Тэг: амигдалин

Метаболическая терапия рака: мировая практика, мишени и перспективы

Введение

Современная онкология стремительно развивается. За последние два десятилетия внедрение молекулярно-таргетных препаратов, иммунных ингибиторов контрольных точек и персонализированного подбора терапии изменили представления о возможностях лечения злокачественных опухолей. Однако даже самые современные подходы сталкиваются с ограничениями: лекарственная резистентность, токсичность, высокая стоимость.

На этом фоне всё большую известность получает метаболическая терапия рака — направление, которое рассматривает опухоль не только как генетически изменённую ткань, но и как структуру с нарушенным энергетическим обменом. Воздействие на эти особенности открывает новые возможности для замедления прогрессирования болезни и повышения эффективности стандартного лечения.

Почему метаболическая терапия актуальна

Опухолевые клетки обладают метаболическими отличиями от здоровых. Наиболее известное из них — так называемый эффект Варбурга: предпочтение гликолиза как основного источника энергии даже при нормальном поступлении кислорода. Дополнительные особенности включают:

• глутаминовую зависимость — многие опухоли используют глутамин как источник азота и углерода;

• переключение на липидный обмен — некоторые опухоли активно окисляют жирные кислоты;

• повышенное образование активных форм кислорода — опухолевые клетки балансируют на грани прооксидантного стресса;

• сниженную гибкость метаболизма — в отличие от нормальных клеток, опухоль часто «заперта» в одном энергетическом пути.

Эти особенности создают «ахиллесову пяту», на которую можно воздействовать фармакологическими и нутритивными методами.

География применения метаболической терапии

Метаболические подходы активно изучаются и применяются в различных странах:

• Европа — Германия, Австрия и Чехия известны клиническими программами с применением дихлорацетата (DCA), кетогенной диеты, внутривенных высоких доз витамина С и амигдалина для инъекций.

• Северная Америка — в США и Канаде исследуются комбинации метформина, 2-дезоксиглюкозы и кетогенного питания; в онкологических центрах также применяются высокодозные аскорбатные инфузии.

• Южная Америка — в Бразилии и Аргентине используют внутривенный витамин С и амигдалин, а также диетологические программы для контроля уровня глюкозы.

• Азия — Япония, Южная Корея и Китай сосредоточены на растительных метаболических модуляторах (куркумин, ресвератрол, экстракты зелёного чая), а также на митохондриально-направленных препаратах.

Основные направления и их мишени

1. Ингибирование гликолиза

• Препараты: 2-дезоксиглюкоза, дихлорацетат.

• Мишени: ферменты гликолиза, пируват-дегидрогеназная киназа.

• Эффект: снижение потребления глюкозы опухолью, истощение энергетических запасов, повышение чувствительности к радиации и химиотерапии.

2. Влияние на митохондрии и окислительный стресс

• Препараты: метформин, фенформин, высокие дозы аскорбата, амигдалин для внутривенного введения.

• Мишени: дыхательная цепь митохондрий, прооксидантный баланс.

• Эффект: запуск апоптоза, накопление активных форм кислорода, ослабление опухолевых клеток при сохранении жизнеспособности нормальных тканей.

3. Регуляция аминокислотного обмена

• Препараты: ингибиторы глутаминазы (BPTES, CB-839), ограничение глутамина в диете.

• Мишени: зависимость опухоли от глутамина.

• Эффект: блокировка роста глутамин-зависимых опухолей, усиление эффективности иммунотерапии.

4. Модификация липидного метаболизма

• Препараты: этомоксир (ингибитор β-окисления жирных кислот), диетические программы с низким содержанием жиров.

• Мишени: использование жиров в качестве источника энергии.

• Эффект: энергетическое «обеднение» опухолей с липидной зависимостью.

5. Нутритивные стратегии

• Кетогенная диета — перевод организма в состояние кетоза, снижение уровня глюкозы, использование кетоновых тел.

• Ограничение метионина и глутамина — создание неблагоприятных условий для синтеза нуклеотидов и белков опухолевыми клетками.

• Эффект: ослабление роста опухоли при сохранении питания нормальных клеток.

Роль амигдалина

Амигдалин — природный цианогенный гликозид, содержащийся в семенах некоторых растений (например, абрикоса). В ряде стран он применяется в виде внутривенных инъекций как дополнительное средство метаболической терапии.

Предполагаемые механизмы действия включают:

• локальное образование цианидных радикалов в опухолевых тканях, где активны определённые β-глюкозидазы;

• усиление прооксидантного стресса в раковых клетках;

• возможное повышение чувствительности опухоли к классическим видам лечения.

Хотя данные остаются противоречивыми и требуют строгих клинических исследований, амигдалин продолжает использоваться в ряде протоколов как дополнительный метаболический агент.

Перспективы и вызовы

Несмотря на растущий интерес, у метаболической терапии есть свои трудности:

• неравномерность доказательной базы: одни подходы (метформин, кетогенная диета) имеют больше подтверждений, другие (амигдалин, 2-дезоксиглюкоза) требуют дополнительных исследований;

• различия в законодательстве: препараты, разрешённые в одной стране, могут быть под запретом в другой;

• необходимость персонализации: разные опухоли используют разные метаболические пути, поэтому универсального метода не существует;

• вопросы безопасности: избыточное вмешательство в обмен веществ может повлиять и на здоровые клетки.

В то же время возможности огромны. Метаболическая терапия способна усиливать стандартные методы, снижать токсичность лечения, повышать качество жизни пациентов и открывать новые пути для персонализированной медицины.

Заключение

Метаболическая терапия — это не альтернатива классической онкологии, а её дополнение. Она объединяет фармакологию, нутрициологию и молекулярную биологию, создавая условия, в которых опухолевые клетки становятся более уязвимыми.

Применение препаратов вроде дихлорацетата, метформина, высоких доз витамина С, а также амигдалина для внутривенных инъекций демонстрирует, что воздействие на энергетические пути опухоли способно усиливать результаты хирургического, химиотерапевтического и иммунного лечения.

Метаболическая терапия уже сегодня становится важным подспорьем современной онкологии, а в будущем, по мере развития персонализированных подходов, её роль будет только возрастать.

Амигдалинин дуцирует апоптоз через регуляцию экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP

Хён-Кён Чанг, Мал-Сун Шин, Хе-Ян Ян, Джин-Ву Ли, Ён-Сик Ким, Мён-Хва Ли, Джулия Ким, Кхе-Хван Ким и Чанг-Джу Ким*

*Кафедра физиологии, Медицинский колледж, Университет Кён Хи; #1 Хоиги-дон, Донгдэмун-гу, Сеул 130–701, Южная Корея. Получено 8 сентября 2005; принято 1 марта 2006*

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Амигдалин является одним из нитрилозидов, природных веществ, содержащих цианид, в изобилии содержащихся в семенах растений семейства пруназин, которые использовались для лечения раков и облегчения боли. В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. Апоптоз, запрограммированная клеточная смерть, является важным механизмом в лечении рака. В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen (семена абрикоса) и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. В настоящих результатах, клетки DU145 и LNCaP, обработанные амигдалином, проявляли несколько морфологических характеристик апоптоза. Обработка амигдалином увеличивала экспрессию Bax, проапоптотического белка, уменьшала экспрессию Bcl-2, антиапоптотического белка, и увеличивала активность фермента каспазы-3 в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Здесь мы показали, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP путем активации каспазы-3 через down-регуляцию (подавление экспрессии) Bcl-2 и up-регуляцию (усиление экспрессии) Bax. Настоящее исследование показывает, что амигдалин может предложить ценный вариант для лечения раков предстательной железы.

Ключевые слова амигдалин; рак предстательной железы; апоптоз; Bcl-2; Bax; Каспаза-3

Амигдалин (витамин B1717​; ранее называвшийся лаэтрилом) является одним из многих нитрилозидов, которые являются природными веществами, содержащими цианид, в изобилии содержащимися в семенах семейства пруназин, растений, таких как абрикосы, миндаль, персики, яблоки и другие розоцветные растения. Среди пруназинов, Armeniacae semen (семена абрикоса) использовались для лечения астмы, бронхита, эмфиземы, проказы, колоректального рака, витилиго и боли. 1−31−3 Амигдалин состоит из двух молекул глюкозы, одной бензальдегида, который индуцирует анальгезирующее действие, и одной синильной кислоты, которая является противоопухолевым соединением. Помимо вышеуказанных показаний, амигдалин использовался для лечения раков и облегчения боли. 4−64−6 В частности, известно, что D-амигдалин (D-манделонитрил-β-D-гентибиозид) проявляет избирательное убивающее действие на раковые клетки. 77

Рак предстательной железы является одним из наиболее распространенных немеланомных раков у мужчин. Эта злокачественная опухоль чаще всего возникает в наружной части предстательной железы, и по мере роста опухоли она метастазирует в ткани вокруг предстательной железы или в семенные пузырьки. 88

Апоптоз, также известный как запрограммированная клеточная смерть, происходит в нескольких патологических ситуациях у многоклеточных организмов и составляет часть общего механизма замены клеток, ремоделирования тканей и удаления поврежденных клеток. Апоптоз представляет собой сложный процесс, характеризующийся сморщиванием клеток, конденсацией хроматина, интернуклеосомной фрагментацией ДНК и образованием «апоптотических тел». 99

Две важные группы белков, вовлеченных в апоптотическую гибель клеток, это члены семейства Bcl-2 1010 и класс цистеиновых протеаз, известных как каспазы. 1111 Семейство Bcl-2 можно классифицировать на две функционально различные группы: антиапоптотические белки и проапоптотические белки. Bcl-2, антиапоптотический белок, как известно, регулирует апоптотические пути и защищает от клеточной смерти. Bax, проапоптотический белок этого семейства, экспрессируется обильно и избирательно во время апоптоза и способствует клеточной смерти. Увеличение соотношения Bcl-2 к Bax обычно использовалось для определения индукции апоптоза в нескольких тканях. 1212 Каспазы являются аспартат-специфичными цистеиновыми протеазами, которые emerged as (проявились как) центральный исполнитель апоптоза. Среди каспаз, активация каспазы-3 рассматривается как первичный механизм апоптоза. 1313 Каспаза-3 может быть активирована через цитозольный выброс цитохрома c белком Bax. 1414

Многочисленные исследования задокументировали, что индукция апоптоза является очень важным механизмом в спонтанном регрессе опухолей и в разработке противоопухолевых агентов. 1515 Апоптоз опухолевых клеток способствует уменьшению опухоли и promotes (способствует) регрессии опухоли. 1616 Более того, известно, что противораковые препараты индуцируют апоптоз опухолевых клеток, повреждая их ДНК, ингибируя синтез ДНК, истощая внутриклеточный пул нуклеотидов и разрушая митотический аппарат. 17,1817,18

В настоящем исследовании мы приготовили водный экстракт амигдалина из Armeniacae semen и исследовали, индуцирует ли этот экстракт апоптотическую гибель клеток в клетках рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP. Для этого исследования использовались анализ с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ), окрашивание 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), анализ мечения ник-концов dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) (TUNEL-анализ), обратная транскриптаза-полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Вестерн-блоттинг анализ и анализ активности фермента каспазы-3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экстракция амигдалина Armeniacae semen, использованные в этом эксперименте, были получены с рынка Кёндон (Сеул, Корея). 500 г Armeniacae semen, вылущенных из скорлупы, и 10 л 4% раствора лимонной кислоты упаривали в течение 2 ч. После фильтрования в горячем состоянии, фильтрат пропускали через колонку, заполненную HP-20. Вещество, поглощенное в колонке, концентрировали после его элюирования этанолом. Амигдалин (4,2 г для получения выходной скорости 0,84%) был получен путем перекристаллизации экстракта с этанолом. Амигдалин использовали после того, как чистота была

• Кому следует направлять корреспонденцию. e-mail: changju@khu.ac.kr

© 2006 Фармацевтическое общество Японии

===== Страница 2 =====

1598 Vol. 29, No. 8

определена как >99,0% с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ; Shiseido, Токио).

Препараты и реагенты МТТ и DAPI были получены от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, МО, США). TUNEL-анализ был получен от Boehringer Mannheim (Маннхайм, Германия), и набор для анализа каспазы-3 от CLONTECH (Пало-Альто, Калифорния, США).

Культура клеток Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP были purchased (приобретены) из Корейского банка клеточных линий (KCLB, Сеул, Корея). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Jell Biotechservices Inc., Тэгу, Корея) с добавлением 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) при 37°C во влажном клеточном инкубаторе с атмосферой 5% CO22​-95% O22​. Среду меняли каждые 2 дня. Клетки высевали на чашки для культивирования при плотности 2$\times$1044 клеток/см22 за 24 ч до обработок амигдалином.

Анализ цитотоксичности МТТ Клетки рака предстательной железы DU145 и LNCaP выращивали в конечном объеме 100 мкл культуральной среды на лунку в 96-луночных планшетах. Для определения цитотоксичности амигдалина, клетки обрабатывали амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Клетки контрольной группы оставляли необработанными. После добавления 10 мкл меточного реагента МТТ, содержащего 5 мг/мл МТТ в фосфатно-солевом буфере (PBS), в каждую лунку, планшеты инкубировали в течение 4 ч. В каждую лунку добавляли 100 мкл раствора для солюбилизации, содержащего 10% додецилсульфат натрия (SDS) в 0,01 М соляной кислоте (HCl), и клетки инкубировали еще в течение 12 ч. Затем оптическую плотность (ОП) измеряли с помощью микропланшетного ридера (Bio-Tek, Уинуски, Вермонт, США) при тестовой длине волны 595 нм с референсной длиной волны 690 нм. Оптическая плотность (O.D.) рассчитывалась как разница между поглощением на референсной длине волны и наблюдаемым на тестовой длине волны. Процент жизнеспособности рассчитывали как (O.D. обработанного препаратом образца/контрольный O.D.)$\times$100.

Окрашивание DAPI Клетки сначала культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International, Нейпервилл, Иллинойс, США). После обработки амигдалином клетки собирали и фиксировали путем инкубации в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин. После промывки в PBS клетки инкубировали в 1 мкг/мл DAPI в метаноле в течение 30 мин в темноте. Затем клетки наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Zeiss, Оберкохен, Германия).

Окрашивание TUNEL Для in-situ детекции апоптотических клеток, TUNEL-анализ проводили с использованием набора для детекции апоптоза in situ ApoTag® пероксидаза. Клетки культивировали на 3-камерных слайдах (Nalge Nune International) при плотности 2$\times$1044 клеток/камеру. После обработки амигдалином клетки промывали PBS и фиксировали путем инкубации в 4% PFA при 4°C в течение 10 мин. Затем фиксированные клетки инкубировали с конъюгированным с дигоксигенином dUTP в реакции, катализируемой TdT, при 37°C во влажной атмосфере в течение 60 мин и погружали в стоп/промывочный буфер при комнатной температуре на 10 мин. Затем клетки инкубировали с анти-дигоксигениновым антителом, конъюгированным с пероксидазой, в течение 30 мин. Фрагменты ДНК окрашивали с использованием 3,3-диаминобензидина (DAB; Sigma Chemical Co., США) в качестве субстрата для пероксидазы.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР Для идентификации экспрессии мРНК Bcl-2 и Bax, проводили ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли из клеток DU145 и LNCaP с использованием RNAzoI™B (TEL-TEST, Френдсвуд, Техас, США). Два микрограмма РНК и 2 мкл случайных гексамеров (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) добавляли вместе, и смесь нагревали при 65°C в течение 10 мин. Затем один микролитр AMV обратной транскриптазы (Promega), 5 мкл 10 мМ dNTP (Promega), 1 мкл RNasin (Promega) и 5 мкл 10× буфера для AMV RT (Promega) добавляли к смеси, и конечный объем доводили до 50 мкл водой, обработанной диметилпирокарбонатом (DEPC). Затем реакционную смесь инкубировали при 42°C в течение 1 ч.

ПЦР-амплификацию проводили в реакционном объеме 40 мкл, содержащем 1 мкл соответствующей кДНК, 1 мкл каждого набора праймеров в концентрации 10 пМ, 4 мкл 10× ПЦР буфера, 1 мкл 2,5 мМ dNTP и 2 единицы Taq ДНК-полимеразы (TaKaRa, Сига). Для человеческого Bcl-2, последовательности праймеров были 5'-CGAGACTTCTCCGGCGGCTACCGCA-3' (25-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 334) и 5'-CGGCATGTGGGGCCGTACAGTTCC-3' (25-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 628). Для человеческого Bax, последовательности праймеров были 5'-GTGCACAAAGTGGCGGAAAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 375) и 5'-TCAGCCATCTTCTCCAGAT-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 560). Для циклофилина, внутреннего контроля, использованного в этом исследовании, последовательности праймеров были 5'-ACCCCACCGTTCTTCTGAC-3' (20-мерный смысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 52) и 5'-CATTTGCCATGGACAAGATG-3' (20-мерный антисмысловой олигонуклеотид, начиная с позиции 332). Ожидаемый размер ПЦР-продукта составлял 318 п.н. для Bcl-2, 205 п.н. для Bax и 299 п.н. для циклофилина.

Для Bcl-2 и Bax, процедуры ПЦР проводили с использованием системы ПЦР GeneAmp 9600 (Perkin-Elmer, Норуолк, Коннектикут, США) в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 30 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 58°C в течение 30 с и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Для циклофилина, процедура ПЦР выполнялась в следующих условиях: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин, затем 25 циклов амплификации, каждый из которых состоял из денатурации при 94°C в течение 30 с, отжига при 55°C и элонгации при 72°C в течение 45 с, с заключительным этапом элонгации при 72°C в течение 10 мин. Конечное количество продукта ОТ-ПЦР для каждого вида мРНК рассчитывали денситометрически с использованием Molecular Analyst™ версия 1.4.1 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).

Вестерн-блот анализ Клетки рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP лизировали в ледяном буфере для лизиса целых клеток, содержащем 50 мМ HEPES (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 1% Тритон X-100, 1,5 мМ гексагидрат хлорида магния, 1 мМ этиленгликоль-бис-(β-аминоэтиловый эфир)-N,N'-тетрауксусная кислота (EGTA), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 2 мкг/мл лейпептин, 1 мкг/мл пепстатин, 1 мМ ортованадат натрия и 100 мМ фторид натрия. Смесь инкубировали при 4°C в течение 30 мин. Клеточный дебрис удаляли путем микроцентрифугирования, с последующей быстрой заморозкой супернатанта. Концентрацию белка измеряли с использованием колориметрического набора для определения белка Bio-Rad (Bio-Rad). Сорок микрограмм белка разделяли на SDS-полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher & Schuell GmbH, Дассель, Германия). Мышиные анти-актин, анти-Bcl-2 и анти-Bax ан-

===== Страница 3 =====

Август 2006 1599

титела (1:1000; Santa Cruz Biotech, Калифорния, США) использовали в качестве первичных антител. Конъюгированное с пероксидазой хрена кроличье анти-мышиное антитело (1:2000; Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Фрайбург, Германия) использовали в качестве вторичного антитела. Детекцию полос проводили с использованием системы детекции с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech GmbH).

Анализ активности фермента каспазы Активность фермента каспазы измеряли с использованием набора для анализа каспазы-3 ApoAlert® в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, после обработки амигдалином клетки лизировали 50 мкл охлажденного буфера для лизиса клеток. Пятьдесят микролитров 2× реакционного буфера (содержащего DTT) и 5 мкл соответствующего конъюгированного субстрата в концентрации 1 мМ добавляли к каждому лизату. Смесь инкубировали в водяной бане при 37°C в течение 1 ч, и поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера при тестовой длине волны 405 нм.

Статистический анализ Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.). Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим пост-хок тестом Дункана с использованием SPSS. Различия считались статистически значимыми при $p<0,05$.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние амигдалина на жизнеспособность клеток рака предстательной железы Для оценки цитотоксического эффекта амигдалина на клетки рака предстательной железы человека, клетки DU145 и LNCaP культивировали с амигдалином в конечных концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, после чего проводили анализы МТТ. Клетки, культивируемые в средах без амигдалина, использовали в качестве контроля.

Жизнеспособность человеческих клеток DU145, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 82,67±2,22% ($n=8,p<0,05$), 77,25±2,06% ($n=8,p<0,05$), 76,09±1,90% ($n=8,p<0,05$) и 45,63±1,65% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Жизнеспособность человеческих клеток LNCaP, инкубированных с амигдалином в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч, составила 96,68±1,11% ($n=8,p<0,05$), 91,33±1,57% ($n=8,p<0,05$), 57,11±0,81% ($n=8,p<0,05$) и 45,02±0,73% ($n=8,p<0,05$) от контрольного значения, соответственно (Рис. 1).

Тенденция к снижению жизнеспособности с увеличением концентрации амигдалина была достоверно observed (наблюдаема) при 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в обоих типах клеток DU145 и LNCaP. Результаты анализа МТТ показали, что амигдалин оказывает дозозависимый цитотоксический эффект на клетки рака предстательной железы.

Морфологические изменения, индуцированные амигдалином Анализ DAPI выявил возникновение конденсации ядра, фрагментации ДНК и перинуклеарных апоптотических тел при обработке амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч. Апоптотические тельца, один из строгих морфологических критериев апоптоза, характерно присутствовали в обработанных амигдалином клетках DU145 и LNCaP, окрашенных DAPI (Рис. 2).

Разрывы цепей ДНК происходят во время апоптоза, и известно, что ники в молекулах ДНК могут быть обнаружены с помощью TUNEL-анализа. TUNEL-позитивные клетки были окрашены в темно-коричневый цвет при световой микроскопии, и конденсация ядра наблюдалась в клетках, обработанных 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл амигдалина. В настоящем исследовании, TUNEL-позитивные клетки, которые указывали на возникновение апоптоза, наблюдались среди обработанных амигдалином клеток DU145 и LNCaP (Рис. 2).

Влияние амигдалина на экспрессию мРНК Bcl-2 и Bax Анализ ОТ-ПЦР уровней мРНК Bcl-2 и Bax был performed (проведен) для оценки относительных уровней экспрессии этих генов. В настоящем исследовании, уровень мРНК Bcl-2 и Bax в контрольных клетках был установлен как 1,00.

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках DU145, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,89±0,05 ($n=4,p<0,05$), 0,69±0,03 ($n=4,p<0,05$) и 0,21±0,03 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно increased (увеличен) до 1,08±0,07 ($n=4,p<0,05$), 2,07±0,17 ($n=4,p<0,05$) и 2,43±0,15 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

После обработки амигдалином в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл в течение 24 ч на клетках LNCaP, уровень мРНК Bcl-2 был достоверно снижен до 0,78±0,20 ($n=4,p<0,05$), 0,52±0,20 ($n=4,p<0,05$) и 0,48±0,38 ($n=4,p<0,05$), соответственно, в то время как уровень мРНК Bax был достоверно увеличен до 2,25±0,25 ($n=4,p<0,05$), 2,42±0,27 ($n=4,p<0,05$) и 3,64±0,50 ($n=4,p<0,05$), соответственно (Рис. 3).

Настоящие результаты показали, что амигдалин оказывает снижающее действие на экспрессию мРНК Bcl-2 и ускоряющее действие на экспрессию мРНК Bax дозозависимым образом на обе клеточные линии рака предстательной железы DU145 и LNCaP.

Вестерн-блот анализ белков Bcl-2 и Bax Эф-

===== Страница 4 =====

1600 Vol. 29, No. 8

A B C D
DAPI

TUNEL

A B C D
DAPI

TUNEL

Рис. 2. Морфологические наблюдения клеток, обработанных амигдалином (A) Контрольная группа; (B) группа, обработанная амигдалином 0,1 мг/мл; (C) группа, обработанная амигдалином 1 мг/мл; (D) группа, обработанная амигдалином 10 мг/мл. Эксперименты повторялись по крайней мере четыре раза. Вверху: Влияние амигдалина на клетки DU145, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL. Внизу: Влияние амигдалина на клетки LNCaP, окрашенные с помощью анализа DAPI и TUNEL.

фекты амигдалина на экспрессию белков Bcl-2 и Bax были исследованы. Уровень экспрессии актина indicated (указывал), что количество образца было загружено одинаково. После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл на клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP, экспрессия белка Bcl-2 (25 кДа) дозозависимо снижалась, тогда как экспрессия белка Bax (26 кДа) дозозависимо увеличивалась (Рис. 4).

Анализ активности фермента каспазы-3 Активность фермента каспазы-3 измеряли с использованием DEVD-пептид-нитроанилида (pNA). После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках DU145 было достоверно increased (увеличено) с контрольного значения 5,25±0,50 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 9,47±0,11 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 11,66±0,67 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 11,62±0,59 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 7,28±0,35 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk. DEVD-fmk является ингибитором каспазы-3 (Рис. 5)

После 24 ч воздействия амигдалина в концентрациях 0,1 мг/мл, 1 мг/мл и 10 мг/мл, количество расщепленного DEVD-pNA в течение 6 ч в клетках LNCaP было достоверно увеличено с контрольного значения 4,21±0,07 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) до 6,82±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), 7,36±0,18 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) и 7,50±0,24 пмоль ($n=4$, $p<0,05$), соответственно, и впоследствии снизилось до 4,26±0,28 пмоль ($n=4$, $p<0,05$) при обработке 10 мг/мл амигдалина и 1 мкг DEVD-fmk (Рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

Разнообразные сигналы могут запускать апоптотический процесс во время развития опухоли. В некоторых случаях, истощение факторов роста/выживания, гипоксия, радиация, потеря клеточно-матриксных взаимодействий, повреждение ДНК и нарушения теломер могут быть включены в число триггеров апоптоза.20 Исследование действий большинства противоопухолевых агентов было сосредоточено на их внутриклеточных сигналах-мишенях, которые индуцируют гибель опухолевых клеток. Противоопухолевые действия подразумевают клеточные ответы, происходящие во время взаимодействий, которые индуцируют гибель опухолевых клеток.21,22 Индукция апоптоза в раковых клетках нарушает инициацию, прогрессию и метастазирование опухолевых клеток.23

В настоящем исследовании, оценка жизнеспособности клеток с использованием анализа МТТ подтвердила, что амигдалин в высоких концентрациях проявляет дозозависимую цитотоксичность в отношении клеток рака предстательной железы DU145 и LNCaP (Рис. 1). Более того, амигдалин индуцировал характерные апоптотические изменения в морфологии клеток рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Разрывы цепей ДНК, которые происходят во время апоптоза,24 наблюдались как TUNEL-позитивные клетки в обработанных амигдалином клетках. Кроме того, апоптотические тельца были обнаружены с помощью окрашивания DAPI в клетках DU145 и LNCaP, обработанных амигдалином (Рис. 2).

Bcl-2, антиапоптотический белок семейства Bcl-2, как известно, способствует неопластической прогрессии, усиливая выживаемость опухолевых клеток через ингибирование апоптоза.26 В большинстве андроген-независимых раков предстательной железы можно наблюдать сверхэкспрессию Bcl-2.27,28 Экспрессия Bcl-2 также значительно усилена при ранних раках предстательной железы.29 В доклинических моделях рака предстательной железы, ингибирование экспрессии Bcl-2 потенцировало химиотерапевтический эффект путем увеличения апоптоза в

===== Страница 5 =====

клетках рака предстательной железы.[30, 31] В настоящем исследовании, амигдалин подавлял экспрессию мРНК Bcl-2, а также down-регулировал (подавлял) экспрессию белка Bcl-2 в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP дозозависимым образом.

Многочисленные исследования сообщали, что сверхэкспрессия белка Bax вызывает выброс цитохрома c, активацию каспазного пути и апоптоз в большинстве клеточных линий рака предстательной железы.[32, 33] Модуляция экспрессии Bax имеет широкое применение для индукции терапевтического апоптоза в лечении рака. Марчелли и др.[34] сообщили, что сверхэкспрессия Bax может индуцировать апоптотическую гибель клеток в нескольких клетках рака предстательной железы, таких как линии клеток DU145 и PC-3, которые устойчивы к некоторым типам химически индуцированного апоптоза. Более того, Лоу и др.[35] сообщили, что сверхэкспрессия белка Bax с помощью промотора, специфичного для предстательной железы, может индуцировать апоптоз в клетках карциномы предстательной железы человека LNCaP, предполагая, что генная терапия Bax является перспективным подходом для лечения раков предстательной железы. В настоящем исследовании, амигдалин усиливал экспрессию мРНК Bax и up-регулировал (усиливал) экспрессию белка Bax в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP дозозависимым образом.

Каспазы, семейство цистеиновых протеаз, как известно, образуют неотъемлемые части апоптотического пути. В частности, каспаза-3 имеет множество клеточных мишеней, и активация этого белка производит типичные морфологические особенности апоптоза.[11] Активированная каспаза-3 расщепляет свой субстрат, и этот процесс знаменует начало расщепления ДНК.[36] В настоящем исследовании, активность фермента каспазы-3 была increased (увеличена) обработкой амигдалином в клетках DU145 и LNCaP, что позволяет предположить, что амигдалин оказывает противораковый эффект, индуцируя апоптоз в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP.

В настоящем исследовании, обработка высокими концентрациями амигдалина клеток рака предстательной железы человека DU145 и LNCaP индуцировала апоптотическую гибель клеток. Наиболее сильный апоптотический

Рис. 4: Вестерн-блот анализ уровней белка Bcl-2 и Bax

Рис. 5: Активность фермента каспазы-3

Рис. 3: Результаты анализа ОТ-ПЦР уровней мРНК Bcl-2 и Bax

===== Страница 6 =====

эффект наблюдался при 10 мг/мл амигдалина в этом исследовании. В некоторых клинических исследованиях, $2-9\text{г/кг}$ амигдалина вводили внутривенно для достижения противораковых эффектов у мужчин. Следовательно, возможно, что высокие дозы амигдалина, использованные в этом исследовании, могут совпадать с клиническими дозировками для пациентов. Недавно сообщалось, что \textit{Armeniacae semen}, содержащие abundant (обильное количество) амигдалина, проявляют анальгезирующий и противовоспалительный эффекты, показывая, что низкие дозы амигдалина могут облегчать боль.11 Было предложено много гипотез для объяснения противораковых эффектов амигдалина. Например, амигдалин может быть специфично расщеплен бета-глюкозидазой, которая в изобилии содержится в раковых клетках, и, следовательно, цианид высвобождается на раковые поражения, где он оказывает токсичность на раковые клетки.37−3937−39 Другое предположение заключается в том, что амигдалин усиливает функции панкреатических ферментов, которые могут предотвращать трансформацию первичных зародышевых клеток рака.4,384,38 Третья гипотеза состоит в том, что амигдалин (витамин B1717​) восстанавливает дефицит витаминов, который мог привести к метаболическим нарушениям у больных раком.4040 В частности, Бхатти и др.4141 сообщили, что амигдалин может стимулировать иммунную систему для производства противораковой активности у пациентов с раком предстательной железы.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что амигдалин индуцирует апоптотическую гибель клеток путем активации каспазы-3 через down-регуляцию антиапоптотического белка Bcl-2 и up-регуляцию проапоптотического белка Bax в клетках рака предстательной железы DU145 и LNCaP. Основываясь на этих результатах, амигдалин показывает considerable (значительные) перспективы в лечении раков предстательной железы.

Благодарности Это исследование было поддержано грантом проекта по разработке восточной медицины, Министерство здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея. (0405-OD00-0815-В050049)

ЛИТЕРАТУРА

1. Chang H. K., Yang H. Y., Lee T. H., Shin M. C., Lee M. H., Shin M. S., Kim C. J., Kim O. J., Hong S. P., Cho S., \textit{Biol. Pharm. Bull.}, 28, 449—454 (2005).

2. Hwang D. R., Kang Y. S., Kim S. S., Kim D. H., Shin M. K., Song H. J., \textit{Kor. J. Herbol.}, 18, 201—208 (2003).

3. Pak J. U., Moon S. J., Moon K., Won J. H., \textit{J. Kor. Orient. Oncol.}, 5, 137—150 (1999).

4. Ellison N. M., Byar D. P., Newell G. R., \textit{New Engl. J. Med.}, 299, 549—552 (1978).

5. Fukuta T., Ito H., Mukainaka T., Tokuda H., Nishino H., Yoshida T., \textit{Biol. Pharm. Bull.}, 26, 271—273 (2003).

6. Shim B. S., Park J. K., Choi S. H., \textit{J. Kor. Orient. Oncol.}, 6, 19—28 (2000).

7. Koo J. Y., Hwang E. Y., Cho S., Lee J. H., Lee Y. M., Hong S. P., \textit{J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.}, 814, 69—73 (2005).

8. Landis S. H., Murray T., Bolden S., Wingo P. A., \textit{Cd Cancer J. Clin.}, 49, 8—31 (1999).

9. Wylie A. H., Kerr J. F., Currie A. R., \textit{Int. Rev. Cytol.}, 68, 251—306 (1980).

10. Korsmeyer S. J., \textit{Cancer Res.}, 59, 1693—1700 (1999).

11. Cohen G. M., \textit{Biochem. J.}, 326, 1—16 (1997).

12. Oliva Z. N., Milliman C. L., Korsmeyer S. J., \textit{Cell.}, 74, 609—619 (1993).

13. Nagata S., \textit{Cell.}, 88, 355—365 (1997).

14. Communal C., Sumandea M., de Tombe P., Narula J., Solano R. J., Hajjar R. J., \textit{Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.}, 99, 6252—6256 (2002).

15. Thompson C. B., \textit{Science}, 267, 1456—1462 (1995).

16. Lowe S. W., Lin A. W., \textit{Corcinogenesis}, 21, 485—495 (2000).

17. Fisher D. E., \textit{Cell.}, 78, 539—542 (1994).

18. Steller H., \textit{Science}, 267, 1445—1449 (1995).

19. Wright S. C., Wei Q. S., Kinder D. H., Larrick J. W., \textit{J. Exp. Med.}, 183, 463—471 (1996).

20. Raff M. C., \textit{Nature} (London), 356, 397—400 (1992).

21. Dive C., Hickman J. A., \textit{Br. J. Cancer}, 64, 192—196 (1991).

22. Eastman A., \textit{Cancer Cells}, 2, 275—280 (1990).

23. Frisch S. M., Francis H., \textit{J. Cell Biol.}, 124, 619—626 (1994).

24. Qiao L., Hanif R., Sphicas E., Shiff S. J., Rigas B., \textit{Biochem. Pharmacol.}, 55, 53—64 (1998).

25. Eastman A., Barry M. A., \textit{Cancer Invest.}, 10, 229—240 (1992).

26. Tsujimoto Y., Croce C. M., \textit{Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.}, 83, 5314—5218 (1986).

27. Colombel M., Symmans F., Gil S., O’Toole K. M., Chopin D., Benson M., Olsson C. A., Korsmeyer S., Buttyan R., \textit{Am. J. Path.}, 143, 390—400 (1993).

28. McDonnell T. J., Navone N. M., Troncoso P., Pisters L. L., Conti C., von Eschenbach A. C., Brisbay S., Logothetis C. J., \textit{J. Urol.}, 157, 569—574 (1997).

29. McDonnell T. J., Troncoso P., Brisbay S. M., Logothetis C., Chung L. W., Hsieh J. T., Tu S. M., Campbell M. L., \textit{Cancer Res.}, 52, 6940—6944 (1992).

30. Gleave M. E., Tolcher A., Miyake H., Nelson C., Brown B., Beraldi E., Goldie J., \textit{Clin. Cancer Res.}, 5, 2891—2898 (1999).

31. Miyake H., Monia B. P., Gleave M. E., \textit{Int. J. Cancer}, 86, 855—862 (2000).

32. Du C., Fang M., Li Y., Li L., Wang X., \textit{Cell.}, 102, 33—42 (2000).

33. Verdagren A. M., Ekert P. G., Pakusch M., Silke J., Connolly L. M., Reid G. E., Moritz R. M., Simpson R. J., Vaux D. L., \textit{Cell.}, 102, 55—66 (2000).

34. Marcelli M., Marani M., Li X., Sturgis L., Haidacher S. J., Trial J. A., Mannucci R., Nicoletti I., Denner L., \textit{Prostate}, 42, 260—273 (2000).

35. Lowe S. L., Rubinchik S., Honda T., McDonnell T. J., Dong J. Y., Norris J. S., \textit{Gene Therapy}, 8, 1363—1371 (2001).

36. Hoshi T., Sasano H., Kato K., Yabuki N., Ohara S., Konno R., Asaki S., Toyota T., Tateno H., Nagura H., \textit{Anticancer Res.}, 18, 4347—4353 (1998).

37. Dorr R. T., Paxinos J., \textit{Ann. Intern. Med.}, 89, 389—397 (1978).

38. Greenberg D. M., \textit{Cancer}, 45, 799—807 (1980).

39. Herbert V., \textit{Am. J. Clin. Nutr.}, 32, 1121—1158 (1979).

40. Young V. R., Newberne P. M., \textit{Cancer}, 47, S1226—1240 (1981).

41. Bhatti R. A., Ablin R. J., Guinan P. D., \textit{IRCS Med. Sci. Biochem.}, 9, 19 (1981).

Экспериментальные и терапевтические испытания амигдалина

Авторы:

Рагга Х. Салама¹⁵, Абд эль-Рахман Г. Рамадан², Тасним А. Альсанури³, Мохаммед О. Хердан², Омния М. Фатхаллах², Ая А. Альсанури²
¹Кафедра медицинской биохимии и молекулярной биологии, Медицинский факультет, Университет Асьют, Египет
²Студенты, Медицинский факультет, Университет Асьют, Египет
³Студент, Фармацевтический факультет, Университет Асьют, Египет

Информация о статье

Корреспондирующий автор:
Рагга Х. Салама
Профессор
Заведующий кафедрой медицинской биохимии и молекулярной биологии
Содиректор Медицинского исследовательского центра
Медицинский факультет
Университет Асьют
Египет
Тел.: +201063492008
E-mail: ragaa_2002@yahoo.com

Поступила: 16 сентября 2019 г.
Принята: 18 октября 2019 г.
Опубликована: 28 октября 2019 г.

Цитирование: Salama RH, Ramadan AEG, Alsanory TA, Herdan MO, Fathallah OM, Alsanory AA. Experimental and Therapeutic Trials of Amygdalin. Int J Biochem Pharmacol. 2019; 1(1): 21–26. doi: 10.18689/ijbp-1000105

Авторское право © 2019 Автор(ы). Данная работа лицензирована согласно Creative Commons Attribution 4.0 International License, что разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинала.

Опубликовано издательством Madridge Publishers

Аннотация

Природные вещества и альтернативные лекарства, такие как амигдалин, приобрели огромную популярность в лечении различных заболеваний благодаря широкой доступности и относительно низкой стоимости. Тем не менее, их использование может вызывать серьезные побочные эффекты, если не учитывать соответствующие дозы. Следовательно, этот обзор иллюстрирует предполагаемую противораковую активность амигдалина, а также его другие эффекты на различные системы организма. Например, эндокринную, мочевыделительную, половую и дыхательную системы, учитывая его токсические побочные эффекты. Также в этом обзоре упоминаются различные клинические испытания с использованием амигдалина как на людях, так и на животных.

Ключевые слова:

Амигдалин; Витамин B17; Цианогенная токсичность; Противоопухолевое; Бета-глюкуронидаза; Роданеза.

Введение

История

Хотя обычно амигдалин называют лаэтрилом, они не являются одним и тем же продуктом с биомедицинской точки зрения. Более того, амигдалин известен под ошибочным названием витамин B17, что неверно, так как ни амигдалин, ни лаэтрил не являются витаминами [1]. Интересно, что египетские папирусы 5000 лет назад упоминали полезное использование производных горького миндаля для лечения кожных опухолей. Также римляне и греки связывали некоторые терапевтические свойства с этими производными [2]. Впоследствии эти производные стали известны как амигдалин или витамин B17, поскольку горький миндаль считается одним из самых богатых их источников [3,4]. Более того, было замечено, что у некоторых народов и изолированных племен по всему миру не было случаев рака, таких как абхазы, индейцы хопи и навахо, хунзы, эскимосы и каракорум. Оказалось, что их объединяет диета, богатая амигдалином [2]. В результате многие исследователи и ученые по всему миру провели различные исследования и клинические испытания, чтобы доказать его противораковую активность, и они обнаружили, что амигдалин может избирательно атаковать раковые клетки, не затрагивая другие здоровые клетки [5], снижать активность теломеразы [6] и блокировать рост клеток рака мочевого пузыря [7]. С другой стороны, амигдалин показал серьезные побочные эффекты, вызванные цианидными соединениями, высвобождающимися после распада амигдалина [8,9].

Источники амигдалина

Амигдалин имеет растительное происхождение и присутствует в семенах около 800 растений. Семена Prunus являются одним из самых богатых источников амигдалина. Более того, семена горького миндаля, абрикосов, вишни, черешни, персиков, слив, нектаринов и яблок также богаты амигдалином. Кроме того, семена оливок, винограда и гречихи содержат амигдалин. Помимо амигдалина, эти семена богаты белками, полиненасыщенными жирами и другими питательными веществами и содержат до 2% или более нитрилозида [3,4,10].

Химия

Структура, формула и физические свойства:
Амигдалин (C20H27NO11) принадлежит к группе ароматических цианогенных гликозидов. Химическое название амигдалина - (R)-α-[(6-O-β-D-глюкопиранозил-b-D-глюкопиранозил)-окси]-(фенил)ацетонитрил, также называемый d-(-)-манделонитрил-β-d-гентобиозид. Между тем, активной формой амигдалина является R-амигдалин с правовращающей структурой, которая является природной формой (Рисунок 1). Амигдалин бесцветен, имеет молекулярную массу 457.4 г/моль, температуру плавления 213°C, а его номер CAS (Chemical Abstracts Service) - 29883-15-6. Хотя амигдалин нерастворим в неполярных растворителях, таких как хлороформ, он хорошо растворим в этаноле и умеренно растворим в воде. Амигдалин также называют лаэтрилом или витамином B-17. Но названия лаэтрил, витамин B-17 и амигдалин не обозначают один и тот же продукт. Поскольку амигдалин является цианогенным гликозидом, а его очищенная форма называется лаэтрил, что относится к терминам левовращающий и манделонитрил. В то время как лаэтрил является полусинтетическим цианогенным глюкуронидом, поэтому он структурно отличается от амигдалина. Лаэтрил в США и Мексике различается по процессу синтеза. В США лаэтрил является частично синтетической (искусственной) формой амигдалина, тогда как в Мексике его получают из измельченных косточек абрикоса. Э.Т. Кребс-младший дал название витамин B-17 лаэтрилу, обозначив его как витамин или пищевую добавку, а не как лекарство. Но на самом деле, ошибочно называют его витамином B17, поскольку это соединение не является витамином [5,8,11].

Биосинтез амигдалина:
В амигдалине аминокислота фенилаланин подвергается гидроксилированию ферментом CYP79 в фенилацеталдоксим, который далее гидроксилируется ферментом CYP71 в манделонитрил. Последующее присоединение одной молекулы глюкозы к α-гидроксильной группе манделонитрила, катализируемое уридиндифосфат глюкозо-глюкозилтрансферазой (UGT), приводит к образованию пруназина (d-(-)-манделонитрил-β-d-глюкозид, номер CAS 99-18-3, 295.3 г/моль). При добавлении другой молекулы глюкозы к 6'-гидроксильной группе он окончательно превращается в амигдалин, образуя диглюкозид генциобиозу (Рисунок 2). Биосинтез амигдалина в растениях следует общей схеме для CNG, то есть последовательного гидроксилирования аминокислоты ферментами цитохрома P450 (CYP) до оксима и последующего α-гидроксинитрила, за которым следует гликозилирование последнего [1].

Экстракция

Амигдалин получали из семян и белковых изолятов. Процесс экстракции амигдалина проводили следующим образом: первый шаг - смешивание 550 мг семян с 15 мл MeOH или 40 мг белковых изолятов с 5 мл MeOH для приготовления раствора, из которого экстрагировали амигдалин. Второй шаг - накрытие раствора и его выдерживание в течение 24 часов в водяной бане с перемешиванием при 60 ± 2°C. Затем раствор центрифугировали в течение 10 минут при 4000 g. После этого супернатанты вводили в высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) серии 1100. Хроматографические условия были следующими: изократическая элюция с водой:MeOH 65:35; скорость потока 1 мл/мин; температура 25°C; объем инъекции 10 мкл; УФ-детектирование при 218 нм [10].

Способ введения

Существует два способа введения амигдалина; его можно давать перорально в виде таблеток или путем инъекции (внутривенно или внутримышечно). Однако наиболее распространенным способом введения является первоначальное внутривенное введение в течение определенного периода времени с последующей поддерживающей пероральной терапией. Считается, что пероральное введение амигдалина вызывает гораздо более высокие уровни отравления цианидом, в то время как инъекция амигдалина приводит к незначительному распаду с образованием цианистого водорода. Это связано с тем, что лаэтрил гидролизуется в кишечнике ферментами (бета-глюкозидазами), которые активируют высвобождение цианида из лаэтрила и превращают лаэтрил в токсичное вещество (цианистый водород). Этот фермент присутствует в кишечных бактериях и некоторых часто употребляемых растениях [5].

Фармакокинетика

После приема лаэтрила или амигдалина оба они метаболизируются путем гидролиза с помощью ферментов двенадцатиперстной и кишечной щелочной жидкости, производя D-глюкуроновую кислоту и L-манделонитрил, последний далее гидролизуется до бензальдегида и цианистого водорода (синильной кислоты или HCN), который при приеме в большом количестве приведет к цианогенной токсичности [11]. Кроме того, каталитическое разложение амигдалина внеклеточными ферментами Aspergillus niger привело к четырем продуктам, которые были идентифицированы как манделонитрил, пруназин, бензальдегид и фенил-(3,4,5-тригидрокси-6-метил-тетрагидро-пиран-2-илокси)-ацетонитрил (PTMT) [12].

В эксперименте, проведенном Li et al. [13], после перорального введения крысам 20 мг/кг амигдалина фармакокинетические результаты показали короткое Tmax (менее 2 часов), что указывало на то, что амигдалин может быстро всасываться после перорального введения с немедленным обнаружением амигдалина в плазме в течение 5 минут. Между тем, у крыс было длительное значение t1/2 амигдалина, приблизительно 8,45 часов, что указывало на то, что выведение амигдалина может быть медленным.

В другом исследовании на здоровых китайских добровольцах, проведенном Li et al. [14], исследователи использовали лиофилизированный порошок для инъекций Huoxue-Tongluo (HTLPI), в котором амигдалин является биологически активным компонентом, поскольку HTLPI представляет собой смесь Paeoniae Radix Rubra и Persicae semen. Исследование показало, что пол не влиял существенно на фармакокинетические свойства амигдалина. Между тем, фаза однократного введения исследования показала, что средняя максимальная концентрация в плазме, а также средняя площадь под кривой "концентрация-время" амигдалина пропорционально увеличивались с каждым увеличением дозы, тогда как после многократного введения 6 г HTLPI стабильная концентрация была достигнута к 4 дню. Также не было замечено значительного системного накопления после повторного введения 6 г HTLPI, так как средние фармакокинетические параметры, достигнутые на 1 день, были аналогичны тем, которые были на 7 день. Более того, исследование показало, что приблизительно 79,6% введенного амигдалина выводилось в неизмененном виде с мочой в течение 24 часов. В конечном итоге, исследователи не наблюдали каких-либо серьезных неблагоприятных событий в течение всего исследования.

Также Shalayel [11] заключил, что содержание амигдалина в горьких абрикосовых косточках может влиять на контроль организмом различных минералов, азота и, возможно, также на кислотно-щелочной баланс. Хотя 42-дневное введение абрикосовых косточек в дозе 60 мг/кг массы тела значительно снизило выведение кальция с мочой, это снижение переместило повышенное среднее значение в контрольном сборе в обычный физиологический диапазон, кроме того, были обнаружены изменения в моче в отношении уровней мочевины и фосфора.

Теории, объясняющие его предполагаемую противораковую активность

Сторонники лаэтрила предложили различные теории, объясняющие его предполагаемую противораковую активность.

• Одна из них - "трофобластическая теория рака". Эта теория утверждает, что все раковые заболевания возникают из первичных половых клеток (клеток, которые в норме дают начало яйцеклеткам или сперматозоидам), некоторые из которых распространяются по всему телу во время эмбриогенеза и, соответственно, они не ограничены яичками или яичниками. Использование лаэтрила объясняется предположением, что злокачественные клетки особенные тем, что имеют уровни выше нормы фермента под названием бета-глюкуронидаза и что они дефектны в другом ферменте под названием роданеза (тиосульфат-сератрансфераза). Другое мнение гласит, что лаэтрил модифицируется в печени, а затем фермент бета-глюкуронидаза расщепляет модифицированное соединение, производя цианид. После этого роданеза превращает цианид в относительно безвредное соединение тиоцианат. Таким образом, дисбаланс в этих двух ферментах показывает, что раковые клетки более подвержены токсическому действию лаэтрила, чем нормальные клетки.
• Другая теория утверждает, что лаэтрил, или амигдалин/витамин B-17, является недостающим витамином, необходимым организму для восстановления здоровья. Соответственно, эта теория предполагает, что рак - это метаболическое расстройство, вызванное дефицитом витамина. Несмотря на экспериментальные данные, которые указывают на то, что уровень потребления отдельных витаминов может влиять на развитие рака, нет доказательств того, что лаэтрил необходим для нормального метаболизма.
• Также есть теория, которая предполагает, что цианид, высвобождаемый из лаэтрила, увеличивает кислотное содержание опухолевых клеток, приводя к разрушению лизосом с высвобождением их содержимого. Тем самым прекращая рост опухоли и разрушая раковые клетки. Согласно этой теории, другим следствием лизосомального разрушения является стимуляция иммунной системы [5].
• Более того, амигдалин мог значительно снижать действие фермента теломеразы, который присутствует в более высоких уровнях в раковых клетках (в 13 раз). Поэтому он снижает экспрессию обратной транскриптазы теломеразы и РНК-компонента теломеразы. В результате это вызвало подавление роста раковых клеток. Поэтому Moon et al. [6] рассматривали амигдалин как мощное средство для лечения рака.

Токсичность амигдалина

Разложение 1 г амигдалина высвобождает 59 мг цианистого водорода (HCN), который присутствует в его диссоциированной форме как цианид [1,15]. Несмотря на то, что цианид оказывает благотворное действие в борьбе с раком, он считается большим риском из-за его токсических побочных эффектов, главным образом, когда амигдалин принимается перорально, поскольку цианид, высвобождаемый после перорального приема, намного больше, чем высвобождаемый при внутривенном пути введения, не только из-за быстрого действия бактерий кишечной микрофлоры в высвобождении цианида [9,16], но также в результате жевания или измельчения [1].

Максимальная доза амигдалина, которая не вызывала каких-либо неприемлемых побочных эффектов у мышей, кроликов и собак, составляла 3 г/кг при внутривенном и внутримышечном введении и 0,075 г/кг при пероральном введении; также максимальная переносимая доза амигдалина при внутривенном введении человеку составляла около 0,07 г/кг. Кроме того, после лечения мышей путем ингибирования кишечных бактерий пероральное введение 300 мг/кг не приводило к смерти, с другой стороны, смертность увеличивалась на 60% при использовании той же дозы у нелеченых мышей. Более того, системная токсичность у людей возникала после перорального введения амигдалина в дозе 4 г в день в течение периода половины месяца или месяца внутривенных инъекций. Тем не менее, после прекращения приема амигдалина или когда ежедневная пероральная доза снижалась до 0,6~1 г, токсичность исчезала. Кроме того, реакция токсичности пищеварительной системы более частая и сопровождается изменениями предсердных преждевременных сокращений [16].

В клиническом случае, описанном Sauer et al. [8], у 4-летнего ребенка, получавшего дополнительное и альтернативное лечение по поводу злокачественного заболевания головного мозга, родители давали ему амигдалин внутривенно и перорально в виде абрикосовых косточек, что привело к острому отравлению цианидом, которое в конечном итоге привело к тяжелой энцефалопатии. После этого состояние ребенка быстро улучшилось после введения тиосульфата натрия. Более того, согласно Sauer et al. [8], токсичность цианида приводит к нарушению процесса окислительного фосфорилирования в клетках, следовательно, клинические симптомы легкого отравления цианидом - это тошнота, сонливость, головная боль, металлический привкус, головокружение, гиперпноэ, тревога и раздражение слизистых оболочек. Поэтому Milazzo и Horneber [9] считали, что баланс риска и пользы от использования амигдалина для лечения рака был соответственно отрицательным.

Кроме того, важно учитывать употребление абрикосов среди дифференциальных диагнозов у пациентов с тяжелым лактоацидозом с нормальной сатурацией кислорода. Как в клиническом случае, описанном Dalk et al. [17], родители пациента сообщили, что пациент извлек и съел ядра 3 абрикосовых косточек перед тем, как проявился тяжелый ацидоз. Более того, pH крови пациента и сердечно-сосудистые функции показали значительное улучшение после начала гемодиализа. Поэтому клинический случай заключил, что в тяжелых случаях отравления цианидом, когда нет доступа к гидроксокобаламину и нет ответа на поддерживающую терапию, гемодиализ можно рассматривать как подход для избавления от токсических метаболических побочных продуктов и свободного цианида в крови.

Экспериментальные испытания амигдалина

В целом, было показано, что амигдалин оказывает множество благотворных эффектов на многие системы и заболевания, такие как: пищеварительная система, где он проявляет успокаивающее и защитное действие; мочевыделительная система, так как он способствует апоптозу человеческих почечных фибробластов и улучшает функцию почек; дыхательная система, использовалась для лечения астмы, бронхита, эмфиземы и проказы, в дополнение к противокашлевому эффекту [18]. Также при таких заболеваниях, как рак, противоречивые отчеты показывают, что он может уменьшать плевральный выпот у пациентов с раком легких. При воспалении амигдалин подавляет как его ответ в человеческих эпидермальных кератиноцитах, так и экспрессию TNF-α и IL-1β в LPS-обработанных клетках RAV 264.7. Кроме того, сообщалось, что амигдалин предотвращает аллоксан-индуцированный диабет [19].

Эндокринная система

Различные дозы амигдалина вызывали высвобождение эстрадиола-17β, но не прогестерона, овариальными гранулезными клетками в зависимости от дозы. Он также регулировал выработку стероидов в яичниках свиней. Более того, амигдалин входит в фармакологические компоненты сырых ингредиентов Keishi-bukuryo-gan, японского растительного лекарственного средства, используемого для индукции овуляции у женщин с бесплодием. Грубый компонент Keishi-bukuryo-gan влиял на стероидогенез в преовуляторных фолликулах и желтом теле в яичниках крыс как in vivo, так и in vitro. Следовательно, природное вещество в семенах горького миндаля может быть вовлечено в механизмы фолликулогенеза в яичниках кроликов через репрессию ФСГ [11,20]. Однако внутримышечное и пероральное применение амигдалина не оказывало значительного влияния на уровни в плазме некоторых эндокринных регуляторов (прогестерон, 17β-эстрадиол, тестостерон), щитовидной железы (трийодтиронин, тироксин, тиреотропный гормон), передних гипофизарных гормонов (пролактин, лютеинизирующий гормон) или среднюю массу тела кроликов, использованных в эксперименте [15].

Мочеполовая система

Блокирование фиброза при хроническом заболевании почек: Было доказано, что амигдалин обладает сильной антифибротической активностью и может использоваться для лечения пациентов с фиброзом почек. Поскольку культивированные интерстициальные фибробластные клетки при обработке амигдалином показали уменьшенную пролиферацию и продукцию трансформирующего фактора роста (TGF)-β1. Кроме того, в испытаниях на крысах с обструктивной нефропатией после обструкции мочеточника применение амигдалина немедленно устраняло накопление внеклеточного матрикса. Также на 21 день амигдалин уменьшал почечное повреждение в целом. Следовательно, амигдалин мог ослаблять активацию почечных фибробластов и интерстициальный фиброз почек у крыс [21].

Снижение роста рака мочевого пузыря: Было показано, что амигдалин может останавливать прогрессирование рака путем подавления cdK2 и циклина A. Поскольку амигдалин, зависимо от дозы, ингибировал рост и пролиферацию клеточных линий рака мочевого пузыря и значительно задерживал прогрессирование клеточного цикла с остановкой в фазе G0/G1. Кроме того, молекулярная оценка подразумевала уменьшенную фосфорилированную Akt, фосфоRictor и потерю компонентов CdK и циклина [22].

Индукция апоптоза в клетках рака шейки матки человека in vivo: Применение амигдалина останавливало рост ксенографтов клеток HeLa через апоптоз, так как он значительно ингибировал жизнеспособность клеточной линии HeLa при раке шейки матки. Используя иммуногистохимию, увеличенная активность каспазы-3 подтвердила развитие апоптоза в этих клетках. Дальнейшие исследования показали снижение антиапоптотического белка Bcl-2 и увеличение проапоптотического белка Bax в клетках HeLa, обработанных амигдалином, подразумевая процесс апоптоза [23].

Влияние на клеточный цикл рака простаты in vitro: С оптимальными результатами при 10 мг/мл амигдалин уменьшал рост опухолевых клеток и апоптоз PC3 и LNCaP, но не клеток DU-145 (которые являются классическими клеточными линиями рака простаты), полностью останавливая образование колоний в клеточных линиях. Он также демонстрировал высокую противоопухолевую активность как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-резистентных клеточных линиях PCa [24].

Кроме того, амигдалин значительно модулировал хемотаксис и адгезию андроген-резистентных клеточных линий рака простаты, DU-145 и PC3. Тем не менее, воздействие амигдалина привело к совершенно разным ответам в двух клеточных линиях. С одной стороны, в клеточной линии DU-145 амигдалин уменьшал взаимодействие опухоль-эндотелиальные клетки, адгезию к коллагену, хемотаксис и миграцию. С другой стороны, адгезия PC3 увеличивалась после 2-недельного длительного воздействия амигдалина [25].

Влияние на рак молочной железы in vitro

Амигдалин показал противоопухолевую активность против клеток рака молочной железы через их сенсибилизацию к окислительному стрессу in vitro. Также амигдалин вызывал дифференциальное ингибирование пролиферации клеточных линий рака молочной железы MCF-7 и T47D. Это дифференциальное ингибирование может быть связано с разницей в его способности сенсибилизации к окислительному стрессу. Следовательно, механизм действия амигдалина против клеток рака молочной железы в основном заключается в индукции окислительного стресса [26].

Дыхательная система

Амигдалин обладает противокашлевым и противоастматическим действием при условии, что он вводится перорально, потому что синильная кислота, образующаяся в результате гидролиза амигдалина, может подавлять дыхательный центр. Следовательно, уменьшать дыхательные движения. Кроме того, эксперимент на животных с респираторным дистресс-синдромом показал, что амигдалин может усиливать образование легочного сурфактанта и облегчать заболевание [16]. Кроме того, амигдалин обладает подавляющим действием на липополисахарид-индуцированное острое повреждение легких путем ингибирования путей передачи сигналов NF-kB (ядерный фактор каппа-легкая цепь-энхансер активированных B-клеток) и NLRP3 [19].

Более того, амигдалин может использоваться в качестве лекарственного средства для лечения ХОБЛ. Поскольку амигдалин, в определенной степени, мог ингибировать процесс эпителиально-мезенхимального перехода, индуцированного курением, как in vivo, так и in vitro. Этот эффект может быть связан со способностью амигдалина ингибировать как экспрессию TGF-β1, так и фосфорилирование smad2/3, что связано с ингибированием пути TGF-β/smad [27].

Влияние на пищеварительную систему

Когда крыс лечили перорально 500 мг/кг пепсинового гидролизата водного раствора миндаля на тетрахлориде углерода, действие пепсина ингибировалось бензальдегидом, полученным в результате распада амигдалина. Кроме того, уровень AST и ALT снижался, содержание гидроксипролина повышалось, и удлинение времени эуглобулинолиза уменьшалось. Также он мог уменьшать пролиферацию соединительной ткани печени крыс. Более того, амигдалин оказался эффективным лекарственным средством для лечения хронического гастрита и атрофического гастрита у крыс [16].

Кроме того, амигдалин обладал значительным защитным эффектом при хроническом повреждении печени у крыс. Более того, потребление амигдалина обращало вспять большинство патологических изменений LPS-индуцированного повреждения печени у крыс. Кроме того, благотворные эффекты амигдалина могут быть связаны с его сильным противовоспалительным действием и улучшением печеночной дисфункции через ингибирование путей передачи сигналов PI3K/AKT, JAK2/STAT3 и NF-kB [28].

Более того, амигдалин уменьшал продукцию воспалительных факторов фиброза поджелудочной железы и улучшал микроциркуляторные нарушения, ослабляя активацию звездчатых клеток поджелудочной железы. Вероятный механизм заключается в регуляции экспрессии ET-1 и CGRP in vivo [29].

Улучшение иммунной функции организма

Амигдалин мог значительно увеличивать полигидроксиалканоаты, которые стимулируют периферические кровяные T-лимфоциты к секреции IL-2 и IFN-y, а затем уменьшают секрецию TGF-β1. Более того, он усиливает экспрессию регуляторных T-клеток при лечении атеросклероза. Следовательно, амигдалин играет ценную роль в улучшении иммунной функции [16].

Влияние на нейродегенеративные заболевания

Согласно Cheng et al. [30], амигдалин играет положительную роль в лечении нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона, потому что он усиливает NGF-индуцированный рост нейритов, а также защищает клетки от нейротоксичности, вызванной 6-гидроксидофамином, путем индукции экспрессии кальретикулина.

Заключение

Амигдалин приобрел широкую популярность благодаря своей предполагаемой противораковой активности и природному присутствию в семенах многих фруктов. Поэтому теории пытались объяснить эту активность наличием определенного фермента в раковых клетках и его отсутствием в других нормальных клетках. Этот фермент расщепляет амигдалин на активное противораковое соединение - цианид. Несмотря на благотворное действие цианида против рака, он может вызывать множество вредных побочных эффектов и приводить к токсичности, особенно при пероральном приеме. Тем не менее, амигдалин показал другие благотворные эффекты на различные системы организма, помимо своей противораковой активности, такие как ингибирование почечного фиброза, противоастматическое действие, улучшение иммунной функции и антипаркинсонический эффект. Следовательно, амигдалин демонстрирует многообещающие результаты в качестве противоракового лечения, но с учетом его побочных эффектов необходимы соответствующие дозы и хорошее управление его вредными последствиями. Более того, необходимы дальнейшие исследования, чтобы найти способ, с помощью которого мы можем преодолеть эти побочные эффекты и обеспечить его безопасность в качестве надежного противоракового лечения.

Амигдалин как перспективный противораковый агент 

Оригинал статьи: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37762572/

Мария Спанудаки 1 2, София Стоумпу 1, Соусана К. Пападопулу 1, Димитра Карафиллаки 3, Эвангелос Соловос 4, Константинос Пападопулос 4, Анастасия Джаннакула 1 5, Константинос Гиагинис 6

 PMCID: PMC10531689

 DOI: 10.3390/ijms241814270

Уровень заболеваемости раком растет, и рак является одной из основных причин смерти во всем мире. Амигдалин, также известный как витамин B17 (и синтетическое соединение лаэтрил), представляет собой цианогенное гликозидное соединение, которое в основном содержится в ядрах и мякоти фруктов. Это соединение предлагалось на протяжении десятилетий как многообещающее природное вещество, которое может оказывать противораковое действие. Это всеобъемлющий обзор, который критически суммирует и анализирует имеющиеся исследования, изучающие противораковое действие амигдалина, подчеркивая его потенциальные противораковые молекулярные механизмы, а также необходимость нетоксичной формулы этого вещества. Глубокие исследования проводились с использованием самых точных научных баз данных, например, PubMed, Cochrane, Embase, Medline, Scopus и Web of Science, с применением эффективных, характерных и релевантных ключевых слов. Существует несколько доказательств, подтверждающих идею о том, что амигдалин может оказывать противораковое действие против рака легких, груди, простаты, колоректального рака, рака шейки матки и желудочно-кишечного тракта. Сообщалось, что амигдалин вызывает апоптоз раковых клеток, подавляя пролиферацию раковых клеток и замедляя метастатическое распространение опухоли. Однако было проведено лишь несколько исследований на животных моделях in vivo, а клинических исследований еще меньше. Текущие данные не могут подтвердить рекомендацию использования пищевых добавок с амигдалином из-за его циано-группы, которая вызывает неблагоприятные побочные эффекты. Предварительные данные показали, что использование наночастиц может быть многообещающей альтернативой для усиления противоракового действия амигдалина при одновременном снижении его неблагоприятных побочных эффектов. Амигдалин, по-видимому, является многообещающим природным агентом против развития и прогрессирования раковых заболеваний. Однако существует большая потребность в исследованиях на животных in vivo, а также в клинических исследованиях на людях для изучения потенциальной эффективности профилактики и/или лечения амигдалином рака. Более того, амигдалин может быть использован в качестве ведущего соединения путем эффективного применения последних разработок в процессах разработки лекарств.

Ключевые слова: амигдалин; противораковые эффекты; противораковые молекулярные механизмы; апоптоз; рак; пролиферация раковых клеток; открытие лекарств; лаэтрил; наночастицы; пищевые добавки; витамин B17.

Определение цитотоксического эффекта амигдалина в клеточной линии DLD-1 и антицитотоксического эффекта в клеточной линии CCD-18CO

 Год 2022 , Том: 44 Выпуск: 4, 377 - 383, 31.12.2022

Альпаслан Озтюрк  , Айбюке Афра Кескинер , Берна Коджаман , Эдже Авулоглу Йылмаз

https://doi.org/10.7197/cmj.1185366

Абстрактный

Цель: Амигдалин, который является частью ароматической цианогенной гликозидной группы, содержится в семенах растений, таких как абрикос, персик, слива, яблоко, груша и вишня. Было показано, что амигдалин обладает противоопухолевыми свойствами против многих видов рака, таких как рак толстой кишки, молочной железы и легких. Целью данного исследования было определение цитотоксического и антицитотоксического действия амигдалина на клетки рака толстой кишки человека (DLD-1) и нормальный эпителий толстой кишки (CCD-18Co) с использованием теста MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-YL)-2,5-дифенилтетразолий бромид).
Материалы и методы: Клетки DLD-1 и CCD-18Co выращивали в колбах, содержащих Roswell Park Memorial Institute-1640 и минимальную необходимую среду Игла соответственно. Обе группы клеток обрабатывали концентрациями амигдалина 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 и 1,56 мМ в течение 24 часов. Затем в лунки аспирированных планшетов добавляли 20% красителя МТТ и инкубировали в течение 3 часов. После остановки реакции чистым диметилсульфоксидом (ДМСО) в конце периода значения поглощения планшетов считывали спектрофотометрически при длине волны 570 нм.
Результаты: значения процента жизнеспособности для линии клеток DLD-1 были обнаружены в диапазоне 48,3–71,6%, а значение IC50 было рассчитано как 74,03 мМ. Значения жизнеспособности для линии клеток CCD-18Co после обработки амигдалином варьировались от 101,6 до 117,9%.
Заключение: В то время как амигдалин показал цитотоксический эффект в клеточной линии DLD-1, он показал антицитотоксический эффект в клеточной линии CCD-18Co. В нашем исследовании было установлено, что амигдалин снизил жизнеспособность раковых клеток DLD-1 дозозависимым образом и не показал цитотоксического эффекта на нормальные эпителиальные клетки CCD18-Co. Необходимы более комплексные контролируемые клинические испытания, чтобы продемонстрировать возможность использования амигдалина в сочетании с другими противоопухолевыми препаратами и разработать искусственный синтез активных ингредиентов в амигдалине с целью повышения противоопухолевой активности этих препаратов.

Ключевые слова

Амигдалин, Лечение рака, Культура клеток, Рак толстой кишки, Витамин В17, Амигдалин, Лечение рака, Клеточная культура, Рак толстой кишки, Витамин B17

Ссылки

• 1. Herbst MC. Ассоциация по борьбе с раком Южной Африки (CANSA). Информационный бюллетень о десяти основных видах рака в каждой группе населения. 2015 г. https://www.compcom.co.za/wp-content/uploads/2020/03/Fact-Sheet-on-Cancer-of-an-Unknown-Primary-CUP.pdf.
• 2. Африн С., Джампьери Ф., Гаспаррини М., Форбс-Эрнандес Т.Й., Варела-Лопес А. и др. Химиопрофилактические и терапевтические эффекты съедобных ягод: фокус на профилактике и лечении рака толстой кишки. Molecules. 2016; 21(169):1 – 41.
• 3. Хаксли Р.Р., Ансари-Могаддам А., Клифтон П., Чернихов С., Парр К.Л. и др. Влияние факторов риска, связанных с питанием и образом жизни, на риск колоректального рака: количественный обзор эпидемиологических данных. Int J Cancer. 2009;125(1):171 – 80.
• 4. Котеча Р., Таками А., Эспиноза Дж. Л. Фитохимические вещества в рационе и химиопрофилактика рака: обзор клинических данных. Oncotarget 2016; 7(32):52517–29. Doi: 10.18632/oncotarget.9593.
• 5. Ван Дж., Цзян Й. Ф. Природные соединения как противораковые агенты: экспериментальные данные. World J Exp Med 2012; 2(3):45–57.
• 6. Аббуд ММ, Аль Авайда В, Альхатиб ХХ, Абу-Айяд А.Н. Противоопухолевое действие амигдалина на клетки рака молочной железы человека путем селективной сенсибилизации к окислительному стрессу. Nutr Cancer. 2019;71(3):483-490. doi: 10.1080/01635581.2018.1508731.
• 7. Сириша Д., Редди Б.С., Реджинальд БА, Самата М., Камал Ф. Влияние амигдалина на линию клеток рака полости рта: исследование in vitro. J Oral Maxillofac Pathol. 2019; 23(1): 104–107.
• 8. Santos Pimenta LP, Schilthuizen M, Verpoorte R, Choi YH. Количественный анализ амигдалина и пруназина в Prunus serotina Ehrh. с использованием (1) спектроскопии ЯМР-Н. Phytochem Anal 2014; 25:122–126. https://doi.org/10.1002/pca.2476.
• 9. Owa C, Messina ME, Halaby R, Halaby R. Триптолид индуцирует лизосомально-опосредованную запрограммированную клеточную смерть в клетках рака груди MCF-7. Int J Womens Health 2013; 5:557–569. doi.org/10.2147/IJWH.S44074.
• 10. Ши Дж., Чэнь Цюй, Сюй М., Ся Цюй, Чжэн Т. и др. Последние обновления и будущие перспективы относительно амигдалина как потенциального противоракового средства: обзор. Cancer Medicine 2019; 8(6), 3004-3011.
• 11. Lea MA, Koch MR. Влияние цианата, тиоцианата и амигдалина на поглощение метаболитов в нормальных и опухолевых тканях крыс. J Natl Cancer Inst. 1979;63(5):1279‐1283.
• 12. Шаки Ф., Сабери-Хасанабади П. Фармакологическая активность и токсикологические эффекты амигдалина: обзор. Фармацевтические и биомедицинские исследования 2022; 8(1), 1-12.
• 13. Сюй С, Сун З. Расширенные исследования противоопухолевых эффектов амигдалина. J Cancer Res Ther 2014; 1:3-7. doi.org/10.4103/0973-1482.139743.
• 14. Keydar I, Chen L, Karby S, Weiss FR, Delarea J, et al. Создание и характеристика линии клеток происхождения человеческой карциномы молочной железы. Eur J Cancer 1979; 15, 659–670.
• 15. Chang HK, Shin MS, Yang HY, Lee JW, Kim YS и др. Амигдалин индуцирует апоптоз посредством регуляции экспрессии Bax и Bcl-2 в клетках рака простаты человека DU145 и LNCaP. Biol Pharm Bull 2006; 8: 1597–1602.
• 16. Пак Х.Дж., Юн Ш.Х., Хан Л.С., Чжэн Л.Т., Юнг К.Х. и др.: Амигдалин ингибирует гены, связанные с клеточным циклом в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4. World J Gastroenterol 2005; 11: 5156–5161.
• 17. El-Kholy WB, Abdel-Rahman SA, Abd El-Hady El-Safti FEN, Issa NM. Влияние витамина B17 на экспериментально вызванный рак толстой кишки у взрослых самцов белых крыс. Folia Morphol (Warsz) 2021; 80(1): 158–169 DOI: 10.5603/FM.a2020.0021.
• 18. Cassiem W, Kock M. Антипролиферативное действие экстрактов абрикосовых и персиковых косточек на клетки рака толстой кишки человека in vitro. BMC Complement Altern Med. 2019; 19(1): 32. doi: 10.1186/s12906-019-2437-4.
• 19. Димитров М., Илиев И., Бардаров К., Георгиева Д., Тодорова Т. Фитохимическая характеристика и биологическая активность экстракта абрикосовых косточек в тестах на основе дрожжевых клеток и клеточных линиях гепатоцеллюлярной и колоректальной карциномы. J Ethnopharmacol. 2021 28 октября; 279:114333. https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.114333.
• 20. Макаревич Дж., Рутц Дж., Юнгель Э., Каульфусс С., Цаур И. и др.: Амигдалин влияет на адгезию и инвазию клеток рака мочевого пузыря in vitro. PLoS One 2014; 9: e110244.
• 21. Квон ХЙ, Хонг СП, Хан ДХ и Ким ДЖХ: Индукция апоптоза экстракта семени персика в клетках промиелоцитарного лейкоза человека (HL-60). Arch Pharm Res 2003; 26: 157–161.
• 22. Qian L, Xie B, Wang Y, Qian J. Амигдалин-опосредованное ингибирование инвазии клеток немелкоклеточного рака легких in vitro. Int J Clin Exp Pathol 2015; 8:5363–5370
• 23. Кадир М., Фатима К. Обзор фармакологической активности амигдалина. Arch Cancer Res 2017; 5: 10–12.
• 24. Jucaa M, Bandeira B, Carvalho D, Leal AT. Сравнительное исследование 1,2-диметилгидразина и азоксиметана по индукции колоректального рака у крыс. J Coloproctol. 2014; 34(3): 167–173. doi: 10.1016/j.jcol.2014.06.003.
• 25. Chari KY, Polu PR, Shenoy RR. Оценка экстракта семян тыквы при раке толстой кишки, вызванном 1,2-диметилгидразином у крыс Wistar. J Toxicol. 2018; 6086490, doi: 10.1155/2018/6086490.
• 26. Chen Y, Ma J, Wang F, Hu J, Cui A и др. Амигдалин индуцирует апоптоз в клетках линии HeLa рака шейки матки человека. Immunopharmacol Immunotoxicol 2013; 35(1): 43–51. doi: 10.3109/08923973.2012.738688.
• 27. Newmark J, Brady RO, Grimley PM, Gal AE, Waller SG и др. Амигдалин (Laetrile) и пруназин бетаглюкозидазы: распределение в безмикробных крысах и в опухолевой ткани человека. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 6513-6516.

Показать меньше ссылок

Воспаление, его регуляция и противовоспалительное действие цианогенного гликозида амигдалина

Кафедра физиологии животных, факультет биотехнологии и пищевых наук, Словацкий сельскохозяйственный университет в Нитре, Триеда Андрея Глинку 2, 949 76 Нитра, Словакия*Автор, которому должна быть адресована корреспонденция.Молекулы 2021, 26(19), 5972; https://doi.org/10.3390/molecules26195972Заявка получена: 13 июля 2021 / Исправлено: 27 сентября 2021 / Принята к печати: 29 сентября 2021 / Опубликован: 1 октября 2021

Абстрактный

Воспалительная реакция частично или полностью сопровождает любой патологический процесс в васкуляризированной многоклеточной. Эта сложная реакция контролируется регуляторными механизмами, некоторые из которых вызывают неприятные симптоматические проявления воспаления. Поэтому были предприняты усилия по разработке селективных препаратов, направленных на устранение боли, лихорадки или отека. Постепенно, однако, стали очевидны серьезные неблагоприятные побочные эффекты таких ингибиторов. Поэтому научные исследования продолжают изучать новые возможности, в том числе природные вещества. Амигдалин является цианогенным гликозидом, присутствующим, например, в горьком миндале. Этот гликозид уже вызвал множество дискуссий среди ученых, особенно о его противораковом потенциале и связанных с ним токсичных цианидах. Однако токсичность при разных дозах делала его в целом неприемлемым. Хотя амигдалин, принимаемый в правильной пероральной дозе, может не привести к отравлению, он еще не был точно количественно определен, поскольку на его действие часто влияют различные кишечные микробные консорциумы. Его фармакологическая активность была изучена, но его влияние на воспалительную реакцию организма отсутствует. В этом обзоре обсуждается химическая структура, токсичность и современные знания о молекулярном механизме влияния амигдалина на иммунные функции, включая противовоспалительный эффект, а также обсуждается воспаление как таковое, его медиаторы с различными функциями, на которые обычно нацелены лекарства.Ключевые слова: амигдалин; токсичность цианида; воспаление; медиаторы воспаления

1. Введение

За последние два десятилетия одним из ключевых открытий в области медицины стало открытие того, что воспаление является не только частью некоторых конкретных расстройств, но частично или полностью вовлечено в широкий спектр заболеваний психического или физического происхождения, и эти проблемы со здоровьем являются одними из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности в настоящее время [1]]. Воспаление — это биологическая защитная реакция васкуляризированных тканей многоклеточных организмов на раздражитель, такой как чужеродный патоген или повреждение внутренних тканей [2]. Арахидоновая кислота, как один из ключевых регуляторов воспаления, может модулировать его течение через продукты отдельных ферментативных путей [3]. Метаболиты арахидоната представляют собой многоступенчатое решение причины, но также и болезненные сопутствующие симптомы, в зависимости от ферментативного пути, из которого они происходят [4]. Поэтому фармакологические и медицинские исследования все чаще обращают свое внимание на препараты, способные влиять на воспаление, особенно на уровне метаболитов симптоматического пути циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) [5].Предметом интереса подобных исследований и данного обзора является природный цианогенный продукт амигдалин. За последние десять лет исследования цианогенных гликозидов резко возросли. Цитотоксическое действие амигдалина на раковые клетки in vitro и распределение амигдалина в растениях, которые обычно употребляются в рационе человека, являются двумя наиболее популярными темами исследований. Этот биоактивный гликозид естественным образом встречается в органических источниках, например, в миндале с горьким вкусом, персиковых косточках, абрикосах или сливах [6,7]. Его присутствие в семенах ядер оценивается примерно у 800 растений [8]. Однако мы не относим его к современному соединению, так как он веками использовался в традиционной и альтернативной медицине благодаря своим многочисленным лечебным свойствам [9,10]. Она предложила помощь в облегчении боли; лихорадка; или подавление кашля, жажды и тошноты, а позже в качестве профилактики и лечения рака [7,11].Однако, в дополнение ко всем сообщенным эффектам амигдалина, его токсичность из-за цианистого водорода, который выделяется в основном при столкновении с желудочным ферментом β-глюкозидазой [12], остается спорной темой в научных кругах и угрожает жизнеспособности клеток в определенных концентрациях [13]. В таблице 1 представлены метаболиты, побочные эффекты, лечение передозировкой и фармакологическая функция амигдалина.Таблица 1. Метаболиты амигдалина, побочные эффекты, лечение передозировки и фармакологическая функция.

2. Амигдалин

2.1. Химия амигдалина

Амигдалин (AMG) является представителем органических соединений цианогенных гликозидов с молекулярной формулой C20H27НЕТ11 (Рисунок 1) и молекулярной массой 457,42 г.моль−1. Амигдалин состоит из бензальдегида, синильной кислоты и двух молекул глюкозы (d-манделонитрил-β-d-глюкозид-6-β-глюкозид) [14]. Впервые он был выделен из горького миндаля Робике и Бутрон-Шарларом в 1930-х годах, а позже было обнаружено, что он встречается в природе в качестве цианогенного гликозида в плодах и семенах абрикосов, персиков, горьковатого миндаля, черной вишни, слив, яблок и т. д. [15,16]. Многолетние исследования эффектов амигдалина продемонстрировали его широкий спектр свойств, включая его поддерживающую функцию при лечении астмы, бронхита, проказы или колоректального рака. Амигдалин также характеризуется обезболивающим эффектом, в котором бензальдегид является важным компонентом [14,17,18]. Противоопухолевая активность амигдалина до сих пор вызывает споры и является предметом многочисленных исследований. Эта способность может быть связана с ферментативным гидролизом, который приводит к выделению синильной кислоты [19]. Амигдалин также отождествляется с терминами «амигдалин» и «витамин В17», но оба термина неправильно используются в отношении амигдалина [20].Рисунок 1. Химическая структура амигдалина [21].

2.2. Токсичность амигдалина

Метаболизм препарата или любого чужеродного вещества, поступающего в организм, зависит от просвета желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), кишечника и кишечных микробов, особенно при пероральном приеме [22]. β-глюкозидаза — это фермент, присутствующий в кишечнике, который высвобождает глюкозу путем гидролиза гликозидной связи между сахарной и бензиловой группами. Смерть из-за токсичности цианида вызвана вмешательством цианида в утилизацию кислорода в митохондриях, что приводит к клеточной гипоксии и лактатацидозу. Это связано с тем, что он связывается с ионом железа, присутствующим в цитохромоксидазе, ингибируя транспорт электронов и окислительный метаболизм [23,24].Конечные продукты ферментативной гидролизации амигдалина — бензальдегид вместе с цианистым водородом — отвечают за горький аромат и вкус амигдалина во фруктах и приводят к указанной токсичности амигдалина, а также влияют на активность пепсина при пероральном приеме [25,26]. Тем не менее, результаты цитотоксичности Choi и его команды [27] показали, что амигдалин сам по себе не токсичен после инкубации в течение 24 ч, но показал цитотоксичность с точки зрения ингибирования пролиферации клеток, генерации активных форм кислорода (АФК) и индукции апоптоза (рис. 2) только после лечения β-глюкозидазой. Таким образом, амигдалин представляет высокий риск, особенно при пероральном приеме [28], поскольку цианид выделяется в гораздо больших количествах после перорального приема, чем при внутривенном введении, не только из-за быстрого действия кишечной микрофлоры [29], но и из-за жевания или измельчения [30]. Растения, содержащие амигдалин, также включают отделенные β-гликозидазы, которые смешиваются при жевании [31].Рисунок 2. Апоптотический эффект амигдалина через несколько клеточных сигнальных путей. Амигдалин активирует p38MAPK, который влияет на стимулы смерти, активирует апоптотические белки Bax и ингибирует антиапоптотические белки Bcl-2. Белки, связанные с апоптозом, индуцируют пермеабилизацию митохондриальной наружной мембраны (MOMP), решающее событие в процессе высвобождения цитохрома с. Активация высвобождения цитохрома с в качестве митохондриального ответа на проапоптотические стимулы через митохондриальный или внутренний апоптотический путь в конечном итоге приводит к активации каспаз, включая каспазу-3, которая индуцирует апоптоз. Амигдалин вызывает перепроизводство АФК, что нарушает окислительный баланс и в конечном итоге приводит к апоптозу. Амигдалин подавляет циклин-зависимую киназу 2 (CDK2) и циклин А, что индуцирует остановку клеточного цикла в фазах G0/G1. Амигдалин также ингибирует перенос клеток из G1 в S-фазу, что приводит к ингибированию пролиферации и роста клеток. «Активация» обозначена красными стрелками, а «торможение» — черными стрелками. Взято из Pharmaceuticals с разрешения авторов [51].Шим и Квон [32] наблюдали метаболизм перорально вводимого амигдалина в смоделированной культуре желудочно-кишечных клеток и обнаружили, что он разлагается сначала до пруназина, а затем до манделонитрила под действием β-глюкозидазы, а затем гидроксилируется до гидроксиманделонитрила в тонком кишечнике. На этой стадии цианид или бензальдегид не выделялся, что указывает на то, что цианид, вероятно, вырабатывается в нижних отделах кишечника, которые богаты бактериальной микрофлорой. Firmicutes, Bacteroidetes, и Actinobacteria являются основными группами бактерий, которые способствуют высвобождению цианида в кишечнике. Смертельные пероральные дозы (ЛД50) для цианида составляют 2,13–6 mg.kg−1 массы тела, и было подтверждено, что из 1 г амигдалина высвобождается 59 мг цианида [24,33]. Однако, основываясь на имеющихся рецензируемых отчетах Makarevic et al. [34], высокоочищенный амигдалин применяли в «терапевтических» концентрациях (перорально 0,6~1 g.kg−1) вряд ли вызовет токсичность [18,35]. Скорее всего, отравление цианидом связано с передозировкой, дальнейшим приемом абрикосовых косточек или дополнительным поступлением витамина С в мегадозах, который, как известно, увеличивает in vitro превращение амигдалина в цианид. Sahin et al. (2011) и Sauer at el. (2015) сообщили, что у детей в возрасте 2 и 4 лет 500 мг амигдалина вызывали рвоту, апатию, диарею, ускоренное дыхание и концентрацию цианида в крови 163 мкг/л [26,36]. У взрослой женщины 9 г амигдалина вызывали рвоту, головокружение и концентрацию цианида в крови 143 мкг/л [37].

Лечение токсичности цианида

В анамнезе чрезмерное употребление амигдалина много раз проявлялось в гипотензии, параличе, коме и даже смертельном отравлении цианидом, хотя в растительном царстве цианогенные гликозиды выполняют полезную защитную функцию. В долгосрочной перспективе прием таких веществ часто сопровождается тревогой, головной болью, головокружением или даже спутанностью сознания [37,38].Роданец – фермент, присутствующий у млекопитающих в митохондриях печени, основная функция которого заключается в том, чтобы действовать в процессе превращения высокотоксичного цианида в менее токсичный тиоцианат в оптимальной среде pH = 8. После этого он проявляет свой так называемый «пинг-понговый» механизм действия, при котором роданец впоследствии высвобождает водорастворимое тиоцианатное соединение, выводимое через почки из организма через мочу из компетентного субстрата путем присоединения атома серы при добавлении цианидной группы (ЦН). Однако аскорбиновая кислота (витамин С), йод, аллоксан, перекись водорода или меркаптаны могут ингибировать эту активность [37,38,39].В случае отравления цианидом следует провести анализ газов артериальной крови для быстрой и эффективной диагностики с последующим соответствующим лечением [40]. Распространенным является прием Цианокита, который представляет собой гидроксикобаламин, не вызывающий клинически значимых побочных эффектов, за исключением хроматурии и покраснения кожи. Кобаламин, или витамин B12, используется для этой цели из-за его способности хелатировать токсичное цианистое соединение из-за его более высокой связывающей активности отдельно или в сочетании с тиосульфатами, запуская вышеупомянутый роданский путь. Витамин В12 также может применяться для детоксикации с образованием циангидрина, эндогенного α-кетоглутарата, который является поглотителем азота, и источника глутамата и глутамина, который способствует синтезу белка и предотвращает деградацию белка в мышцах, которые могут детоксицировать цианид с образованием α-кетоглутарата циангидрина [41]. Пробиотики до сих пор обсуждались, поскольку они помогают подавить β-глюкозидазу-продуцирующие бактериальные штаммы, которые расщепляют амигдалин до цианида, но этот метод недостаточно изучен [22,42,43,44,45,46,47].

3. Элементарные процессы при воспалении

Болезни очень разнообразны. Они не имеют единой причины, и они не влияют на один орган или тип клеток. Это разнообразие породило воспаление как защитную реакцию, которая «подходит» для лечения различных заболеваний, и поэтому воспаление активируется самыми разными расстройствами и травмами. Иногда организм задействует единственную часть этой универсальной защитной реакции. Его чрезмерная активация или аномальная регуляция также повреждает его клетки и системы. Первоначально этот процесс также считался в основном вредной реакцией. Однако в последние годы были уточнены основные молекулярные и клеточные механизмы, участвующие в воспалении, а также их взаимодействие [52,53].В настоящее время функцию воспаления обычно определяют как защитную реакцию многоклеточных васкуляризированных организмов на стимуляцию атакой патогенов или эндогенных сигналов, таких как поврежденные клетки, приводящая к устранению первоначальной причины повреждения, удалению некротических клеток и восстановлению тканей [54]. Согласно анализу данных, хроническое воспаление связано с сердечными заболеваниями, диабетом, раком, артритом и заболеваниями кишечника, такими как болезнь Крона и язвенный колит. Проказа, астма, эмфизема, бронхит, витилиго и колоректальный рак лечатся амигдалином [33,56].Воспаление является ключевым аспектом реакции тканей на вредные воспалительные вещества. Однако в рамках этого защитного процесса также образуются очень эффективные токсичные вещества, которые, хотя и являются основой защиты от чужеродных вредных форм, также могут повреждать окружающие их структуры. Таким образом, их формирование не только находится под строгим регуляторным контролем, но и с началом воспалительной реакции активизируются противовоспалительные механизмы, что снижает риск повреждения их тканей [53].В этом сложном ответе участвуют лейкоциты, такие как макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты, также известные как воспалительные клетки. В ответ на воспалительный процесс эти клетки выделяют специализированные вещества, в состав которых входят вазоактивные амины и пептиды, эйкозаноиды, провоспалительные цитокины и белки острой фазы, которые опосредуют воспалительный процесс, предотвращая дальнейшее повреждение тканей и, в конечном итоге, приводят к заживлению и восстановлению функции [57].Арахидоновая кислота (АК), полиненасыщенная жирная кислота, ковалентно связанная в этерифицированной форме, присутствует в большинстве клеточных мембран организма [3] и высвобождается цитозольной фосфолипазой А2α (cPLA2α). cPLA2α является повсеместно специфичным и конститутивно экспрессируется в двух клетках и тканях, при этом его активация инициируется субмикромолярными концентрациями кальция и фосфорилированием [58]. После расщепления из клеточной мембраны этим раствором арахидоновая кислота метаболизируется двумя основными путями: циклооксигеназой (ЦОГ-1, ЦОГ-2 и ЦОГ-3), что приводит к образованию простаноидов-простагландинов, простациклинов и тромбоксанов, и липоксигеназным путем (LOX), который приводит к образованию лейкотриенов и липоксинов [2,53]. Циклооксигеназы (ЦОГ) 1, 2 и 3 представляют собой специфические изоформы, хотя существуют значительные различия в их распределении в организме и физиологической и патофизиологической активности. ЦОГ-3 является последним из обнаруженных, и его точное функциональное значение до сих пор полностью не выяснено. ЦОГ-1 и ЦОГ-2 демонстрируют примерно 60% последовательной идентичности [59], состоящей из длинного узкого липофильного канала со шпилькой на его конце [60]. Тем не менее, ЦОГ-1, присутствующий в низких концентрациях во всех клетках и конститутивно зависящий от циркулирующих гормонов, продуцирует простагландины, обеспечивая определенные гомеостатические функции, такие как поддержание нормальной слизистой оболочки желудка, влияние на почечный кровоток и снижение пролиферации гладкомышечных клеток, тем самым внося значительный вклад в защиту миокарда [61,62,63]. Напротив, фермент ЦОГ-2, как важный компонент воспалительного каскада, принимает активное участие в производстве простагландинов, которые опосредуют боль и воспаление за счет увеличения проницаемости сосудов [64], обеспечивая экстравазацию провоспалительных клеток, белков и ферментов, которые опосредуют реакции, приводящие к отеку [65]. Простагландины также сенсибилизируют болевые волокна к механическим и химическим раздражителям [66]. Концентрации ЦОГ-2, а также ее метаболитов в макрофагах, моноцитах, эндотелиальных клетках и фибробластах могут быть увеличены до 20 раз при воспалительных раздражителях за счет действия провоспалительных цитокинов фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) и интерлейкина (IL-1 и IL-6), где различные транскрипционные факторы приводят к передаче ядерного сигнала [61].

3.1. Пути ЦОГ-1 и ЦОГ-2

Циклооксигеназа или простагландин-Н-синтаза (ПГГ) — бифункциональный фермент с циклооксигеназой и пероксидазной активностью. Он циклизируется путем вставки двух молекул кислорода AA с образованием циклического простагландина G2 (ПГГ2), который впоследствии превращается в результате реакции пероксидазы в гидроксиэндопероксид простагландин Н2 (ПГХ2) [67]. Он дает образование специфическими ферментативными реакциями клеток не только к простагландинам D2, E2, и F2-α но, также, к простациклину (ЗГУ2) и тромбоксан (TXA2), которые выступают в качестве рецептор-зависимых медиаторов и внутриклеточных вторичных мессенджеров [68]. Дефицит ЦОГ приводит к неравновесным концентрациям этих эйкозаноидов, принося благоприятные и неблагоприятные физиологические условия в организм человека [69,70], поэтому важно исследовать путь для понимания таких эффектов ингибирования ЦОГ.Первая изоформа ЦОГ-ЦОГ-1 была впервые выделена из бычьих везикулярных желез в 1976 г. научным коллективом под руководством Миямото [71], а впоследствии, в 1989 г., Simmons et al. обнаружили ЦОГ-2 из фибробластов куриных эмбрионов [72]. Различные научные исследования показывают, что эти две изоформы сходны по структуре, но функционируют как разные ферменты, присутствующие в эндоплазматическом ретикулуме — в случае ЦОГ-1 [73] и перинуклеарной оболочки — ЦОГ-2 [74]. В исследовании Feletou, Huang, and Vanhoutte [75] они сравнили эти два пути, отметив, что ЦОГ-1 ферментативно обрабатывает АК, но ЦОГ-2 использует 2-арахидонилглицерин в качестве субстрата в дополнение к АА, в результате чего образуются вторые упомянутые продукты, на которых синтез ЦОГ-1 не может работать. Таким образом, доступность предшественников и кинетика этих ферментов являются существенными факторами, определяющими регуляцию отдельных реакций [76].

Селективность между ЦОГ-1 и ЦОГ-2 и действие неселективных лекарственных средств

В частности, ЦОГ-1 и ЦОГ-2 являются гомодимерами, состоящими из трех доменов: эпидермального домена, подобного фактору роста, мембрансвязывающего домена и каталитического домена, который содержит как ЦОГ, так и активный центр пероксидазы [77]. Эти две ферментативные изоформы отличаются 120-й аминокислотой. В то время как ЦОГ-1 имеет изолейцин, ЦОГ-2 использует меньший валин в качестве заменителя, создавая меньшую боковую папку, с которой многие препараты связываются в рамках своего избирательного действия в воспалительном процессе [60].Неизбирательное действие нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) имеет общую цель в ингибировании циклооксигеназы без различия, когда необходимые симптоматические проявления воспаления (боль, отек и лихорадка) предотвращаются, но при этом возникают некоторые неблагоприятные побочные эффекты. Таким образом, простагландины в желудочно-кишечном тракте могут поддерживать физиологические реакции гидрофобной воздушной секреции на эпителиальные поверхностные клетки или поддержание мембраны эпителиальных клеток [78]. Поэтому, после открытия двух изоформ этого фермента, пришло время протестировать препараты с селективным эффектом, надеясь предотвратить подобные негативные побочные эффекты.Тем не менее, некоторые исследования, например, Aid и Bosetti [59], представили убедительные доказательства негативных эффектов селективного ингибирования как ЦОГ-1, так и ЦОГ-2. ЦОГ-2 был обнаружен в коре головного мозга, гиппокампе и миндалевидном теле с нейронными и сосудистыми ассоциациями и, как известно, использует пространственное обучение in vivo. Было показано, что традиционные противовоспалительные препараты, действующие на его путь, своим ингибирующим эффектом увеличивают риск развития серьезных сердечно-сосудистых побочных эффектов, увеличения атеротромботических событий, в результате чего даже такие селективные ингибиторы ЦОГ-2 впоследствии были изъяты с фармацевтического рынка [79,80].Наконец, такие неблагоприятные побочные эффекты привели к поиску других методов лечения, основанных на генной или цитокиновой терапии, а также к исследованиям других природных противовоспалительных препаратов, которые могут быть альтернативой доступным препаратам, таким как предмет данного обзора — цианогенный гликозид амигдалин.

4. Медиаторы воспаления

Адаптивная воспалительная реакция на стимулы экзогенного или эндогенного происхождения (микробы, аллергены, стрессовые, дисфункциональные, мертвые клетки и др.) представляет собой целую сеть клеточных и молекулярных взаимодействий [57], которые можно разделить на четыре стадии: индукторы, сенсоры, медиаторы и эффекторы [81]. Это процесс, при котором индуктивные воспаления после их распознавания сенсорами (специфическими трансмембранными рецепторами распознавания образов — PRR) [82] запускают образование многих медиаторов воспаления, что впоследствии изменяет функциональность тканей и органов хозяина, особенно сосудистую сеть и мобилизацию эффекторов или изменение физического положения лейкоцитов [83]. Их масштаб не всегда только локальный; Они могут действовать и в более отдаленных местах [40]. Эти растворимые молекулы секретируются нейтрофилами, макрофагами, базофилами, эозинофилами, тучными клетками, хелперными и цитотоксическими Т-лимфоцитами, а также тромбоцитами и эндотелиальными клетками [84].Биохимический аспект диффузионных медиаторов воспаления позволяет провести следующее деление [53]:

• Провоспалительные цитокины (интерлейкины и факторы некроза опухоли) — гликопротеины, мобилизующие лейкоциты и эндотелиальные клетки, обеспечивают острую фазу.
• Эйкозаноиды — липидные метаболиты арахидоновой кислоты.
• Хемокины — стимуляция хемотаксиса лейкоцитов.
• Вазоактивные амины (гистамин и серотонин) — причина вазоконстрикции/вазодилатации, которая может увеличить проницаемость сосудов.
• Вазоактивные пептиды (брадикинин, калликреин и кинин) — увеличение проницаемости сосудов, боль и стимуляция метаболизма арахидоновой кислоты.
• Протеолитические ферменты (эластаза и матриксные металлопротеиназы) — сотрудничество в уничтожении фагоцитированных микробных частей и пополнении лейкоцитов.
• Части комплемента (C3a и C5a) — активация тучных клеток, базофилов и тромбоцитов; Они химотактически и анафилатоксически активны.

Существует достаточно доказательств того, что определенные группы цитокинов участвуют не только в инициации, но и в стойкости патологической боли путем прямой активации ноцицептивных сенсорных нейронов, а также в центральной сенсибилизации, вызванной повреждением нерва или воспалением, тем самым способствуя этиологии различных патологических болевых состояний [85, 86]. Поскольку до сих пор известный механизм противовоспалительного действия амигдалина заключается в избирательном ингибировании метаболитов арахидоновой кислоты, а также в блокировании транскрипции цитокинов, мы рассмотрим их подробнее.

4.1. Медиаторы воспаления: метаболиты эйкозаноидов арахидоновой кислоты

Эти липидные медиаторы образуются из 20 углеродных жирных кислот веществами циклооксигеназы и липоксигеназы, причем арахидоновая кислота является наиболее распространенным субстратом из-за ее присутствия в воспалительных клетках фосфолипидной мембраны в значительно больших количествах, чем другие потенциально подходящие полиненасыщенные жирные кислоты [87,88]. Однако некоторые исследования указывали на снижение выработки эйкозаноидов на основе арахидоновой кислоты при приеме внутрь рыбьего жира, содержащего эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК), которая может частично замещать АК в воспалительных клеточных мембранах [89].Эйкозаноиды арахидоновой кислоты в совокупности представляют собой категорию простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов и липоксинов, которые являются важными медиаторами воспаления, различных иммунных процессов, даже рака, и хронического ремоделирования тканей. Хотя, с другой стороны, их эффекты представляют собой такие биологические активности, как поддержание гомеостаза тканей, сокращение гладкой мускулатуры или агрегация тромбоцитов [90]. Эта самая большая группа тканевых гормонов имеет множество измененных структур и функций, в зависимости от образца (моно или ди); позиция (5, 8, 12 или 15); и стереоспецифичность (R/S) включения кислорода в основание субстрата. Тип рецептора, экспрессируемого на соответствующей поверхности клетки, также имеет решающее значение [91]. В нормальном состоянии клеток эйкозаноиды образуются в небольших концентрациях, а последующая апрегуляция происходит в основном после стимуляции воспаления [92]. Это увеличивает экспрессию микросомальных простагландинов Е-синтазы-1 и ЦОГ-2, которые ускоряют биосинтез простагландинов и тромбоксана из арахидоновой кислоты [93,94]. Хотя эйкозаноиды имеют короткий период полураспада, они участвуют во многих биологических активностях паракринным или аутокринным образом. Они играют решающую двойную роль в регулировании врожденного иммунитета и устранении воспаления через семь трансмембранных доменов рецепторов, сопряженных с G-белком, обнаруженных на других клетках. Эйкозаноидные рецепторы контролируют высвобождение вторичных мессенджеров, таких как циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), диацилглицерин и инозитол-1,4,5-трифосфат, которые опосредуют многие из их клеточных эффектов. Первая из этих ролей — когда ткани воспалены или инфицированы; В дополнение к боли и отеку, метаболиты АА усиливают воспалительные сигналы для мобилизации лейкоцитов, иммунных клеток помогают с резистентностью и устраняют патогены. Это также приводит к цитокиновому шторму. Во второй задаче эйкозаноиды могут уравновешивать индуцированные воспалительные сигналы, продуцируя расщепляющие метаболиты, которые действуют как защита хозяина, поскольку, как уже упоминалось, если воспаление не контролируется должным образом, оно имеет очень негативный эффект [95]. К эйкозаноидам относятся, помимо метаболитов арахидоновой кислоты, гидроксиэйкозатетраеновые кислоты, гидроксиэйкозапентаеновые кислоты, эоксины, изопростаны и резольвины [96,97].

4.1.1. Простагландины

Простагландины — это семейство гормоноподобных молекул, продуцируемых всеми типами клеток. Они поддерживают гомеостатические функции и опосредуют патогенные механизмы, в том числе воспалительную реакцию. Они участвуют в сохранении воспалительного процесса за счет повышения проницаемости сосудов и усиления действия других медиаторов воспаления, таких как кинин, серотонин и гистамин [98], тем самым способствуя покраснению, усилению кровотока и оттоку плазмы в зоне острого воспаления, приводящему к отеку [57]. Основными биоактивными простагландинами (ПГ), вырабатываемыми in vivo, являются ПГЭ2, ЗГУ2, ПГД2и PGF2α, упомянутый выше.

• PGE2Этот биоактивный липид вызывает широкий спектр биологических эффектов, от пролиферации клеток, апоптоза, ангиогенеза, воспаления и рака до иммунного надзора [99]. Однако его роль при воспалительных состояниях не ясна. Этот простагландин действует на нейроны в гипоталамической терморегулирующей сети и вызывает повышение температуры тела и может способствовать активации воспалительных клеток Th17, но, с другой стороны, ингибирует выработку IL-2 и IL-12 в других подмножествах Т-клеток. Эта разница, по-видимому, связана с зависимостью от экспрессии различных рецепторов, а также от типа клеток [100]. Также известно, что он регулирует активацию, созревание, миграцию и секрецию цитокинов нескольких иммунных клеток, в первую очередь тех, которые участвуют во врожденном иммунитете, а именно: макрофагов, нейтрофилов, естественных клеток-убийц и дендритных клеток. PGE2 Синтез увеличивается за счет экспрессии одной из циклооксигеназ [101].
• ЗГУ2: Простациклин или ЗГУ2 является конечным продуктом метаболизма АА, впервые обнаруженного в 1976 г. при участии Moncada [102]. ЗГУ2 также было обнаружено, что он необходим для поддержания здоровья сердечно-сосудистой системы, поскольку он ингибирует агрегацию тромбоцитов и оказывает сильное сосудорасширяющее действие за счет расслабления гладких мышц [103]. Активируя рецепторы простациклина (IP-рецепторы), ЗГУ2 оказывает положительное сердечно-сосудистое действие, например, подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов. Однако эти рецепторы не функционируют при патологических состояниях и, таким образом, имеют вредные эффекты, которые контрастируют с их физиологическими защитными эффектами через тромбоксан-простаноидные (ТП) рецепторы [104]. Помимо различных иммуномодулирующих эффектов на Т-клетки, ЗГУ2 также регулирует функции В-клеток [105]. Он участвует в передаче болевых ощущений, опосредует проницаемость сосудов во время воспалительного процесса, регулирует скорость фильтрации сосудистых клубочков. В состоянии воспаления ЗГУ2 Сигнал способствует воспалительной боли [106]. Наличие рецепторов к этому липидному медиатору было обнаружено и в центральной нервной системе [107]. Противовоспалительные эффекты простациклина в значительной степени контролируются цАМФ (циклическим аденозинмонофосфатом) и подавлением воспалительного сигнального каскада NF-κB [108].
• ПГД2: ПГД2 является важным простаноидом, который выделяется в основном тучными клетками, а также другими иммунными клетками, такими как ТГ2 и дендритные клетки. ПГД2 выполняет свои биологические функции преимущественно через два рецептора, сопряженных с G-белком, ПГД2 рецепторы 1 (DP1) и 2 (DP2). Эффект DP1 заключается в ингибировании агрегации тромбоцитов, вазорелаксации, бронходилатации, увеличении выработки слизи и гиперчувствительности дыхательных путей. Благодаря взаимодействию с последним, ПГД2 стимулирует значительный хемотаксис и дегрануляцию воспалительных клеток [109]. ПГД2 опосредует несколько физиологических эффектов в различных тканях и органах, в дополнение к упомянутым; В его функции входит индукция сна или секреция слизи в дыхательных путях [110]. Он также является мощным стимулятором воспаления, но временная перспектива играет важную роль, если он действует в ранней или поздней фазе воспаления [111]. Этот простаноид также действует гастропротекторно, уменьшая секрецию кислоты из париетальных клеток, увеличивая кровоток и стимулируя секрецию слизи [112]. Наличие аллергена провоцирует быструю выработку ПГД2 у сенсибилизированных лиц, например, у пациентов с бронхиальной астмой, у которых концентрации этого биологически активного вещества могут увеличиваться до 150 раз, чем до появления аллергена. Его количество также увеличивается при аллергическом рините и атопическом дерматите. На сегодняшний день известно несколько исследований, указывающих на то, что тучные клетки являются основным источником простаноидной ПГД2 на участках аллергического воспаления [113]. Он увеличивает миграцию, активацию и выживаемость лейкоцитов при различных расстройствах, связанных с аллергией. На периферии гемопоэтическая ПГД-синтаза (hPGDS) воздействует на арахидоновую кислоту и ЦОГ-пути путем изомеризации PGH2 в PGD2, которые ученые стремятся использовать в терапевтических процедурах при аллергическом воспалении и разработать подходящие ингибиторы hPGDS [111].
• ПГФ2α: PGF2α является ключевым сигнальным медиатором в родах, поскольку участвует не только в стимуляции сокращения матки, но и в опосредовании перехода матки путем регуляции экспрессии белков, активирующих матку, и усиления продукции провоспалительных цитокинов и хемокинов [114]. ПГФ2α Повышает внутриклеточную концентрацию кальция за счет стимуляции высвобождения накопленного кальция, что приводит к фазовому сокращению, которое позволяет крови притекать к плоду между схватками и оптимизирует способность матки к изгнанию плода [115]. Также было показано, что концентрация PGF2α в материнской плазме выше до родов по сравнению с первым периодом родов, и нет существенных изменений даже в момент родов, что может означать, что PGF2α имеет другие роли в этот период [116]. Этот простагландин может влиять на жизнеспособность лютеиновых клеток, вызывая пролиферацию или гибель клеток через апоптоз или некроз, в зависимости от его местных и системных эффектов [117]. ПГФ2α показал положительное влияние на повышение децидуальной желатинолитической активности за счет увеличения матриксной металлопротеиназы (ММП)-2 и ММП-9 при одновременном снижении тканевого ингибитора экспрессии ММП (TIMP)-1 [118]. ПГФ2α в качестве средства резорбции костной ткани также регулирует экспрессию фактора роста фибробластов-2 и рецептора фактора роста фибробластов (FGFR) в остеобластах [119].

4.1.2. Тромбоксаны

Тромбоксаны представляют собой эйкозаноиды, полученные из арахидоновой кислоты и связанные с простагландинами. Они представляют собой вещества, вырабатываемые тромбоцитами, вызывающие свертывание крови, сужение кровеносных сосудов и оказывающие положительное влияние на агрегацию тромбоцитов. Тромбоксан А2 (TXA2) активен в течение очень короткого времени и преобразуется путем гидролиза в неактивную форму — тромбоксан В2 (ТХБ2) [120].

• TXA2: Это нестабильный метаболит АА с периодом полураспада около 30 с, синтезируется из простагландина Н2 тромбоксансинтазой, и неферментативно расщепляется до биологически неактивного ТХБ2 [121,122]. TXA2 образуется в основном в тромбоцитах (которые экспрессируют только ЦОГ-1), при этом его продукция увеличивается во время их активации и тромбоксан действует через его рецептор тромбоксанового рецептора (ТП)α рецептора. Он способствует агрегации тромбоцитов [123], вазоконстрикции, пролиферации гладкой мускулатуры и активации воспалительных реакций эндотелия [124]. Он является частью важного механизма восстановления ран, в том числе поврежденных стенок сосудов, и отвечает за раннюю регенерацию тканей посредством передачи сигналов рецептора TP [125]. Метаболит тромбоксана 12-гидроксигептадекатреновая кислота (12-HHT) особенно важен для регенерации кожи [126]. TXA2 первоначально был описан как высвобождаемый из тромбоцитов, но известно, что он высвобождается несколькими другими клетками, включая макрофаги, нейтрофилы, моноциты и эндотелиальные клетки [121].

4.1.3. Лейкотриены

Лейкотриены (ЛТ) — а именно, ЛТБ4, LTC4ООО4и LTE4— важные биологически активные липидные вещества, полученные из АК через другую 5-липоксигеназу [127]. Они являются мощными биологическими медиаторами в патофизиологии воспалительных заболеваний и синтезируются различными клетками, включая тучные клетки, эозинофилы, базофилы и макрофаги. Они запускают сократительные и воспалительные процессы за счет специфических взаимодействий с рецепторами клеточной поверхности, относящимися к суперсемейству рецепторов, сопряженных с G-белком [128].

• ЛТБ4: Лейкотриен В4 является одним из самых эффективных хемоаттрактантов, медиаторов воспаления. Он стимулирует хемотаксис нейтрофилов, хемокинез и адгезию к эндотелиальным клеткам и активирует нейтрофилы, что приводит к высвобождению ферментов, медиаторов и дегрануляции [129]. Он активирует их особенно для производства активных форм кислорода и высвобождения лизосомальных ферментов. ЛТБ4 также участвует в воспалительной боли путем снижения ноцицептивного порога посредством нейтрофиль-зависимых процессов [130]. Высокие концентрации этого лейкотриола, вероятно, будут обнаружены в воспалительных выделениях у пациентов с артритом и муковисцидозом. Его синтез подавляется колхицином — противовоспалительным средством, эффективным при лечении подагры [53].
• LTC4: LTC4, совместно с ООО4 и LTE4, считаются известными цистеиниллейкотриенами (CysLT), которые сопровождают астматические состояния [131]. CysLTs действуют на сужение сосудов и увеличивают проницаемость сосудов, позволяя выводить макромолекулы плазмы, что приводит к отеку дыхательных путей, который характеризует астму. Кроме того, CysLT стимулирует секрецию слизи и подавляет мукоцилиарный клиренс. Они также характеризуются как активные ингредиенты «медленно реагирующих веществ анафилаксии» [132]. LTC4 образование происходит путем сопряжения LTA4 и восстановленный глутатион, основными источниками которого являются эозинофилы, базофилы, тучные клетки, макрофаги и гранулоциты, адгезивные к тромбоцитам [133]. Цистеиниллейкотриен участвует в индукции как окислительного стресса, так и апоптоза [134] и является мощным бронхоконстриктором [135].
• ООО4 и LTE4:ООО4 является членом класса цистеинилов, и его эффекты опосредованы в основном лейкотриеновыми рецепторами CysLT1 и CysLT2. Он был вовлечен в различные воспалительные эффекты, включая бронхоконстрикцию, вазоконстрикцию, увеличение посткапиллярной проницаемости с отеком и сокращение гладкой мускулатуры [136]. Есть данные, что LTD4 и LTE4 являются мощными и специфичными хемоаттрактантами для эозинофилов, которые, по-видимому, играют важную роль в патофизиологии бронхиальной астмы [137].

4.1.4. Липоксины

Эта группа эндогенных противовоспалительных медиаторов поддерживает решение [138]. Они играют ключевую роль в снижении чрезмерного повреждения тканей и хронического воспаления и регулируют компоненты как врожденной, так и адаптивной иммунной системы, включая нейтрофилы, макрофаги, Т- и В-клетки [139]. Липоксины (LX) также контролируют продукцию других эйкозаноидов по механизму стимуляции продукции простагландинов [140]. Они могут модулировать концентрации различных факторов транскрипции, таких как NF-κB или белок-активатор-1, и других для контроля экспрессии нескольких воспалительных генов [141].

• ЛХА4: Это эндогенный эйкозаноидный медиатор, который обладает не только двойной способностью к рассасыванию, но и противовоспалительными свойствами. Он является индуктором быстрой дилатации артерий. Он подавляет лейкоцитарно-опосредованное повреждение и способствует хемотаксису моноцитов и фагоцитозу апоптотических нейтрофилов [142], а также флогистическому поглощению апоптотических полиморфноядерных нейтрофилов [143].
• ЛХБ4: LXB4 имеет структуру, отличную от остальной части семейства липоксинов, и его сигнальный путь отличается от LXA4. Это нейропротекторный медиатор, который действует локально для подавления воспаления путем ингибирования выработки цитокина, активируемого Т-клетками TNF-α. Его продукция регулируется активностью инфламмасомы нуклеотид-связывающего домена (NOD)-подобного рецептора белка 3 (NLRP3) [144]. Он также оказывает сильное влияние на макрофаги и невоспалительную активацию моноцитов [138]. Он может стимулировать секрецию иммуноглобулина G (IgG) в В-клетках памяти, и исследование Kim et al. [145] также предоставило доказательства его способности увеличивать IgG-секретирующие В-клетки.

4.2. Влияние амигдалина на путь ЦОГ-2

Исследование Янга и его команды [146] предоставило четкие доказательства этого эффекта, когда амигдалин ингибировал стимулированное липополисахаридами (ЛПС) увеличение экспрессии рибонуклеиновой кислоты (мРНК) мессенджера ЦОГ-1, экспрессии мРНК ЦОГ-2 и ПГЭ2 синтез в мышиных клетках микроглии BV2. Экспрессия мРНК ЦОГ-2 более эффективно подавлялась этим гликозидом по сравнению с экспрессией мРНК ЦОГ-1. Исследовательская группа под руководством Кунга [147] подчеркнула способность амигдалина дозозависимым образом ингибировать экспрессию TNF-α, индуцируемой синтазы оксида азота и ЦОГ-2, а также экспрессию белка NF-κB и повышать уровни белков, связанных с окислительным стрессом, например, фактора, связанного с ядерным фактором-эритроидом-2 2 (Nrf2). Это связано с тем, что активность ЦОГ-2 связана с радикалами оксида азота (NO), образующимися на основе активности NO-синтазы, и, как уже упоминалось, амигдалин ингибирует ее, тем самым косвенно подавляя выработку PGE2, основной метаболит ЦОГ-2 [148]. Результаты работы Tang et al. [149] свидетельствуют о том, что лечение амигдалином резко ингибировало продукцию TNF-α, IL-6 и IL-1β, а также индуцированную LPS/D-галактозамином (GalN) экспрессию iNOS и белка COX-2 у мышей, тем самым улучшая острое повреждение печени (ОПЛ). Результаты работы Gago-López et al. (2021) подтвердили экспрессию важных медиаторов инициации псориаза и эпидермальной гиперплазии, таких как TNF-α [150]. По данным Wang et al. (2020), амигдалин, основной компонент Prunus persica (L.) Stokes, снижал уровень воспалительных цитокинов (Il-6, Tnf-α) в мышиной модели [150].

5. Медиаторы воспаления: цитокины

Цитокины представляют собой небольшие белки, выделяемые клетками, которые оказывают значительное специфическое влияние на взаимодействия, коммуникацию между клетками, и они вмешиваются в воспалительную реакцию в чрезвычайно широкой степени, особенно в пикомолярных, иногда наномолярных, концентрациях. Они действуют в основном местно, аутокринным или паракринным образом, но когда они попадают в кровообращение или лимфатический круг, они могут влиять на всю систему [151].Цитокины включают интерлейкины, факторы некроза опухолей, лимфокины, монокины, факторы некроза опухоли и интерфероны, а также колониестимулирующие факторы, трансформирующие факторы, пептидные факторы роста, белки теплового шока и глюкозорегулируемые белки [53].Цитокиновая система является важным и эффективным механизмом гомеостаза, когда ее активация происходит локально, а отдельные цитокины действуют в непосредственной близости, будь то в диффузной форме или связанные с клеточными поверхностями. Однако, если продукция цитокинов длительна и постоянно поддерживается или носит системный характер, то в такой ситуации цитокины усугубляют воспалительные, аутоиммунные и злокачественные состояния [152].В процессе воспаления основными активными цитокинами являются ФНО, ИЛ-1 и ИЛ-6, которые вырабатываются резидентными клетками, такими как макрофаги, тучные клетки и лимфоциты, и опосредуют миграцию клеток к пораженному участку, лихорадку (оптимизирующую обменные процессы и т.д.), отеки, а также, сенсибилизацию тканей к боли. В частности, TNF-α и IL-1β в основном секретируются для высвобождения биоактивных липидных медиаторов — простагландинов и симпатомиметических аминов [86].

5.1. Регуляция цитокинов

Провоспалительные цитокины являются ключевыми игроками, ответственными не только за последующий ход врожденных иммунных реакций, но и, в частности, за развитие адаптивного иммунитета в этом направлении, который стимулирует их к дифференцировке и активации специфических подгрупп Т-клеток. Недостаточная регуляция или преобладание фактора, вызывающего дестабилизацию организма, может привести к вредному воспалению, такому как ревматоидный артрит [153]. В частности, фактическое присутствие цитокинов в месте воспаления играет роль в разрушении тканей. Это длительный процесс, который сопровождается попытками организма восстановиться. Такой дисбаланс также может вылечить хронические воспалительные заболевания или аутоиммунные заболевания [154].Механизм регуляции цитокинов базируется на двух китах: первый – антагонизм рецепторов, второй – контраст их эффектов, например, определенные группы цитокинов стимулируют продукцию деструктивных матриксных металлопротеи, в то время как другая группа способствует продукции тканевых ингибиторов матриксных металлопротеи, тем самым контролируя баланс между этими эффектами [155].Последний механизм имеет ключевое значение при воспалительных процессах и используется в качестве терапевтического подхода, например, гены IL-1 кодируют IL-1α и IL-1β, а также рецептор-антагонист (IL-1ra), где состояние гомеостаза между IL-1, IL-1ra и другими природными ингибиторами поддерживается их равновесными состояниями [156]. Блокирующие лиганды-растворимые рецепторы, например, IL-1sR и TNF-sR, также могут действовать [53,157].

5.2. Влияние амигдалина на воспаление - подавление высвобождения провоспалительных цитокинов

IL-1α: Больше, чем любое другое, семейство цитокиновых лигандов и рецепторов IL-1 в первую очередь связано с острым и хроническим воспалением [158], поэтому основные воспалительные реакции, такие как индукция циклооксигеназы 2-го типа, продукция множественных цитокинов и хемокинов, а также повышенная экспрессия молекул адгезии или синтез оксида азота, являются неразличимыми ответами на лиганды IL-1 [159]]. Сигнальный путь IL-1α приводит к активации NF-κB и белка-активатора (AP-1) в цитозоле [160]. Исследования показывают, что амигдалин обладает противовоспалительным действием за счет сниженной экспрессии провоспалительного цитокина IL-1α [161]. Гистологическая оценка ожоговых ран в этом исследовании показала значительное улучшение при раннем заживлении, меньшую площадь раны и лучший рубец в группе, получавшей амигдалин, что также показало значительное снижение концентраций воспалительных цитокинов.IL-1β: IL-1β является плейотропным цитокином, который может опосредуть повышенную прокоагулянтную активность и проницаемость в эндотелиальной ткани при воспалительных состояниях [162]. IL-1β участвует в воспалении сосудов, гемодинамике и ангиогенезе [163]. По завершении процесса созревания этого интерлейкина, происходящего в клеточной белковой структуре инфламмасомы, он участвует в регуляции иммунных процессов посредством активации транскрипционного фактора NF-κB и митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK)38 [164,165]. Ученые Hwang et al. [166] и многие другие продемонстрировали противовоспалительную способность амигдалина. Hwang et al. продемонстрировали это в исследовании in vivo на крысах, в котором они вызывали воспаление внутримышечно с помощью каррагинана и контролировали молекулярные маркеры воспаления и боли с добавлением амигдалина в концентрациях 0,005, 0,05 и 0,1 mg.kg−1. При самой низкой выбранной концентрации амигдалина (АМГ) наблюдалось значительное ингибирование экспрессии IL-1β, TNF-α и белка c-Fos в качестве маркера нейрональной активности. Ингибирование экспрессии этого цитокина амигдалином дозонезависимым образом также было продемонстрировано в исследованиях Luo et al. [10] при коллаген-индуцированном артрите II типа у крыс.IL-6: IL-6 представляет собой стратегический мост, который соединяет врожденную и адаптивную иммунную системы, привлекая моноциты и лимфоциты для замены нейтрофилов при переходе от врожденного к адаптивному иммунитету [167,168]. Это плейотропный цитокин, образованный макрофагами и нейтрофилами, а также эндотелиальными и эпителиальными клетками и другими. Также было показано, что Ил-6 индуцирует ПГЭ2, который может ингибировать синтез провоспалительных медиаторов TNF-α и IL-1 [169]. Он также индуцирует выработку белков острой фазы в клетках печени. IL-6 передает сигналы через свою уникальную рецепторную систему. Он взаимодействует с рецепторным комплексом I типа на клеточной поверхности, который состоит из лиганд-связывающего гликопротеина IL-6Rα (также называемого кластером дифференцировки (CD)126) и компонента сигнальной трансдукции гликопротеина (GP) 130 (также называемого CD130) [170]. Zhang et al. [171] проверили противовоспалительное действие нашего природного вещества в связи с IL-6 и IL-1β в поисках подходящего лечения для пациентов с острым повреждением легких (ОПЛ). Это связано с тем, что ОПЛ вызывается прямым или косвенным повреждением альвеолярных эпителиальных клеток легких и капилляров эндотелиальных клеток, где ЛПС отвечает за активацию сигнального пути NF-κB. В результате этой активации ЛПС косвенно влияет на экспрессию генов цитокинов (TNF-α, IL-1β и IL-6), что приводит к повреждению легочной ткани. В заключение следует отметить, что результаты, полученные Zhang et al., показали, что амигдалин подавляет ЛПС-индуцированный ОПЛ, ингибируя синтез воспалительных цитокинов IL-6 и IL-1β, влияя на сигнальные пути NF-κB и NLRP3. Gago-López et al. (2021) продемонстрировали, что лечение аналогом амигдалина приводит к снижению экспрессии провоспалительных цитокинов, которые высоко экспрессируются у пациентов с псориазом, таких как IL6 [172].TNF-α: Фактор некроза опухоли-альфа представляет собой плейотропный провоспалительный цитокин, который продуцируется в основном макрофагами, но также и некоторыми другими клетками, например, эндотелиальными клетками [173]. Его ключевые функции включают индукцию провоспалительных белков (хемокинов, цитокинов и молекул адгезии) за счет активации транскрипционного фактора NF-κB [174]. В исследовании Hu F., Hu Y. и Peng [175] амигдалин в сочетании с аторвастатином, статиновым препаратом, используемым для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний у лиц с высоким риском и лечения аномальных уровней липидов, продемонстрировал значительные изменения в исходах и снизил уровни мРНК цитокинов. TNF-α и IL-6, наоборот, увеличивают активность антиоксидантных ферментов глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы на крысовых моделях эндометриоза.MCP-1: Моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1 / CCL2) является одним из ключевых хемокинов , регулирующих миграцию и инфильтрацию моноцитов/макрофагов [176]. Он индуцирует активацию моноцитов, а рекрутирование может увеличивать экспрессию молекул адгезии и продукцию цитокинов моноцитами [177]. Он может непосредственно повышать регуляцию провоспалительного цитокина IL-6 и молекулы адгезии межклеточной молекулы адгезии-1 (ICAM-1). Таким образом, MCP-1 является не только хемокином, но и провоспалительным медиатором, индуцируя образование провоспалительных молекул [178]. MCP-1 проявляет свои эффекты, связываясь с рецепторами, связанными с G-белком, на поверхности лейкоцитов, что приводит к активации Aktкиназы и образованию фосфатидилинозитолтрифосфата при самых высоких концентрациях хемокинов [179,180]. Тем не менее, Lv и исследовательская группа [181] для поиска подходящего течения формирования атеросклероза зарегистрировали значимое (p < 0,05) иммуномодулирующее действие AMG на этот фактор, а также на IL-6. Концентрации MCP-1 определяли в атеросклеротических артериях. Амигдалин вводили в брюшную полость мышей в дозах 1, 3, 10 mg.kg−1 в течение 4 недель, где при его средней указанной концентрации вестерн-блоттинг показал значительное снижение продукции белка MCP-1. Исследования Zhao и Yang [182] представили аналогичные доказательства в пользу AMG, защитной роли амигдалина в развитии атеросклероза. Здесь опять же при концентрации 10 mg.kg−1, это значительно (p < 0,05) снижало экспрессию белка MCP-1 по сравнению с образцом без обработки AMG. Эти данные свидетельствуют о том, что исследуемый натуральный продукт может прямо или косвенно ингибировать развитие атеросклероза и способствовать более стабильному фенотипу бляшек за счет ингибирования экспрессии нескольких провоспалительных молекул, включая MCP-1.

5.3. Основные принципы сигнальных путей, в которых участвует амигдалин

5.3.1. Янус-киназа 2 и сигнальный преобразователь и активатор пути транскрипции 3 (JAK2/STAT3)

Этот сигнальный путь участвует в различных воспалительных и противовоспалительных сигнальных путях, а также в нескольких физиологических и патологических регуляторных процессах [183].Передача сигналов начинается с присоединения цитокина лиганда к рецептору клетки-мишени, расположенному на его мембране. Янус-киназы (JAKs) — это внутриклеточные рецептор-ассоциированные ферменты, которые катализируют перенос фосфатной группы от нуклеозидтрифосфатов — в основном аденозинтрифосфата (АТФ) — к аминокислоте тирозину в белках. Связывание цитокина с рецептором приводит к их близости во внутриклеточном пространстве и взаимному фосфорилированию, тем самым активируя и фосфорилируя тирозиновые остатки рецепторной цитоплазмы. Белок STAT (преобразователь сигнала и активатор транскрипции), присутствующий в цитозоле, может затем связываться с фосфотирозинами через его домен Src Homology 2 (SH2)2. Впоследствии JAKs снова проявляют свою тирозинкиназную активность по отношению к прикрепленным белкам STAT, что приводит к диссоциации этих белков от рецептора или отделению от фосфотирозинов. Домен SH2 опосредует связывание с фосфотирозином второй молекулы STAT, в результате чего гомо/гетеродимер транслоцируется в ядро клетки. Здесь он инициирует транскрипцию и экспрессию генов [180,183,184].

5.3.2. Путь NF-κB

NF-κB является центральным медиатором индукции провоспалительных генов и функционирует как в клетках врожденного, так и адаптивного иммунитета [185]. NF-κB образуется не одним белком, а комплексом индуцируемых транскрипционных факторов [186], который первым реагирует на вредные клеточные стимулы, например, АФК [187] или ионизирующее излучение [188]. Активация NF-κB контролируется двумя различными путями, которые были названы каноническими и неканоническими путями [189]. В первом случае гетеродимер NF-κB, состоящий из белков RelA и P50, поддерживается в неактивном состоянии за счет цитоплазматической ассоциации с ингибирующим белком IKBα [186]. Активация канонического пути путем связывания сигнальной молекулы в форме IL-1 или TNF-α/β с TLR (толл-подобным рецептором) [190], TNFR (рецептором опухолевого некротизирующего фактора) [180] или RANK (рецепторным активатором NF-κB) [191] приводит к ингибиторному фосфорилированию каппа-киназы (IKK) (IκB киназа), убиквитинированию и последующей протеасомальной деградации IκB (ингибитора NF-κB), что позволяет транслоцироваться транскрипционному фактору в ядерные клетки и активировать гены, несущие связанные сайты связывания для производства цитокинов или выживания клеток [189]. TNFR (TNFR1 и TNFR2) внутриклеточно связаны с адаптерными белками TRAF (факторами, ассоциирующими рецепторы TNF) либо напрямую, либо через другие белки — TRADD (TNF-рецептор-ассоциированный домен смерти), роль которых заключается в регуляции воспалительных и апоптотических путей [180]. TRAF-2 в комплексе с TRADD мобилизует белок IAP (белок ингибитора апоптоза), который связывается с TRAF-2, что приводит к активации транскрипционного фактора NF-κB белком RIP (рецептор-взаимодействующие протеинкиназы) [192], активируя уже упомянутую киназу IKK. После активации NF-κB регулирует экспрессию почти 400 различных генов, в том числе ферментов COX-2 и iNOS [190].

5.4. Молекулярный механизм действия амигдалина на иммунную функцию in vitro

В начале XXI века научная группа под руководством Барони [193] исследовала защитные эффекты амигдалина на иммунную функцию васкуляризированного организма. Затем этот гликозид продемонстрировал способность увеличивать индуцированную полигидроксиалканоатом (PHA) пролиферацию Т-клеток в периферической крови человека, которая впоследствии секретировала IL-2 и интерферон-гамма (IFNγ) для ингибирования продукции трансформирующего фактора роста (TGF)-β1. В суперсемейство TGF-β входят эндогенные белки, ингибирующие рост; повышенная экспрессия TGF-β часто коррелирует со злокачественными новообразованиями при многих видах рака и дефектом в ответе на ингибирование роста клеток на TGF-β [194]. Нарушение регуляции иммуносупрессивных функций этой группы также участвует в патогенезе аутоиммунных заболеваний, опосредованном присутствием других цитокинов [195].В 2019 году Тан и его команда [149] отметили, что лечение амигдалином эффективно улучшает гистопатологические изменения в печени за счет снижения уровней малонового диальдегида (MDA), миелопероксидазы (MPO), аланинаминазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST). Амигдалин также подавлял секрецию TNF-α, IL-1β и IL-6, тем самым подавляя воспаление печеночных органов.Данные, полученные от нескольких исследовательских групп [149,161,171,182,196], свидетельствуют о том, что противовоспалительная активность изучаемого природного гликозида заключается в ингибировании экспрессии нескольких провоспалительных молекул, в результате чего регуляция сигнального пути NF-κB, NLRP3, а также путей фосфатидилинозитол-3-киназы/протеинкиназы B (PI3K/AKT) и JAK2/STAT3, предотвращает их транскрипцию. Воспалительные стимулы распознаются клетками-хозяевами через специфические трансмембранные рецепторы, где взаимодействия этих рецепторов с соответствующими иммунными системами приводят к передаче сигналов их ядру, где через транскрипционные и посттранскрипционные механизмы активируется селективный набор генов (MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа), NF-κB (ядерный фактор каппа-легкая цепь-энхансер активированных В-клеток), JAK2/STAT3 (янус-киназа 2/Сигнальный преобразователь и активатор транскрипции 3) и др.) [81,197,198,199]. Воспалительные реакции впоследствии координируются продуктами таких генов — цитокинами, хемокинами и интерлейкинами. Амигдалин продемонстрировал этот противовоспалительный потенциал в ингибировании IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-9, TNF-α и MCP-1 [149,166,171,196,200,201,202]. Tang et al. [149] продемонстрировали в своих исследованиях ингибирование экспрессии IL-6 амигдалином, что на глубоком молекулярном уровне предотвращало транслокацию NF-κB из цитозоля в ядро и, таким образом, предотвращало его транскрипцию. Кроме того, амигдалин уменьшает чрезмерный окислительный стресс, воспаление и фиброз почечной ткани при диабетической нефропатии в основном за счет подавления сигнального пути TGF-β1/Smad и регуляции ключевых ферментов деградации ВКМ [203].

6. Заключение

У нашего иммунитета есть защитные механизмы, такие как воспаление. Амигдалин, являясь биологически активным продуктом, имеет тенденцию избирательно воздействовать на арахидоновую кислоту при воспалительном процессе, однако молекулярный механизм и специфические обстоятельства этого эффекта in vitro и in vivo до конца не выяснены. Тем не менее, другие опубликованные научные исследования на сегодняшний день показали, что амигдалин обладает потенциалом в качестве природного биологически активного соединения. Мы надеемся, что представленный обзор может быть полезен для исследований в области молекулярной биологии, токсикологии и медицины.

Финансирование

Данная публикация была поддержана Операционной программой «Интегрированная инфраструктура» в рамках проекта: Исследования, ориентированные на спрос в области устойчивого и инновационного питания, Drive4SIFood 313011V336, совместно финансируемой Европейским фондом регионального развития и Словацким агентством по исследованиям и разработкам, Гранты No. АПВВ-19-0243, АПВВ-18-0312 и АПВВ-20-0218; Номер проекта GA 24/2019; и по проекту VEGA No 1/0038/19.

Амигдалин индуцирует апоптоз в клетках линии HeLa рака шейки матки человека

Оригинал статьи: https://www.researchgate.net/publication/233383171_Amygdalin_induces_apoptosis_in_human_cervical_cancer_cell_line_HeLa_cells

Данная работа частично поддержана грантом Ключевого грантового проекта Министерства образования КНР (№ 707020).

Декларация интересов

Авторы не сообщают о каких-либо декларациях интересов.

• Февраль 2013 г.
• Иммунофармакология и иммунотоксикология 35(1):43-51

ДОИ: 10.3109/08923973.2012.738688

• Источник
• PubMed

Авторы:Юй ЧэньЦзиньшу МаФан ВанЦзе Ху

Иммунофармакология и иммунотоксикология, 2013; 35(1): 43–51
© 2013 Informa Healthcare USA, Inc.
ISSN 0892-3973 печать / ISSN 1532-2513 онлайн
DOI: 10.3109/08923973.2012.738688

ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ СТАТЬЯ

Амигдалин индуцирует апоптоз в клетках рака шейки матки человека HeLa

Юй Чен, Цзиньшу Ма, Фан Ван, Цзе Ху, Ай Цуй, Чэнго Вэй, Цин Ян и Фан Ли

Кафедра патогенобиологии, Медицинский колледж Бетьюн, Цзилиньский университет, Чанчунь, Цзилинь, Китай

Аннотация
Амигдалин, природное вещество, было предложено в качестве эффективного противоракового средства. Влияние амигдалина на клетки рака шейки матки ранее не изучалось. В данном исследовании мы обнаружили, что жизнеспособность клеточной линии рака шейки матки человека HeLa значительно подавлялась амигдалином. Окрашивание 4,6-диамино-2-фенилиндолом (DAPI) показало, что клетки HeLa, обработанные амигдалином, развивали типичные апоптотические изменения. Развитие апоптоза в клетках HeLa, обработанных амигдалином, было подтверждено двойным окрашиванием аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI), а также увеличением активности каспазы-3 в этих клетках. Дальнейшие исследования показали, что антиапоптотический белок Bcl-2 был подавлен, тогда как проапоптотический белок Bax был активирован в клетках HeLa, обработанных амигдалином, что указывает на вовлечение внутреннего пути апоптоза. In vivo введение амигдалина ингибировало рост ксенотрансплантатов клеток HeLa через механизм апоптоза. Результаты настоящего исследования предполагают, что амигдалин может предложить новую терапевтическую опцию для пациентов с раком шейки матки.

Ключевые слова: Амигдалин, рак шейки матки, клетки HeLa, апоптоз, ксенотрансплантат

Введение

Рак шейки матки в настоящее время является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований и второй ведущей причиной смерти женщин во всем мире, унося жизни около 280 000 женщин ежегодно. Восемьдесят процентов случаев рака шейки матки происходят в развивающихся странах, и это также вторая ведущая причина смертности среди женщин в возрасте 21–39 лет в США. Несмотря на достижения в радиотерапии и химиотерапии, проблемы, связанные с этими методами лечения, такие как побочные эффекты и развитие лекарственной устойчивости, остаются нерешенными. В то же время высокий уровень смертности от рака шейки матки остается относительно стабильным. Одной из стратегий решения этих проблем является разработка новых методов лечения и их добавление к текущим подходам борьбы с раком шейки матки. В поиске альтернативных методов лечения рака мы обратили внимание на то, что природное цианидсодержащее вещество, амигдалин, приобретает репутацию дополнительного средства для лечения рака благодаря своей эффективности в подавлении роста раковых клеток и легкой доступности. Поэтому механизмы противоракового действия амигдалина и его применение in vivo заслуживают дальнейшего изучения.

Амигдалин в изобилии содержится в семенах абрикосов, миндаля, персиков, яблок и других растений семейства розоцветных и состоит из двух молекул глюкозы, одной молекулы бензальдегида и одной молекулы цианида. Амигдалин, как сообщалось, обладает противораковым эффектом, индуцируя апоптоз в клетках рака простаты и подавляя гены, связанные с клеточным циклом, в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4. Считается, что бензальдегид в амигдалине способен вызывать анальгетический эффект, а цианид в амигдалине может индуцировать противоопухолевый эффект. Амигдалин может стать новым терапевтическим средством для пациентов с раком, хотя использование амигдалина в качестве противоракового препарата вызывает споры из-за опасений токсичности цианида.

Растет интерес к сообщениям об амигдалине как о препарате для лечения рака. Противораковый эффект и механизм действия амигдалина при раке шейки матки ранее не изучались. Настоящее исследование было разработано для изучения апоптотического эффекта амигдалина на клетки рака шейки матки человека HeLa in vitro и in vivo, чтобы обосновать его использование в лечении рака шейки матки.

Материалы и методы

Реагенты
Амигдалин, диметилсульфоксид (DMSO), 4,6-диамино-2-фенилиндол (DAPI) и тритон X-100 были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Мышиные антитела против β-актина, мышиные антитела против Bcl-2 и кроличьи антитела против Bax были приобретены у Santa Cruz (Санта-Круз, Калифорния, США). Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, кроличьи антимышиные или козьи антикроличьи антитела были приобретены у Rockland Inc. (Филадельфия, Пенсильвания, США).

Культура клеток
Клеточная линия рака шейки матки человека HeLa и клеточная линия человеческого эмбрионального амниона FL были приобретены в Онкологическом центре Китайской академии медицинских наук. Клетки культивировали в 75 см² флаконах для культивирования тканей в увлажненной атмосфере с 5% CO₂ при 37°C в среде Дульбекко, модифицированной Игла (DMEM; Gibco, США), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, США) и 1% пенициллина-стрептомицина (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). В ходе эксперимента клетки поддерживались в тех же условиях, за исключением использования 0,2% FBS вместо 10% FBS.

МТТ-тест на цитотоксичность
МТТ-тест на цитотоксичность использовался для определения цитотоксичности амигдалина на клетки HeLa и FL. Клетки HeLa и FL выращивали в конечном объеме 100 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, в 96-луночных планшетах при плотности 1 × 10⁶ клеток/мл. Через 12 часов амигдалин добавляли в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в среде DMEM с 0,2% FBS на 24 часа. После добавления 5 мкл МТТ-реагента (набор для анализа пролиферации клеток MTT; Trevigen, США) в каждую лунку планшет инкубировали в течение 4 часов перед добавлением 100 мкл растворителя DMSO в лунки. Затем оптическую плотность при 570 нм измеряли с помощью микропланшетного ридера (Bio-Tek, Уинуски, Вермонт, США). Процент жизнеспособности клеток рассчитывали по формуле (OD обработанного образца / контрольный OD) × 100%. Тест проводился не менее трех раз.

Морфология клеток HeLa и FL
Клетки HeLa и FL высевали в 96-луночные планшеты для культивирования. Через 12 часов амигдалин добавляли в лунки в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в среде DMEM, содержащей 0,2% FBS, на 24 часа. Затем морфологические изменения клеток наблюдали под инвертированным оптическим микроскопом (CKX41 Olympus; Olympus, Япония).

Окрашивание DAPI
Окрашивание DAPI использовалось для наблюдения морфологических изменений ядра в апоптотических клетках. 2 × 10⁵ клеток HeLa высевали в 6-луночные планшеты и культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, в течение ночи. Затем среду заменяли на DMEM с 0,2% FBS и обрабатывали амигдалином в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в течение 24 часов. После удаления среды клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали 100% этанолом в течение 20 минут при комнатной температуре и снова дважды промывали холодным PBS. Клетки наблюдали под флуоресцентным микроскопом (IX70-SIF2 Olympus; Olympus).

Двойное окрашивание аннексином V-FITC и йодидом пропидия
Индукция апоптоза амигдалином оценивалась с помощью двойного окрашивания аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI). После инкубации клеток HeLa с амигдалином в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в среде DMEM, содержащей 0,2% FBS, в 6-луночных планшетах в течение 24 часов, клетки собирали, дважды промывали холодным PBS и анализировали на апоптоз с помощью двойного окрашивания аннексином V-FITC и PI (набор для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC; KeyGEN, Нанкин, Китай). Вкратце, 5 × 10⁵ клеток ресуспендировали в связывающем буфере (10 мМ HEPES, pH 7,4, 140 мМ NaCl, 1 мМ MgCl₂, 5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl₂), окрашивали 5 мкл аннексина V-FITC в течение 10 минут, а затем окрашивали 5 мкл PI в течение еще 15 минут. Клетки немедленно анализировали с помощью проточного цитометра (FACScan; BD Biosciences, Милан, Италия). На изображении с проточного цитометра клетки в верхней правой части (Q2), нижней левой части (Q3) и нижней правой части (Q4) представляют поздние апоптотические клетки, жизнеспособные клетки и ранние апоптотические клетки соответственно.

Вестерн-блоттинг
Вестерн-блоттинг использовался для оценки экспрессии белков, связанных с апоптозом. После инкубации с амигдалином в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в среде DMEM, содержащей 0,2% FBS, в течение 24 часов, клетки HeLa собирали, дважды промывали PBS и растворяли в лизирующем буфере [150 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 0,5% натрия дезоксихолата, 0,1% SDS, 50 мМ Tris, 1 мМ дитиотреитол (DTT), 5 мМ Na₃VO₄, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 10 мкг/мл трипсина, 10 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл лейпептина; pH 7,4] в течение 2 часов при 4°C. Лизат центрифугировали при 12 000 g в течение 15 минут при 4°C. Концентрацию белка в лизате измеряли с помощью набора для колориметрического анализа белка Bio-Rad (Bio-Rad, США). По 30 мкг белка из каждого образца подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с SDS и переносили на мембрану из поливинилидендифторида. Затем мембрану блокировали PBS, содержащим 5% обезжиренного молока, при 4°C в течение 1 часа и инкубировали с мышиными антителами против β-актина, мышиными антителами против Bcl-2 и кроличьими антителами против Bax (1:200) при 4°C в течение 12 часов. Мембрану промывали буфером TBST (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,05% (об./об.) Tween 20) три раза. Затем мембрану инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, кроличьими антимышиными или козьими антикроличьими антителами (1:500) в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации мембрану полностью покрывали равным количеством усилителя и раствора перекиси из набора ECL Plus (Beyotime, Шанхай, Китай) в течение 2 минут. Затем мембрану экспонировали на пленку (Kodak, США) и проявляли. Эксперимент повторяли не менее трех раз.

Анализ активности фермента каспазы-3
Каспаза-3 является ключевым биомаркером апоптоза. Активность каспазы-3 in vitro измеряли с помощью колориметрического набора (Genscript, Нью-Джерси, США). Согласно инструкции производителя, клетки HeLa, инкубированные в среде DMEM, содержащей 0,2% FBS, обрабатывали амигдалином в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл в течение 24 часов. Затем клетки лизировали для обнаружения хромофора p-нитроанилида (pNA) после его отщепления от меченого субстрата DEVD-pNA. Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью микропланшетного ридера. Относительное увеличение активности каспазы-3 определяли путем сравнения оптической плотности pNA из клеток HeLa, обработанных амигдалином, с таковой из необработанного контроля.

Противопухолевая активность амигдалина in vivo
Модель голых мышей, имплантированных клетками HeLa, использовалась для оценки влияния амигдалина на образование опухоли и морфологию. Самцы голых мышей BALB/c (4–6 недель, 16–20 г) были приобретены у Beijing Vital River Experimental Animals Technology (Пекин, Китай). Для создания ксенотрансплантата опухоли HeLa у мышей культивированные 5 × 10⁶ клеток HeLa собирали и вводили в правый бок мышей. Когда размер опухолей достигал 30–50 мм³, мышей случайным образом разделяли на три группы по шесть мышей в каждой. Мыши контрольной группы получали ежедневную внутрибрюшинную инъекцию 0,9% NaCl в объеме 0,2 мл в течение 14 дней. Мыши положительной контрольной группы получали ежедневную внутрибрюшинную инъекцию 30 мг/кг 5-фторурацила (5-FU) в объеме 0,2 мл в течение 14 дней. В группе лечения мыши получали 300 мг/кг амигдалина в объеме 0,2 мл в течение 14 дней. Мышей в каждой группе взвешивали, и размер опухолей регистрировали с помощью штангенциркуля каждые 2 дня. Объем опухоли (TV) рассчитывали по формуле 0,5 × длинная ось × (короткая ось)². Через день после последней инъекции опухоли аккуратно удаляли, фиксировали в 10% нейтральном формалине в PBS и затем заливали в парафин. Все процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Национальным научным советом Китайской Республики.

TUNEL-анализ
Срезы толщиной 5 мкм, полученные из парафиновых блоков опухолевых тканей, использовали для идентификации апоптоза с помощью набора для терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP-концевого мечения (TUNEL) (KeyGEN). Степень апоптоза оценивали путем подсчета TUNEL-положительных клеток. Апоптотический индекс определяли по формуле количество TUNEL-положительных клеток / общее количество клеток в пяти случайно выбранных полях зрения с большим увеличением (увеличение, ×400).

Статистический анализ
Данные были выражены как средние значения и стандартное отклонение для всех экспериментов. Статистически значимые различия определялись между контрольной и обработанной амигдалином группами с использованием t-критерия Стьюдента (программное обеспечение SPSS 16.0). Значимость различий обозначалась как *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001.

Результаты

Влияние амигдалина на жизнеспособность клеток HeLa и FL
Жизнеспособность клеток HeLa, обработанных амигдалином, снижалась в зависимости от дозы. При концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл жизнеспособность клеток HeLa, обработанных амигдалином, составляла 93,38 ± 4,15% (p > 0,05), 91,67 ± 5,29% (p > 0,05), 83,14 ± 5,46% (p < 0,01), 70,67 ± 2,59% (p < 0,001) и 48,56 ± 2,86% (p < 0,001) от контрольного значения соответственно. Интересно, что амигдалин не оказывал влияния на жизнеспособность клеток FL (рисунок 2).

Морфологические изменения клеток HeLa, обработанных амигдалином
Увеличение концентраций амигдалина вызывало тенденцию к снижению количества клеток HeLa, но не вызывало значительных изменений в количестве клеток FL (данные не показаны). Клетки HeLa становились округлыми после обработки амигдалином, особенно при более высоких концентрациях амигдалина (рисунок 3A). Окрашивание DAPI клеток HeLa, обработанных амигдалином, выявило конденсацию и фрагментацию ядер (рисунок 3B).

Анализ апоптоза с помощью двойного окрашивания клеток HeLa аннексином V-FITC и PI
Клетки HeLa становились апоптотическими после обработки амигдалином. Распределение апоптотических клеток HeLa, измеренное с помощью проточной цитометрии, показало, что количество ранних (Q4) и поздних апоптотических (Q2) клеток HeLa значительно увеличилось по сравнению с контрольной группой (рисунок 4A). Конкретно, увеличение концентраций амигдалина при 0, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл коррелировало с увеличением соотношения апоптотических клеток к общему количеству клеток HeLa следующим образом: 8,8 ± 0,7%, 14,3 ± 1,6%, 15,6 ± 2,9%, 21,4 ± 1,8%, 25,4 ± 2,3% и 33,7 ± 2,6% (рисунок 4B).

Экспрессия белков Bcl-2 и Bax
Экспрессия белка Bax увеличивалась, а экспрессия белка Bcl-2 снижалась в зависимости от дозы в клетках HeLa, обработанных амигдалином. После 24 часов воздействия амигдалина в концентрациях 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл соответствующие соотношения экспрессии белка Bax к экспрессии белка Bcl-2 были следующими: 0,17 ± 0,05, 0,25 ± 0,04, 0,41 ± 0,09, 0,68 ± 0,1, 1,36 ± 0,13 и 1,69 ± 0,11 (рисунок 5A и B).

Влияние амигдалина на активность каспазы-3 в клетках HeLa
Каспаза-3 в клетках HeLa активировалась амигдалином в зависимости от дозы. Увеличение концентраций амигдалина при 0, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мг/мл приводило к соответствующим увеличениям активности каспазы-3 следующим образом: 0,139 ± 0,02, 0,149 ± 0,02, 0,164 ± 0,01, 0,29 ± 0,01, 0,394 ± 0,01, 0,482 ± 0,04. Кроме того, ингибитор каспазы-3 DEVD-fmk прекращал активацию каспазы-3, вызванную амигдалином. При концентрации 20 мг/мл амигдалина активность каспазы-3 в клетках HeLa, обработанных DEVD-fmk, составляла только 25,7% от таковой без обработки DEVD-fmk (рисунок 6).

Влияние амигдалина на рост клеток HeLa in vivo
Ксенотрансплантаты опухолей, пересаженные клетками HeLa, использовались для оценки противоопухолевого эффекта амигдалина in vivo. Амигдалин значительно ингибировал рост опухоли. Средний объем опухоли (TV) у контрольных мышей составлял 453,2 ± 132 мм³ через 14 дней после инъекции физиологического раствора. В то время как TV у мышей, которым вводили 300 мг/кг амигдалина или 30 мг/кг 5-FU, составлял 255,4 ± 134,8 или 269,5 ± 101,3 мм³ (рисунок 7A и B). Не было значительных изменений в массе тела между контрольной, 5-FU и амигдалиновой группами (рисунок 7C). Амигдалин ингибировал рост опухоли в модели ксенотрансплантата опухоли через механизм апоптоза. Процент TUNEL-положительных клеток в группах контроля (физиологический раствор), 5-FU (30 мг/кг) и амигдалина (300 мг/кг) составлял 2,1 ± 0,7, 36,3 ± 2,1 и 33,8 ± 3,5 соответственно (рисунок 7D и E).

Обсуждение

Основной целью настоящего исследования было проверить гипотезу о том, что амигдалин индуцирует апоптоз в клеточной линии рака шейки матки человека HeLa, чтобы оценить его как дополнение к текущим методам лечения рака шейки матки. В настоящем исследовании есть три ключевых вывода: (1) жизнеспособность и количество клеток HeLa снижались после обработки амигдалином; (2) индуцированный апоптоз в клетках HeLa может происходить через внутренний путь апоптоза; (3) in vivo введение амигдалина ингибировало рост опухоли клеток HeLa через механизм апоптоза.

МТТ-тест может точно определить количество живых клеток и является незаменимым для оценки цитотоксичности, связанной с скринингом противораковых препаратов. Используя этот тест в настоящем исследовании, мы обнаружили, что амигдалин снижал жизнеспособность клеток HeLa в зависимости от дозы. Эффект амигдалина на жизнеспособность клеток, по-видимому, зависел от типа клеток, так как жизнеспособность клеток FL, обработанных амигдалином, не показала значительных изменений по сравнению с необработанными клетками FL (рисунок 2). Подобное явление было продемонстрировано при наблюдении культивируемых клеток под микроскопом: количество клеток HeLa, обработанных амигдалином (рисунок 3A), было значительно меньше, чем у необработанных контрольных клеток HeLa, тогда как количество клеток FL не изменялось под действием амигдалина. Механизмы, лежащие в основе различий между клетками HeLa и FL в ответ на амигдалин, остаются неясными. Некоторые уникальные особенности клеток HeLa или FL должны способствовать этим различиям. Некоторые исследования предполагают, что раковые клетки богаты β-глюкозидазой, которая может расщеплять амигдалин для высвобождения цианида, оказывая токсическое воздействие на раковые клетки.[^14, 15, 16] Другие исследования предполагают, что роданеза, которая способна детоксифицировать цианид, присутствует в нормальных тканях, но отсутствует в раковых клетках. Совместное действие этих двух ферментов может быть ответственно за индукцию токсичности, связанной с цианидом, в раковых клетках, обработанных амигдалином, в то время как нормальные клетки остаются неповрежденными.[^9, 17] Клеточная линия HeLa происходит из клеток рака шейки матки человека, а клетки FL — из доброкачественных клеток эмбрионального амниона человека. Дальнейшие исследования необходимы для определения, обогащены ли клетки HeLa β-глюкозидазой, а клетки FL — роданезой, и отвечают ли эти особенности за специфичность амигдалина на пролиферацию клеток HeLa по сравнению с клетками FL.

Настоящее исследование продемонстрировало, что амигдалин способен индуцировать апоптоз в клетках HeLa. Поэтому мы считаем, что снижение жизнеспособности клеток HeLa под действием амигдалина происходило через механизм апоптоза. Мы проверили апоптотические эффекты амигдалина на клетки HeLa с помощью различных методов, включая окрашивание DAPI и анализ морфологических изменений ядер под флуоресцентным микроскопом (рисунок 3B). Двойное окрашивание аннексином V-FITC и PI использовалось для измерения количества ранних и поздних апоптотических клеток с помощью проточной цитометрии (рисунок 4).[^19, 20] Активность каспазы-3, которая, как известно, опосредует ключевые части апоптотического пути[^21, 22, 23], и соотношение Bax к Bcl-2 также увеличивались под действием амигдалина. Результаты этих исследований продемонстрировали апоптотический эффект амигдалина на клетки HeLa. Индукция апоптоза амигдалином в нескольких других типах клеток была недавно сообщена, включая клетки рака простаты и клетки промиелоцитарного лейкоза, что согласуется с выводами нашего исследования, за исключением типа клеток. Существует два пути, опосредующих развитие апоптоза: внешний путь и внутренний путь. Внешний путь опосредуется рецепторами смерти. Митохондрии играют центральную роль во внутреннем пути[^28, 29], который регулируется семейством белков Bcl-2.[^30, 31, 32] Результаты настоящего исследования показали, что соотношение белка Bax к белку Bcl-2 увеличивалось в клетках HeLa, обработанных амигдалином, в зависимости от дозы, что предполагает вовлечение внутреннего пути в индуцированный амигдалином апоптоз. Помимо апоптоза, другим механизмом, с помощью которого амигдалин снижал жизнеспособность клеток HeLa, могла быть остановка клеточного цикла. Чтобы проверить возможность вовлечения клеточного цикла, клетки HeLa, обработанные амигдалином, окрашивали, и распределение клеток на фазах G0/G1, S и G2/M измеряли с помощью проточной цитометрии. Было показано, что распределение клеток HeLa, обработанных и не обработанных амигдалином, на фазах G0/G1, S и G2/M оставалось одинаковым, что указывает на отсутствие остановки клеточного цикла в снижении жизнеспособности клеток HeLa под действием амигдалина (данные не показаны). Механизмы, с помощью которых амигдалин снижает жизнеспособность клеток, могут варьироваться в зависимости от типа клеток с различным генетическим фоном: снижение жизнеспособности, вызванное амигдалином в клетках рака толстой кишки человека SNU-C4, было показано как опосредованное механизмом подавления белков, связанных с клеточным циклом, а не апоптозом.

Результаты настоящего исследования продемонстрировали, что амигдалин значительно ингибировал рост ксенотрансплантата клеток HeLa у голых мышей BALB/c через механизм индукции апоптоза (рисунок 7). Результаты исследования in vivo являются новыми, так как мы не видели подобных отчетов в публикациях до сих пор. Не было обнаружено явных побочных эффектов у голых мышей после введения амигдалина. Это может быть правдой, так как амигдалин является своего рода травой или витамином, встречающимся в природе. Хотя он содержит цианидную группу, которая токсична для живых клеток, он безопасен, пока молекула амигдалина остается неповрежденной без высвобождения цианидной группы ферментативно из молекулы амигдалина.

Заключение

В этом исследовании наши результаты демонстрируют, что амигдалин способен ингибировать рост клеточной линии рака шейки матки человека HeLa как in vitro, так и in vivo через механизм индукции апоптоза. Мы предполагаем, что амигдалин может служить потенциально эффективной терапией для рака шейки матки.

Благодарности

Эта работа частично поддержана грантом Министерства образования КНР (№ 707020).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Антимутагенный, антирекомбиногенный и противоопухолевый эффект амигдалина в тесте на основе дрожжевых клеток и клеточных линий млекопитающих

оригинал статьи: https://www.yeastgenome.org/reference/S000204830

Med Food. 2017 Apr;20(4):360-366. doi: 10.1089/jmf.2016.0108. Epub 2017 Feb 1.

Атанаска Тодорова 1, Маргарита Пешева 1, Иван Илиев 2, Крум Бардаров 3, Теодора Тодорова 4

Амигдалин является основным компонентом семян растений семейства розоцветных, таких как абрикосы, персики, вишня, нектарины, яблоки, сливы и т. д., а также миндаль. Он используется в альтернативной медицине для профилактики рака, облегчения лихорадки, подавления кашля и утоления жажды. Целью настоящего исследования является определение мутагенных и рекомбиногенных эффектов амигдалина в тестовой системе Saccharomyces cerevisiae и оценка его потенциального противоопухолевого эффекта в тесте на основе дрожжевых клеток и клеточных линиях рака толстой кишки. Полученные результаты показывают, что концентрации 25, 50 и 100 мкг/мл не оказали никакого цитотоксического, мутагенного и канцерогенного эффекта в тестах на основе дрожжевых клеток. Предварительная обработка амигдалином в концентрации 100 мкг/мл приводит к примерно двукратному повышению выживаемости клеток и снижению частоты обратных мутаций, вызванных алкилирующим агентом метилметансульфонатом. Частота генной конверсии и митотического кроссинговера примерно в три раза ниже. Антиканцерогенный потенциал амигдалина в той же концентрации представлен примерно четырехкратным снижением ретротранспозиции Ty1, вызванной шестивалентным хромом. Подводя итог, данные, представленные в этом исследовании, свидетельствуют о неспособности самого амигдалина провоцировать события, связанные с начальными этапами опухолегенеза. Кроме того, наблюдаемый антимутагенный/антирекомбиногенный эффект может заключаться в активации безошибочных и подверженных ошибкам событий рекомбинации. Основываясь на высокой селективности по отношению к нормальным или опухолевым линиям клеток, можно предположить, что амигдалин оказывает более высокий цитотоксический эффект в клеточных линиях с более высокой пролиферативной и метаболической активностью, которые составляют большинство быстро развивающихся опухолей.

Генотоксический и антигенотоксический потенциал амигдалина на изолированных человеческих лимфоцитах с помощью кометного анализа

оригинал статьи: https://wellesu.com/10.1111/jfbc.13436

Эрикель Э. , ЮЗБАШИОГЛУ Д. , ЮНАЛ Ф.

ЖУРНАЛ ПИЩЕВОЙ БИОХИМИИ, том 44, № 10, 2020 (SCI-расширенный)

Краткое содержание

Амигдалин — это цианогенный гликозид, в основном присутствующий в семенах семейства розоцветных, таких как абрикосы, персики и горький миндаль. В этом исследовании генотоксические и антигенотоксические эффекты амигдалина in vitro были изучены на лимфоцитах периферической крови человека с использованием кометного анализа. Антигенотоксическое действие амигдалина оценивали в отношении перекиси водорода (H2O2) с использованием трех различных типов лечения (до, одновременно и после лечения). Выделенные лимфоциты инкубировали с различными концентрациями амигдалина (0,86-13,75 мкг/мл) отдельно и в сочетании с H2O2 (100 мкМ). Результаты показали, что амигдалин проявлял антигенотоксическое действие в отношении H2O2, но он не вызывал генотоксический эффект сам по себе в тестируемых концентрациях in vitro на лимфоцитах человека. Практическое применение Амигдалин – это природное соединение, используемое в альтернативной медицине в качестве противоракового, жаропонижающего и противокашлевого средства. Кометный анализ, который является относительно простым, быстрым, чувствительным и экономически эффективным, измеряет изменения в стабильности генома. Оценка амигдалина в отдельности не оказывает генотоксического действия на лимфоциты человека. Более того, антигенотоксичное применение амигдалина (до, одновременно и после лечения) значительно уменьшало повреждение ДНК, вызванное H(2)O(2) на изолированных лимфоцитах человека. В заключение следует отметить, что амигдалин не является генотоксичным, а также проявляет антигенотоксическую активность в отношении окислительно-поврежденной ДНК благодаря своим антиоксидантным свойствам на лимфоцитах человека.

Амигдалин задерживает прогрессирование клеточного цикла и блокирует рост клеток рака простаты in vitro

оригинал статьи: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S002432051630039X

Ясмина Макаревич а 1,Игорь Цаур а 1,Ева Юнгель а,Хендрик Боргманн а,Карен Нельсон б,Кристиан Томас а,Георг Барч а,Аксель Хаферкамп а 2,Роман А. Блахета а 2

Кафедра урологии, Университет Гёте, Франкфурт-на-Майне, ГерманиябКафедра сосудистой и эндоваскулярной хирургии, Университет Гёте, Франкфурт-на-Майне, Германия

Получено 10 августа 2015 г., пересмотрено 22 января 2016 г., принято 26 января 2016 г., доступно онлайн 29 января 2016 г., версия записи 10 февраля 2016 г.

Цели

Несмотря на впечатляющие преимущества в выживании от новых препаратов для лечения метастазирующего рака простаты (РПЖ), прогрессирующая лекарственная устойчивость препятствует долгосрочному ответу и ограничивает эффективность последующей терапии. В связи с зарегистрированной противоопухолевой активностью амигдалина и растущей популярностью комплементарной и альтернативной медицины был оценен потенциал этого природного, широко используемого вещества для оказания противоопухолевого воздействия на клетки рака простаты.

Основные методы

Клетки LNCaP (чувствительные к кастрации), DU-145 и PC3 (устойчивые к кастрации) подвергались воздействию различных концентраций амигдалина в течение 24  ч или 2 недель. Рост клеток измерялся с помощью теста МТТ, клонирование — с помощью клоногенного анализа . Проточная цитометрия служила для исследования апоптоза и фаз клеточного цикла . Белки, регулирующие клеточный цикл, и сигнальная ось mTOR–akt анализировались с помощью вестерн-блоттинга . 

Основные выводы

Амигдалин дозозависимо уменьшал рост опухолевых клеток с максимальным эффектом при 10 Белки клеточного цикла cdk 1, cdk 2 и cdk 4, а также циклин A , циклин B и циклин D3 модулировались амигдалином как через 24 часа, так и через 2 недели. Отчетливое влияние на экспрессию p19 и p27, а также на активацию Akt, Rictor и Raptor стало очевидным только через 2 недели. мг/мл. Апоптоз клеток PC3 и LNCaP , но не DU-145, был снижен, тогда как образование колоний было подавлено во всех клеточных линиях. Было зарегистрировано снижение числа клеток G2/M- и S-фазы наряду с повышенным числом клеток G0/G1-фазы.   

Значение

Амигдалин проявляет значительную противоопухолевую активность как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-резистентных линиях клеток РПЖ и заслуживает дальнейшей оценки в терапевтических целях.

Введение

 В 2015 году в США было зарегистрировано 220 800 новых случаев рака предстательной железы (РПЖ), в то время как 27  540 мужчин умрут, что делает РПЖ, помимо рака кожи, наиболее часто диагностируемой злокачественной опухолью и второй по значимости причиной смерти от рака у мужчин [1]. Исключительная клиническая и экономическая значимость РПЖ способствовала проведению множества исследований, способствуя быстрому расширению возможностей лечения метастатического РПЖ [2]. Таким образом, значительное улучшение выживаемости на кастрационно-резистентной стадии было достигнуто за счет клинического применения новых препаратов для биосинтеза андрогенов и рецепторного таргетирования, радиофармацевтических препаратов, циторедуктивных и иммунотерапевтических агентов [3]. Предварительные данные также указывают на многообещающий результат ранней химиотерапии доцетакселом при кастрационно-чувствительном РПЖ, хотя для этой терапевтической концепции необходимы дальнейшие исследования [4]. Несмотря на обнадеживающие результаты новых протоколов, первичная или приобретенная лекарственная резистентность исключает долгосрочный ответ. Перекрестная резистентность часто ограничивает эффективность последующей терапии [5]. Кроме того, побочные эффекты, требующие тщательного наблюдения за пациентами и даже прерывания лечения, могут ограничивать клиническое применение [6].Чтобы избежать токсичности, укрепить иммунную систему и, возможно, предотвратить рецидив РПЖ [7], наблюдается рост популярности комплементарной и альтернативной медицины (КАМ), несмотря на скудную доказательную эффективность [8]. Около трети пациентов с РПЖ, и даже больше с запущенным заболеванием, используют КАМ в форме натуральных продуктов для здоровья, таких как витамин Е, пальма сереноа, селен и ликопин [9], [10]. Из-за зарегистрированной противоопухолевой активности цианогенное вещество, диглюкозид амигдалин ( d -манделонитрил-β-гентиобиозид), использовалось в качестве синергического партнера с известными средствами для лечения РПЖ. Предполагается, что это вещество, в изобилии встречающееся в косточках плодов видов Rosaceae, поможет предотвратить негативные эффекты химиотерапии [11]. Однако воздействие амигдалина на РПЖ и его молекулярный механизм активности еще предстоит выяснить.Целью настоящего исследования было изучение влияния амигдалина на способность к росту и молекулярные механизмы в трех линиях клеток РПЖ.

Культура клеток

Клеточные линии рака простаты человека PC3, DU-145 (устойчивые к кастрации) и LNCaP (чувствительные к кастрации) были получены из DSMZ (Брауншвейг, Германия). Опухолевые клетки выращивали и субкультивировали в RPMI 1640 (Gibco/Invitrogen; Карлсруэ, Германия). Среда содержала 10% сыворотки плода теленка (FCS), 2% буфера HEPES (1  М, pH  7,4), 2% глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина.

Лечение амигдалином

Амигдалин из абрикосовых косточек (Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия) был свежерастворен в среде для культивирования клеток (1–10  мг/мл) и

Анализ зависимости реакции от дозы

Воздействие амигдалина на опухолевые клетки PC3, DU-145 и LNCaP в течение 24  ч привело к зависимому от концентрации снижению числа опухолевых клеток, причем наиболее выраженные эффекты были очевидны в присутствии 10  мг/мл (рис. 1А, 24  -часовая инкубация). Тот же ответ наблюдался, когда опухолевые клетки хронически обрабатывались амигдалином в течение 2  недель (рис. 1А, 2-недельная инкубация). Тест исключения трипанового синего не выявил токсических эффектов на линии опухолевых клеток после воздействия  амигдалина в концентрации 10 мг/мл (данные не показаны). Поскольку

Обсуждение

Это исследование показывает, что лечение амигдалином значительно снижает скорость роста как кастрационно-чувствительных (LNCaP), так и кастрационно-устойчивых (PC3, DU-145) клеточных линий и ослабляет образование клонов во всех трех клеточных линиях без токсических эффектов. Эти результаты согласуются с отчетами, показывающими ингибирующее рост, антипролиферативное и проапоптотическое действие амигдалина на промиелоцитарный лейкоз [12], рак толстой кишки [13], рак шейки матки [14] и клетки рака мочевого пузыря [15]. В настоящее время

Заключение

Эти результаты указывают на заслуживающую внимания противоопухолевую активность природного соединения, амигдалина, как в кастрационно-чувствительных, так и в кастрационно-устойчивых клетках РПЖ. Дальнейшая проверка этих предварительных данных необходима in vitro и in vivo, чтобы выяснить, заслуживает ли амигдалин оценки в надлежащим образом спланированных будущих клинических испытаниях.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана « Фондом Бригитты и Норберта Мут » и « Vereinigung von Freunden und Förderern der Goethe-Universität ».