Тэг: цисплатин

Активация митохондриального окисления путем ингибирования

PDK2 обращает вспять устойчивость к цисплатину при раке головы и шеи

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1016/j.canlet.2015.11.023

Чон Лиел Рох a, *, Джин Янг Парк a, Ын Хе Ким a, Хе Джин Чан a, Минсу Квон b

a Отделение отоларингологии, Медицинский центр Асан, Медицинский колледж Университета Ульсан, Сеул, Республика Корея
b Отделение отоларингологии, Медицинская школа при больнице Национального университета Кёнсан, Чинджу, Республика Корея

Автор переписки: Тел: +82 2 3010 3965; факс: +82 2 489 2773. Адрес электронной почты: rohjl@amc.seoul.kr (J.-L. Roh).

Получено: 9 сентября 2015 г.
Пересмотрено: исправленная форма 13 ноября 2015 г.
Принято: 14 ноября 2015 г

Аннотация

Дихлорацетат (ДХА), сиротский препарат, способствующий переходу от гликолиза к окислительному фосфорилированию, был повторно использован для лечения рака. В настоящем исследовании изучалось, может ли DCA преодолеть резистентность к цисплатину при раке головы и шеи (РГШ). Были использованы две устойчивые к цисплатину линии клеток РГШ (AMC-HN4R и -HN9R), их родительские линии и другие линии клеток РГШ человека. Эффект DCA, отдельно и в комбинации с цисплатином, оценивали путем измерения клеточного цикла, жизнеспособности, гибели, продукции реактивных форм кислорода (ROS), мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) и экспрессии белков в доклинических моделях опухолевых ксенотрансплантатов мыши. Увеличение гликолиза коррелировало со снижением чувствительности к цисплатину и уменьшалось под действием DCA. Устойчивые к цисплатину клетки сверхэкспрессировали киназу пируватдегидрогеназы 2 (PDK2). DCA индуцировал гибель клеток HNC путем снижения ΔΨm и стимулирования производства митохондриальной ROS. Этот эффект снижался антиоксидантом N-ацетил-л-цистеином или ингибированием апоптоза, опосредованного каспазой. Активация митохондриального окисления глюкозы под действием DCA в конечном итоге активировала нижележащие митохондриальные апоптотические сигналы, что привело к гибели химиорезистентных раковых клеток. Таким образом, DCA значительно сенсибилизировал устойчивые клетки HNC к цисплатину in vitro и in vivo. Высокий гликолиз и сверхэкспрессия PDK2 тесно связаны с устойчивостью клеток НЯК к цисплатину; последняя может быть преодолена с помощью DCA.

Ключевые слова: Рак головы и шеи, устойчивость к цисплатину, PDK2, дихлорацетат, ремоделирование митохондрий
Сокращения: РГШ, рак головы и шеи; ДХА, дихлорацетат; CDDP, цисплатин; OXPHOS, окислительное фосфорилирование; PDK2, киназа 2 пируватдегидрогеназы; PDHE1α, изоформа E1α пируватдегидрогеназы; ROS, реактивные виды кислорода; ΔΨm, мембранный потенциал митохондрий; NAC, N-ацетил-цистеин; DCF-DA, 2′,7′- дихлорфлуоресцеин диацетат; PARP, поли(АДФ-рибоза) полимераза; siRNA, короткая интерферирующая РНК; 18F-FDG, 18F-фтордезоксиглюкоза; PET, позитронно-эмиссионная томография; SUV, стандартизированное значение поглощения; MTV, метаболический объем опухоли; TUNEL, терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованное мечение ник-конца ДУТФ.

© 2015 Elsevier Ireland Ltd. Все права защищены.

ВВЕДЕНИЕ

Рак головы и шеи (РГШ) является восьмым по распространенности раком во всем мире, ежегодно диагностируется более полумиллиона новых случаев [1]. Опухоли возникают в верхних отделах пищеварительного тракта, включая ротовую или носовую полость, глотку и гортань, и метастазируют в регионарные лимфатические узлы и отдаленные участки. Современный стандарт лечения ГНК включает мультимодальный подход, включающий хирургию, химиотерапию и радиотерапию, особенно при распространенном ГНК. Наряду с недавним интересом к стратегиям сохранения органов, нехирургические методы, такие как радиотерапия в сочетании с химиотерапией, все чаще используются в качестве первой линии терапии при НЯК [2]. В настоящее время системная химиотерапия является центральным компонентом нескольких лечебных подходов, включая комбинацию с окончательной лучевой терапией или индукционным лечением, превышающим резервирование только для паллиации [3]. Цисплатин, платиновое производное цис-диамминдихлорплатина (II) (CDDP), остается химиотерапевтическим препаратом первой линии в нехирургических методах лечения НЯК, несмотря на последние достижения в области таргетной терапии [4]. Однако за последние три десятилетия, несмотря на диагностические и терапевтические достижения, общая выживаемость при НЯК существенно не изменилась, что является результатом стойкой резистентности раковых клеток к терапии, включая цисплатин и облучение [2].

Метаболические изменения являются общей чертой раковых клеток: сдвиг в генерации клеточной энергии от митохондриального окислительного фосфорилирования к аэробному гликолизу обеспечивает биосинтетическое преимущество раковых клеток [5]. Увеличение гликолиза в раковых клетках, называемое эффектом Варбурга, обычно связано с фенотипическими изменениями, включая адаптацию к гипоксии и недостатку питательных веществ, устойчивость к окислительному стрессу и апоптотическим стимулам, а также повышенный синтез биомассы [6]. Дерегулированный метаболизм связан с устойчивостью к лечению при терапии рака [7]. В гликолитическом пути повышение уровня транспортера глюкозы (GLUT), гексокиназы (HK), пируваткиназы M2 (PKM2), киназы пируватдегидрогеназы (PDK), лактатдегидрогеназы-A (LDHA), синтеза жирных кислот (FASN) и глутаминазы, среди прочих, связано с устойчивостью к противораковым препаратам [7]. Имеются данные о том, что регулирование метаболизма раковых клеток может улучшить терапию и преодолеть устойчивость к химиотерапии или радиотерапии [8,9].

Дихлорацетат (ДХА), сиротский препарат для лечения молочнокислого ацидоза, сдвигает метаболизм раковых клеток с гликолиза на окислительное фосфорилирование [10]. DCA избирательно ингибирует PDK, который активируется во многих видах рака, что приводит к активации пируватдегидрогеназы (PDH), комплекса ферментов, которые превращают цитозольный пируват в митохондриальный ацетил-КоА. Ингибирование PDK с помощью малой интерферирующей РНК (siRNA) или лечение DCA изменяет биоэнергетику рака и восстанавливает митохондрий-зависимый апоптоз в раковых клетках [11]. DCA эффективен в лечении рака с агрессивным фенотипом in vitro и in vivo[12,13], а также преодолевает резистентность к сорафенибу в гепатоцеллюлярной карциноме путем активации митохондриального окислительного фосфорилирования [14]. Таким образом, DCA может быть подходящим противораковым препаратом для повышения эффективности химиотерапии и преодоления резистентности к химиотерапевтическим средствам при раке человека; однако, хотя DCA широко изучался при раке, он редко тестировался на клетках НЯК [15], особенно в условиях резистентности к химиотерапевтическим средствам. Необходимо дальнейшее изучение механизмов действия DCA и синергизма с традиционными химиотерапевтическими препаратами. Здесь мы показываем, что DCA смещает биоэнергетику НЯК в сторону митохондриального окисления глюкозы и приводит к накоплению в клетках митохондриальных реактивных форм кислорода (mROS), тем самым сенсибилизируя химиорезистентные клетки НЯК к цисплатину in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Культура клеток и создание цисплатин-устойчивых клеток НГШ
Клетки рака головы и шеи человека (РГШ) AMC-HN2, -HN3, -HN4, -HN5, -HN9 и -HN10 выращивали в минимальной основной среде Орла (Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA); Клетки SNU-1041, -1066 и -1076 выращивали в среде Roswell Park Memorial Institute (Life TechnologiesTM ); а клетки UMSCC1 выращивали в модифицированной среде Дульбекко Eagle (Life TechnologiesTM ). Среда была дополнена 10% фетальной бычьей сывороткой. Все линии раковых клеток были подтверждены путем профилирования ДНК (короткие тандемные повторы, STR), предоставленной Корейским банком клеточных линий. Клетки инкубировали при 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2.

Устойчивые к цисплатину клетки AMC-HN4 и HN9 (HN4R и HN9R) были получены из родительских чувствительных к цисплатину клеток AMC-HN4 и HN9, соответственно, путем воздействия возрастающих концентраций цисплатина (цис-платина (II) диамин дихлорид [CDDP]; Sigma-Aldrich, Луис, МО, США) [16]. Устойчивость к цисплатину в созданных клеточных линиях оценивали с помощью анализа жизнеспособности клеток и сравнивали с родительскими клетками.

Анализ клеточного цикла и гибели клеток
Для анализа клеточного цикла клетки подвергали воздействию ДКА в течение 72 ч. Затем клетки трипсинизировали, фиксировали на ночь в ледяном этаноле и окрашивали в течение 30 мин йодистым пропидием (Sigma-Aldrich) при температуре 37 °С. Содержание клеточной ДНК измеряли с помощью проточного цитометра FACScalibur (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США). Для анализа клеточной гибели клетки культивировали с цисплатином и DCA, отдельно или в комбинации, или эквивалентным количеством ДМСО (транспортный контроль). Через 72 часа клетки собирали, промывали ледяным PBS и ресуспендировали в буфере для связывания. Клетки окрашивали аннексином V-FITC (флуоресцеин изотиоцианат) и йодистым пропидием с использованием набора для выявления апоптоза аннексином V-FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), а затем анализировали методом проточной цитометрии. Все данные анализировали с помощью программного обеспечения Cell Quest (BD Biosciences). Статистическую значимость между различными группами лечения оценивали с помощью двуххвостового U-теста Манна-Уитни или t-теста Стьюдента.

Для анализа активности каспазы клетки HN4R и HN9R, посеянные в 96-луночный планшет, подвергали воздействию 100 мкл среды, содержащей цисплатин и DCA отдельно или в комбинации, в течение 72 ч, с или без 3 мМ NAC или 50 мкМ Z-VAD-fmk (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) перед воздействием 30 мМ DCA. Анализы проводили в трех лунках с использованием флуориметрического Homogeneous Caspase Assay (Roche Life Science, Базель, Швейцария). Добавляли рабочий раствор субстрата, и планшет инкубировали в темноте при 37 °C в течение 2-8 ч или при комнатной температуре в течение ночи. Поглощение в каждой лунке измеряли при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны эмиссии 520 нм с помощью микропланшетного ридера SpectraMax M2.

Для измерения мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) клетки HN4R и HN9R, посеянные в 96-луночный планшет, подвергались воздействию 100 мкл среды, содержащей цисплатин и DCA отдельно или в комбинации в течение 36 ч. Клетки окрашивались 200 нМ тетраметилродамин этилового эфира (TMRE, Life Technologies TM ) в течение 20 мин и затем анализировались методом проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) каждой группы лечения была нормализована по отношению к контрольной группе.

Доклинические исследования
Все процедуры исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных нашего учреждения. Шестинедельные атимичные самцы мышей BALB/c (nu/nu) были приобретены у Central Lab Animal Inc. (Сеул, Республика Корея). Клетки AMC-HN4R или HN9R (5 x 10 6 ) вводили подкожно во фланг. Объем опухоли и вес тела измеряли каждые 3 дня. Опухоли измеряли с помощью штангенциркуля, а объем рассчитывали как (длина х ширина2 )/2. Лечение начиналось, когда клеточные имплантаты становились пальпируемыми узелками (= день 0). Мыши были рандомизированы на четыре группы лечения: транспортное средство, DCA, цисплатин и DCA плюс цисплатин.

Мышей лечили питьевой водой с добавлением 0,5 г/л DCA, или внутривенным введением 5 мг/кг цисплатина один раз в неделю, или комбинацией DCA и цисплатина по одинаковым графикам. Мышей приносили в жертву на 24-й день, опухоли выделяли и анализировали с помощью иммуноблотинга и in situ терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы-опосредованного мечения никкеля ДУТФ (TUNEL) (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Количество апоптотических телец подсчитывали вслепую в десяти случайно выбранных полях высокой мощности. Статистическую значимость между различными группами лечения оценивали с помощью двуххвостового U-теста Манна-Уитни или t-теста Стьюдента.

Результаты

Увеличение гликолиза в клетках HNC связано с резистентностью к цисплатину и обратимо под действием DCA
Все клеточные линии, использованные в нашем исследовании, были человеческими HNC. Цитотоксический эффект DCA оценивался в клетках HNC с помощью исключения трипанового синего, окрашивания кристаллическим фиолетовым и МТТ. DCA, протестированный в концентрации до 30 мМ в течение 72 ч, заметно подавлял рост клеток HNC (МТТ-тест, рис. 1А). Биоэнергетика клеток НЯК изменялась под действием ДКА: клеточный гликолиз значительно уменьшался, а окислительное фосфорилирование увеличивалось (рис. 1В). Изменение биоэнергетики варьировалось между линиями клеток НЯК и было значительно связано с чувствительностью к цисплатину: клетки НЯК с высоким гликолизом демонстрировали устойчивость к цисплатину (R2 = 0,859, P < 0,001; рис. 1С ). Кроме того, при воздействии DCA раковые клетки с наибольшим изменением биоэнергетики, скорее всего, становились более апоптотичными (R2 = 0,769, P = 0,002; рис. 1D ). Это позволяет предположить, что DCA вызывает специфический для раковых клеток апоптоз путем снижения гликолиза в клетках HNC.

Рис. 1. Повышенный гликолиз в клетках HNC коррелирует со снижением чувствительности к цисплатину и уменьшается под действием дихлорацетата (DCA). (А) DCA индуцировал гибель клеток в клетках HNC. Цитотоксичность оценивалась с помощью МТТ-анализа после воздействия различных концентраций ДХА в течение 72 ч. (B) Изменение биоэнергетики под воздействием ДХА в клетках HNC. Измерения гликолиза и OXPHOS (%) были описаны в разделе «Материалы и методы». (C) Корреляция между гликолизом и IC50 цисплатина в группе клеточных линий HNC. IC50 рассчитывали с помощью МТТ-анализа в трех независимых экспериментах, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. Корреляция оценивалась с помощью линейной регрессии. (D) Корреляция между биоэнергетическими изменениями и апоптозом в клетках HNC. В анализе апоптоза измеряли аннексин V-положительные апоптотические фракции после воздействия 20 мМ DCA в течение 72 часов.

Экспрессия PDK2 связана с устойчивостью к цисплатину в HNC
Цитотоксическое действие цисплатина было проверено на культивируемых клеточных линиях HN4-cisR и HN9-cisR и родительских раковых клетках (рис. 2А). Устойчивые к цисплатину клетки HN4-cisR и HN9-cisR показали 12-кратное и 18-кратное увеличение IC50, соответственно, по сравнению с соответствующими родительскими линиями. Вестерн-блот анализ показал, что HK2 и PDK2 были высоко экспрессированы в клетках HN4-cisR и HN9-cisR по сравнению с соответствующими родительскими клетками, в то время как экспрессия PDHE1α была низкой в клетках, устойчивых к цисплатину (рис. 2B). Уровень экспрессии мРНК PDK2 также был выше в резистентных клетках, чем в чувствительных (P < 0,01) (рис. 2C). DCA подавлял рост цисплатин-резистентных клеток HNC в той же степени, что и цисплатин-чувствительных клеток HNC (рис. 2D). Вестерн-блот анализ показал, что DCA значительно снизил уровень PDK2 и фосфо-PDHE1α (pPDHE1α), но повысил уровень проапоптотических белков, включая расщепленный PARP (cPARP) и PUMA, а также p21 в HN4-cisR и HN9-cisR (рис. 2E). Это говорит о том, что DCA может эффективно подавлять рост цисплатин-резистентных клеток HNC, а также чувствительных к цисплатину клеток HNC.

Рис. 2. Экспрессия PDK2 связана с устойчивостью к цисплатину в НЯК. (А) Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью МТТ-анализа после воздействия цисплатина в течение 72 ч. (B) Вестерн-блот анализ показывает различные уровни белков гексокиназы 2 (HK2), киназы пируватдегидрогеназы 2 (PDK2), пируватдегидрогеназы (PDH) E1α (PDHE1α) и лактатдегидрогеназы-A (LDHA) в необработанных клетках HN4 (HN4R) и HN9 (HN9R), устойчивых к цисплатину, и в их родительских клетках. (C) Изменение уровня экспрессии гена PDK2 между клетками, устойчивыми к цисплатину (cis-R), и их родительскими клетками. * обозначает P <0,01 относительно родительских клеток HNC. (D) Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-анализа после воздействия 15 и 30 мМ DCA в течение 72 ч. Столбики ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. (E) Вестерн-блот анализ выявляет изменения в уровнях расщепленного PARP, PUMA, p21, PDK2, phosho-PDHE1α (pPDHE1α) и PDHE1α в цисплатин-устойчивых клетках HN4R и HN9R, подвергнутых воздействию ДКА в течение 24 ч. Уровень β-актина оценивался в качестве контроля загрузки.

DCA индуцирует накопление ROS в клетках HNC
Изменение клеточной ROS под воздействием DCA оценивалось методом проточной цитометрии с использованием редокс-чувствительного флуоресцентного зонда DCF-DA. Воздействие DCA вызвало значительное повышение уровня ROS в клетках HNC (P < 0,01), которое блокировалось совместным воздействием NAC или ингибитором SOD диэтил-дитиокарбаматом (рис. 3A). Гликолиз значительно увеличился в цисплатин-устойчивых клетках HNC по сравнению с родительскими клетками (P < 0,01), но DCA вызвал значительное снижение гликолиза и увеличение окислительного фосфорилирования как в чувствительных к цисплатину, так и в цисплатин-устойчивых клетках HNC (P < 0,01) (рис. 3B). Мембранный потенциал митохондрий (ΔΨm) измеряли с помощью TMRM, чувствительного к напряжению митохондрий красителя на основе родамина, а митохондриальную ROS (mROS, супероксид митохондрий) измеряли с помощью MitoSOX red. В клетках HNC, обработанных DCA, наблюдалось снижение ΔΨm и увеличение mROS (P < 0,01) (рис. 3C). Изменение ΔΨm в цисплатин-устойчивых клетках HNC при воздействии DCA блокировалось предварительной обработкой NAC (рис. 3Д). Это говорит о том, что DCA может вызывать накопление ROS в клетках HNC путем активации окислительного фосфорилирования.

Рис. 3. DCA индуцирует внутриклеточное накопление ROS в клетках HNC. (A) Повышение уровня ROS под действием DCA. Устойчивые к цисплатину клетки HN4R и HN9R подвергали воздействию 15 или 30 мМ DCA в течение 24 ч. Клетки также предварительно обрабатывали ингибитором ROS N-ацетил-цистеином(NAC, 3 мМ) или ингибитором супероксиддисмутазы (iSOD) диэтил-дитиокарбаматом (10 мкМ). Уровни ROS измерялись методом проточной цитометрии с использованием DCF-DA и показаны как изменения в разах по сравнению с контрольным (базальным) уровнем. Все значения являются средними ± S.E. трех независимых экспериментов. * обозначает P <0,01 относительно контроля, и ** обозначает P <0,01 относительно 30 мМ DCA. (B) Изменение биоэнергетики под действием ДКА в клетках HNC. * обозначает P <0,05 по сравнению с контролем, и ** обозначает P <0,01 по сравнению с родительскими клетками, чувствительными к цисплатину. (C) Изменение реактивных форм кислорода (ROS, т.е. супероксид), измеренных с помощью mitoSOX, и мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm, красное окрашивание) при воздействии 20 мМ DCA по сравнению с необработанным контролем (ctr). Произвольные единицы флуоресценции (AFU) в контрольных и обработанных ДКА клетках. (D) Изменения ΔΨm в клетках HN4R и HN9R после 36 ч воздействия ДКА. ΔΨm измеряли с помощью тетраметилродамин этилового эфира и анализировали методом проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции в каждой группе лечения была нормализована по отношению к контрольной группе. Планки ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. * обозначает P <0,01 по сравнению с контролем. ** обозначает P <0,01 по сравнению с DCA или DCA плюс NAC.

ДКА способствует остановке клеточного цикла и апоптозу в клетках HNC
Клоногенный анализ привел к заметному снижению числа колоний HN4-cisR и HN9-cisR при воздействии ДКА (P < 0,01) (рис. 4A ). Проточная цитометрия с окрашиванием йодистым пропидием показала значительное изменение клеточного цикла в клетках HNC: вогонин увеличил популяцию апоптотических клеток sub-G1 (P < 0,05), и этот эффект блокировался при совместном воздействии с NAC (рис. 4B ). Вестерн-блот анализ показал, что DCA снижал pPDHE1α, но увеличивал cPARP, p21, фосфо-p53 и расщепленную каспазу-3 (cCasp3) в зависимости от времени (рис. 4C ). Активация PDHE1α путем нокдауна PDK2 в клетках AMC-HN4-cisR не привела к значительному увеличению проапоптотических белков cPARP и cCasp3 (рис. 4D ); однако нокдаун PDHE1α снизил экспрессию p21 и фосфорилирование p53. Проточная цитометрия с использованием йодистого пропидия и окрашивания аннексином-V показала эффективную индукцию апоптоза и гибели клеток в цисплатин-устойчивых клетках HNC под действием DCA; эффект снижался при совместном воздействии DCA и антиоксиданта NAC или пан-каспазного ингибитора Z-VAD-fmk (рис. 4E). Это было подтверждено измерением активности каспазы, которая значительно увеличивалась под действием ДКА в зависимости от концентрации (рис. 4F).

Рис. 4. DCA индуцирует гибель клеток и изменения клеточного цикла в клетках HNC. (A) Клоногенный анализ устойчивых к цисплатину раковых клеточных линий, подвергнутых воздействию DCA. Раковые клетки AMC-HN4R и HN9R подвергались воздействию DCA в течение 72 ч. Столбики ошибок представляют собой средние квадратичные значения трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился в трех экземплярах. * обозначает P <0,01. (B) Анализ клеточного цикла при воздействии ДКА. Клетки AMC-HN4R, подвергнутые воздействию DCA в течение 72 ч, окрашивали йодистым пропидием и подвергали проточному цитометрическому анализу. * обозначает P <0,05. (C) Вестерн-блот анализ выявил изменения в уровнях расщепленного PARP (cPARP), p21WAF1, фосфо-p53-ser 15 (pp53), расщепленной каспазы 3 (cCasp3), pPDHE1α и PDHE1α. Клеточные экстракты были получены после воздействия на клетки AMC-HN4R 30 мМ DCA. (D) Влияние DCA и генетического ингибирования PDK2 и PDHE1α на проапоптотические белки, расщепленный PARP и расщепленную каспазу 3, а также на p21WAF1. Белки были измерены с помощью Вестерн-блот анализа в клетках AMC-HN4R, подвергнутых воздействию 30 мМ DCA. Раковые клетки были трансфицированы скремблированной siRNA (scr), PDK2 siRNA или PDHE1α siRNA в течение 48 ч до воздействия 30 мМ DCA. (E) Анализ апоптоза в клетках AMC-HN4R и HN9R, подвергнутых воздействию ДКА. Клетки подвергали воздействию ДКА в течение 72 ч, после чего измеряли апоптотические фракции, позитивные по аннексину V. (F) Повышение активности каспазы при обработке ДКА. Столбики ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех повторов. * и ** обозначают P <0,01 относительно контроля и 30 мМ DCA, соответственно. Перед воздействием 30 мМ ДКА клетки также предварительно обрабатывали 3 мМ NAC или 50 мкМ пан-каспазного ингибитора Z-VAD-fmk.

DCA сенсибилизирует цисплатин-устойчивые клетки HNC к цисплатину in vitro и in vivo
Цисплатин (10 мкМ) не вызывал значительной цитотоксичности или экспрессии апоптотических белков в цисплатин-устойчивых линиях HNC HN4-cisR и HN9-cisR по сравнению с родительскими чувствительными к цисплатину линиями HN4 и HN9 (рис.

5А).

5A); однако DCA вызывал заметное снижение выживаемости в цисплатин-устойчивых клетках HNC (P < 0,05), которое блокировалось предварительной обработкой NAC. DCA индуцировал экспрессию апоптотических белков и увеличивал цисплатин-индуцированную цитотоксичность и экспрессию апоптотических белков в клетках HN4-cisR (рис.

B

). В комбинации DCA увеличивал цитотоксичность цисплатина в клетках HN4-cisR за счет повышения активности каспаз до степени, превышающей сумму эффектов каждого из агентов в отдельности (CI < 1, P < 0,01), которые ослаблялись при глушении гена PDHE1α (рис. 5C). Уровень ΔΨm был выше в клетках HN4-cisR, устойчивых к цисплатину, чем в чувствительных к цисплатину родительских клетках HN4 (ΔΨm, средняя интенсивность флуоресценции [MFI]: 1 ± 0 против 0,54 ± 0,09, P < 0,001) и снижался под действием DCA или комбинации цисплатина и DCA, что ослаблялось глушением гена PDHE1α (рис. 5D).

Рис. 5. DCA сенсибилизировал цисплатин-резистентные клетки HNC к цисплатину. (А) Жизнеспособность клеток оценивали по исключению трипанового синего после воздействия цисплатина (CDDP), DCA или их комбинации. Цитотоксический эффект DCA блокировался антиоксидантом N-ацетил-цистеином(NAC, 3 мМ). Планки ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. * обозначает P <0,01 по сравнению с контролем, и ** обозначает P <0,01 по сравнению с предварительной обработкой NAC. (B) Вестерн-блоттинг, показывающий увеличение чувствительности к цисплатину (CDDP) под действием DCA. Устойчивые к цисплатину клетки AMC-HN4R обрабатывали DCA, цисплатином или обоими препаратами в течение 72 ч. (C) Повышение уровня каспаз после 72-часового воздействия DCA, цисплатина и PDHE1α siRNA. Клетки HN4R подвергались воздействию DCA, цисплатина или комбинации обоих препаратов, после чего измерялась активность каспазы.(D) Изменения ΔΨm в клетках HN4R после 36-часового воздействия DCA, цисплатина или комбинации обоих препаратов. ΔΨm измеряли с помощью этилового эфира тетраметилродамина и анализировали методом проточной цитометрии. Медиана интенсивности флуоресценции в каждой группе лечения была нормализована по отношению к контрольной группе. Планки ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. * и ** означают P <0,01 по сравнению с контролем и скремблированной (scr) siRNA, соответственно. *** обозначает P <0,01 по сравнению с DCA или цисплатином.

Эти результаты были далее изучены на мышиных моделях опухолевых ксенотрансплантатов in vivo. Атимичные мыши BALB/c, несущие опухоли AMC-HN4-cisR или HN9-cisR, получали DCA, цисплатин, DCA плюс цисплатин или транспортное средство. Комбинация цисплатина и DCA синергетически подавляла рост опухоли (рис. 6A). Визуализация роста опухоли in vivo проводилась с помощью ПЭТ с 18 F-ФДГ на 21 день лечения. Очаговые поглощения 18 F-ФДГ наблюдались в местах имплантации опухоли, где измерялось максимальное стандартизированное поглощение (SUVmax) и метаболический объем опухоли при SUV 2.0 (MTV2.0). SUVmax не отличался между группами лечения (P > 0,1), но MTV2.0 был значительно ниже в группах, получавших DCA и комбинацию, чем в других группах (P < 0,05) (рис. 6B). Анализ апоптоза in situ показал, что TUNEL-положительные апоптотические тельца чаще встречались в опухолях, получавших DCA и цисплатин плюс DCA, чем в опухолях, получавших транспортное средство (P < 0,01) (рис. 6C). Вестерн-блот анализ опухолевых тканей показал, что уровень апоптотических белков увеличился в большей степени в клетках HN4-cisR, обработанных комбинацией цисплатина и DCA, чем в опухолях, обработанных одним агентом (рис. 6D).

Рис. 6. DCA сенсибилизирует цисплатин-резистентные клетки HNC к цисплатину in vivo. (A) Противоопухолевый эффект DCA и цисплатина в модели опухолевого ксенотрансплантата на мышах. Голым мышам вводили 5 ×106 клеток AMC-HN4R и HN9R во фланг. Лечение транспортным средством, цисплатином (CDDP), DCA или комбинацией цисплатина и вогонина начиналось после того, как имплантированные опухолевые клетки образовывали пальпируемые узелки. Каждая группа включала десять мышей. Столбики ошибок представляют S.E. * и ** обозначают P <0,05 и P <0,01 по сравнению с контролем (ctr), соответственно. (B) Визуализация опухоли in vivo с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) с 18F-фтордезоксиглюкозой. ПЭТ-сканирование проводилось через 3 недели после начала лечения. Максимальный стандартизированный объем поглощения (SUVmax) и метаболический объем опухоли (MTV2.0) были получены в опухолях (стрелки), и средние значения сравнивались между различными группами лечения. * и ** обозначают P <0,05 и P <0,01 по сравнению с контролем, соответственно. (C) Количественная оценка по результатам анализа TUNEL in situ в срезах опухолей из каждой группы. TUNEL-позитивные апоптотические тельца подсчитывали вслепую в десяти случайно выбранных мощных полях. Столбики ошибок представляют S.E. Двухсторонний t-тест Стьюдента, * обозначает P <0,01. (D) Вестерн-блот анализ расщепленного PARP, фосфо-p53-ser15, расщепленной каспазы 3 и белков PDHE1α, полученных из опухолей, обработанных транспортным средством, DCA, цисплатином или комбинацией обоих препаратов. β-актин служил в качестве внутреннего контроля нагрузки.

Обсуждение

Повышенный гликолиз, который часто встречается при раке, тесно связан с нарушением митохондрий или дефектным окислительным фосфорилированием и способствует терапевтической резистентности [18,19]. Аэробный гликолиз был связан с устойчивостью к химиотерапии [20] или радиотерапии [21]. В настоящем исследовании клеточные линии, устойчивые к цисплатину, показали повышенный гликолиз, что указывает на биохимическую связь между гликолизом и химиорезистентностью. Устойчивые к лекарствам клетки испытывают большую потребность в АТФ, чем нормальные клетки, для поддержания клеточного гомеостаза и активации путей выживания, которые позволяют избежать гибели клеток при генотоксическом стрессе [20]. Устойчивые раковые клетки увеличивают гликолиз для быстрой выработки АТФ, чтобы удовлетворить внутриклеточные потребности. Это было четко обнаружено в наших клетках, устойчивых к цисплатину, по сравнению с родительскими чувствительными клетками, что указывает на то, что лекарственная устойчивость в HNC напрямую связана с увеличением гликолиза. Это означает, что изменение биоэнергетики раковых клеток в сторону увеличения гликолиза связано с химиорезистентностью [14,22]. Таким образом, уровень гликолиза в раковых клетках человека может быть биомаркером химиорезистентности и требует клинического подтверждения в раковых тканях человека.

В настоящем исследовании показано, что DCA смещает генерацию энергии с гликолиза на митохондриальное окисление глюкозы в HNC. Это вызванное DCA изменение метаболического сдвига в сторону гликолиза устраняет пролиферативное преимущество раковых клеток и в конечном итоге приводит к их гибели [23]. DCA, являясь структурным аналогом пирувата, ингибирует PDK и реактивирует PDH, фермент, входящий в комплекс, который преобразует пируват в ацетил-КоА, основной субстрат цикла Кребса [10,23]. Поскольку большинство типов рака создают гипоксическую среду, раковые клетки полагаются на анаэробный гликолиз в качестве основного источника энергии. Активация гипоксия-индуцибельного фактора (HIF) индуцирует митохондриальную PDK [24]. Митохондриальная активность PDH в раке блокируется PDK, что приводит к снижению доступности ацетил-КоА для митохондриального окисления глюкозы [24]. Повышенная экспрессия PDK связана с лекарственной устойчивостью при раке [25,26]. Регуляция PDK2 в результате митохондриальных мутаций и стабилизации HIF1α также наблюдается в клетках HNC [27]. В настоящем исследовании также была подтверждена связь между сверхэкспрессией PDK2 и устойчивостью к цисплатину в клетках HNC. Эти данные указывают на важность PDK как новой молекулярной мишени в терапии рака [10]. Предыдущие данные показали, что генетическое или фармакологическое ингибирование PDK изменяет биоэнергетику рака и восстанавливает митохондрий-зависимый апоптоз в раковых клетках [11,13]. Поэтому ДКК эффективен для преодоления резистентности к лечению в раковых опухолях с агрессивным фенотипом in vitro и in vivo[12-14].

Активация PDH под действием DCA вызывает накопление mROS в раковых клетках. В раковых клетках снижен митохондриальный метаболизм глюкозы, что приводит к снижению активности электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) и уменьшению mROS [10], [28]. Митохондриальное ремоделирование ΔΨm гиперполяризации и снижение выработки mROS в раковых клетках приводит к устойчивости к апоптозу при генотоксическом стрессе. В устойчивых раковых клетках с более гликолитическим фенотипом HK2 приводит к транслокации на внешнюю митохондриальную мембрану и увеличению ΔΨm [29]. Ингибирование гликолиза и транслокации HK2 снижает ΔΨm рака и отменяет устойчивость к апоптозу [29]. В настоящем исследовании повышенная экспрессия HK2 и PDK2 и мембранный потенциал митохондрий также были обнаружены в устойчивых к цисплатину раковых клетках. DCA заставляет пируват поступать в митохондрии через активацию PDH, регулятора митохондриального окисления глюкозы, снижает ΔΨm и увеличивает mROS [13]. В настоящем исследовании DCA просто отменил повышенное митохондриальное ремоделирование в клетках HNC, устойчивых к цисплатину, что способствовало гибели раковых клеток. Активация митохондриального окисления глюкозы под действием DCA вызвала mROS и активацию митохондриальной сигнализации, что привело к активации p53 и связанных с ним проапоптотических путей и к гибели устойчивых к химиотерапии раковых клеток. В нашем исследовании фармакологическое ингибирование выработки mROS или каспаза-опосредованного апоптоза ослабляло цитотоксический эффект DCA в клетках HNC, что подтверждает известные механизмы действия препарата.

Доклинические и клинические исследования поддерживают применение ДКА у онкологических больных и у пациентов с молочнокислым ацидозом, связанным с митохондриальными заболеваниями [10,23]. В ряде исследований продемонстрировано цитотоксическое действие DCA, отдельно или в комбинации с другими препаратами, на различные опухоли, полученные из всех трех зародышевых слоев [23]. Предыдущее исследование показало, что глиобластома, один из самых агрессивных видов рака человека, сверхэкспрессирует PDK2 в раковых тканях, взятых у 49 пациентов, и регрессирует у пяти пациентов после лечения ДКА, что доказывает клиническую пользу ДКА в резистентных раковых опухолях [13]. В недавнем исследовании, посвященном HNC, сравнивался эффект DCA на трех клеточных линиях плоскоклеточной карциномы полости рта (OSCC) [15]. Клетки OSCC с дефицитом митохондриального окислительного фосфорилирования (т.е. высоким гликолизом) были более чувствительны к DCA, чем другие [15,30]. Настоящее исследование подтвердило, что клетки HNC с высокими биоэнергетическими изменениями были более чувствительны к DCA. Фактически, поскольку химиорезистентные раковые клетки имеют тенденцию к высокому гликолизу, эти клетки могут быть мишенью для ингибиторов метаболизма [31]. Таким образом, DCA является хорошим кандидатом для лечения раковых клеток с агрессивным фенотипом, включая химиорезистентные клетки HNC. Однако, поскольку потенциальные противораковые эффекты DCA все еще спорны, особенно в опухолях в условиях гипоксии, необходимы дальнейшие доклинические и клинические исследования DCA и рака [32]. Недавний систематический обзор показал, что DCA синергирует со многими стандартными противораковыми препаратами, а клинические испытания на ранней стадии свидетельствуют о том, что хронический DCA безопасен и хорошо переносится при пероральном приеме 12,5 мг/кг дважды в день [23].

 заключение, наши данные свидетельствуют о том, что высокий уровень гликолиза и сверхэкспрессия PDK тесно связаны с устойчивостью к цисплатину в клетках HNC. DCA переключает биоэнергетику клеток НЯК на митохондриальное окислительное фосфорилирование. Это приводит к снижению ΔΨm и увеличению mROS, тем самым сенсибилизируя химиорезистентные клетки НЯК к цисплатину in vitro и in vivo. Эти данные дают основания для дальнейших доклинических и клинических исследований DCA, перспективного противоракового препарата, при НЯК с агрессивным фенотипом. Однако наше заключение следует принимать во внимание с осторожностью при противоположном сценарии. Дефектное митохондриальное окислительное фосфорилирование было связано с чувствительностью раковых клеток к состоянию низкой глюкозы, что может быть использовано в качестве биомаркера для терапии рака [37]. Раковая клетка также приспособлена для обеспечения пролиферации путем поглощения и включения питательных веществ в биомассу, а не для эффективного производства АТФ [38]. Поэтому доклинические и клинические эффекты DCA на HNC и другие виды рака должны быть изучены далее.

Амигдалин как химиопротекторное средство при совместном лечении с цисплатином

оригинал статьи: https://www.frontiersin.org/journals/pharmacology/articles/10.3389/fphar.2022.1013692/full

ОРИГИНАЛЬНАЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ статья

Фронт. Фармакол. , 20 сентября 2022 г.Секция Экспериментальная фармакология и открытие лекарствТом 13 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fphar.2022.1013692

Панайота Христодулу1,2 *Панайотис Буцикос1Кристиана М. Неофиту3Теодора-Кристина Кириаку1,3Мария-Иоанна Христодулу2Панайотис Папагеоргис3Анастасис Стефану1Иоаннис Патрикиос1

• 1 Медицинский факультет Европейского университета Кипра, Никосия, Кипр
• 2 Лаборатория иммунологии опухолей и биомаркеров, Центр фундаментальных и трансляционных исследований рака, Факультет наук о жизни, Европейский университет Кипра, Никосия, Кипр
• 3 Лаборатория микроокружения опухоли, метастазирования и экспериментальной терапии, Центр фундаментальных и трансляционных исследований рака, Факультет наук о жизни, Европейский университет Кипра, Никосия, Кипр

Амигдалин — это природный гликозид, используемый в традиционной китайской медицине, который, как известно, обладает противораковыми свойствами. Несмотря на то, что противораковые свойства амигдалина хорошо известны, его воздействие на нормальные клетки не было тщательно изучено. Целью настоящего исследования было изучение возможной химиопротекторной роли амигдалина против цитотоксических эффектов химиотерапии для нормальных клеток человека. В частности, он был протестирован в сочетании с сильным химиотерапевтическим препаратом цисплатином. Человеческая неканцерогенная эпителиальная клеточная линия MCF12F, клетки человеческих фибробластов, клетки человеческого рака молочной железы MCF7 и MDA-MB-231 были обработаны цисплатином в зависимости от дозы и времени в отсутствие или в присутствии амигдалина. Когда клетки MCF12F и фибробласты подвергались предварительной обработке амигдалином с последующей обработкой цисплатином (24 ч амигдалин + 24 ч цисплатин), жизнеспособность клеток увеличивалась (22%, p < 0,001), как показано с помощью анализа МТТ. Как подтверждается проточной цитометрией, комбинированное лечение было связано с уменьшением процента поздних апоптотических клеток по сравнению с монотерапией (кратность изменения снижения = 1,6 и 4,5 для 15 и 20 мкМ соответственно). Кроме того, экспрессия белков PUMA, p53, фосфо-p53 и Bax снижалась, когда использовалась комбинированная обработка по сравнению с одним цисплатином, в то время как проапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL демонстрировали повышенную тенденцию в присутствии амигдалина. Более того, уровни проапоптотических генов PUMA , p53 и мРНК BAX были значительно снижены (∼83%, ∼66% и ∼44% соответственно) по сравнению с одним цисплатином, в то время как уровни мРНК антиапоптотических генов BCl-2 и Bcl-XL были повышены (∼44,5% и ∼51% соответственно) по сравнению с одним цисплатином после 24 ч комбинированного лечения. Исследование анализа индекса комбинации (CI) показало, что амигдалин, возможно, можно рассматривать как антагонист цисплатина (2,2 и 2,3) для клеток MCF12F и фибробластов соответственно. Напротив, для клеток рака молочной железы MCF7 и MDA-MB-231 амигдалин и цисплатин показали синергический эффект (0,8 и 0,65) соответственно. Наши текущие результаты показывают, что амигдалин оказывает химиомодулирующее действие при совместном лечении с цисплатином и способен защищать нормальные клетки молочной железы, а также фибробласты во время химиотерапии, что указывает на сильную селективную химиопротекторную способность и может способствовать улучшению качества жизни онкологических больных.

Введение

Рак является второй по значимости причиной смерти в мире, после сердечно-сосудистых заболеваний ( Nagai and Kim, 2017 ). Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным видом рака среди женщин во всем мире и представляет собой серьезную проблему для общественного здравоохранения [Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), 2021]. Химиотерапия является наиболее эффективным и часто используемым методом лечения большинства злокачественных новообразований ( Huang et al., 2017 ). Несмотря на многочисленные достижения за последнее десятилетие в области адъювантной терапии РМЖ, остаются нерешенными многочисленные проблемы, включая неблагоприятные побочные эффекты, вызываемые химиотерапевтическими препаратами, такие как тошнота, выпадение волос, рвота, усталость и в тяжелых случаях даже смерть ( Waris and Ahsan, 2006 ; Ye et al., 2017 ). Управление по контролю за продуктами и лекарствами США одобрило в общей сложности 132 химиотерапевтических препарата, из которых 56, как сообщается, вызывают окислительный стресс ( Chen et al., 2018 ). Многие классы химиотерапевтических препаратов, такие как таксаны и производные платины, могут вызывать окислительный стресс ( Cauli, 2021 ).

Цис-диаммининдихлорплатина (II) (цисплатин) — неорганическое соединение, «алкилирующий агент», используемый в качестве основного лечебного препарата, способного уменьшать рост раковых клеток, против различных видов рака человека, включая рак молочной железы, яичек, яичников и легких ( Dasari and Tchounwou, 2014 ). Цисплатин образует внутри- и межцепочечные аддукты с ДНК и, таким образом, является мощным индуктором остановки клеточного цикла, приводящей к апоптозу для большинства типов раковых клеток. Сшивающие взаимодействия цисплатина с ДНК способствуют ингибированию репликации, транскрипции и других ядерных функций, которые могут останавливать пролиферацию раковых клеток и рост опухоли ( Zwelling et al., 1979 ; Dasari and Tchounwou, 2014 ). Эффективность цисплатина зависит от способности клеток либо восстанавливать повреждения ДНК, либо приступать к гибели ( Mirmalek et al., 2016 ). Таким образом, сигнальные пути, регулирующие апоптоз, играют ключевую роль в том, как клетки будут реагировать на цисплатин ( Истман, 1990 ).

Амигдалин (D-манделонитрил-β-гентиобиозид) — это цианогенный диглюкозид, который естественным образом содержится в косточках многочисленных фруктов и растений семейства розоцветных, таких как Prunus armeniaca (абрикос) и Prunus persica (персик). Все больше доказательств подтверждают, что амигдалин (также известный как «лаэтрил») может действовать как противораковый агент, вызывая остановку клеточного цикла и апоптоз ( Guo et al., 2013 ; Makarevic et al., 2014 ; Lee and Moon, 2016 ; Saleem et al., 2018 ). Амигдалин проявляет синергический эффект в сочетании с другими соединениями, такими как синильная кислота (противоопухолевое вещество) и бензальдегид (обезболивающее соединение); вызывая гибель раковых клеток ( Song and Xu, 2014 ). Кроме того, in vitro сообщалось, что амигдалин связан с противораковой активностью в отношении клеток рака молочной железы, главным образом, посредством окислительного стресса; он способствует дифференциальному ингибированию пролиферации клеток MCF7 и T470 ( Abboud et al., 2019 ).

Амигдалин может быть расщеплен ферментом, известным как β -глюкозидаза, высвобождающим цианистый водород, бензальдегид и глюкозу. Бензальдегид является обезболивающим, который может быть преобразован в бензойную кислоту кислородом в нормальных/здоровых тканях. Цианистый водород может вызывать токсичность цианида и, следовательно, убивать раковые клетки ( Blaheta et al., 2016 ). С другой стороны, другой фермент, роданеза, который присутствует только в нормальных тканях, а не в раковых, по-видимому, обладает способностью детоксифицировать цианид и, следовательно, защищать нормальные ткани ( Newmark et al., 1981 ). Эти два вышеупомянутых фермента, вероятно, могут способствовать избирательной токсичности амигдалина, контролируя рост и метастазирование раковых клеток.

Теперь мы намерены изучить влияние амигдалина, цисплатина и их комбинированной терапии на жизнеспособность клеток с использованием как нормальных, так и раковых клеточных линий, а также оценить потенциальную химиопротекторную роль амигдалина.

Материалы и методы

Культура клеток

Амигдалин был приобретен у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США) и растворен в воде (концентрат 1М). Концентрат цисплатина 1 мг/мл для приготовления раствора для инфузий был приобретен у Accord. Клеточные линии MCF12F, MCF7 и MDA-MB-231 были приобретены у American Type Culture Collection (ATCC, Роквилл, Мэриленд). Фибробласты, извлеченные из ткани поджелудочной железы, были любезно предоставлены Университетом Кипра. Клетки MCF12F и фибробласты культивировались в модифицированной среде Дульбекко с питательной смесью Ham's F-12 (DMEM/F12), содержащей 5% лошадиной сыворотки, обработанной Chelex, приобретенной Sigma-Aldrich, эпидермальный фактор роста (EGF, 10 мкг/500 мл), холерный токсин (50 мкг/500 мл), инсулин (5 мг/500 мл) и гидрокортизон (250 мкг/500 мл) вместе с 1% антибиотиков и антимикотиков. Клетки MCF7 и MDA-MB-231 культивировались в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотика, приобретенного Sigma-Aldrich. Клетки инкубировались при 37°C в увлажненной камере при 95% O2 / 5% CO2 . Bcl-2, фосфо-p53, p53, Bax, GAPDH, каспаза-9, антитела были приобретены в Cell Signalling Technology (Дэнверс, Массачусетс, США). β -Актин и каспаза-8 были приобретены в Santa Cruz Biotechnology Inc. Реагенты для культивирования клеток (DMEM, FBS, HS, антибиотик/противогрибковый препарат и трипсин) были приобретены в Gibco, Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США).

Анализ комбинированного индекса

Анализ индекса комбинации (CI) является самым простым способом оценки фармакологических взаимодействий препаратов и в нашем случае использовался для количественной оценки синергизма или антагонизма. Синергизм используется для описания улучшения ответа опухоли, тогда как антагонизм используется, когда эффект комбинации менее токсичен, чем результат индивидуальных эффектов.

Результаты анализа индекса комбинации основаны на теории Chou-Talalay ( Chou, 2010 ). CompuSyn — это компьютерная программа для количественной оценки синергизма и антагонизма в комбинациях лекарственных средств и определения значений IC50 и ED50. Когда этот конкретный анализ дает CI = 1, это означает, что реагирующие вещества имеют аддитивный эффект, CI < 1 означает, что реагирующие вещества имеют синергический эффект, а CI > 1 означает, что реагирующие вещества имеют антагонистический эффект ( таблица 1 и дополнительный материал 2 ) ( Chou, 2010 ).

ТАБЛИЦА 1

ТАБЛИЦА 1. Значения IC50 различных линий клеток.

МТТ-тест

Для оценки жизнеспособности клеток был проведен анализ пролиферации клеток с использованием МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромида, M2128 от Sigma-Aldrich] ( Gasparini et al., 2017 ). После трипсинизации и подсчета с помощью гемоцитометра клетки MCF12F и MCF7 были высеяны в 96-луночный планшет ( Green and Sambrook, 2019 ). После проверки адгезии (примерно через 18 ч после высевания) клетки инкубировали с 10 мМ амигдалина и через 24 ч добавляли 15 мкМ цисплатина еще на 24 ч. После обработки клеток 20 мкл красителя МТТ в течение 4 ч, а затем инкубации с 150 мкл ДМСО (диметилсульфоксид, D8418 от Sigma-Aldrich) в течение 15 мин. Поглощение при 595 нм измеряли с помощью микропланшетного ридера (ThermoFisher Scientific).

синтез кДНК

Общая РНК из каждой популяции клеток была выделена с помощью набора RNeasy Micro Kit (50), а концентрация, а также чистота были измерены с помощью поглощения в λ = 280 и 260 нм/280 нм соответственно. кДНК каждого образца синтезирована с помощью набора primeScript first strand cDNA Synthesis kit (Takara) для смеси 1 и 2. Смесь 1 инкубировали при 65°C в течение 10 мин, а затем во льду в течение 3 мин перед добавлением смеси 2 до конечного объема 20 мкл. Последним шагом была инкубация смесей при определенных температурах в машине RT-qPCR (Bio-Rad) ( Neophytou et al., 2019 ).

ОТ-ПЦР в реальном времени

Для измерения экспрессии мРНК была проведена ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) с использованием набора KAPA SYBR FAST qPCR (KK4610). Были использованы следующие праймеры: Bax, прямой: 5′-ACA​TGG​AGC​TGC​AGA​GGA​TG-3′, обратный: 5′-CCA​GTT​GAA​GTT​GCC​GTC​AG-3′; p53, прямой: 5′-CCT​CAG​CAT​CTT​ATC​CGA​GTG​G-3′, обратный: 5′-TGG​ATG​GTG​GTA​CAG​TCA​GAG​C-3′; PUMA, прямой: 5′-ACG​ACC​TCA​ACG​CAC​AGT​ACG​A-3′, обратный: 5′-GTA​AGG​GCA​GGA​GTC​CCA​TGA​T-3′; Bcl-2, прямой: 5′-GGA​TAA​CGG​AGG​CTG​GGA​TG-3′, обратный: 5′-GGC​CAA​ACT​GAG​CAG​AGT​CT-3′; Bcl-xL, прямой: 5′-AGA​GCC​TTG​GAT​CCA​GGA​GA-3′, обратный: 5′-TCA​GGA​ACC​AGC​GGT​TGA​AG-3′; GADPH, прямой: 5′-GTC​TCC​TCT​GAC​TTC​AAC​AGC​G-3′, обратный: 5′-ACC​ACC​CTG​TTG​CTG​TAG​CCA​A-3′. GADPH использовали в качестве гена домашнего хозяйства. В конце реакции регистрировали значения Ct, и среднее значение трехкратных повторов использовали для расчета кратности изменения экспрессии гена с использованием метода 2[-Delta Delta C(T)] ( Livak and Schmittgen, 2001 ), как описано ранее ( Papageorgis et al., 2010 ). Для оценки эффекта лечения использовали данные по крайней мере трех независимых биологических повторов.

Извлечение белка

Среду удаляли из 6-луночного планшета и добавляли 1 мл PBS для промывки лунок, а затем аспирировали. После этого добавляли 150 мкл RIPA для лизиса клеток. Гомогенизированные образцы переносили в пробирки Eppendorf на льду на 30 мин с частым встряхиванием. Образцы центрифугировали при 10 000 об/мин/10 мин/4°C ( Ngoka, 2008 ). Образцы хранили при температуре –80 до дальнейшего использования ( Дополнительные материалы 1 и 3).

вестерн-блоттинг

Для определения уровня белка мы провели анализ вестерн-блоттинга. Смеси белков инкубировали при 98°C в течение 5 минут, а затем переносили на мембрану PVDF и блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в первичном антителе в течение ночи при 4°C, а затем добавляли вторичное антитело в течение 60 минут при комнатной температуре. MCF12F обрабатывали цисплатином и амигдалином по отдельности или в комбинации в течение 48 часов. Белки экстрагировали и разделяли с помощью электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и зондировали с помощью антител против Bcl-2, фосфо-p53, p53, Bax, PUMA, PARP-1 и каспазы-9. Bcl-2 (CST 15071, 1:1000), PARP-1 (CST 9542, 1:1000), Bax (CST 2772, 1:1000), каспаза-9 (CTS 9502, 1:1000), фосфо-p53 (CST 9286 (Ser15), 1:1000), p53 (CST 9282, 1:1000), PUMA (CST 12450, 1:1000) были приобретены для Cell Signalling Technology (Дэнверс, Массачусетс, США), а Bcl-2 (sc-783, 1:1000), GAPDH (sc-25778, 1:1000) были приобретены у Santa Cruz Biotechnology Inc. Мы визуализировали полосы белков с использованием субстрата вестерн-блоттинга с улучшенной хемилюминесценцией (ECL) (Thermo Fisher Scientific) и машины Chemidoc от Biorad. Значения интенсивности из денситометрического анализа вестерн-блотов были нормализованы относительно GAPDH или β -актина с использованием программного обеспечения для анализа ImageJ. Значения интенсивности были выражены как кратное изменение по сравнению с контролем ( Ngoka, 2008 ).

Оценка апоптоза/некроза методом проточной цитометрии

Исследование индукции апоптоза/некроза оценивалось с помощью проточного цитометрического анализа при двойном окрашивании Annexin-V-FITC/пропидиум йодидом (PI). Клетки высевали в концентрации 1 × 10 5 клеток на лунку в 6-луночные планшеты для культивирования тканей и обрабатывали цисплатином (15 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ) и/или амигдалином (10 мМ), как указано. Клетки, обработанные только цисплатином, использовали в качестве положительного контроля, а необработанные клетки — в качестве отрицательного контроля. Клетки собирали и окрашивали с помощью набора Annexin V/Dead Cell Apoptosis (Life Technologies, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Апоптоз и некроз клеток анализировали с помощью проточного цитометра Attune NxT (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) и программного обеспечения FlowJo v10 (BD Biosciences, США) ( Steensma et al., 2003 ).

Статистический анализ

Все результаты были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка между самой низкой и самой высокой точками измерения. Непарные t -тесты были применены для исследования возможных различий в непрерывных переменных для двух групп. p -значения представлены как двусторонние с доверительными интервалами 95%. Статистический тест и анализ были проведены с использованием программного обеспечения Prism версии 5.0 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США). Для взаимодействия лекарств использовался метод Chou-Talalay (индекс комбинации) для оценки эффекта комбинированного лечения на основе данных о концентрации-эффекте ( Chou, 2010 ). Этот метод для комбинации лекарств основан на уравнении медианы-эффекта, которое исходит из принципа закона действия масс, который связывает один объект и несколько объектов, а также динамику первого и более высокого порядка ( Chou, 2011 ). Для результатов программного обеспечения уравнения индекса комбинации используется программа CompuSyn ( Chou, 2010 ).

Результаты

Оценка жизнеспособности нормальных и раковых клеток молочной железы после однократного лечения цисплатином или амигдалином

Чтобы определить влияние лечения амигдалином и цисплатином на нормальные (MCF12F) и раковые (MCF7, MDA-MB-231) клетки молочной железы, а также на фибробласты (FBS), мы использовали анализ MTT для оценки жизнеспособности клеток в зависимости от дозы в различные моменты времени. Во-первых, влияние амигдалина и цисплатина оценивалось по отдельности. Когда была указана идеальная концентрация (цисплатин 15 мкМ, амигдалин 10 мМ) для обоих видов лечения, была проведена комбинированная терапия с использованием цисплатина и амигдалина вместе для оценки разницы в количестве клеток.

Клетки MCF12F, MCF7, MDA-MB-231 и FBS обрабатывали 1, 10, 15, 20 и 30 мкМ цисплатина, а жизнеспособность клеток оценивали через 24, 48 и 72 ч ( рисунок 1A ). Цисплатин повлиял на все клеточные линии, уменьшив количество жизнеспособных клеток. Клетки рака молочной железы были поражены цисплатином больше, чем нормальные клетки молочной железы, а также фибробласты. Однако обе клеточные линии были значительно затронуты цисплатином.

РИСУНОК 1

РИСУНОК 1. Эффект цисплатина и амигдалина в линиях клеток молочной железы, а также в фибробластах. (A) Анализ МТТ использовался для оценки цитотоксичности (% жизнеспособности клеток) возрастающих концентраций цисплатина (1, 10, 15, 20 и 30 мкМ) в i) MCF-12F, ii) FBS, iii) MCF-7 и iv) MDA-MB-231 в течение 24, 48, 72 ч и (B) возрастающих концентраций амигдалина (10, 25, 50, 75 и 100 мМ) в i) MCF-12F, ii) FBS, iii) MCF-7 и iv) MDA-MB-231 в течение 24, 48, 72 ч лечения. Звездочки указывают на силу статистической значимости между столбцами [* (0,05) < ** (0,01) < ***(0,001)].

Кроме того, клетки MCF12F, MCF7, MDA-MB-231 и FBS обрабатывали 10, 25, 50, 75 и 100 мМ амигдалина в течение 24, 48 и 72 ч ( Рисунок 1B ). Во всех клеточных линиях количество жизнеспособных клеток уменьшалось с увеличением концентрации амигдалина. Однако при использовании 10 мМ обработки амигдалином существенных различий не наблюдалось, поскольку уровень жизнеспособности клеток составлял >90% во всех временных точках. IC 50 цисплатина был определен равным 23,8 мкМ в MCF12F и 21,7 мкМ в MCF7, тогда как IC 50 амигдалина был равен 85,4 мМ в MCF12F и 64,5 мМ в MCF7 после 24, 48 и 72 ч обработки соответственно ( таблица 1 ).

Комбинированное лечение демонстрирует химиопротекторный эффект в нормальных клетках молочной железы

Комбинированное лечение применялось к клеткам MCF12F с использованием 10 мМ амигдалина и 1, 10, 15, 20 и 30 мкМ цисплатина. Сначала клетки обрабатывали амигдалином в течение 24 ч, а затем добавляли цисплатин на 24, 48 и 72 ч ( рисунки 2Ai–iii ). Затем мы предварительно обработали клетки 10 мМ амигдалином в течение 24 ч и наиболее подходящей концентрацией цисплатина, 15 мкМ в течение 24, 48 и 72 ч. Концентрация цисплатина основывалась на жизнеспособности клеток, которая составляла >50% при лечении одним агентом. Результаты показывают, что комбинированное лечение повышает жизнеспособность клеток во всех временных точках по сравнению с лечением одним цисплатином ( рисунок 2B ). Наиболее значительное увеличение жизнеспособности клеток ( ∼ 22%) наблюдалось через 48 ч при комбинированном лечении (24 ч амигдалин + 24 ч цисплатин). Анализ индекса комбинации, указывающий на синергизм или антагонизм амигдалина с цисплатином, представлен в таблице 1 .

РИСУНОК 2

РИСУНОК 2. Эффект цисплатина отдельно и в сочетании с амигдалином в нормальных клетках молочной железы, MCF12F. Клетки были предварительно обработаны 10 мМ амигдалином, а затем цисплатин (1, 10, 15, 20 и 30 мкМ) был добавлен в течение (A) i) 24 ч, ii) 48 ч и iii) 72 ч. Анализ МТТ был применен для измерения жизнеспособности клеток в этих условиях. (B) Амигдалин (10 мМ) снижает цитотоксичность цисплатина (15 мкМ) и увеличивает выживаемость во всех временных точках с пиком на 48 ч общей обработки. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM трех различных повторов и являются репрезентативными по крайней мере для трех различных экспериментов [* (0,05) < ** (0,01) < ***(0,001)].

Оценка апоптоза, опосредованного комбинированным лечением

Окрашивание аннексином V/PI использовалось для оценки апоптотического эффекта возрастающих концентраций цисплатина 15 и 20 мкМ с 10 мМ амигдалином или без него в течение 48 часов лечения.

Как показано на рисунке 3 , в клетках MCF12F процент поздних апоптотических клеток (двойной положительный результат по аннексину-V/PI) после 48-часовой комбинированной обработки (% среднего ± SE; цисплатин 15 мкМ + 10 мМ амигдалин: 5,8 ± 1,2 или цисплатин 20 мкМ + 10 мМ амигдалин: 4,3 ± 0,6) был значительно ниже по сравнению с обработкой цисплатином (15 мкМ: 9,5 ± 1,8; кратность изменения снижения = 1,6 или 20 мкМ: 19,3 ± 2,4; кратность изменения снижения = 4,5). Более того, % живых клеток при комбинированном лечении был увеличен (цисплатин 15 мкМ + 10 мМ амигдалин: 90,1 ± 1,2 или цисплатин 20 мкМ + 10 мМ амигдалин: 90,2 ± 0,5) по сравнению с применением только цисплатина (15 мкМ: 86,8 ± 0,5; p = 0,05 или 20 мкМ: 74,4 ± 1,9; p = 0,03 соответственно). Процент живых, ранних, поздних апоптотических и некротических клеток для всех условий лечения представлен на рисунке 3B . Была использована концентрация 30 мкМ, поскольку было обнаружено, что это самая высокая концентрация, способная убить более 50% обработанных клеток. Кроме того, 30 мкМ использовали в качестве положительного контроля для остальных экспериментов.

РИСУНОК 3

РИСУНОК 3. Влияние амигдалина на апоптоз, вызванный цисплатином в клетках MCF-12F. (A) Окрашивание аннексином V/PI использовалось для оценки апоптотического эффекта (% по сравнению с контролем) 15 и 20 мкМ цисплатина с 10 мМ амигдалином или без него в течение 48 ч. Приведены диаграммы зебра % живых (Q4), ранних (Q3), поздних апоптотических (Q2) и некротических клеток (Q1) при каждой стимуляции. (B) Сложенные столбчатые диаграммы, изображающие изменения в вышеупомянутых популяциях. Показаны данные трех независимых экспериментов.

Амигдалин и цисплатин регулируют белки, связанные с апоптозом

Комбинация цисплатина и амигдалина снизила уровни проапоптотических BAX, фосфо-p53, p53 и PUMA, медиаторов апоптотических ответов ( Рисунок 4 ). Напротив, уровни антиапоптотического BCl-2, известного ингибитора процесса проницаемости митохондриальной наружной мембраны (MOMP), были повышены ( Рисунок 4A ). PARP-1, фермент репарации ДНК, который расщепляется во время апоптоза, не представил свою расщепленную форму во время комбинированного лечения ( Рисунок 4B ). Расщепленная каспаза-9, мишень проапоптотических белков, высвобождаемых из митохондрий, была обнаружена в клетках, обработанных цисплатином, но не в группе комбинированного лечения ( Рисунок 4C ). Расщепленная каспаза-9 является активной формой, которая расщепляется от прокаспазы-9 (полной длины), показывая инициацию апоптотического пути. Эти результаты показывают, что комбинированное лечение с амигдалином подавляло апоптоз по сравнению с лечением только цисплатином.

РИСУНОК 4

РИСУНОК 4. Влияние амигдалина и цисплатина на уровни и локализацию апоптотических белков в нормальных клетках. (A) Сочетание 10 мМ амигдалина и 15 мкМ цисплатина снизило уровни белков Bax, phosho-p53, p53, PUMA и увеличило уровни белков Bcl-2 после 48 ч обработки в MCF12F. (B) Показана экспрессия расщепленного PARP при обработке цисплатином. Цисплатин сам по себе вызывал расщепление каспазы-9, тогда как (C) амигдалин (10 мМ) снижал этот эффект. Значения интенсивности из денситометрического анализа вестерн-блотов показаны в верхней части каждого блота и были нормализованы по GAPDH с помощью программного обеспечения ImageJ. Результаты являются репрезентативными по крайней мере для трех независимых экспериментов.

Влияние амигдалина и цисплатина на экспрессию мРНК про- и антиапоптотических генов

После комбинированной обработки в течение 48 ч на клетках MCF12F уровни мРНК PUMA , p53 и Bax были значительно снижены на ∼83%, ∼66% и ∼44% соответственно по сравнению с обработкой только цисплатином. Напротив, уровни мРНК Bcl-2 и Bcl-xL были повышены на ∼44,5% и ∼51% соответственно при комбинированной обработке по сравнению с обработкой только цисплатином. Кроме того, уровни мРНК соотношения BAX/Bcl-2 были снижены на ∼81% при комбинированной обработке по сравнению с обработкой только цисплатином ( Рисунок 5 ). Более того, комбинированная обработка не показала никакого химиопротекторного эффекта на основе уровней экспрессии мРНК про- и антиапоптотических генов в клетках MCF7 и MDA-MB-231. ( Рисунок 5 ). Амигдалин сам по себе показал увеличение мРНК p53 в клетках MCF12F ( Рисунок 5 ), однако на уровне белка p53 ( Рисунок 4 ) он остался неизменным, и это может означать, что уровень мРНК не всегда коррелирует с уровнем белка. Аналогично, амигдалин не способствовал гибели клеток, как было оценено с помощью проточной цитометрии в клетках MCF12F ( Рисунок 3 ).

РИСУНОК 5

РИСУНОК 5. Влияние амигдалина и цисплатина на экспрессию мРНК проапоптотических и антиапоптотических генов. В MCF12F экспрессия мРНК проапоптотических генов PUMA, p53 и Bax , а также соотношение BAX/Bcl-2 были снижены при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), тогда как экспрессия мРНК антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-xL была повышена при комбинированном лечении. В MCF7 экспрессия мРНК проапоптотических генов PUMA, p53 и Bax , а также соотношение BAX/Bcl-2 были увеличены при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), в то время как экспрессия мРНК антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-xL была снижена при комбинированном лечении. В MDA-MB-231 экспрессия мРНК проапоптотического гена p 53 была увеличена при лечении комбинацией амигдалина (10 мМ) и цисплатина (15 мкМ) по сравнению с лечением цисплатином (15 мкМ), в то время как экспрессия мРНК антиапоптотического гена Bcl-2 была снижена. Результаты представляют собой среднее значение ± SEM трех различных повторов и являются репрезентативными по крайней мере для трех различных экспериментов, ∗ значение p < 0,05, ∗∗ значение p < 0,01, ∗∗∗ значение p < 0,001.

Обсуждение

Наиболее широко используемыми методами лечения рака являются хирургия, радиотерапия и химиотерапия, однако их эффективный терапевтический результат остается ограниченным из-за их неблагоприятных побочных эффектов, которые часто могут быть серьезными, что подчеркивает необходимость альтернативных или адъювантных методов лечения. Следовательно, стратегии, включающие фитохимические вещества, могут помочь в снижении этих побочных эффектов и улучшении качества жизни. Химиопротекторное лечение является многообещающим подходом, направленным на смягчение химиотерапевтических побочных эффектов в организме ( Maier et al., 2010 ). Фитохимические вещества, по-видимому, участвуют в профилактике и лечении рака из-за их относительно безопасного профиля цитотоксичности ( Duthie, 2007 ; Jagtap et al., 2009 ). В последнее десятилетие исследования направлены на выявление потенциала комбинированных стратегий с использованием одного или нескольких натуральных продуктов вместе с эффективным химиотерапевтическим средством для улучшения традиционной терапии рака ( Krzyzanowska et al., 2010 ; Kaminski et al., 2011 ; Saldanha and Tollefsbol, 2012 ).

В этом исследовании мы исследовали химиопротекторное и терапевтическое действие амигдалина в сочетании с обычным химиотерапевтическим средством цисплатином. Чтобы определить дифференциальную цитотоксичность по отношению к нормальным и раковым клеткам молочной железы, а также к фибробластам, эффект различных концентраций цисплатина и амигдалина, по отдельности, оценивался на клеточных линиях MCF12F, MCF7, MDA-MB-231, а также на фибробластах. Цисплатин и амигдалин снижали жизнеспособность клеток всех клеточных линий в зависимости от дозы и времени. Важно отметить, что обработка амигдалином в концентрации 10 мМ как нормальных, так и раковых клеток не показала статистически значимой разницы в жизнеспособности клеток, и этот показатель составлял более 90% во всех временных точках. Это подтверждает предыдущие выводы, указывающие на то, что многие фитохимические вещества, включая амигдалин, куркумин и сульфорафан, малотоксичны для нераковых, нормальных клеток ( Ravindran et al., 2009 ; Sharma et al., 2011 ).

На основании результатов IC50 концентрация амигдалина была установлена ​​на уровне 10 мМ (не повлияла на жизнеспособность клеток ни в одной из клеточных линий в течение 24 ч). Концентрация цисплатина была установлена ​​на уровне 15 мкМ для всех клеточных линий, чтобы иметь более 50% жизнеспособности клеток (для лучшей оценки эффекта комбинированного лечения в нормальных клетках).

Цисплатин является хорошо известным химиотерапевтическим препаратом для лечения широкого спектра злокачественных новообразований человека, но он связан с серьезными побочными эффектами и неспецифической цитотоксичностью, которая приводит к повреждению нормальных клеток и развитию лекарственной устойчивости ( McWhinney et al., 2009 ; Gopal et al., 2012 ). Предыдущие исследования продемонстрировали цитотоксический синергизм цисплатина и других агентов, таких как пчелиный яд, производное тиазоло[5,4-b] хинолина D3CLP и препарат AT-101 по отношению к различным линиям раковых клеток ( Alizadehnohi et al., 2012 ; Gonzalez-Sanchez et al., 2012 ; Mazumder et al., 2012 ; Karaca et al., 2013 ). Другое исследование продемонстрировало синергетическую активность фитохимического эпигаллокатехин галлата (EGCG) в сочетании с цисплатином и опухолеактивными соединениями палладия при раке яичников, что позволяет предположить, что комбинации платиновых препаратов, включая цисплатин и разработанные транс-палладии вместе с выбранными фитохимическими веществами, могут опосредовать преодоление лекарственной устойчивости в будущем. В нашем исследовании мы использовали комбинированную обработку 15 мкМ цисплатина и 10 мМ амигдалина как в нормальных клетках MCF12F, так и в FBS, чтобы дополнительно оценить безопасность амигдалина на нормальных клетках, а также его цитопротекторные способности в присутствии противораковых методов лечения. Также изучалась способность амигдалина сенсибилизировать эффекты, вызывающие смерть, в раковых клетках.

Проточная цитометрия подтвердила химиопротекторный эффект амигдалина, снижающий процент поздних апоптотических клеток до 4,5 раз ( рисунок 3 ). Как показано, амигдалин способен снижать цитотоксическое действие цисплатина на нормальные клетки молочной железы. Это подтверждается индексом комбинации (CI), который показал антагонизм между амигдалином и цисплатином при использовании в нормальных клетках и синергизм против раковых клеток.

Амигдалин приобрел широкую популярность благодаря своей противораковой активности и другим полезным эффектам на различные системы организма, таким как подавление фиброза почек, противоастматическое действие и улучшение иммунной функции ( Syrigos et al., 1998 ). Однако химиопротекторный потенциал амигдалина на нормальных эпителиальных клетках молочной железы ранее не исследовался.

Как показали наши результаты ( Рисунок 5 ), уровень мРНК проапоптотических PUMA, p53, BAX был значительно снижен, в то время как мРНК антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-xL были повышены после комбинированного лечения по сравнению с лечением только цисплатином в нормальных клетках. Это конкретное наблюдение и открытие подтверждают основное обоснование механизма действия через апоптотический путь. Напротив, уровень мРНК проапоптотических PUMA, p53, BAX был повышен, в то время как мРНК антиапоптотических Bcl-2 и Bcl-xL были снижены после комбинированного лечения по сравнению с лечением только цисплатином в раковых клетках. Результаты ОТ-ПЦР в клетках рака молочной железы (MCF7 и MDA-MB-231) предполагают возможный синергический эффект амигдалина с цисплатином и подчеркивают его противораковую активность. Из предварительных отчетов известно, что возможным механизмом этого токсического эффекта является наличие β -глюкозидазы в раковых клетках, но не в нормальных клетках, которая способна расщеплять и высвобождать цианит из основной молекулы амигдалина. С другой стороны, нормальные клетки содержат фермент роданезу, который не может приводить к расщеплению и высвобождению цианида ( Newmark et al., 1981 ).

Похожая картина про- и антиапоптотической экспрессии также наблюдалась на уровнях белков. Экспрессия белков PUMA, p53, фосфо-p53 и Bax ( Рисунок 4 ) также снижалась при использовании комбинированного лечения по сравнению с одним цисплатином. С другой стороны, проапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL демонстрировали повышенную тенденцию в присутствии амигдалина. Кроме того, при использовании комбинированного лечения были получены сниженные уровни расщепленной формы каспазы 9 и PARP, что указывает на ингибирование апоптотического пути. Мы поясняем, что даже несмотря на то, что можно наблюдать некоторую непоследовательность в отношении результата уровня GAPDH, учитывая полученный результат во всех других белках, запущенных для эксперимента по сравнению с GAPDH, непоследовательность нельзя считать проблемной. Более того, разница в расщеплении каспазы-9 между дорожкой 1 (контроль) и дорожкой 3 (15 мкМ цисплатин) очень слабая, но это обычное явление в ситуациях, когда наблюдается повышенный апоптотический результат.

Эти результаты могут указывать на то, что комбинированное лечение способно подавлять апоптоз по сравнению с лечением цисплатином.

Учитывая предыдущие изменения как в экспрессии мРНК, так и в экспрессии белка, мы можем сделать вывод, что комбинированное лечение цисплатином и амигдалином, возможно, может способствовать нормальному выживанию клеток выборочно, ингибируя апоптоз только в нормальных клетках. Эти наблюдения и выводы подтверждают нашу первичную и основную гипотезу и совместимы с другими исследованиями, которые указали на аналогичный механизм действия амигдалина в различных клеточных линиях или в моделях животных ( Kwon et al., 2003 ; Chang et al., 2006 ; Chen et al., 2013 ; Makarevic et al., 2014 ; Su et al., 2014 ).

В раковых клетках мы показали, что цисплатин способствует активации p53, что приводит к апоптозу посредством снижения уровня антиапоптотического белка Bcl-2 и повышения уровня проапоптотического белка Bax. Про- и антиапоптотические белки семейства Bcl-2 активируют процесс MOMP, который, в свою очередь, активирует апоптоз. MOMP приводит к высвобождению цитохрома c из митохондрий в цитозоль, вызывая активацию каспазы и последующий апоптоз ( Рисунок 6 ). С другой стороны, амигдалин оказывает цитопротекторное действие на нераковые клетки, способствуя эффективной экспрессии антиапоптотического гена.

РИСУНОК 6

РИСУНОК 6. Потенциальный механизм действия амигдалина и цисплатина в нормальных клетках молочной железы против рака молочной железы. При лечении цисплатином индуцируется повреждение ДНК с последующей активацией фосфо-p53, приводящей к апоптозу. Фосфо-p53 может индуцировать апоптоз посредством снижения регуляции Bcl-2 и повышения регуляции Bax, что приводит к MOMP и активации каспазы-9.

Рак груди известен как одно из самых смертельных злокачественных новообразований среди женщин во всем мире и является серьезной проблемой общественного здравоохранения. Более того, известно, что существующие методы химиотерапии рака связаны с серьезными побочными эффектами, влияющими на качество жизни пациентов и продолжительность жизни. Таким образом, существует острая необходимость в новых терапевтических подходах. Это делает наши нынешние результаты важными для открытия новых горизонтов и направлений в области лечения рака.

Это исследование может быть расширено в будущем за счет использования экспериментов in vivo с использованием животных для оценки эффективности амигдалина при лечении рака. Предыдущие исследования показали, что они лечили мышей амигдалином с использованием 200, 100 и 50 мг/кг веса тела ( Albogami et al., 2020 ). Это правда, что используемые дозы концентрации (10–100 мМ) можно считать очень высокими для будущих исследований на животных. Тем не менее, тот факт, что они не были токсичными, дает нам уверенность в том, что они не будут способствовать возникновению побочных или токсических эффектов при использовании на животных. Кроме того, мы уточняем, что будут проведены новые исследования по оптимизации дозы, включая исследования ФК для обнаружения амигдалина в плазме перед использованием на животных.

Понимание цитопротекторного действия амигдалина во время химиотерапии может позволить разработать новые методы лечения, позволяющие снизить неблагоприятные побочные эффекты и, следовательно, улучшить качество и продолжительность жизни онкологических больных.

Заявление о доступности данных

Исходные данные, подтверждающие выводы настоящей статьи, будут предоставлены авторами без неоправданных оговорок.

Вклад автора

Задумал, разработал, контролировал и предоставил финансирование для исследования, IP, AS и PC; Обзор литературы и эксперименты, PC и PB; Проанализировал данные, PC, M-IC и CN; Сгенерировал и предоставил реагенты/материалы/инструменты анализа, CN и PP; Статистический анализ, PC и CN; Составил черновик рукописи: PC и IP; Отредактировал рукопись: AS и PP. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить благодарность доценту Панайотису Политису за его любезную поддержку и предоставление использованных учебников.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все заявления, высказанные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют заявления их аффилированных организаций или заявления издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не гарантируется и не одобряется издателем.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.1013692/full#supplementary-material