изменена в клетках RCC. Cdk2/циклин A способствует переходу из фазы G1 в фазу S и, как было показано, важен для ингибирования клеток рака мочевого пузыря, вызванного амигдалином ( 18 ). Мы предполагаем, что накопление клеток G0/G1 было обусловлено ингибирующим эффектом, который амигдалин оказывал на cdk2 и циклин B. Однако обработка клеточной линии KTC-26 амигдалином не привела к остановке фазы G0/G1, а скорее к остановке фазы S. Предположительно, это связано с ингибирующим клеточный цикл белком p19, уровень которого был повышен в клетках Caki-1 и A498 после применения амигдалина, но снижен в клетках KTC-26. p19 участвует в активности контрольной точки G1, останавливая вход клеток в фазу S ( 24 ). Ингибирование p19 увеличивает фракцию клеток в фазе S ( 25 ). Таким образом, это, вероятно, объясняет, почему мы отметили увеличение в фазе G0/G1 клеток Caki-1 и A498, в то время как клетки KTC-26 накапливались в фазе S. Следовательно, мы предполагаем, что вызванные амигдалином изменения в экспрессии регулирующего клеточный цикл белка ответственны за различные эффекты на прогрессирование клеточного цикла в разных клеточных линиях.

Во время возникновения и прогрессирования опухоли RCC происходит дедифференциация, сопровождаемая эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT) ( 26 , 27 ). Во время перехода опухолевые клетки теряют эпителиальный (E)-кадгерин и приобретают нейральный (N)-кадгерин ( 26 , 28 ). Во всех трех линиях клеток RCC, использованных в этом исследовании, применение амигдалина в течение 24 часов вызвало значительное снижение экспрессии N-кадгерина, что указывает на повторную дифференциацию. Ранее N-кадгерин был связан с агрессивностью и злокачественным потенциалом RCC ( 29 ). Следовательно, мы предполагаем, что нарушение экспрессии N-кадгерина при 24-часовом применении амигдалина приводит к менее злокачественному типу опухоли. После 2 недель воздействия амигдалина стало очевидным переключение способа действия амигдалина, в основном затрагивающее экспрессию E-кадгерина. Экспрессия поверхности E-кадгерина Caki-1 и KTC-26 значительно увеличилась. В различных клетках RCC in vitro эпителиально-мезенхимальный переход, рост опухоли и агрессивный фенотип, как было показано, обратно связаны с низким уровнем E-кадгерина ( 30 , 31 ). Плохой прогноз и опухоли RCC высокой степени злокачественности были связаны с недостатком E-кадгерина ( 32 ). В опухолевой ткани RCC человека наблюдалось 3-кратное снижение E-кадгерина ( 33 ), и было постулировано, что экспрессия E-кадгерина в RCC является важным предиктором рецидива заболевания ( 34 ). Таким образом, мы предполагаем, что вызванное амигдалином увеличение E-кадгерина в клетках Caki-1 и KTC-26, которое мы отметили, указывает на повторную дифференцировку обратно к менее агрессивному фенотипу. Наблюдаемое переключение от снижения N-кадгерина к усилению E-кадгерина указывает на различные режимы действия амигдалина. Поскольку уровень N-кадгерина больше не снижался ни в одной из трех линий клеток после 2 недель воздействия амигдалина и даже повышался в клетках Caki-1, мы предполагаем, что соотношение между экспрессией E- и N-кадгерина имеет решающее значение для статуса дифференциации. Действительно, было показано, что эффект N-кадгерина зависит от экспрессии E-кадгерина ( 29 ).

В заключение, амигдалин ингибирует прогрессирование клеточного цикла и рост опухолевых клеток в клетках почечно-клеточного рака, по крайней мере частично, за счет нарушения экспрессии cdk1 и циклина B, тем самым оказывая противоопухолевое действие in vitro . Хотя in vitro не было обнаружено некротических эффектов , возможны токсические эффекты, вызванные деградацией амигдалина до HCN, и этот аспект требует оценки. Необходимы дальнейшие исследования с использованием животных для проверки эффектов амигдалина in vitro и оценки того, вызывает ли HCN цитотоксичность in vivo .

Благодарности

Это исследование было поддержано «Стифтунгом Бригитты и Норберта Мут» и «Проф. Доктор Фонд Карла и Герхарда Шиллеров

преведено с английского SAID-lab.com

Амигдалин как перспективный противораковый агент:

молекулярный Механизмы и будущие перспективы развития Новые наноформулы для его доставки

Аннотация: Уровень заболеваемости раком растет, и рак является одной из основных причин смертности во всем мире. Амигдалин, также известный как витамин B17 (и лаэтрил, синтетическое соединение), представляет собой цианогенное гликозидное соединение, которое в основном содержится в ядрах и мякоти фруктов. Это соединение на протяжении десятилетий предлагалось как многообещающее природное вещество, которое может оказывать противораковое действие. Это всеобъемлющий обзор, в котором критически обобщаются и тщательно анализируются имеющиеся исследования, изучающие противораковый эффект амигдалина, подчеркиваются его потенциальные противораковые молекулярные механизмы, а также необходимость создания нетоксичной рецептуры этого вещества. Углубленное исследование проводилось с использованием наиболее точных научных баз данных, например, PubMed, Cochrane, Embase, Medline, Scopus и Web of Science, с применением эффективных, характерных и релевантных ключевых слов. Есть несколько доказательств, подтверждающих идею о том, что амигдалин может оказывать противораковое действие при раке легких, молочной железы, простаты, колоректального рака, рака шейки матки и желудочно-кишечного тракта. Сообщалось, что амигдалин индуцирует апоптоз раковых клеток, ингибируя пролиферацию раковых клеток и замедляя метастатическое распространение опухоли. Однако на моделях животных in vivo было проведено лишь несколько исследований , а клинические исследования остаются еще более скудными. Имеющиеся данные не могут поддержать рекомендации по использованию пищевых добавок с амигдалином из-за его цианогруппы, которая вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Предварительные данные показали, что использование наночастиц может быть многообещающей альтернативой для усиления противоракового эффекта амигдалина при одновременном снижении его неблаго Амигдалин, по-видимому, является многообещающим природным агентом против развития и прогрессирования раковых заболеваний. Тем не менее, существует большая потребность в исследованиях на животных in vivo , а также клинических исследованиях на людях для изучения потенциальной эффективности профилактики и/или лечения амигдалина против рака. Более того, амигдалин можно использовать в качестве ведущего соединения, эффективно применяя последние разработки в процессах разработки лекарств.

1. Введение

Характеристика глобальных изменений бремени болезней и тенденций с течением времени дает важную информацию об этиологии рака и служит основой для стратегий профилактики и лечения. Злокачественные новообразования считаются основной причиной смертности во всем мире; число новых случаев рака во всем мире достигло 19,3 миллиона, и в 2020 году умерло почти 10 миллионов человек [1]. Вызывают тревогу новые данные, согласно которым число новых случаев заболевания с 2020 по 2040 год во всем мире составит 28,4 миллиона человек [2]. Кроме того, самые последние данные Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) показывают, что рак молочной железы остается наиболее распространенным злокачественным заболеванием у женщин в 158 из 183 стран (86%) и основной причиной смертности от рака в 173 из 183 стран.

95%) [3]. По данным Глобальной статистики рака 2020 года (GLOBOCAN) второй наиболее распространенной причиной смертности от рака во всем мире и третьей по распространенности злокачественной опухолью с точки зрения диагностики является колоректальный рак [1,4]. Более того, текущие модели смертности и долгосрочные тенденции для основных типов рака в 47 странах мира, исключая Африку, показывают, что уровень заболеваемости раком, связанным с инфекциями, таким как рак шейки матки и рак желудка, и раком, связанным с курением, таким как рак легких и пищевода, увеличились примерно в 10 раз [5]. В Европейском Союзе (ЕС) общее прогнозируемое число смертей от рака в 2023 году оценивается в 1 261 990 (702 214 среди мужчин, 559 776 среди женщин) [6]. Общая смертность от рака в 2022 году оценивалась в 1 269 200 [7], при этом колоректальный рак и рак легких были ведущими причинами смертности от рака (>30%)в ЕС. В Греции число новых случаев в 2020 г. составило 64 530, а количество смертей — 33 166 [5–7]. В США число новых случаев рака в 2023 году составит примерно 1 958 310, или примерно 5 370 случаев в день [8]. В этом контексте следует отметить, что эти оценки случаев на 2023 г. основаны

на недавно доступных данных о заболеваемости до 2019 г. и не учитывают влияние пандемии COVID-19 на

Соответственно, прогноз смертности от рака в 2023 году основан на данных до 2020 года [8].

Темой, представляющей интерес, является роль амигдалина, также известного как витамин B17 или лаэтрил (его синтетическое соединение), в профилактике и/или совместном лечении рака. Несколько исследований продемонстрировали широкий спектр биологических свойств амигдалина, предполагая, что он может оказывать профилактическое или даже сопутствующее воздействие на рак шейки матки, молочной железы, простаты, легких и мочевого пузыря, что в основном можно объяснить ингибированием рака. пролиферация клеток [9–13]. Как in vitro , так и in vivo оценки биологического действия экстрактов амигдалина из трех сортов маниоки (Manihot esculenta), выращенных в Бенине, продемонстрировали, что эта встречающаяся в природе молекула может эффективно действовать в профилактике рака и совместном лечении, подавляя образование раковых клеток [14]. ]. Исследования in vitro задокументировали индукцию апоптоза амигдалином из-за увеличения экспрессии белка Bax и каспазы-3 и снижения экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 [15,16]. В области химиопрофилактического потенциала амигдалина Erikel et al. (2023) отметили, что амигдалин может оказывать модулирующее действие на химиотерапевтические агенты, которые, по-видимому, вызывают геномные повреждения лимфоцитов человека [17].

Основные противораковые молекулярные механизмы амигдалина в основном связаны с ингибированием клеточного цикла, индукцией апоптоза, стимуляцией цитотоксического эффекта и регуляцией иммунной функции в организме человека [15,18,19]. Более того, основным молекулярным механизмом апоптоза является активация протеазы каспазы-3, которая инициируется клеточной репликацией белка Bax цитохрома С [20]. Высокая экспрессия проапоптотического белка Bax связана с апоптозом и последующей пролиферацией клеток [ 21]. В связи с этим считается, что амигдалин индуцирует апоптоз за счет увеличения активности каспазы-3 в клетках HeLa и подавления Bcl-2 [22]. Параллельно выяснилось, что Bax активируется в клетках HeLa, обработанных амигдалином, что позволяет предположить, что в апоптозе может быть задействован эндогенный путь [22]. Несколько линий клеток человека, в том числе раковых клеток легких, молочной железы, толстой кишки, яичек, предстательной железы, прямой кишки и мочевого пузыря, показали, что амигдалин может вызывать апоптоз и остановку клеточного цикла [19,20,22–26].

Несмотря на многообещающие результаты имеющихся в настоящее время исследований по изучению противораковых

эффектов амигдалина, существует большая потребность в дальнейших исследованиях по этой теме. На сегодняшний день Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) не одобрило медицинское использование амигдалина.

при одновременном лечении рака или других заболеваний в США, поскольку отсутствия адекватных данных об эффективности амигдалина и риске потенциального

неблагоприятные побочные эффекты [27,28]. В связи с этим целью настоящего обзора было критически обобщить и тщательно изучить имеющиеся данные о потенциальных противораковых эффектах амигдалина, подчеркивая его противораковые молекулярные механизмы и его возможное будущее применение в клинической практике борьбы с раком.

1. Методы

Всесторонний и углубленный обзор был проведен с использованием наиболее точных научных баз данных, например, PubMed, Scopus, Web of Science и Google Scholar, с применением

эффективные, характерные и релевантные ключевые слова, такие как «амигдалин» или «лаэтрил» или «витамин B17» и «токсичность», «противоопухолевые эффекты» и/или «рак» и «молекулярные механизмы».

Критериями включения были исследования, написанные на английском языке, клинические исследования на людях,

исследования на животных in vitro и in vivo , а также рандомизированные клинические исследования (РКИ). Серая литература,

комментарии, редакционные статьи, письма в редакцию, рецензии, тезисы в материалах конференций,

а статьи в нерецензируемых журналах были исключены из окончательного анализа.

поиск был дополнен сканированием списков литературы соответствующих исследований и ручным

поиск ключевых журналов, комментариев, редакционных статей и тезисов в материалах конференций . Полученные опросы были дополнительно тщательно проверены на предмет наличия соответствующих исследований.

цитируются в их тексте.

Все авторы выступали в качестве рецензентов. Чтобы повысить согласованность действий рецензентов, все рецензенты

проверил все полученные публикации, обсудил результаты и внес изменения в процедуру проверки и

руководство по извлечению данных перед началом проверки для этого обзора. Все рецензенты работали в парах последовательно оценить названия, аннотации, а затем полные тексты всех публикаций

выявленные в ходе поиска потенциально релевантных публикаций. Мы разрешили разногласия по

отбор исследований и извлечение данных путем консенсуса и обсуждения со всеми авторами/рецензентами,

если нужно. Форма диаграммы данных была совместно разработана двумя рецензентами (MS и CG) для

определить, какие переменные следует извлечь. Два рецензента независимо друг от друга составили диаграммы данных.

обсуждали результаты и постоянно обновляли форму диаграммы данных в рамках итеративного процесса.

1. Результаты

3.1. Амигдалин: основная информация и свойства

Амигдалин был открыт в 1803 году Шрейдером при исследовании ингредиентов горького миндаля.

и был впервые выделен в 1830 году двумя французскими химиками, Пьером-Жаном Робике и Антуаном.

Франсуа Бутрон-Шарлар [29,30]. Химики Хауорт и Уайлам наконец определились.

его точная химическая структура в 1923 году (рис. 2) [31]. Амигдалин (d-манделонитрил-β-d- глюкозид-6-β-глюкозид) представляет собой цианогенное гликозидное соединение, состоящее из дибензальдегида , синильной кислоты и двух молекул глюкозы (D-манделонитрил-β-D-глюкозид- 6 -глюкозид). β-глюкозид) [32]. Его биоактивная форма (D-манделонитрил-β-глюкоза) была использована в

Патент штата (USP). Лаэтрил — частично искусственная, синтетическая форма природного вещества.

амигдалин (рис. 2) [32]. В Мексике структура была дифференцирована и определена как D- манделонитрил-β-гентиобиозид [33]. Национальный центральный институт США (NCI) продемонстрировал

что мексиканская форма амигдалина (пероральная и внутривенная) не соответствует требованиям препарата США. стандартам, и это вещество было запрещено для потребления человеком [33]. Амигдалин в основном содержится в ядрах и мякоти таких фруктов, как сливы, абрикосовые косточки, черешня, персики.

Цитотоксический эффект амигдалина на раковые клетки in vitro и распределение амигдалина в растениях, которые

Содержаниеобычнопотребляютсяамигдалинаврационеврастенияхчеловека,являются,которыедвумяобычноизних.употребляются в пищу человеком, являются

наиболеедвумянаиболееинтересныеинтереснымитемыпоследнихтемамиисследованийнедавнихиссле.Однакоованийэто. Однаконеновоеэтосоединениеновое,соединениеоновеками, и оно имеет использовалось в традиционной и альтернативной медицине из-за его противораковых и противораковых свойств. использовался в традиционной и альтернативной медицине на протяжении веков благодаря своим противораковым

противовоспалительнымьныесвойствам и, в целом,,многочисленнымегомногочисленныемедицинскицинскиемпреимуществампреимущества[35,36,38][35,36,38].Это.

Это помогло облегчить боль и лихорадку; подавление кашля, жажды и тошноты; и в качестве

помог облегчить боль и лихорадку; подавление кашля, жажды и тошноты; и средство для профилактики

• сопутствующего лечения рака в последние годы [39,40].

• качестве средства профилактики и сопутствующего лечения рака в последние годы [39,40].

3.2. Противораковые эффекты и молекулярные механизмы амигдалина: данные in vitro и in vivo

3.2. Противораковые эффекты и молекулярные механизмы амигдалина: данные in vitro и in vivo

На сегодняшний день в нескольких исследованиях изучались потенциальные противораковые эффекты амигдалина.

На сегодняшний день несколько исследований изучили потенциальные противораковые эффекты амигдалина,

подчеркнув его противораковые молекулярные механизмы, особенно в легких, молочной железе, предстательной железе,

подчеркивая его противораковые молекулярные механизмы, особенно при раке легких, молочной железы, предстательной

железы, колоректального рака, рака шейки матки и желудочно-кишечного тракта. Потенциальные противораковые эффекты и

рак прямой кишки, шейки матки и желудочно-кишечного тракта. Потенциальные противораковые

эффекты и молекулярные механизмы амигдалина изображены на рисунке 3. Клинические исследования на людях

Механизмы действия амигдалина изображены на рисунке 3. Клинические исследования на людях, а

также на раковых клетках человека и животных представлены в таблице 1.

а также в раковых клетках человека и животных представлены в табл. 1.

3.2.1. Рак легких

Амигдалин может быть полезен в качестве вспомогательного терапевтического средства при опухолях легких.

Этот ком- 3.2.1. Рак легких

фунт значительно индуцировал апоптоз клеток рака легких A549 и PC9 в определенной дозе. Амигдалин может быть полезен в качестве совместного терапевтического агента при опухолях легких. Этот взаимозависимый путь посредством митохондриально-опосредованного и каспазозависимого апоптоза

 значительно индуцировал апоптоз клеток рака легких A549 и PC9 в дозовом пути [41]. Одновременно в клетках рака легких A549 и PC9 наблюдалось увеличение цитохрома C и усиление каспазозависимой активности посредством

митохондриально-опосредованной и каспазозависимой активности апоптоза 9 и каспазы-3. В пробирке

путь [41]. Одновременно увеличение цитохрома С и усиление каспаз- ингибирования пролиферации клеточных линий рака легкого H1299/M и PA/M требовали высокой

Активность 9 и каспазы-3 наблюдалась в клетках рака легких A549 и PC9. In vitro ингибируют концентрацию амигдалина [42]. Однако при более низкой концентрации амигдалина это было

Для пролиферации клеточных линий рака легких H1299/M и PA/M требовалась высокая концентрация. Было обнаружено, что инвазионная и миграционная способность раковых клеток H1299/M PA/M была

амигдалина [42]. Однако при более низкой концентрации амигдалина наблюдалось его значительное ингибирование [42]. Таким образом, было высказано предположение, что амигдалин, вероятно, обладает способностью к инвазии и

миграции раковых клеток H1299/M PA/M, обладая значительной временной метастатической активностью, индуцируя апоптоз и ингибируя пролиферацию рака легких.

отношенииингибируетсяклеток[42]. [42]Таким. образом, было высказано предположение, что амигдалин, вероятно, обладает антиметастатической активностью в

индуцируя апоптоз и ингибируя пролиферацию клеток рака легких [42].

3.2.2. Рак молочной железы

3.2.2. Рак молочной железы

Было показано, что амигдалин индуцирует апоптоз и ингибирует адгезию молочной железы.

Примечательнозначительн,что усиливалобоих апоптоз путем подавления пролиферации клеток и повышения эффективности лучевой терапии за счет индукции остановки клеточного цикла (на стадиях клеточного цикла G1 и суб-G1) [11]. Также было обнаружено, что амигдалин снижает миграцию клеток MDA-MB-231 в большей степени, чем клеток MCF-7 [43]. Кроме того, было высказано предположение, что ингибирование протеолитических ферментов способствует активации апоптотических событий в клетках рака молочной железы MCF-7 [44]. Кроме того, было показано, что амигдалин увеличивает экспрессию Bax и снижает экспрессию Bcl-2 в клетках рака молочной железы SK-BR-3 и MCF-7. Однако по сравнению с конъюгатом аффитела амигдалин-ZHER2 влияние на экспрессию Bax и Bcl-2 в клетках SK-BR-3 было сильнее, чем в клетках MCF-7 [45]. Также была продемонстрирована способность амигдалина уменьшать рост клеток рака молочной железы человека MCF-7 и T47D в зависимости от концентрации путем стимуляции производства малонового диальдегида (MDA) и окисленного глутатиона . Более того, наблюдалось значительное снижение общего уровня глутатиона и активности глутатионредуктазы в клетках рака молочной железы [46].

3.2.3. Рак простаты

Амигдалин дозозависимо ингибировал рост опухоли и уменьшал опухолевые клоны в клеточных линиях рака простаты путем ингибирования фазы G0/G1 [47]. Более того, было очевидно ингибирование роста клеток рака предстательной железы и роста опухоли под действием амигдалина, что указывает на функцию метаболических ферментов бетаглюкозидазы (β-глюкозидазы) и роданезы в регулировании противораковой активности амигдалина in vivo [10]. Активацию амигдалина β -глюкозидазой можно рассматривать как стратегию ферментной/лекарственной терапии, которая может стать новым многообещающим подходом к таргетному лечению рака простаты [48]. Было также обнаружено, что воздействие амигдалина на некоторые клетки рака предстательной железы, такие как DU-145, ингибирует распространение метастазов, чему способствует интегрин α6 [49].

3.2.4. Колоректальный рак

• альтернативной и традиционной медицине амигдалин обычно используется для профилактики и лечения

злокачественных новообразований колоректальных опухолей [50]. Было обнаружено , что противораковый эффект амигдалина на клетки колоректального рака, например, на клетки колоректального рака SNU-C4 человека, усиливается за счет снижения экспрессии генов, связанных с клеточным циклом [51]. Сообщалось, что клетки рака толстой кишки более чувствительны к действию амигдалина по сравнению с нормальными клетками из-за более высокой концентрации β-глюкозидазы и более низких уровней печеночного фермента роданезы, который может превращать цианид в относительно безвредное соединение тиоцианат [52].

3.2.5. Рак шейки матки

Доказано, что амигдалин значительно ингибирует пролиферативную активность клеток рака шейки матки HeLa

• Антиапоптотический белок Bcl-2 подавлялся, а проапоптотический Bax повышался в клетках HeLa, обработанных амигдалином [22]. Более того, соотношение Bax-к-Bcl-2 и активность каспазы-3 увеличивались при обработке амигдалином в клетках HeLa, усиливая апоптотический эффект амигдалина на клетки рака шейки матки [22,53].

3.2.6. Рак желудочно-кишечного тракта

Было продемонстрировано, что амигдалин стимулирует процесс апоптоза путем повышения

экспрессии каспазы-3 и снижения экспрессии Bcl-2, а также ингибирования пролиферации

гепатоцеллюлярных раковых клеток HepG2 и EAC и повышения экспрессии Beclin-1 [54].

Примечательно , что комбинация амигдалина с метформином показала многообещающий эффект

по сравнению с монотерапии амигдалином; их комбинация была более цитотоксичной, демонстрируя

большую способность индуцировать апоптоз и останавливать клеточный цикл в гепатоцеллюлярных раковы

Было показано, что помимо этой комбинации активность амигдалина с цинком приводит к усилению апоптотического эффекта при лечении HepG2 по сравнению с действием амигдалина без цинка [56].

3.2.7. Другие злокачественные

новообразования опухолей. Ингибирующее действие амигдалина на маркеры роста и дифференцировки E- и N-кадгерин в клетках почечно-клеточного рака (ПКР) было также продемонстрировано при применении 10 г/мл амигдалина к клеточным линиям ПКР A498, Caki-1. и KTC-26 в течение 24 часов или 2 недель in vitro [35]. Исследование влияния амигдалина (1,25–10 мг/

мл) на несколько клеточных линий рака мочевого пузыря (UMUC-3, RT112 и TCCSUP) также показало положите

Наиболее заметное воздействие амигдалина связано с осью cdk2-циклин А.

Исследования по нокдауну siRNA показали положительную связь с cdk2/циклином.

Также было обнаружено, что амигдалин ингибирует развитие опухоли за счет подавления CDK2 и циклина [57]. Напротив, колониеобразующие клетки из лейкозных клеточных линий и нормального костного мозга были относительно толерантны к амигдалину и его метаболитам in vitro. Хотя наблюдалось увеличение скорости апоптоза, не наблюдалось избирательного разрушения между линиями лейкозных клеток человека и нормальными клетками костного мозга [58].

Таблица 1. Исследования, оценивающие противораковые эффекты и противораковые молекулярные механизмы амигдалина.

3.3. Токсичность амигдалина.

Чрезмерное употребление амигдалина может привести к отравлению (более 1 мг/л цианида в крови). Амигдалин превращается в глюкозу, бензальдегид и цианистый водород под действием эндогенного фермента (β-глюкозидазы) при измельчении фруктовых косточек. С более аналитической точки зрения, при высвобождении HCN цитохромоксидаза C может реагировать с ионом железа.

Это может индуцировать образование комплексов ионов металлов, которые лизуют клетки и ингибируют синтез АТФ [65].

Сообщалось, что амигдалин оказывает токсическое действие при приеме внутрь с добавками.

Пероральный прием 500 мг амигдалина может привести к высвобождению 30 мг цианида [66].

Токсичность цианидов может быть опасной для жизни из-за снижения утилизации кислорода

митохондриями, что приводит к гибели клеток. В раковых клетках отсутствует родханаза, фермент,

который действует как детоксифицирующий агент, связывая железо-серные центры на клеточных

мембранах и превращая HCN в менее токсичный метаболит – тиоцианат. Однако после парентерального

введения амигдалина/лаэтрила путем инъекции более 80% тиоцианата обнаруживалось в моче крыс и

кроликов [66]. Неблагоприятные побочные эффекты токсичности цианидов включают тахикардию,

спутанность сознания, тошноту, головную боль и, что более серьезно, нейромиопатию, цианоз, кому, судороги и с

За последние десятилетия было проведено несколько исследований in vitro и in vivo с использованием однократных или многократных доз и различных форм введения амигдалина (внутривенных и внутримышечных), которые не выявили образования HCN, что подчеркивает решающую роль кишечника в физиологии организма человека после потребление веществ. Анаэробные бактериальные типы, существующие в кишечнике, обладают высокой активностью β-глюкозидазы, которая необходима амигдалину для гидролиза HCN. Тем не менее, при определенных обстоятельствах было обнаружено, что токсичность HCN существует. В некоторых случаях токсичность была вызвана приемом различных доз амигдалина, и не было побочных эффектов HCN, связанных с высокими дозами. Несколько факторов, в том числе потребление пробиотиков или пребиотиков, диета и возраст, могут изменить кишечный консорциум, который отвечает за условия, при которых возникает токсичность. Примечательно, что не было зарегистрировано серьезных реакций на пероральный прием амигдалина

вдозе 3 г у больных раком, которые искали альтернативные методы лечения. Минимальная смертельная доза амигдалина для взрослого человека составляет 50 мг или 0,5–3,5 мг/кг массы тела. Однако взаимодействие с одновременным употреблением витамина С, по-видимому, активирует его неблагоприятные.

3.4. Клинические исследования амигдалина/лаэтрила при злокачественных новообразованиях опухолей человека в 20 веке

Несколько исследований продемонстрировали противораковую активность амигдалина и его

терапевтическое использование для лечения рака и облегчения боли [30,68]. Хотя научные

доказательства противоракового эффекта амигдалина, основанные на клинических испытаниях,

ограничены, было проведено несколько исследований по изучению влияния амигдалина на злокачественные оп

На протяжении многих лет рассматривалось несколько клинических испытаний комбинации амигдалин/

лаэтрил [32]. В 1980 году отдел исследований лекарственных средств Национального института рака

(NCI) объявил, что около 200 больных раком, «для которых никакое другое лечение не было эффективным», планировалось получить химическое вещество, специальную диету и дополнительные витамины (см . Институт начинает клинические испытания лаэтрила», 1980) [69]. В течение следующих двух лет были проведены два клинических исследования в области применения лаэтрила при раке человека. Первое из этих двух клинических испытаний было проведено в 1981 году на шести пациентах

• поздней стадией рака [32]. Амигдалин вводили как внутривенно, так и перорально в течение 21 дня без признаков токсических реакций. Эти данные согласуются с предыдущими наблюдениями за пациентом после самостоятельного приема лаэтрила [70]. В 1982 году было проведено еще одно клиническое исследование с участием 178 пациентов с раком, которые получали лечение амигдалином плюс «метаболическую терапию» [59]. Никаких существенных преимуществ с точки зрения излечения, улучшения или стабилизации рака, улучшения симптомов, связанных с раком, или увеличения продолжительности жизни не наблюдалось. Опасность терапии амигдалином у нескольких пациентов была подтверждена симптомами токсичности цианида или уровнями цианида в крови, приближающимися к летальному уровню [59,69,70]. Однако следует отметить, что эти клинические испытания были проведены более 40 лет назад и теперь их следует считать устаревшими, что подчеркивает необходимость проведения новых клинических испытаний, включающих введение амигдалина в различных фармацевтических формах, которые могли бы быть более переносимыми и приемлемыми для организм человека, демонстрируя большую биоактивную эффективность и нетоксичные эффекты.

3.5. Наночастицы и амигдалин в 21 веке Наночастицы считаются

многообещающим биотехнологическим методом доставки лекарств и лечения злокачественных опухолей человека, избегая при этом токсичности. Несколько исследований на линиях раковых клеток человека продемонстрировали положительные результаты в отношении метаболизма амигдалина без побочных эффектов. Как уже упоминалось, амигдалин, несмотря на его противораковое действие, столкнулся с противоречиями из-за выделения цианида. Сохаил и Аббас исследовали наночастицы альгината-хитозана (ACNP) как способ введения лекарств посредством инкапсуляции и доставки амигдалина в опухолевые клетки (H1299) [64]. Наночастицы продемонстрировали стабильное высвобождение лекарственного средства в течение десяти часов и значительную скорость набухания в слабокислой и нейтральной среде. Было показано, что ACNP оказывают большее противоопухолевое действие на клеточные линии H1299, чем свободный амигдалин, что предполагает большее поглощение клетками соединения, инкапсулированного в наночастицы. В связи с этим биомиметические и биосовместимые наночастицы бальгината-хитозана могут быть использованы в качестве выгодной системы доставки лекарств для пролонгированной и контролируемой доставки амигдалина с повышенной цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток, одновременно защищая нормальные ткани человека и здоровые клетки [64].

Наночастицы серебра, инкапсулирующие амигдалин и сшивающие микрокапсулы, заряженные хитозаном, также были исследованы в клеточных линиях рака молочной железы. Противораковый ответ также наблюдался в рамках контролируемого высвобождения амигдалина за счет соединения хитозана, преодолевающего низкие цитотоксические эффекты при высоких дозах [63].

Кроме того, наночастицы продемонстрировали устойчивое высвобождение амигдалина и фолиевой кислоты и очевидную селективность в отношении клеток путем подавления роста опухоли. В то же время было обнаружено, что они повышают эффективность лучевой терапии за счет усиления апоптоза, блокирования клеточного цикла и уменьшения пролиферации клеток рака молочной железы за счет

снижения уровня железа и митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK/P38). Также была показана амигдалин-фолиев

ингибировать дифференцировку экспрессии комплекса CD4 и CD80, вызывая подавление трансформации фактора роста бета (TGF-бета)/интерлейкин-6, (IL-2)/интерферон-гамма, (INF-g)/интерлейкин-2, и Экспрессия (IL-2)/фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) на сигнальном пути при одновременной модуляции экспрессии гена CD8 и группы естественных киллеров 2D [11].

Мосайеби и его коллеги создали наноформулу амигдалина с β-циклодекстрином, чтобы исследовать усиление его действия против миграции клеточной линии MCF-7, апоптоза и миграции генов. Наноформулированный амигдалин показал больший эффект на опухолевые клетки, чем один амигдалин [62].

3.6. Пищевые добавки с амигдалином для лечения рака Амигдалин, лаэтрил

или витамин B17 с 1845 года заявлялись в качестве средства для лечения различных заболеваний, особенно злокачественных опухолей [33]. Однако в 1982 году возникло мнение, что амигдалин может быть токсичным препаратом и неэффективен при лечении рака [59].

Недавние теоретические и практические разработки показали, что амигдалин может оказывать благотворное воздействие на больных раком [28,62,63]. Амигдалин использовался для лечения рака как в виде монотерапии, так и в сочетании с метаболической терапией. Поэтому стоит отметить, что токсичность витаминных добавок не является редким явлением, и амигдалин рекомендуется пациентам в качестве пищевой добавки при раке, при этом предлагаются высокие дозы [71]. Таблетки и капсулы амигдалина в настоящее время продаются как натуральная пищевая добавка под неправильным названием лаэтрил или сомнительным названием «витамин B17» [72].

Некоторые исследования клинических случаев продемонстрировали рецидив метаболического ацидоза после массивной передозировки амигдалина и опасной для жизни токсичности цианидов, включая нефрогенный несахарный диабет [73–76]. Токсичность амигдалина может быть вызвана ядовитым составным продуктом бензальдегида и цианида после перорального приема [35]. Как токсикологи, так и нефрологи должны знать о способности этого «витамина» вызывать отравление цианидами [ 77]. Кроме того, в настоящее время существует серьезная обеспокоенность тем, что натуральные пищевые добавки не подвергаются строгим аналитическим и клиническим испытаниям. В соответствии с Регламентом Европейского Союза ((EC)

• 178/2002), касающимся общего законодательства в области пищевых продуктов, пищевые добавки считаются пищевыми продуктами, а не лекарственными средствами [78]. Согласно приведенным выше данным, предполагающим, что клиническое использование пищевых добавок амигдалина может сопровождаться неблагоприятными побочными эффектами, соотношение риска и пользы не является благоприятным д Более того, амигдалин ошибочно называют витамином B17; соединение не является витамином [36].

1. Дискуссия

 альтернативной медицине амигдалин уже несколько десятилетий считается противораковым средством без строгого научного подтверждения его эффективности и безопасности. Несколько тематических исследований выявили риск плохо регулируемых добавок [79]. Недавние исследования in vitro продемонстрировали, что амигдалин может оказывать противораковую активность, влияя на клеточный цикл, способствуя апоптозу и цитотоксичности, а также модулируя иммунный ответ [29,80,81].

Однако клинические исследования показали, что метаболиты амигдалина могут превращаться в синильную

кислоту и что накопление синильной кислоты с течением времени может привести к неблагоприятному токсическому эффекту у человека [82].

Более того, доступные в настоящее время исследования имеют некоторые ограничения. На сегодняшний день проведено лишь несколько исследований на животных in vivo . Кроме того, результаты исследований противоречивы, возможно, из-за неоднородности конструкции их методов. Доза, форма вещества, тип введения, отсутствие РКИ на людях, а также отсутствие клинических испытаний фазы III и IV являются существенными ограничениями для рекомендаций по назначению амигдалина для профилактики и/или лечения рака в клинической практике. Таким образом, преимуществом нашей обзорной статьи является выявление пробела в литературе относительно проведения клинических исследований амигдалина. С другой стороны, до сих пор недостаточно надежных данных о биодоступности амигдалина и соответствующих уровнях его концентрац

циркуляция. Соответственно, не существует данных о том, можно ли использовать амигдалин в качестве совместного лечения с другими химиотерапевтическими средствами.

Значительный научно-исследовательский разрыв между концом 20-го века и началом 21-го века возник из-за того, что до сих пор исследовательская деятельность проводилась ограниченно . Более того, большинство исследований, подтверждающих противораковое действие амигдалина, было проведено на различных линиях раковых клеток in vitro. Таким образом, разумно предположить, что его противораковые эффекты не могут быть экстраполированы на человека. Противоречивые результаты исследований in vitro и in vivo [41,51,60,83–86] и нескольких клинических исследований [61] еще раз подчеркивают необходимость дополнительных исследований

• области терапии рака, особенно связанных с изучением новую, нетоксичную формулу амигдалина, принимая во внимание роль нанотехнологий в современную эпоху биомедицинской науки. В целом, существует большая потребность в дальнейших исследованиях на животных in vivo , а также клинических исследованиях на людях для изучения потенциальной эффективности профилактики и/или лечения амигдалина против развития и прогрессирования раковых заболеваний. Кроме того, расхождения, обнаруженные в некоторых клинических исследованиях, могут быть связаны с небольшими размерами выборки, а также с различными персонализированными характеристиками участников , что подчеркивает необходимость проведения хорошо спланированных клинических исследований с адекватными размерами выборки в будущем.

• 2015 году Кокрановская база данных систематических обзоров заявила, что лаэтрил или амигдалин оказывают благоприятное воздействие на больных раком, что в настоящее время не подтверждается научно обоснованными клиническими данными [28]. В приведенном выше отчете документально подтверждено, что существует значительный риск серьезных побочных эффектов от отравления цианидом после введения лаэтрила или амигдалина, особенно после перорального приема

• Таким образом, баланс риска и пользы лаэтрила или амигдалина для лечения рака остается однозначно сомнительным [28]. Однако с 2015 года было проведено много исследований. Более того, Национальный институт рака сообщил, что частота отравлений цианидами намного выше при пероральном приеме лаэтрила, поскольку кишечные бактерии и некоторые часто употребляемые в пищу растения содержат ферменты (бета-глюкозидазы), которые активируют высвобождение цианида после при

Наконец, эффективно применяя последние разработки в процессах разработки лекарств, амигдалин можно использовать в качестве ведущего соединения для синтеза и разработки более биологически активных аналогов, родственных амигдалину, с более высокой эффективностью и целевой селективностью, а также со сниженными нежелательными побочными эффектами и улучшенной биодоступностью при пероральном приеме. Например, в последние годы методы машинного обучения произвели революцию в области разработки лекарств на основе структуры [88].

Подходы искусственного интеллекта для ускорения и предотвращения сбоев в разработке лекарств также могут быть применены в случае амигдалина [89]. Помимо методов машинного обучения и искусственного интеллекта, квантовые вычисления являются еще одним значительным достижением

• области технологий генеративной химии и процессов открытия лекарств, которые исследователи

могут использовать в случае амигдалина [90]. Функционализация на поздней стадии также создает новые проблемы для введения новых групп химических фрагментов, таких как амигдалин и его будущие потенциальные синтетические аналоги, ближе к концу синтетической последовательности, что означает, что новые молекулы, к которым можно быстро получить доступ без трудоемких химических процессов de novo. синтез [91]. Этот конкретный подход может предложить такие преимущества, как эффективный доступ к разнообразным библиотекам для изучения взаимосвязей структура-активность и улучшение физико-химических и фармакокинетических свойств [91].

Компьютерное открытие лекарств также может обеспечить быструю идентификацию весьма разнообразных, мощных, селективных по мишеням и подобных лекарству лигандов белков, открывая новые возможности для экономически эффективной разработки более безопасных и эффективных низкомолекулярных методов лечения, таких как амигдалин . 92]. Липофильность и биомиметические свойства также играют важную разную и перекрывающуюся роль в поддержке процесса открытия лекарств, главным образом за счет увеличения пероральной биодоступности потенциальных лекарств и значительного снижения их потенциальных неблагоприятных побочных эффектов [93,94]. Липофильность имеет уникальную ценность на ранних этапах разработки лекарств для скрининга библиотек и для первоначальной идентификации перспективных соединений, в то время как биомиметические свойства полезны для экспериментальной оценки свойств абсорбции, распределения, метаболизма и выведения (ADME) синтезированных новых соединений. поддержка определения приоритетности потенциальных лекарств и руководство дальнейшим синтезом; эти подходы могли бы

могут быть применены в случае амигдалина для получения новых синтетических аналогов амигдалина с повышенной пероральной биодоступностью и уменьшенными нежелательными побочными эффектами [93,94].

• поддержку вышеизложенных соображений недавно были применены модели двойного докинга и молекулярной динамики для разработки новых подходов к объяснению влияния амигдалина на динамическое поведение комплекса Bcl-2/BAX, каспазы-3 и PARP- 1 . 95]. Эти молекулярные мишени могут играть определяющую роль в путях апоптоза и могут рассматриваться как потенциальные терапевтические мишени для лечения рака [95]. В целом, эти компьютерные наблюдения можно считать хорошим доказательством отказа от убеждения, что цианогруппа амигдалина, которая является основной группой, ответственной за противораковую активность амигдалина [95], может быть заменена другой химической группой с меньшими побочными эффектами. [96,97]. Кроме того, результаты вычислений подтвердили, что амигдалин имеет уникальную структуру и может считаться эталонным соединением для разработчиков лекарств

при разработке новых молекул со схожими эффективными противораковыми химическими структурами, но с меньшими неблагоприятными побочными эффектами [95–97].

1. Выводы

• настоящее время имеется несколько линий данных in vitro , свидетельствующих о том, что

амигдалин и его синтетический аналог лаэтрил обладают противораковыми свойствами, а предыдущие и предстоящие исследования на животных in vivo , по-видимому, подтверждают их противораковые свойства. Однако существуют определенные возникающие и серьезные проблемы, связанные с их токсичностью из-за их цианогруппы, а также из-за плохой биодоступности при пероральном приеме. В связи с этим необходимо эффективно применять новые технологии при разработке лекарств, чтобы свести к минимуму их неблагоприятные побочные эффекты, а также повысить их пероральную биодоступность. В связи с этим химики-медики должны сосредоточиться на лабораторном синтезе химических аналогов, которые могли бы поддерживать противораковую активность амигдалина, одновременно снижая его неблагоприятные побочные эффекты. Технология наночастиц кажется многообещающей для увеличения биодоступности и противораковой активности амигдалина при одновременном снижении его токсических эффектов. Однако в литературе существует значительный пробел, касающийся проведения клинических испытаний по изучению его противораковой активности на людях и обеспечению безопасности амигдалина до его внедрения в клиническую практику. Сочетание технологии наночастиц с использованием новых и более безопасных синтетических аналогов амигдалина.

переведено с английского Said-lab.com

Доктор Амира Альнур, Int. Журнал фармацевтических наук и медицины (IJPSM),

выпуск 2. 10 октября 2017 г., с. 8-14

Профилактическая роль амигдалина при плоскоклеточном раке Клеточная карцинома, индуцированная у хомяков

Доктор Амира Альнур, доктор

философии. Преподаватель

патологии полости рта, ассистент кафедры патологии полости рта, Сирийский частный университет. Электронная почта: dr.amieranour@gmail.com, номер телефона: 00963988126576

Абстрактный:

Предыстория и цель исследования:

Плоскоклеточный рак полости рта (ПКРП) составляет 95% всех форм рака головы и шеи. В последние годы разработка противоопухолевых препаратов постепенно трансформировалась от цитотоксических препаратов к разработке новых таргетных препаратов с низкой токсичностью и высокой специфичностью. Амигдалин извлекается из косточек горького абрикоса и используется для лечения многих видов рака. Амигдалин считается натуральным продуктом, обладающим противоопухолевой активностью, меньшим количеством побочных эффектов и широко используемым. В этом исследовании мы исследуем профилактическую роль амигдалина при плоскоклеточном раке, индуцированном в буккальном мешке хомяков, путем обнаружения его корреляции с основными белками клеточного цикла и апоптоза (P53 и BCL2 соответственно).

Материалы и методы:

30 хомяков инкубировали и лечили амигдалином перорально, попеременно с канцерогенным агентом (ДМБА), в течение 3,5 месяцев. Затем хомяков умерщвляли, и мы готовили буккальный мешочек для традиционного и иммуногистохимического окрашивания, используя P53 и BCL2.

Полученные результаты:

Возникла карцинома с задержкой. В течение 3,5 мес наблюдался только вариант диспластических изменений. Кроме того, обнаружено снижение экспрессии маркеров клеточного цикла и апоптоза (P53 и BCL2) в образцах, обработанных амигдалином.

Заключение:

Амигдалин играет профилактическую роль в отношении плоскоклеточного рака полости рта, вызванного у хомяков. Он выполняет эту роль, контролируя основные белки, связанные с клеточным циклом и апоптозом (P53 и BCL2 соответственно).

Введение:

Злокачественные опухоли являются основным заболеванием, наносящим серьезный ущерб здоровью человека, и Всемирной организацией здравоохранения они были внесены в список серьезно угрожаемых здоровью человека. (1).

Поэтому лечение этой карциномы, как и других видов рака, с помощью таких традиционных методов лечения или дополнительных и альтернативных подходов, которые широко распространяются, представляет собой сложную задачу. (2)

(3) (4) (5).

Лаэтрил (амигдалин) также является важным примером альтернативной терапии рака и связан с цианогенными гликозидами, полученными из ядер различных фруктов (миндаля, абрикосов, персиков и т. д.). Это натуральный продукт, обладающий противоопухолевой активностью и меньшим количеством побочных эффектов. Это перспективный противоопухолевый препарат в сочетании с условно-хирургической терапией и химиотерапевтическими препаратами (6, 7).

Все больше данных подтверждают противораковое действие амигдалина и его избирательное убивающее действие на раковые клетки (8) (9) (10) (11).

Амигдалин также можно использовать для лечения рака и облегчения боли (8, 12, 13) (14) (15).

Материалы и методы:

Дизайн исследования:

• этом исследовании приняли участие 30 золотых сирийских хомяков. Мы индуцировали SCC в буккальном мешочке три дня в неделю, взаимозаменяемо с пероральным приемом амигдалина (200 мг). Это исследование длилось 3,5 месяца — время, необходимое для индукции плоскоклеточного рака в буккальном мешке. Всех хомяков забили через 3,5 месяца. Для гистопатологического исследования мы подготовили традиционные и иммуногистохимические красители.

Экспериментальное исследование проводилось в инкубаторах для животных фармацевтического факультета Дамасского университета. Подготовка образцов и методы окрашивания проводились в лаборатории патологии полости рта стоматологического факультета Дамасского университета.

Расчет размера выборки:

• соответствии с текущими требованиями исследования был предложен минимальный размер выборки в 30 хомяков, демонстрирующий 2,5-кратное увеличение. Этот расчет установил мощность теста на уровне 80% и уровень значимости на уровне 5%.

Материалы:

Амигдалин: амигдалин от компании «Терезия» применялся перорально в концентрации, достигающей 200 мг/кг.

Канцерогенный агент: мы использовали ДМБА, полициклический ароматический углеводородный канцероген, наносили его на слизистую оболочку щечной сумки молотков с помощью малярной кисти в течение трех с половиной месяцев.

Окрашивание: Мы использовали традиционные атласы (гематоксилин и эозин). В дополнение к иммуногистохимическим окраскам; P53 и BCL2 от американской компании Bio-SB.

Методы:

ДМБА наносили на левый щечный мешочек хомяка с помощью малярной кисти в течение трех с половиной месяцев.

Это предлагаемый период времени для индукции плоскоклеточного рака в рамках этого метода.

Амигдалин был приготовлен для перорального применения в дозе 200 мг/кг.

Хомяков забивали всех вместе через 3,5 месяца.

Образцы готовили для традиционного и иммуногистохимического окрашивания.

Классификация повреждений эпителия была разделена на 7 категорий: нормальный эпителий (значение 0), гиперплазия (значение 1), гиперплазия и дисплазия (значение 2), легкая дисплазия (значение 3), умеренная дисплазия (значение 4) и тяжелая дисплазия (значение 4). значение 5)

Статистика:

Мы использовали Т-тест Стьюдента для двух отдельных групп, чтобы сравнить экспрессию P53 и BCL2 в разные периоды времени применения препарата, и тест хи-квадрат, чтобы сравнить разницу между частотами положительной экспрессии иммуногистохимических окрасок и между частотами нормальных образцов легких и воспаленных.

Полученные результаты:

• некоторых образцах эпителия буккального мешка выявлены гиперпластические и диспластические изменения (24 случая), тогда как в других образцах (6 случаев) выявлена норма.

Влияние амигдалина на частоту изменений внутри эпителия. Для изучения достоверности различий

между частотами нормального эпителия и диспластического эпителия мы использовали критерий хи-квадрат (таблица 1).

Как показано в таблице 1, наблюдались достоверные изменения между частотами нормальных эпителиальный и диспластический (Р=0,005).

Результаты экспрессии иммуногистохимических окрасок: (таблица 2)

Влияние амигдалина на частоту иммуногистохимических окрасок:

Мы использовали критерий хи-квадрат для изучения значимости различий между частотами экспрессия иммуногистохимических окрасок: (таблица 3)

Никакой значимости между частотой отрицательных и положительных образцов для BCL2 ( P

= 0,796) и для P53 (P = 0,439).

Мы использовали Т-тест Стьюдента для изучения значимости различий между (0) и значениями экспрессии BCL2 и P53. (таблица 4)

• этой таблице показаны различия значимости, которые были продемонстрированы между стандартным значением

• и средними значениями положительных экспрессий в отношении двух исследованных белков (BCL2 и P53) при уровне достоверности 95 процентов (значение P <0,05). Положительный знак разницы указывает на то, что значения экспрессии белков были выше стандартного значения (0) в группе, получавшей амигдалин.

Обсуждение:

• этом исследовании мы обнаружили роль амигдалина, экстрагированного из косточек абрикоса, в качестве профилактического препарата плоскоклеточного рака, индуцированного в буккальном мешке хомяков. Амигдалин состоит из двух молекул глюкозы, одной единицы бензальдегида и синильной кислоты (HCN). Бензальдегид и синильная кислота обладают противоопухолевыми свойствами. Амигдалин использовался для лечения различных типов рака (9-11, 16-20).

• этом исследовании амигдалин, который применялся перорально в дозе 200 мг/кг в течение 3,5 месяцев, значительно подавлял начало развития плоскоклеточного рака у хомяков (15, 21, 22).

Изучая обзоры литературы, мы не обнаружили предыдущих исследований о профилактической роли амигдалина при плоскоклеточном раке или других видах рака.

Новые исследования подтвердили роль этого препарата в лечении различных видов рака человека. Его роль была связана с понижением регулируемого эффекта таких белков, как BCL2 (апоптозный белок) и повышением экспрессии BAX (антиапоптический белок). (6, 9, 11, 18, 20, 22-25).

Заключение:

Что касается злокачественных опухолей и их лечения, исследования сегодня направлены на таргетную терапию, а не на традиционные методы лечения. Дополнительные исследования и исследования должны принять во внимание эту точку зрения. Кроме того, более важно иметь возможность предотвращать возникновение подобных заболеваний среди лиц, имеющих склонность к развитию таких злокачественных новообразований.

В заключение следует отметить, что Амигдлайн заслуживает дальнейшей оценки своей профилактической роли.

Использованная литература:

1. Ллевеллин К.Д., Джонсон Н.В., Варнакуласурия К.А. Факторы риска плоскоклеточного рака полости рта у молодых

людей: комплексный обзор литературы. Оральная онкология. [Исследовательская поддержка, за пределами США

Правительственный обзор]. Июль 2001 г.;37(5):401-18.

2.Асили С., Фатхи Казеруни А., Агагазвини Л., Салигх Рад Х.Р., Пираеш Исламиан Дж. Магнитно-резонансная томография

• динамическим контрастом (DCE-MRI) и диффузионно-взвешенная магнитно-резонансная томография (DWI) для дифференциации доброкачественных и злокачественных опухолей слюнных желез. Журнал биомедицинской физики и инженерии. Декабрь

2015 г.;5(4):157-68.

Чанг Х.К., Ли Дж.В., Ким Ю.С., Ким Х., Ли М.Х. и др. Амигдалин подавляет 3. индуцированную липополисахаридом экспрессию

циклооксигеназы-2 и индуцибельной синтазы оксида азота в клетках микроглии мыши BV2. Нейрол Рез. [Поддержка сравнительных

исследований, правительство за пределами США]. 2007;29

Приложение 1:S59-64.

Боларинва И.Ф., Орфила С., Морган М.Р. Разработка и применение 4. иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения амигдалина, цианогенного гликозида, в пищевых продуктах. J Agric Food Chem. 9 июля 2014 г.;62(27):6299-305.

Боларинва И.Ф., Орфила С., Морган М.Р. Содержание амигдалина в семенах, ядрах и пищевых продуктах 5.

коммерчески доступен в Великобритании. Пищевая хим. 2014;152:133-9.

1. Сонг З, Сюй С. Расширенные исследования противоопухолевого действия амигдалина. J Рак Res Ther. [Исследовать

Поддержка, Обзор правительства за

пределами США]. 10 августа 2014 г. Приложение 1:3–7.

Корман ДБ. Альтернативные средства лекарственной терапии рака: летрил. Вопр Онкол. [Обзор]. 7. 2012;58(5):698-704. 8.

Чанг Х.К., Шин М.С., Ян ХИ, Ли Дж.В., Ким Ю.С., Ли М.Х. и др. Амигдалин индуцирует апоптоз посредством регуляции экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака простаты человека DU145 и LNCaP. Биол Фарм Булл. [Исследовательская поддержка, правительство за пределами США]. 2006 августа;29(8):1597-602.

Ли Х.М., Мун А. Амигдалин регулирует апоптоз и адгезию в тройной негативной молочной железе Hs578T 9.

Раковые клетки. Биомол Тер (Сеул). Январь 2016 г.;24(1):62-6.

1. Макаревич Дж., Рутц Дж., Юнгель Э., Каульфус С., Цаур И., Нельсон К. и др. Амигдалин влияет на адгезию и инвазию клеток рака мочевого пузыря in vitro. ПлоС один. [Исследовательская поддержка, правительство за пределами США]. 2014;9(10):e110244.

1. Чен Ю, Ма Дж, Ван Ф, Ху Дж, Цуй А, Вэй С и др. Амигдалин индуцирует апоптоз в клетках линии клеток рака шейки матки человека HeLa. Иммунофармакол Иммунотоксикол. [Исследовательская поддержка, правительство за пределами США]. Февраль 2013

г.;35(1):43–51.

1. Здроевич З., Отлевска А., Хакемер П. [Амигдалин - структура и клиническое значение]. Пол

Меркур Лекарски. Май 2015 г.;38(227):300-3.

Ли Х., Накашима Т., Танака Т., Чжан Ю.Дж., Ян С.Р., Куно И. Два новых мальтольных гликозида и 13 цианогенных гликозидов из Elsholtzia Rugulosa Hemsl. J Nat Med. Январь 2008 г.;62(1):75-8.

1. Боларинва И.Ф., Орфила С., Морган М.Р. Определение амигдалина в семенах яблок, свежих яблоках и переработанных яблочных соках. Пищевая хим. 1 марта 2015 г.; 170: 437-42.

Бромли Дж., Хьюз Б.Г., Леонг Д.К., Бакли Н.А. Опасное для жизни взаимодействие между 15. дополнительными лекарствами: токсичность цианидов после приема амигдалина и витамина С. Анналы фармакотерапии. Сентябрь 2005 г.; 39 (9): 1566-9.

1. Ли Н, Чен X, Ляо Дж, Ян Г, Ван С, Джозефсон Ю и др. Ингибирование 7,12-

диметилбенз[а]антрацен (ДМБА)-индуцированный оральный канцерогенез у хомяков чаем и куркумином.

Канцерогенез. [Исследовательская поддержка, правительство США, PHS]. 2002 августа;23(8):1307-13.

1. Ха У.С., Бэ В.Дж., Ким С.Дж., Юн Б.И., Хон Ш., Ли Дж.И. и др. Антоцианин индуцирует апоптоз клеток DU-145 in vitro и ингибирует

рост ксенотрансплантата рака простаты. Медицинский журнал Йонсей. [Исследовательская поддержка, правительство за пределами США]. Январь 2015 г.;56(1):16–23.

Пак Х.Дж., Юн С.Х., Хан Л.С., Чжэн Л.Т., Юнг К.Х., Ум Ю.К. и др. Амигдалин ингибирует гены, связанные с клеточным

циклом в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4. Мир Дж Гастроэнтерол. [Исследовательская поддержка, правительство за пределами США].

• сентября 2005 г.; 11 (33):

Цянь Л., Се Б., Ван Й., Цянь Дж. Опосредованное амигдалином ингибирование клеток немелкоклеточного рака легких 5156-61. 19. Инвазия in vitro. Международный журнал клинической и экспериментальной патологии. 2015;8(5):5363-70.

1. Юнгель Э., Томас А., Рутц Дж., Макаревич Дж., Цаур И., Нельсон К. и др. Амигдалин подавляет рост

клеток почечно-клеточного рака in vitro. Int J Mol Med. Февраль 2016 г.;37(2):526-32.

1. Адевуси С.Р., Оке О.Л. О метаболизме амигдалина. 1. ЛД50 и биохимические изменения у крыс. Канадский журнал физиологии

• фармакологии. Сентябрь 1985 г.;63(9):1080-3.

1. Чанг Л.В., Чжу Х.П., Ли В.Б., Лю ХК, Чжан QS, Чэнь Х.Б. Защитное действие амигдалина на альвеолярные эпителиальные клетки II типа, подвергнутые гипероксии, выделенные из легких недоношенных крыс in vitro. Чжунхуа эр ке за чжи Китайский педиатрический журнал. [Исследовательская поддержка, правительство за пределами США]. 2005 февраль;43(2):118-23. 23.

Хён-Гён ЧАН М-СС, Хе-и др. Амигдалин индуцирует апоптоз посредством регуляции Bax Экспрессия Bcl-2 в клетках рака простаты человека DU145 и LNCaP. Биол Фарм. 2006.

Журнал стоматологических и медицинских наук IOSR (IOSR-JDMS)

электронный ISSN: 2279-0853, p-ISSN: 2279-0861. Том 15, выпуск 2, версия. IX (февраль 2016 г.), стр. 75–79, www.iosrjournals.org.

Эффект амигдалина при лечении плоскоклеточного рака

индуцированный в буккальном мешке золотого сирийского хомяка

Амира Нур, доктор медицинских наук, магистр наук

1 Базель Азар, доктор медицинских наук, магистр наук

2 Анас Рабата, доктор медицинских наук, магистр наук

3 Проф.Ахмад Манадили, доктор медицинских наук, магистр, доктор философии

4 Кафедра патологии полости рта Дамасского университета

1Кафедра челюстно-лицевой хирургии Дамасского университета

2 Институт стоматологии и стоматологии Университета Палацкого

2 Кафедра патологии полости рта Дамасского университета

3 Кафедра оральной гистологии Масариковского университета

3 Кафедра патологии полости рта Дамасского университета

В последнее время научные исследования сосредоточились на альтернативной и комплементарной медицине как широко распространенном методе лечения многих заболеваний, включая рак. Рак, который считается опасным для жизни заболеванием, поражает пациентов во всем мире. Традиционная медицина до сих пор не обеспечивает пациентам окончательного и абсолютного решения их страданий, особенно в терминальных случаях рака. Многие люди используют альтернативные и естественные методы, чтобы максимально уменьшить боль и побочные эффекты этой ужасной болезни. Амигдалин, извлеченный из семян абрикоса и миндаля, обсуждается как настоящее лекарство от рака и многих других заболеваний. Поэтому с помощью этого исследования мы хотели оценить эффективность амигдалина в лечении плоскоклеточного рака, наиболее распространенной карциномы полости рта, индуцированной у сирийского хомяка, и определить, каким образом это вещество останавливает раковые клетки.

Материалы и методы:20 хомяков были разделены на две группы: группу больных (10 хомяков), которую лечили амигдалином, и контрольную группу (10 хомяков), которая не получала никакого лечения. Использованный канцерогенный материал представлял собой (DMPA), а иммуногистохимические пятна - P53 и Ki67.

Результаты и выводы:Существует значительная статистическая разница между двумя группами как для P53, так и для Ki67. В заключение отметим, что амигдалин оказывает терапевтический эффект при лечении плоскоклеточного рака, индуцируя апоптоз раковых клеток.

Ключевые слова:Плоскоклеточный рак, Амигдалин, альтернативная терапия, сирийский хомяк, клеточный цикл, P53, Ki67.

Введение:

Злокачественные опухоли являются основными заболеваниями, наносящими серьезный вред здоровью человека.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) включила его в список основных заболеваний, представляющих серьезную угрозу здоровью человека.

Плоскоклеточный рак полости рта (OSCC) составляет 95% всех форм рака головы и шеи и более.

за последнее десятилетие его заболеваемость возросла на 50%. Канцерогенез полости рта представляет собой многостадийный процесс, который одновременно включает предраковые поражения, инвазию и метастазирование. Деградация клеточного цикла и пролиферация злокачественных клеток приводит к утрате механизмов контроля, обеспечивающих нормальную функцию тканей (1).

Плоскоклеточная карцинома головы и шеи (SCCHN) возникает в результате множественных молекулярных событий, вызванных воздействием различных привычек, таких как табакокурение и употребление алкогольных напитков, под влиянием факторов окружающей среды, возможно, в некоторых случаях вирусов, на фоне наследственной резистентности или восприимчивости. Плоскоклеточный рак полости рта имеет аналогичную этиологию. Генетические повреждения затрагивают многие хромосомы и гены, включая онкогены и гены-супрессоры опухолей, и именно накопление таких генетических повреждений, возможно, наряду с нарушением способности восстанавливать эти повреждения (в некоторых случаях это наследственный признак), по-видимому, приводит к карциноме у в некоторых случаях, иногда через клинически очевидное предраковое или потенциально злокачественное поражение. В этом сообщении рассматриваются достижения в понимании этой сложной и быстро развивающейся области исследований за последнее десятилетие (2).

Плоскоклеточный рак полости рта (ПКР) считается первично локализованным заболеванием, отдаленные метастазы встречаются нечасто. В литературе сообщается о растущем количестве сообщений о случаях, связанных с необычными участками отдаленных метастазов карциномы полости рта. Вероятно, это связано с улучшением контроля над раком в первичном очаге, что увеличивает вероятность развития отсроченного метастазирования. В одной статье представлен случай 58-летней женщины, которая отказалась от хирургического лечения по поводу очень агрессивного ПКР альвеолярного гребня нижней челюсти. Опухоль не ответила на химиотерапию или лучевую терапию, и у пациента появились метастазы в черепные кости примерно через 1 год после первоначального диагноза. Расположение первичной опухоли (рядом с костью), а также отказ пациента от предложенного лечения могли привести к гематологическому распространению злокачественных клеток, что привело к отдаленному метастазированию (3).

• настоящее время многие исследования показывают, что 4-6% случаев рака полости рта возникают в возрасте моложе 40 лет. При изучении факторов риска в этой возрастной группе было отмечено, что они не связаны с курением или употреблением алкоголя, которые составляют основные факторы риска в старших возрастных группах. Предполагается, что предрасположенность к генетической

нестабильности является вероятной причиной (4).

Плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) — заболевание людей среднего и пожилого возраста. Однако в последнее время сообщалось о повышении заболеваемости HNSCC у молодых людей в возрасте до 45 лет. В нашем поиске литературы мы сосредоточились на эпидемиологии и этиологии HNSCC у взрослых в возрасте до 45 лет.

HNSCC у молодых людей связан с более высоким уровнем заболеваемости среди некурящих, более низким соотношением женщин и мужчин, более высоким процентом опухолей полости рта и ротоглотки и меньшим количеством вторичных первичных опухолей. Однако, помимо традиционных факторов риска, связанных с употреблением табака и алкоголя, причины возникновения этих видов рака у молодых людей остаются неясными. Агенты, которые могут способствовать риску, включают инфекцию подтипами вируса папилломы человека высокого риска, а также генетические факторы или статус иммунодефицита. Ожидаемый рост заболеваемости и смертности среди молодых людей с HNSCC может стать серьезной проблемой общественного здравоохранения, если текущие тенденции сохранятся, особенно образ жизни, который может способствовать развитию этого заболевания (5).

Исследование вируса папилломы человека и его экспрессии в нормальной слизистой оболочке полости рта и некоторых заболеваниях полости рта показало, что вирус папилломы человека все чаще выявляется в нормальной слизистой оболочке полости рта, доброкачественной лейкоплакии, интраэпителиальной неоплазии, плоскоклеточной карциноме и бородавчатой карциноме. Он выявлялся при плоскоклеточном раке полости рта значительно чаще в исследованиях, в которых использовался анализ с высокой чувствительностью (полимеразная цепная реакция), чем в исследованиях, в которых использовались анализы с умеренной чувствительностью (например, Саузерн-блот-гибридизация) и анализы с низкой чувствительностью (например, иммуногистохимия, гибридизация in situ). ). ДНК вируса папилломы человека значительно чаще обнаруживалась в замороженной плоскоклеточной карциноме полости рта, чем в ткани, залитой в парафин. В исследованиях, в которых анализировалось использование химических кофакторов, употребление табака и алкоголя чаще ассоциировалось с плоскоклеточным раком полости рта, чем с наличием вируса папилломы человека. Однако разница не была существенной. Генотипы вируса папилломы человека высокого риска имеют значительную связь с плоскоклеточным раком полости рта (6).

Мутация, дезактивация и нарушение регуляции экспрессии онкогенов и генов-супрессоров опухолей могут быть участвует в патогенезе плоскоклеточного рака полости рта (SCC). Деактивация гена-супрессора опухолей р53 обеспечивает пролиферацию клеток и блокирует апоптоз злокачественных кератиноцитов полости рта. Мутация онкогена ras приводит к постоянной митогенной передаче сигналов. Повышенная экспрессия c-Myc в присутствии факторов роста обеспечивает дополнительный пролиферативный сигнал. Утрата функции гена-супрессора опухолей ретинобластомы (Rb) может способствовать гиперпролиферации кератиноцитов полости рта, и недавние данные свидетельствуют о том, что для опухолевого процесса необходима одновременная деактивация как р53, так и Rb. Повышенная экспрессия Bcl-2 и пониженная экспрессия Fas ингибируют апоптоз опухолевых клеток и могут вызывать устойчивость к цитотоксическим препаратам и Т-клеточную цитотоксичность соответственно. Экзогенные мутагены, такие как табак, алкоголь и вирусные онкогены, могут вызывать изменение экспрессии онкогенов и генов-супрессоров опухолей в некоторых случаях плоскоклеточного рака полости рта. Подчеркивается влияние этих механизмов на будущие методы лечения плоскоклеточного рака полости рта (7).

• последние годы разработка противоопухолевых препаратов постепенно трансформировалась от цитотоксических препаратов к повышению селективности препаратов, преодолению множественной лекарственной устойчивости, разработке новых препаратов с низкой токсичностью и высокой специфичностью.

Амигдалин еще называют горьким абрикосом, лаэтрилом, миндалем. Это цианогенное соединение, принадлежащее к

группа ароматических цианогенных гликозидов. Его молекулярная формула: C.20ЧАС27НЕТ11, молекулярная масса 457,42.

Химическая структура: D-манделонитрил-β-D-глюкозид-6-β-глюкозид. Амигдалин широко распространен в растениях, особенно в семенах розоцветных растений, например, абрикоса, персика, вишни, сливы и др. (8, 9).

Сам по себе амигдалин нетоксичен, но при разложении некоторыми ферментами образует HCN, который является

ядовитое вещество (9). Многочисленные исследования подтвердили, что амигдалин оказывает противокашлевое и противоастматическое действие, а также влияет на пищеварительную систему. Кроме того, фармакологические эффекты также включают антиатерогенное действие, ингибирование интерстициального фиброза почек, предотвращение легочного фиброза, устойчивость к повреждению легких, вызванному гипероксией, иммуносупрессию, иммунную регуляцию, противоопухолевое, противовоспалительное и противоязвенное действие (10) (11) (12) (13)

Его использовали для лечения астмы, бронхита, эмфиземы, проказы, колоректального рака и витилиго (11). Амигдалин разлагался до синильной кислоты, которая является противоопухолевым соединением, и бензальдегида, который может вызывать обезболивающее действие, поэтому его можно использовать используется для лечения рака и облегчения боли (14).

Ученые указывают на использование амигдалина при лечении рака. Новое исследование изучило корреляцию между амигдалином и раком простаты. Было показано, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток у клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP путем активации каспазы-3 посредством подавления Bcl-2, антиапоптотического белка, и повышения регуляции Bax, проапоптотического белка (14).

Другое исследование изучало, как амигдалин может индуцировать апоптоз в клетках линии клеток рака шейки матки человека HeLa. В клетках HeLa, обработанных амигдалином, развивались типичные апоптотические изменения. Развитие апоптоза в клетках, обработанных амигдалином, было подтверждено двойным окрашиванием обработанных амигдалином клеток аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI) наряду с увеличением активности каспазы-3 в этих клетках (15).

Эффект амигдалина изучался при заболеваниях, отличных от рака, таких как легочный фиброз. В исследовании на крысах экспериментальные группы получали внутрибрюшинное введение амигдалина (15 мг/кг/день). Крыс забивали через 7, 14 и 28 дней после введения блеомицина. Амигдалин может снижать интенсивность пиков дифференциально экспрессируемых белков в сыворотке крыс (10).

Амигдалин эффективен для облегчения воспалительной боли и, следовательно, может использоваться в качестве анальгетика с противовоспалительными средствами.

ноцицептивное и противовоспалительное действие. Проведено исследование антиноцицептивного действия амигдалина, выделенного из Prunus Armeniaca, на крысах. Внутримышечное введение амигдалина достоверно уменьшало вызванную формалином тоническую боль как на ранней (первые 10 мин после инъекции формалина), так и на поздней фазе (10–30 мин после первичной инъекции формалина). На поздней стадии амигдалин уменьшал боль, вызванную формалином, дозозависимым образом в диапазоне доз менее 1 мг/кг (16).

• исследовании in vitro оценивалась противовоспалительная и обезболивающая активность амигдалина. клеточная линия, индуцированная липополисахаридом (ЛПС), и модель крысы с артритом голеностопного сустава, индуцированным каррагинаном. Амигдалин значительно ингибировал экспрессию мРНК TNF-альфа и IL-1beta в обработанных LPS клетках RAW 264.7. Амигдалин (0,005, 0,05 и 0,1 мг/кг) вводили внутримышечно сразу после индукции каррагинан-индуцированной артритной боли у крыс, а антиартритный эффект амигдалина оценивали путем измерения соотношения весового распределения несущих сил обоих стопы и окружность лодыжки, а также путем анализа уровней экспрессии трех молекулярных маркеров боли и воспаления (c-Fos, TNF-альфа и IL-1бета) в спинном мозге. Гипералгезия пораженной артритом лодыжки наиболее значительно облегчалась при инъекции 0,005 мг/кг амигдалина. При этой дозировке экспрессия c-Fos, TNF-альфа и IL-1бета в спинном мозге значительно подавлялась. Однако при дозировке более 0,005 мг/кг обезболивающего эффекта амигдалина не наблюдалось. Таким образом, лечение амигдалином эффективно облегчало реакцию на лечение ЛПС в клетках RAW 264.7 и каррагинан-индуцированный артрит у крыс и может служить анальгетиком для облегчения воспалительной боли (17).

Исследование in vitro изучило влияние амигдалина на рост клеток рака мочевого пузыря.

линии (UMUC-3, RT112 и TCCSUP). Исследовали рост опухоли, пролиферацию, клональный рост и прогрессирование клеточного цикла. Изученными белками, регулирующими клеточный цикл, были cdk1, cdk2, cdk4, циклин A, циклин B, циклин D1, p19, p27. Амигдалин в зависимости от дозы уменьшал рост и пролиферацию во всех трех клеточных линиях рака мочевого пузыря, что отражалось в значительной задержке прогрессирования клеточного цикла и остановке G0/G1. Таким образом, амигдалин может блокировать рост опухоли путем понижающей модуляции cdk2 и циклина А (18).

В другом исследовании сто семьдесят восемь пациентов с раком получали амигдалин плюс

Программа «метаболической терапии», состоящая из диеты, ферментов и витаминов. Подавляющее большинство этих пациентов до лечения находились в хорошем общем состоянии. Одна треть ранее не получала химиотерапию. Никакой существенной пользы с точки зрения излечения, улучшения или стабилизации рака, улучшения симптомов, связанных с раком, или увеличения продолжительности жизни не наблюдалось. В этом исследовании рекомендуется, чтобы пациенты, подвергшиеся воздействию этого агента, были проинструктированы об опасности отравления цианидами, а уровень цианида в их крови должен тщательно контролироваться, поскольку амигдалин является токсичным препаратом, который неэффективен при лечении рака (19).

Новое исследование показало, что амигдалин ингибирует гены, связанные с клеточным циклом в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4. Микрочип показал, что амигдалин подавляет активность, особенно генов, принадлежащих к категории клеточного цикла. Анализ ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР) показал, что уровни мРНК этих генов также снижались при лечении амигдалином в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4. Таким образом, это позволяет предположить, что амигдалин оказывает противораковое действие посредством понижающей регуляции генов, связанных с клеточным циклом, в клетках рака толстой кишки человека и может использоваться в качестве терапевтического противоракового препарата (20).

Новое передовое исследование противоопухолевого эффекта амигдалина показало, что амигдалин является естественным

продукт, обладающий противоопухолевой активностью, меньшим количеством побочных эффектов, широкодоступный и относительно недорогой. Все эти особенности делают амигдалин многообещающим противоопухолевым препаратом в сочетании с препаратами условной химиотерапии, которые могут оказывать синергический эффект, что дает новые идеи для разработки новых противораковых препаратов (9).

1. Материалы и методы:

Образец исследования:в него вошли 10 золотистых сирийских хомяков, которые были разделены на две группы: группу случаев, в которой рак был вызван в буккальном мешке, а в качестве лечения применялся амигдалин. Вторая была контрольной группой, в которой был вызван рак, но лечение не проводилось.

Амигдалин: Препарат был извлечен в лаборатории химического коллажа Дамасского университета из косточек горького абрикоса, затем полученный порошок растворяли в дистиллированной воде и готовили для инъекции в брюшину.

Канцерогенный агент: это ДМБА, полициклический ароматический углеводородный канцероген, который наносили на слизистую оболочку щечной сумки хомяков с помощью малярной кисти.

шрамирование: хомячков второй группы умерщвляли через 14 недель, предполагаемый период, в течение которого индуцируется рак в буккальном мешке. В то время как хомяки в основной группе начали получать амигдалин, инъецированный в брюшину, через 14 недель после того, как в их сумке были обнаружены язвы карциномы. Оно длилось 21 день — рекомендуемый период в различных исследованиях.

Образец окрашивания: Образцы были получены и окрашены традиционными красителями (гематоксилином и эозином), затем

были окрашены двумя иммуногистохимическими красителями: P53 и Ki67.

Статистика:

Т-тест Стьюдента использовался для двух отдельных групп, чтобы сравнить экспрессию P53 и Ki67 между группой, принимавшей витамин, и группой больных раком.

1. Обсуждение:

Предполагается, что амигдалин, как дополнительное и натуральное вещество, является терапевтическим средством при многих заболеваниях. Было проведено множество исследований с целью повышения его эффективности при лечении воспалительных заболеваний, а также различных видов рака. Тем не менее, он по-прежнему является потенциально ядовитым материалом из-за выброса цианида в результате его разложения. Кроме того, в литературе недостаточно доказанных данных, чтобы заявить о самом абсолютном механизме действия этого вещества внутри раковых клеток.

Мы провели это исследование, индуцируя плоскоклеточную карциному, как наиболее распространенную карциному ротовой полости, в буккальном мешке золотого сирийского хомячка, используя ДМБА в качестве канцерогенного агента. Затем индуцированный рак лечили инъекцией амигдалина в брюшину.

Амигдалин состоит из двух молекул глюкозы, одной из которых является бензальдегид, который является болеутоляющим средством.

• одна синильная кислота, которая считается противоопухолевым соединением.

• настоящем исследовании противоопухолевые эффекты амигдалина были изучены путем обнаружения митотического

индекс и путь P53 после лечения индуцированной карциномы, сравнивая результаты с результатами контрольной группы.

Ki67 был почти отрицательным у хомяков, получавших амигдалин, тогда как в группе больных раком он был повышен.

P53 также был отрицательным в группе лечения по сравнению с его высоким значением в группе рака.

• литературе нет статей, в которых упоминался бы митотический индекс при изучении влияния

амигдалин, ни путь P53 не изучались.

Клетки рака простаты, обработанные амигдалином, демонстрировали несколько морфологических характеристик.

апоптоз. Исследование показало, что амигдалин увеличивает экспрессию Bax, проапоптотического белка, снижает экспрессию Bcl-2, антиапоптотического белка, и увеличивает активность фермента каспазы-3 в клетках рака простаты

(14).

Тот же путь белков BAX был изучен в клетках рака шейки матки (клетки HeLa), показав

что в клетках HeLa, обработанных амигдалином, развивались типичные апоптотические изменения. (15)

Другое исследование объяснило влияние амигдалина на блокирование рака мочевого пузыря за счет уменьшения циклина А и циклин-зависимой киназы (cdk2), белков, регулирующих клеточный цикл в раковых клетках.

1. Заключение:

• заключение мы обнаружили, что амигдалин индуцирует апоптоз в клетках, подавляя экспрессию P53. Кроме того, амигдалин снижает уровень митотического индекса (Ki67) в этих клетках.

Благодарности:

Это исследование было поддержано грантом Дамасского университета, факультета стоматологии, кафедры патологии полости рта.

Рекомендации

• Ривера С., Венегас Б. Гистологические и молекулярные аспекты плоскоклеточного рака полости рта (обзор). Письма об онкологии. 2014;8(1):7-11. Электронная публикация

25.06.2014.

• Скалли С., Филд Дж. Генетические аберрации при плоскоклеточном раке головы и шеи (SCCHN) в отношении рака полости рта (обзор). Международный журнал онкологии. 1997;10(1):5-21. Электронная публикация 1 января 1997 г.

• Такахама А.-младший, Корреа М.Б., де Алмейда О.П., Лопес М.А. Плоскоклеточный рак полости рта, метастазирующий в кость черепа: описание случая и обзор литературы. Общая стоматология. 2014;62(2):59-61. Электронная публикация 07.03.2014.

• Ллевеллин К.Д., Джонсон Н.В., Варнакуласурия К.А. Факторы риска плоскоклеточного рака полости рта у молодых людей: комплексный обзор литературы. Оральная онкология. 2001;37(5):401-18. Электронная публикация 30 мая 2001 г.

• Майхжак Е., Шибяк Б., Вегнер А., Пиенковски П., Паздровски Дж., Лучевски Л. и др. Плоскоклеточный рак полости рта и ротоглотки у молодых людей: обзор литературы. Радиология и онкология. 2014;48(1):1-10. Электронная публикация 4 марта 2014 г.

• Миллер К.С., Уайт ДК. Экспрессия вируса папилломы человека в слизистой оболочке полости рта, предраковых состояниях и плоскоклеточном раке: ретроспективный обзор литературы. Хирургия полости рта, оральная медицина, патология полости рта, радиология полости рта и эндодонтия. 1996;82(1):57-68. Электронная публикация, 1 июля 1996 г.

• Шугерман П.Б., Джозеф Б.К., Сэвидж Н.В. Обзорная статья: Роль онкогенов, генов-супрессоров опухолей и факторов роста при плоскоклеточном раке

полости рта: случай апоптоза и пролиферации. Заболевания полости рта. 1995;1(3):172-88. Электронная публикация 1 сентября 1995 г.

• Хольцбехер, доктор медицинских наук, Мосс М.А., Элленбергер Х.А. Содержание цианидов в препаратах лаэтрила, семенах абрикоса, персика и яблока. Журнал токсикологии Клиническая токсикология. 1984;22(4):341-7. Электронная публикация 1 января 1984 г.

• Сонг З, Сюй С. Расширенные исследования противоопухолевого действия амигдалина. Журнал исследований и терапии рака. 2014;10 Приложение 1:3-7. Электронная публикация 11 сентября 2014 г.

• Ду Х.К., Сун ФК, Чжоу Х, Ли Х, Чжан Дж.П. Влияние амигдалина на белковый биомаркер сыворотки при фиброзе легких у крыс, индуцированных блеомицином. Чжунхуа лао донг вэй шэн чжи йе бин за чжи = Чжунхуа лаодун вэйшэн чжиебинг зажи = Китайский журнал промышленной гигиены и профессиональных заболеваний. 2010;28(4):260-3. Электронная публикация 15 мая 2010 г.

• Чанг Х.К., Ян Х.И., Ли Т.Х., Шин М.К., Ли М.Х., Шин М.С. и др. Экстракт спермы Armycae подавляет липополисахаридиндуцированную экспрессию циклооксигеназы (коррекция циклоозигеназы)-2 и индуцибельной синтазы оксида азота в клетках микроглии мыши BV2. Биологический и фармацевтический вестник. 2005;28(3):449-54. Электронная публикация 4 марта 2005 г.

• Мирмиранпур Х., Хагани С., Занди А., Халилзаде О.О., Герайеш-Неджад С., Мортеза А. и др. Амигдалин ингибирует ангиогенез в культивируемых эндотелиальных клетках диабетических крыс. Индийский журнал патологии и микробиологии. 2012;55(2):211-4. Электронная публикация 10 июля 2012 г. Чан Тай. Вероятный случай амигдалин-

• индуцированной периферической нейропатии у вегетарианца с дефицитом витамина B12. Терапевтический лекарственный мониторинг. 2006;28(1):140-1. Электронная публикация 19 января 2006 г.

• Чанг Х.К., Шин М.С., Ян ХИ, Ли Дж.В., Ким Ю.С., Ли М.Х. и др. Амигдалин индуцирует апоптоз посредством регуляции экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака простаты человека DU145 и LNCaP. Биологический и фармацевтический вестник. 2006;29(8):1597-602. Электронная публикация 2 августа 2006 г.

• Чен Ю, Ма Дж, Ван Ф, Ху Дж, Цуй А, Вэй С и др. Амигдалин индуцирует апоптоз в клетках линии клеток рака шейки матки человека HeLa. Иммунофармакология и иммунотоксикология. 2013;35(1):43-51. Электронная публикация 10.11.2012.

• Хван Х.Дж., Ким П., Ким С.Дж., Ли Х.Дж., Шим И., Инь К.С. и др. Антиноцицептивный эффект амигдалина, выделенного из Prunus Armeniaca, на боль, вызванную формалином, у крыс. Биологический и фармацевтический вестник. 2008;31(8):1559-64. Электронная публикация 2 августа 2008 г.

• Хван Х.Дж., Ли Х.Дж., Ким СиДжей, Шим И, Хам Д.Х. Ингибирующее действие амигдалина на экспрессию мРНК TNF-альфа и IL-1beta, индуцируемую липополисахаридами, и каррагинан-индуцированный артрит крыс. Журнал микробиологии и биотехнологии. 2008;18(10):1641-7. Электронная публикация

29.10.2008.

• Макаревич Дж., Рутц Дж., Юнгель Э., Каульфус С., Райтер М., Цаур И. и др. Амигдалин блокирует рост клеток рака мочевого пузыря in vitro за счет уменьшения циклина А и cdk2. ПлоС один. 2014;9(8):e105590. Электронная публикация 20 августа 2014 г.

• Мортель К.Г., Флеминг Т.Р., Рубин Дж., Кволс Л.К., Сарна Г., Кох Р. и др. Клинические испытания амигдалина (Лаэтрила) при лечении рака у человека. Медицинский журнал Новой Англии. 1982;306(4):201-6. Электронная публикация 28 января 1982 г.

• Пак Х.Дж., Юн С.Х., Хан Л.С., Чжэн Л.Т., Юнг К.Х., Ум Ю.К. и др. Амигдалин ингибирует гены, связанные с клеточным циклом в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4. Всемирный журнал гастроэнтерологии: WJG. 2005;11(33):5156-61. Электронная публикация 30 августа 2005 г.