Тэг: меланома

DCA усиливает противоопухолевое действие капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 мыши и ксенотрансплантате немелкоклеточного рака легкого A549 человека

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1007/s00280-013-2281-z

Кафедрабиохимии, факультет наук о жизни, Фуданьский университет, Хандан Роуд 220, Шанхай, 200433, Китай.
Электронная почта: e-mail: whuang@fudan.edu.cn


Получено: 16 мая 2013 г.
Принято: 27 августа 2013 г.
Опубликовано: 17 сентября 2013 г

Аннотация

Цель: Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью. Недавно дихлорацетат натрия (ДХА) показал большой потенциал в качестве противоракового агента. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином при раке со скромной экспрессией TP.

Методы: Для оценки эффекта комбинированного лечения DCA и капецитабином использовали аллотрансплантат меланомы мыши B16 и ксенотрансплантат немелкоклеточного рака легкого человека A549. Гистология и иммуногистохимия использовались для выявления апоптоза и пролиферации раковых клеток. ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот проводились для определения экспрессии TP и каспаз, соответственно.

Результаты: Впервые мы сообщаем, что DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в мышином аллотрансплантате B16 и человеческом ксенотрансплантате A549, способствуя апоптозу опухолевых клеток. DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP.

Выводы: Наши результаты свидетельствуют о том, что DCA в комбинации с капецитабином может стать потенциально новым терапевтическим режимом против некоторых видов рака.

Ключевые слова: DCA, капецитабин, комбинация, противоопухолевый эффект

ВВЕДЕНИЕ

Дихлорацетат натрия (ДХА) — это маленькая молекулярная соль дихлоруксусной кислоты с молекулярной массой 150 Да. DCA ингибирует активность киназы пируватдегидрогеназы, тем самым активируя митохондриальный ферментный комплекс пируватдегидрогеназы [1] и переводя гликолитический путь метаболизма на окислительное фосфорилирование. В течение последних 40 лет DCA использовался в качестве сиротского препарата для лечения врожденного молочнокислого ацидоза у детей и молочнокислого ацидоза, осложненного другими заболеваниями [2], и показал высокую эффективность и низкую токсичность как в доклинических, так и в клинических испытаниях [3]. Недавно DCA продемонстрировал большой потенциал в качестве противоракового средства из-за сходства метаболического ремоделирования некоторых опухолевых клеток с процессами, происходящими при молочнокислом ацидозе [4]. Раковые клетки, особенно раковые стволовые клетки (РСК), сопротивляются апоптозу, производя энергию путем гликолиза и молочнокислого брожения, а не окислительного фосфорилирования, из-за гипоксической природы опухолевой микросреды — явления, известного как эффект Варбурга [5,6]. Было показано, что после перорального приема DCA восстанавливает функцию митохондрий и избирательно способствует апоптозу опухолевых клеток по митохондриально-зависимому пути [7,8]. Терапевтическая активность DCA против глиобластомы была проверена в клинических испытаниях (NCT00540176) и показала некоторые положительные результаты [9]. Однако исследование II фазы NCT01029925 по определению частоты ответа на пероральный прием дихлорацетата у пациентов с рецидивирующим и/или метастатическим и предварительно леченным раком молочной железы и немелкоклеточным раком легкого было прекращено из-за более высокого, чем ожидалось, риска и проблем с безопасностью. Таким образом, клиническая польза DCA для борьбы с раком нуждается в более тщательной оценке.

Как сенсибилизатор апоптоза, DCA также использовался в комбинации с другими методами лечения рака. Cao и другие [10] сообщили, что DCA сенсибилизировал клетки рака простаты к радиации in vitro. Сяо и др. [11] установили, что DCA усиливает гибель опухолевых клеток в сочетании с онколитическим аденовирусом, экспрессирующим опухолевый супрессор MDA-7/IL-24. Недавно метаболическая таргетная терапия с использованием DCA была продемонстрирована как новая стратегия лечения для улучшения результатов фотодинамической терапии [12]. Тонг и др. [13] обнаружили, что DCA и 5-фторурацил проявляют синергетический противоопухолевый эффект в клетках колоректального рака in vitro. Однако до сих пор существуют противоречивые результаты и сомнения относительно применения DCA отдельно или в комбинации с другими препаратами. Шахрзад и др. [14] показали, что DCA снижает апоптоз раковых клеток в гипоксических условиях как in vitro, так и in vivo. Хеше и др. [15] предупредили, что DCA снижает цитотоксичность некоторых стандартных противораковых препаратов, таких как цисплатин и доксорубицин, но не влияет на активность темозоломида в 7 из 10 клеточных линий в их исследовании. Эти противоречивые результаты означают, что применение DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения может зависеть от типа рака и конкретного агента.

Капецитабин является одним из немногих химиотерапевтических препаратов с высокой пероральной доступностью и лицензирован в качестве первой линии лечения метастатического рака прямой кишки или альтернативного лечения метастатического рака молочной железы в сочетании с доцетакселом [16,17]. Капецитабин является пролекарством 5-фторурацила (5-ФУ) и требует 3 ферментативных реакций для окончательного превращения в 5-ФУ в опухолевых клетках. Последняя реакция катализируется тимидинфосфорилазой (TP), которая в некоторых опухолях выражена в большей степени, чем в нормальных тканях [18]. Поэтому цитотоксический 5-ФУ образуется в большей степени в опухолевых клетках, чем в тканях вне опухоли, что делает капецитабин малотоксичным химиотерапевтическим препаратом [18]. Уровни экспрессии TP различны в разных типах опухолей [18]; это ограничивает применение капецитабина только несколькими типами рака. В настоящем исследовании мы оценили противораковый эффект DCA в комбинации с капецитабином для раковых опухолей со скромной экспрессией TP. Мы предположили, что DCA усиливает противораковый эффект и снижает эффективную дозу капецитабина. Комбинация DCA с капецитабином может дать хорошую схему лечения, поскольку оба агента можно принимать перорально при хорошей приверженности пациентов. Кроме того, генерические формы DCA могут снизить эффективную дозу капецитабина, тем самым уменьшая побочные эффекты и стоимость лечения рака.

Материалы и методы

Материалы
Дихлорацетат натрия (ДХА, CSA:2156-56-1), чистота 99 %, был получен от компании Shanghai Jieshi Chemical Co. (Китай). 5-фторурацил (5-FU) и 5′-дезокси-фторуридин (5DFUR) были получены от Sigma-Aldrich (США). МТТ был получен от Shanghai Biological Engineering Co. (Китай). Таблетки капецитабина (Xeloda) были получены от Roche (США). Мышиная меланома B16 и человеческая немелкоклеточная линия клеток рака легкого A549 были получены из Американской коллекции клеточных культур (ATCC, США).

Исследования на животных моделях

Модель аллотрансплантата

Мыши C57BL/6, самки, возраст 6-8 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Один миллион одиночных клеток B16 был подкожно (s.c.) инокулирован в правый фланг мышей C57BL/6. Мышей разбили на случайные группы, по 6 мышей на группу в клетке. Было две группы мышей. DCA и капецитабин вводили этим двум группам мышей через 3 и 10 дней после инокуляции, соответственно. DCA добавляли в стерильную питьевую воду до конечной концентрации 1,4 г/л. Измерение объема потребленной воды показало, что количество ДКА, введенного каждой мыши, было приблизительно равно 100 мг/кг/день. Таблетки капецитабина измельчали и суспендировали в стерильной воде с 4 % карбоксиметилцеллюлозы для получения различных концентраций. Двести микролитров суспензии капецитабина вводили внутрижелудочно каждой мыши. Каждые 2 дня длинный (a) и короткий (b) диаметры опухолей измеряли с помощью штангенциркуля, а также регистрировали массу тела. Объем опухоли рассчитывали по формуле V = 0,5ab2. Через 22 дня после инокуляции мышей умертвили, опухоли удалили и взвесили.

Модель ксенотрансплантата

Мыши BALB/c-nu, самцы, возраст 5-6 недель, весом около 18-20 г, были приобретены в Шанхайском центре лабораторных животных (SLAC, Китай) и акклиматизированы в течение 1 недели. Приблизительно 2 × 2 мм срезы только что измельченных опухолевых тканей A549, полученных от мышей BALB/c-nu, ранее инокулированных клетками A549, были введены внутривенно в область правого фланга самцов мышей BALB/c-nu. DCA и капецитабин вводили мышам, когда объем опухоли достигал ~0,2 см3. Через тридцать-тридцать пять дней после лечения мышей умерщвляли, опухоли удаляли и взвешивали. Другие методы были такими же, как описанные в эксперименте с аллотрансплантацией.

Исследования на животных были одобрены группой по благополучию животных и этике факультета лабораторных животных Фуданьского университета.

Гистология и иммуногистохимия
Гистологическое исследование опухолевых узлов проводили с использованием дополнительных животных (по 3 мыши в каждой группе), которые не рассматривались для мониторинга роста опухоли. Ткани фиксировали в 4 % (w/v) параформальдегиде, после фиксации в течение ночи при комнатной температуре образцы обезвоживали в градуированном этаноле и встраивали в парафин. После этого различные части опухоли произвольно вырезали для получения 4-мкм срезов на микротоме Leica. После депарафинизации и регидратации три среза из разных частей каждого образца были отобраны для последующих операций. Терминальное дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованное никелирование концевого участка ДУТФ (TUNEL) и окрашивание 4′6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) проводили в соответствии с инструкциями производителей наборов TUNEL и DAPI (Beyotime, Китай). Срезы анализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Olympus, Япония). Выявление ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) проводили после депарафинизации срезов и инкубации при 96-100 °C в течение 20 мин. Активность эндогенной пероксидазы гасили 0,3 % (v/v) перекисью водорода в 60 % (v/v) метаноле в течение 30 мин. Неспецифическую адсорбцию минимизировали путем инкубации срезов в 2 % (v/v) нормальной козьей сыворотке в PBS в течение 20 мин. Участки тканей инкубировали в течение ночи с кроличьим поликлональным антителом анти-PCNA (Abcam; 1:100 в PBS), промывали PBS 3 раза, по 30 мин каждый раз, и инкубировали с биотин-конъюгированным козьим антирабическим IgG в течение 2 ч при 37 °C и авидин-биотин-пероксидазным комплексом в течение 1 ч при 37 °C. Срезы контрастировали гематоксилином (Sigma-Aldrich) и анализировали с помощью световой микроскопии (Olympus, Япония). Для анализа иммуногистохимии использовали по три опухоли на группу. Один или два среза на опухоль были слепо отобраны для измерения PCNA- или TUNEL-позитивных клеток. Пять случайных полей на слайде при увеличении 400× измеряли вслепую (n = 250 клеток на группу). При проведении количественного анализа TUNEL-позитивных клеток, возможные некротические клетки исключались путем наблюдения за ядерной морфологией с помощью окрашивания DAPI. Для обеспечения точности результатов проводили как положительный, так и отрицательный контроль.

Выделение белка и вестерн-блоттинг
Опухолевые ткани из каждой группы (3 дополнительные мыши в каждой группе) были объединены вместе и измельчены под жидким азотом, а затем лизированы в 150

мкл

буфера для лизиса тканей (Beyotime, Китай). Пробирки энергично встряхивали в течение 1 мин, помещали на лед на 20 мин и центрифугировали при 5 000g в течение 5 мин при 4 °C. Концентрацию общего белка определяли с помощью набора для определения белка BCA (BioRad). Тридцать микрограммов общего белка из каждого образца разделяли методом SDS-PAGE на 10 % геле, переносили на PVDF мембрану, блокировали, инкубировали в течение ночи с первичным антителом, инкубировали в течение 1 ч с вторичным антителом и окрашивали хромогенным субстратом NBT/BCIP. Мышиное моноклональное антитело против антикаспазы 3 (1:500), антитело против антикаспазы 9 (1:1 000), анти-β-актин (1:2 000) и кроличье поликлональное антитело против антикаспазы 8 (1:1 000) были получены от Beyotime (Нанкин, Китай). Мышиное моноклональное антитело анти-ТФ (1:2,000) было получено от Abcam (Великобритания). в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Плотность полос вестерн-блота анализировали с помощью программы Clinx Gel Analysis V2.02 (Clinx Science, Китай).

ПЦР в реальном времени
Опухоли B16 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши C57BL/6, ранее инокулированной клетками B16 (использовали 3 мышей, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Colo205/A549 и ткани печени были взяты от одной и той же мыши BALB/c-nu, ранее инокулированной клетками Colo205/A549 (3 мыши были использованы, соответственно, подарок Wenlong Ren из Шанхайского института фармацевтической промышленности). Для анализа экспрессии TP после лечения образцы опухолей объединяли из 3 опухолевых тканей одинакового веса в каждой группе. Тотальную РНК выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США) и подвергали обратной транскрипции с помощью набора реагентов PrimeScript® RT (Takara, Япония). кДНК нормировали на β-актин. ПЦР в реальном времени проводили трехэтапным методом с использованием набора SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takata, Япония) с температурой отжига 55 °C и 40 циклами амплификации. Отдельный тест проводили в трех экземплярах. в качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Относительное количество каждой кДНК анализировали с помощью2-△△Ct. Праймеры для ПЦР в реальном времени: β-актин F: 5′-TCAAGATCATTGCTC CTCCTG-3′ и β-актин R: 5′-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3′, hTP F: 5′-TGGCTCAGTCGGGACAGCAG-3′ и hTP R: 5′-TCCGCTGATCATTG GCACCT-3′, mTP F: 5′-GCCTAGCTAAAGCATTGTGCTC-3′ и mTP R: 5′-AAGGGTGCT CGATCTGATAGCA-3′.

Статистика
Мы использовали множественные сравнения ANOVA с post hoc анализом (тест Тьюки), используя программное обеспечение SPSS 16.0 (SPSS Inc., США). Данные представлены как среднее ± SEM, значимым считалось P < 0,05.

Результаты

Экспрессия TP в меланоме мыши B16 и опухолях человека A549 NSCLC
Экспрессия TP в опухолях B16 и A549, удаленных у мышей, была проанализирована методом ПЦР в реальном времени. Печень человека экспрессирует относительно больше TP, чем другие нормальные ткани [18]. В типичных типах рака, подходящих для лечения капецитабином, экспрессия TP в опухоли близка или выше, чем в печени, например, в колоректальном раке и раке молочной железы [18,19]. В ксенотрансплантатах рака человека раковые опухоли с высокой активностью TP были более восприимчивы к лечению капецитабином, чем раковые опухоли с низкой активностью TP [20]. Клеточная линия колоректального рака Colo205 была выбрана в качестве эталона на основании ее умеренной экспрессии TP и умеренной чувствительности к капецитабину [21]. Как показано на рис. 1a, уровень транскрипции TP в Colo205 был немного выше, чем в печени мыши BALB/c-nu. Как показано на рис. 1б, в, уровни транскрипции TP в опухолях B16 и A549 были близки к таковым в печени мышей. Таким образом, B16 и A549 также являются умеренно экспрессирующими TP клеточными линиями. Мы можем сделать вывод, что B16 и A549 будут в определенной степени реагировать на лечение капецитабином, не перекрывая эффект DCA. Таким образом, модели аллотрансплантата B16 и ксенотрансплантата A549 были пригодны для изучения противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина в комбинации.

Рисунок 1. По сравнению с печенью мыши, опухоли B16 и A549 скромно экспрессируют TP ПЦР в реальном времени Анализ уровня транскрипции TP. Использовались праймеры, специфически нацеленные на ТП мыши и человека. Праймер на β-актин подходит как для мышей, так и для человека. a Уровень транскрипции TP в опухоли Colo205 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. b Уровень транскрипции TP в опухоли A549 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей BALB/c-nu. c Уровень транскрипции TP в опухоли B16 по сравнению с уровнем транскрипции в печени мышей-носителей C57BL/6. В каждой группе использовались образцы от 3 мышей

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате мышиной меланомы B16 без дополнительной токсичности
Поскольку гипоксическая природа опухолевой микросреды является критической для оптимальной активности DCA, противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин был протестирован на животных моделях вместо клеточных линий. Тридцать шесть мышей C57BL/6 были инокулированы 1 ×106 клетками меланомы B16 и случайным образом разделены на 6 групп (n = 6): контрольная группа, не получавшая лекарств, группа, получавшая только DCA, группа, получавшая только капецитабин 10 мг/день, и три группы, получавшие DCA плюс капецитабин 5, 10 или 20 мг/день. Через три дня после инокуляции опухолевых клеток мышам вводили DCA в питьевой воде и перорально (p.o.) капецитабин в качестве отдельных агентов или в комбинации с возрастающими концентрациями капецитабина. Как показано на верхней панели рис. 2a, как DCA, так и капецитабин в дозе 10 мг/день в одиночку незначительно подавляли рост опухолей меланомы B16 по сравнению с контрольной группой. Напротив, DCA плюс 10 мг/день капецитабина значительно усиливали ингибирование роста опухоли (P < 0,05). Противоопухолевый эффект DCA плюс 20 мг/день капецитабина был аналогичен тому, который наблюдался при использовании DCA плюс 10 мг/день капецитабина; рост опухоли был почти полностью подавлен. Примечательно, что у мышей, получавших DCA плюс 20 мг/день капецитабина, наблюдалось резкое снижение массы тела (рис. 2а, нижняя панель), в то время как DCA плюс 10 мг/день капецитабина практически не влиял на массу тела по сравнению с контролем.

Рисунок 2. DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в аллотрансплантате меланомы B16 у мышей без дополнительной токсичности. a Через три дня после инокуляции мышам вводили DCA и капецитабин (CAP) по отдельности или в комбинации. Вводили эскалированные дозы [5, 10 и 20 мг/день (мг/день)] капецитабина в комбинации с постоянной дозой DCA. Показаны кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель). b Через 10 дней после прививки мышам вводили DCA и 7,5 мг/день капецитабина отдельно или в комбинации. Представлены кривая объема опухоли(верхняя панель) и кривая массы тела(нижняя панель)

Для оценки противоопухолевого эффекта DCA плюс капецитабин против пальпируемых, обнаруживаемых опухолей, через 10 дней после инокуляции опухолевых клеток, DCA и капецитабин отдельно или в комбинации вводили второй группе из 36 мышей C57BL/6, инокулированных 1 ×106 клетками меланомы B16. Мыши с пальпируемыми опухолями были случайным образом разделены на 4 группы (n = 9, 3 мыши использовались для анализа иммуногистохимии): контроль, только DCA, только капецитабин в дозе 7,5 мг/день и DCA плюс капецитабин в дозе 7,5 мг/день. Как показано на верхней панели рис. 2б, DCA плюс капецитабин 7,5 мг/день значительно подавляли рост опухоли по сравнению с DCA или капецитабином (P < 0,05). Через 22 дня после инокуляции DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина подавляли рост опухоли на 75 % (P < 0,05), в то время как только DCA и капецитабин подавляли рост только на 25 % и 35 %, соответственно (P < 0,05). DCA не вызывал резкой потери массы тела по сравнению с лечением только капецитабином (рис. 2b, нижняя панель). Эти результаты показывают, что DCA и капецитабин могут оказывать синергетический противоопухолевый эффект в опухолях меланомы B16.

DCA усиливает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели НСКЛ человека A549 без дополнительной токсичности
Ранее сообщалось, что НСКЛ человека можно лечить либо DCA [7], либо капецитабином [22-24]. В настоящем исследовании мы изучили противоопухолевый эффект DCA плюс капецитабин в модели ксенотрансплантата НСКЛ A549 человека. Шестьдесят шесть самцов мышей BALB/c-nu с опухолями человека NSCLC A549 (~2 × 2 мм), привитыми внутривенно в правый фланг, были случайным образом разделены на 9 групп: контроль; только DCA; 2,5, 5, 7,5 или 10 мг/день только капецитабина; или DCA плюс 2,5, 5 или 7.5 мг/день капецитабина (n = 6, кроме контроля, только DCA, 7,5 мг/день капецитабина и DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина; в этих группах n = 9, 3 мыши были использованы для иммуногистохимического анализа и анализа Вестерн-блот или ПЦР в реальном времени). Капецитабин в дозе 10 мг/день был установлен в качестве контроля высокой дозы. Когда объем опухоли достигал 0,15-0,2 см3, мышам вводили препараты. Капецитабин вводили внутривенно по схеме 14 дней в день/7 дней в день. Как показано на левой панели рис. 3a, b и c, только DCA оказывал незначительное ингибирующее действие на опухоли A549; этот результат не согласуется с данными предыдущих отчетов [7], в которых только DCA проявлял больший противоопухолевый эффект. Только капецитабин в дозе 10 мг/день значительно подавлял рост опухолей A549, но при этом отмечалось резкое снижение массы тела, что указывает на сильную токсичность (рис. 3a, b, c, правые панели). Как показано на левой панели рис. 3а, 2,5 мг/день только капецитабина значительно уменьшали рост опухолей A549; комбинация DCA плюс 2,5 мг/день капецитабина усиливала ингибирование роста. Кривая увеличения объема опухоли при лечении только DCA предполагает, что капецитабин оказывает доминирующее противоопухолевое действие при комбинированном лечении. Эффект DCA плюс 5 мг/сут капецитабина был немного лучше, чем DCA плюс 2,5 мг/сут капецитабина, хотя и хуже, чем 10 мг/сут капецитабина, и не наблюдалось значительного снижения массы тела (рис. 3б, правая панель). Примечательно, что DCA плюс 5 мг/сут капецитабина значительно усилили ингибирование роста опухоли по сравнению с 5 мг/сут только капецитабина (рис. 3б, левая панель). Противоопухолевый эффект комбинации был близок к лечению капецитабином 10 мг/день, но без значительной потери массы тела (рис. 3б, правая панель). Эффект только капецитабина 7,5 мг/сут (рис. 3c) был немного лучше, чем капецитабина 5 мг/сут; однако при сочетании с ДКА не было значительной разницы между ДКА плюс капецитабин 7,5 мг/сут и ДКА плюс капецитабин 5 мг/сут. Эти результаты означают, что DCA может снизить дозу капецитабина без потери противоопухолевого эффекта или увеличения токсичности.

Рисунок 3. DCA увеличивает противоопухолевый эффект капецитабина в ксенотрансплантационной модели NSCLC A549 человека без дополнительной токсичности. a DCA плюс 2,5 мг/день (мг/день) капецитабина. b DCA плюс 5 мг/день капецитабина. c DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. Группа лечения капецитабином 10 мг/день использовалась в качестве контроля больших доз. Показаны кривые роста опухоли(левые панели) и кривые массы тела(правые панели). Объем опухоли представлен на логарифмической оси

DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина на клетки B16 и A549 in vivo
Гистологическое исследование опухолей меланомы B16 проводилось через 7 дней после начала лечения. Окрашивание TUNEL показало, что лечение опухолей меланомы B16 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало клеточный апоптоз на 8 и 17 %, соответственно. В комбинации DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина индуцировали апоптоз примерно на 30 %, что больше, чем сумма отдельных препаратов вместе взятых (рис. 4a, c, левая панель). Окрашивание PCNA в опухолях меланомы B16 показало, что только DCA оказывал незначительное влияние на пролиферацию, в то время как капецитабин 7,5 мг/день значительно снижал пролиферацию. DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина не усиливали ингибирование пролиферации только капецитабином в опухолевых клетках B16 (рис. 4b, c, правая панель).

Рисунок 4. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях меланомы B16. a Иммунофлуоресцентное окрашивание TUNEL образцов опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Иммуногистохимический анализ антигена пролиферации PCNA в образцах опухолей меланомы B16 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. c Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток(слева) и PCNA-позитивных клеток(справа). *P < 0.05

Подобно опухолям меланомы B16, лечение опухолей NSCLC A549 только DCA или 7,5 мг/день капецитабина индуцировало апоптоз на 15 и 30 %, соответственно. При совместном применении DCA плюс 7,5 мг/сут капецитабина индуцировали апоптоз на 50 %, что больше, чем сумма лечения одним агентом вместе взятым (рис. 5a, b). Эти результаты позволяют предположить, что DCA и капецитабин оказывают синергетическое действие на апоптоз опухолевых клеток NSCLC A549. DCA не усиливал ингибирование пролиферации капецитабином в опухолевых клетках NSCLC A549 (данные не показаны).

Рисунок 3. DCA усиливает апоптотический эффект капецитабина в опухолях NSCLC A549. a Иммуногистохимический анализ TUNEL образцов опухолей NSCLC A549 от мышей, получавших DCA, 7,5 мг/день только капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина в течение 7 дней. b Количественный анализ TUNEL-позитивных клеток. c Вестерн-блот активации каспаз в опухолях NSCLC A549. Активация инициаторных каспаз (каспазы 8 и каспазы 9) и эффекторных каспаз (каспазы 3) была обнаружена в опухолях NSCLC A549, инокулированных мышам BALB/c-nu, получавшим DCA, 7,5 мг/день капецитабина или DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина. d Плотный анализ расщепленных каспаз (C. caspase). Нормализовано по β-актину. *P < 0.05

Вестерн-блот показал, что DCA не оказывает значительного влияния на экспрессию и активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3 в опухолях NSCLC A549 по сравнению с контролем на 7-й день после лечения (рис. 5c, d). Только капецитабин в дозе 7,5 мг/день увеличивал активацию всех трех прокаспаз (рис. 5c, d). Интересно, что хотя DCA сам по себе не оказывал значительного влияния на экспрессию и активацию трех прокаспаз, DCA плюс капецитабин повышали экспрессию прокаспазы 8 и прокаспазы 3 по сравнению с лечением только капецитабином и усиливали активацию прокаспазы 8, прокаспазы 9 и прокаспазы 3.

DCA оказывает незначительное влияние на экспрессию TP в опухоли
Мы проанализировали экспрессию TP в образцах опухоли из ксенотрансплантата A549 на 7-й день после лечения. ПЦР в реальном времени (рис. 6a) и Вестерн-блот (рис. 6b) показали, что DCA как отдельный агент или в комбинации с капецитабином мало влияет на экспрессию TP, что означает, что механизм действия DCA и капецитабина в комбинации отличается от других синергистов капецитабина, о которых сообщалось ранее [19,25-27]. ПЦР в реальном времени также показала, что DCA не влияет на экспрессию других ферментов метаболизма капецитабина (тимидилат синтазы, оротат фосфорибозилтрансферазы, дигидропиримидин дегидрогеназы, тимидин киназы 1 и цитидин деаминазы, данные не показаны). Полученные результаты позволяют предположить, что DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не приведет к повышению токсичности капецитабина.

Рисунок 6. Транскрипция и экспрессия TP в опухоли A549 после лечения. a Анализ транскрипции TP методом ПЦР в реальном времени. Нормализовано по β-актину. b Вестерн-блот анализ экспрессии TP. в качестве внутреннего контроля использовался β-актин. Опухоли A549 резецировали у мышей BALB/c-nu через 7 дней после лечения DCA, 7,5 мг/день капецитабина, DCA плюс 7,5 мг/день капецитабина или контрольной группы. Образцы из трех опухолей каждой группы были объединены вместе

Обсуждение

DCA отдельно или в комбинации с другими методами лечения был протестирован в клинических испытаниях; однако нет сообщений о противоопухолевом действии DCA в комбинации с капецитабином. Мы предположили, что стимулирующее апоптоз действие DCA на клетки солидных опухолей сделает их более чувствительными к капецитабину. В настоящем исследовании только 1,4 г/л DCA не оказывал значительного влияния на рост опухоли NSCLC A549 у мышей. Однако совместное введение DCA и капецитабина позволило снизить эффективную дозу капецитабина на 50 %. DCA усиливал противоопухолевый эффект капецитабина in vivo через сенсибилизацию апоптоза. DCA оказывает незначительное влияние на метаболизм капецитабина, что не увеличивает токсичность капецитабина.

Поскольку были получены как положительные, так и отрицательные результаты (как показано в разделе «Введение»), до сих пор существуют разногласия по поводу использования DCA в качестве противоракового агента. Это расхождение может быть связано с различными экспериментальными условиями, особенно между результатами in vivo и in vitro. Клеточные анализы, использованные в настоящем исследовании, показали, что опухолевые клетки нечувствительны к DCA при культивировании in vitro, IC50 превышает 50 мМ. (данные не показаны). Действие DCA на раковые клетки не связано с прямой цитотоксичностью, а зависит от метаболического паттерна раковых клеток [7, 28]. Клеточные линии, культивируемые in vitro, не могут воспроизвести микроокружение опухоли и могут утратить «эффект Варбурга». Поэтому клеточные анализы in vitro могут быть не самыми подходящими модельными системами для определения применения DCA. Поэтому в настоящем исследовании комбинированный противоопухолевый эффект DCA и капецитабина был оценен на мышиных моделях опухолей in vivo. Мы также обнаружили, что эффект DCA на ксенотрансплантат NSCLC A549 в настоящем исследовании был меньше, чем в работе Bonnet et al. [7], даже несмотря на использование большей дозы DCA. Это может быть связано с разницей в метаболической способности ДКА у мышей и крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что на эффект ДКА может влиять состояние раковых клеток и состояние пациентов, что требует тщательного изучения при клиническом использовании ДКА в лечении рака.

В настоящем исследовании на животных моделях было показано, что DCA сам по себе проявляет слабый противоопухолевый эффект против установленных опухолей. Но в сочетании с капецитабином DCA резко усиливал противоопухолевый эффект капецитабина, что видно как из исследований на животных моделях, так и из результатов иммуногистохимии апоптоза. В соответствии с этим, анализ вестерн-блотов показал, что DCA сам по себе оказывает незначительное влияние на экспрессию и расщепление прокаспаз. Но в сочетании с капецитабином DCA значительно увеличивает экспрессию и расщепление прокаспаз 8, 9 и 3. Сообщается, что цитотоксический агент, такой как 5-Fu, может привести к увеличению экспрессии и активации каспазы 8 [29,30]. Причина, по которой капецитабин приводит к увеличению экспрессии и активации каспазы 9, до сих пор не ясна. Возможно, это связано с антиангиогенетическим действием капецитабина. Сообщается, что DCA может нормализовать ось митохондрий-K+ каналов и действовать как сенсибилизатор апоптоза [7]. Мы предполагаем, что DCA может деполяризовать митохондриальный потенциал раковых клеток, нормализуя эту ось, и тем самым усиливать активацию каспазы 8 и каспазы 9 капецитабином. Повышенная активация каспазы 8 и каспазы 9 приводит к повышенной активации каспазы 3.

Недавно был подчеркнут критический вклад CSCs с их повышенной опухолеродной способностью и устойчивостью к радио- и химиотерапии в злокачественное поведение [31]. Сообщается, что CSCs в солидных опухолях играют важную роль в антихимиотерапевтических и антирадиотерапевтических характеристиках опухолей [32, 33]. Обсуждается множество методов лечения, направленных на CSCs [34, 35], а комбинированные методы лечения, направленные как на CSCs, так и на «нормальные» раковые клетки, вызывают большой интерес [36-38]. Сообщается, что DCA индуцирует апоптоз в предполагаемых стволовых клетках глиобластомы как in vitro, так и in vivo [9]. В нашем исследовании после 7 дней лечения DCA количество CD133-положительных клеток в опухолевых срезах A549, определенных с помощью иммуногистохимии, уменьшилось до 0,5 % по сравнению с 6 % в контрольной группе (данные не показаны), что позволяет предположить, что DCA может также влиять на индуцирование апоптоза в КСК рака легких. Мы предполагаем, что DCA может сенсибилизировать опухолевые клетки, особенно КСК, к капецитабину. Комбинация DCA и капецитабина действует против опухолевых клеток двумя способами: капецитабин нацелен на «нормальные» раковые клетки, щадя CSCs, а DCA нацелен на CSCs и способствует апоптозу капецитабина. Другой вероятный сценарий объяснения эффекта комбинации заключается в том, что DCA подавляет ангиогенез рака in vivo [9], при котором DCA не проявляет прямого действия на раковые клетки. В дополнение к своей классической противоопухолевой активности, капецитабин может действовать как антиангиогенетическая молекула, согласно последним исследованиям [39]. DCA может усиливать антиангиогенный эффект капецитабина, что объясняет противоопухолевый эффект комбинации. Для определения подробного механизма будут проведены углубленные исследования.

В заключение, мы использовали модели опухолей, привитых сингенетически, и ксенотрансплантированных опухолей для изучения комбинированного противоопухолевого эффекта DCA и капецитабина и обнаружили, что DCA впервые потенцировал противоопухолевый эффект капецитабина. Мы определили, что DCA обладает способностью сенсибилизировать раковые клетки и усиливать апоптотическое действие капецитабина. При комбинированном применении DCA позволял снизить эффективную дозу капецитабина без увеличения токсичности. Недорогой, непатентованный и пероральный DCA в сочетании с пероральным капецитабином может стать хорошей терапевтической схемой против рака.

Благодарности

Мы очень благодарны Венлонг Рену из Шанхайского института фармацевтической промышленности за помощь в подготовке мышиных опухолевых моделей.

Конфликт интересов

Нет.

Долгосрочная стабилизация метастатической меланомы с помощью дихлорацетата натрия

Акбар Хан, Дуг Эндрюс, Джилл Шейнхаус, Аннеке С. Блэкберн

Акбар Хан, Дуглас Эндрюс, Medicor Cancer Centres Inc., Торонто, Онтарио M2N 6N4, Канада

Джилл Шейнхаус, Insight Naturopathic Clinic, Торонто, ON M4P 1N9, Канада

Аннеке С. Блэкберн, Школа медицинских исследований Джона Кертина, Австралийский национальный университет, Канберра, ACT 2601, Австралия 

Вклад авторов: Хан А. лечил пациента и написал большую часть отчета о случае; Эндрюс Д. помогал в разработке протокола натурального лечения для снижения побочных эффектов DCA и написал часть отчета о случае; Шейнхаус Дж. лечил пациента с помощью натуральной терапии; Блэкберн А.С. интерпретировал отчет о случае в контексте литературы по исследованиям DCA in vitro и in vivo, написал части введения и обсуждения, а также просмотрел рукопись в целом.

Заявление об информированном согласии: Пациентка, описанная в данной рукописи, дала согласие на публикацию своего случая анонимно. 

Заявление о конфликте интересов: Один из авторов (Хан) проводит терапию дихлорацетатом для онкологических больных через онкологические центры Medicor Cancer Centres за плату и без получения прибыли. Клиника принадлежит члену семьи этого автора. Другим авторам нечего раскрывать.

Открытый доступ: эта статья является статьей открытого доступа, которая была выбрана внутренним редактором и полностью проверена внешними рецензентами. Она распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), которая позволяет другим распространять, перерабатывать, адаптировать, строить на основе этой работы некоммерческие работы и лицензировать свои производные работы на других условиях, при условии, что оригинальная работа должным образом цитируется и использование является некоммерческим. См.: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Источник рукописи: приглашенная рукопись

Адрес для корреспонденции: Акбар Хан, доктор медицины, медицинский директор, 
Medicor Cancer Centres Inc., 4576 Yonge St., Suite 301, Toronto, 
ON M2N 6N4, Canada. akhan@medicorcancer.com
Телефон: +1-416-2270037
Факс: +1-416-2271915

  Получено:  30 января 2017 г.
  Начало рецензирования:  12 февраля 2017 г.
  Первое решение:  28 марта 2017 г.
  Исправлено:  5 мая 2017 г.
  Принято:  30 мая 2017 г.
  Статья в печати:  31 мая 2017 г.
  Опубликовано онлайн:  10 августа 2017 г.

Абстрактный

Дихлорацетат натрия (DCA) изучается как метаболическая терапия рака с 2007 года на основе публикации Bonnet et al, демонстрирующей, что DCA может вызывать апоптоз (запрограммированную гибель клеток) в клетках рака молочной железы, легких и мозга человека. Классически реакция рака на медикаментозную терапию в исследованиях на людях измеряется с помощью определений Критериев оценки ответа для солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации, однако стабилизация заболевания также является полезным клиническим результатом. Было показано, что DCA может функционировать как цитостатический агент in vitro и in vivo, не вызывая апоптоза. Представлен случай 32-летнего мужчины, у которого терапия DCA без сопутствующей традиционной терапии привела к регрессии и стабилизации рецидивирующей метастатической меланомы в течение более 4 лет с незначительными побочными эффектами. Этот случай демонстрирует, что DCA можно использовать для уменьшения объема заболевания и поддержания долгосрочной стабильности у пациентов с запущенной меланомой.

Ключевые слова: Дихлорацетат; Рак; BRAF; Меланома; Цитостатики

© Автор(ы) 2017. Опубликовано Baishideng Publishing Group Inc. Все права защищены.

Основная подсказка: Дихлорацетат натрия (DCA) изучается как метаболическая терапия рака с 2007 года. Было показано, что терапия DCA может привести к классическому ответу, который измеряется уменьшением или исчезновением опухолей при визуализации. Однако DCA может также остановить рост раковых клеток, не вызывая апоптоза (цитостатический эффект). Это может привести к долгосрочной стабилизации метастатического рака. Мы представляем случай пероральной терапии DCA, которая привела к уменьшению и стабилизации метастатической меланомы у 32-летнего мужчины в течение более 4 лет, с небольшими побочными эффектами.

Хан А., Эндрюс Д., Шейнхаус Дж., Блэкберн А.К. Долгосрочная стабилизация метастатической меланомы с помощью дихлорацетата натрия.
World J Clin Oncol 2017; 8(4): 371-377

Доступно по адресу: URL: http://www.wjgnet.com/2218-4333/full/v8/i4/371.htm
DOI: http://dx.doi.org/10.5306/wjco.v8.i4.371

ВВЕДЕНИЕ

Дихлорацетат натрия (DCA) привлек внимание медицинского сообщества в 2007 году, когда Боннет и др.  опубликовали первое исследование in vitro и in vivo, иллюстрирующее ценность DCA как метаболической терапии рака посредством его ингибирующего действия на митохондриальный фермент пируватдегидрогеназу киназу. Ранее Стакпул и др. опубликовали несколько исследований DCA для лечения врожденного лактатацидоза при митохондриальных заболеваниях. Эти исследования показали, что пероральный DCA является безопасным препаратом для использования человеком. Было отмечено, что DCA не оказывает почечной, легочной, костномозговой и сердечной токсичности . Большинство побочных эффектов DCA были умеренными, причем наиболее серьезным из них была обратимая периферическая невропатия . Также сообщалось об обратимом делирии. Повышение уровня печеночных ферментов (бессимптомное и обратимое) было отмечено у небольшого процента пациентов. Предшествующие исследования митохондриальных расстройств на людях позволили быстро перевести DCA на использование человеком в качестве не по назначению терапии рака. В настоящее время опубликовано несколько отчетов о клинических испытаниях с использованием DCA в качестве терапии рака, подтверждающих его профиль безопасности и указывающих на растущее признание потенциальной полезности DCA в онкологической клинике . Одним из ограничений этих исследований с участием пациентов на поздней стадии является то, что они сообщали только о лечении в течение коротких периодов времени.

В публикации Бонне 2007 года  было показано, что лечение DCA снижает потенциал митохондриальной мембраны, что селективно способствует апоптозу в раковых клетках человека. Ингибирование аэробного гликолиза (эффект Варбурга) и активация митохондриальных калиевых ионных каналов были идентифицированы как механизмы действия DCA. Дальнейшие исследования DCA in vitro подтвердили противораковую активность против широкого спектра типов рака, которые были недавно рассмотрены Канкотией и Стэкпулом . Кроме того, DCA также способен усиливать апоптоз в сочетании с другими агентами . Также были предложены другие противораковые действия DCA, включая ингибирование ангиогенеза  , изменение экспрессии HIF1-α , изменение регуляторов pH клеток V-АТФазы и MCT1, а также других регуляторов выживания клеток, таких как p53 и PUMA . Однако во многих исследованиях in vitro используются неоправданно высокие концентрации DCA, которые клинически недостижимы, в попытке продемонстрировать цитотоксическую активность.. В других исследованиях использовались более скромные концентрации DCA, что показало, что DCA может быть цитостатическим. Во втором отчете 2010 года о его противораковой активности in vivo было обнаружено, что DCA сам по себе является цитостатическим в метастатической модели рака молочной железы , ингибируя пролиферацию, не вызывая апоптоз. Это предполагает роль DCA как стабилизатора рака, аналогичного ингибиторам ангиогенеза.

В ответ на отчет 2007 года о противораковом действии DCA Хан начал использовать DCA для лечения онкологических больных с коротким прогнозом или тех, кто перестал реагировать на традиционные методы лечения рака. В сотрудничестве с врачом-натуропатом (Эндрюс) был разработан протокол натурального лечения для решения проблемы ограничивающей дозу неврологической токсичности DCA. Он состоял из 3 лекарств: ацетил L-карнитин , R-альфа-липоевая кислота и бенфотиамин для профилактики нейропатии и энцефалопатии. У более чем 300 пациентов с поздней стадией рака наблюдательные данные показали, что терапия DCA принесла пользу в 60% -70% случаев. Риск нейропатии при сочетании натуральных нейропротекторных лекарств с DCA составлял приблизительно 20% при дозировке 20-25 мг/кг в день в течение 2 недель приема/1 недели перерыва (клинические наблюдательные данные опубликованы онлайн на сайте www.medicorcancer.com). Здесь представлен отчет о случае пациента, иллюстрирующий как апоптотический, так и антипролиферативный эффект хронического лечения DCA в течение более четырех лет.

ОТЧЕТ О ДЕЛЕ

32-летний ранее здоровый светлокожий мужчина изначально заметил, что родинка на его левой икре начала меняться в 2006 году. Он обратился к врачу, и родинка была удалена. Был поставлен патологический диагноз меланомы. Была проведена диссекция сторожевого узла, которая оказалась отрицательной на метастатическое заболевание. В 2007 году пациент отметил увеличение левых паховых лимфатических узлов и небольшие меланоцитарные поражения на коже левой ноги. Он прошел лечение интерфероном альфа в рамках клинического испытания в региональной онкологической больнице, что привело к уменьшению узлов и разрешению кожных метастазов. Интерферон был отменен через 9 месяцев из-за побочных эффектов.
Пациент оставался в хорошем состоянии до 2010 года, когда появился новый кожный метастаз левой ноги. Он был хирургически удален. В конце 2011 года был обнаружен еще один новый кожный метастаз на левой ноге в рубце от первоначальной операции по удалению меланомы. Была проведена биопсия, и был подтвержден диагноз рецидивирующей меланомы. Затем ему сделали широкое иссечение и пересадку кожи.
В марте 2012 года у пациента диагностировали рецидив в кожном лоскуте левой ноги. Он был иссечен, и была проведена новая процедура пересадки кожи. Патология выявила положительные края иссеченного метастаза, поэтому была проведена повторная резекция, снова с положительными краями. В то же время игольчатая биопсия левого пахового лимфатического узла подтвердила наличие BRAF-положительной метастатической меланомы. Компьютерная томография (КТ), проведенная в марте 2012 года, не выявила никаких признаков отдаленных метастазов. Самый большой левый паховый узел имел диаметр 8 мм, что было сообщено как «незначительный по критериям размера» (рисунок 1).
В апреле 2012 года пациент обратился к врачу-натуропату (Shainhouse) и начал терапию следующими пероральными натуральными противораковыми средствами: активное гексозо-коррелированное соединение или AHCC (экстракт гриба) , корень одуванчика  , куркумин и корень астрагала  . Также была начата парентеральная терапия, которая состояла из внутривенного витамина С два раза в неделю и подкожного экстракта омелы европейской. Пациент также перешел на веганскую диету.
В мае 2012 года пациент посетил клинику автора (Khan), желая получить дополнительные нетрадиционные методы лечения. Обсуждалась терапия DCA, но пациент решил сначала провести адекватную пробу натуральных противораковых методов лечения (прописанных Shainhouse). В мае 2012 года была проведена повторная КТ (всего через 1 месяц естественной терапии), которая выявила умеренное увеличение множественных паховых и наружных подвздошных узлов размерами от 10 мм × 11 мм до 14 мм × 15 мм.
В июле 2012 года КТ-сканирование было повторено для оценки естественной противораковой терапии пациента. В то время левые паховые и наружные подвздошные узлы снова увеличились и имели размер от 13 мм × 16 мм до 22 мм × 20 мм (рисунок 2). ПЭТ-сканирование также было проведено в рамках подготовки к участию в клиническом исследовании в Бостоне, штат Массачусетс (США), и подтвердило повышенное поглощение глюкозы в левых паховых узлах. Появилась новая слабая (2/10) ноющая боль в левой паховой области. Обследование выявило 20-миллиметровый безболезненный левый паховый лимфатический узел и два небольших кожные метастаза в пределах кожного трансплантата левой голени.

Рисунок 1. Компьютерная томография от марта 2012 г. до естественной терапии и до терапии дихлорацетатом. Самый большой узел имел диаметр 8 мм.Рисунок 2. Компьютерная томография от июля 2012 г. после 3 месяцев только естественной терапии, непосредственно перед началом терапии дихлорацетатом. Самый большой узел имел размеры 22 мм × 20 мм.

Таким образом, у пациента диагностировали прогрессирование заболевания. В этот момент он решил начать терапию DCA. Он начал принимать DCA перорально по 500 мг 3 раза в день, что было эквивалентно 17 мг/кг в день (производитель: Tokyo Chemical Industry, США) в дополнение к поддержанию других натуральных методов лечения. Цикл лечения DCA составлял 2 недели приема и 1 неделю перерыва. Чтобы свести к минимуму возникновение побочных эффектов DCA, были назначены 3 дополнительных натуральных препарата: пероральный ацетил L-карнитин по 500 мг 3 раза в день, пероральный бенфотиамин по 80 мг два раза в день и пероральная R-альфа-липоевая кислота по 150 мг 3 раза в день. Эти добавки принимались ежедневно (без цикла). Были проведены рутинные базовые анализы крови (таблица 1). Все они были в норме, за исключением низкого уровня креатинина, который считался незначительным.
В ноябре 2012 года, через 4 месяца после добавления DCA к его первоначальной естественной противораковой терапии, пациент прошел повторную оценку. Он чувствовал себя в целом хорошо. Было сообщено, что два новых симптома начались только после начала терапии DCA: слегка сниженная чувствительность кончиков пальцев рук и ног и слегка сниженная способность концентрироваться в течение 2 недель, в течение которых он принимал DCA. Легкая потеря чувствительности не ухудшалась и ощущалась как легкая невропатия, связанная с DCA. Сообщалось, что как онемение, так и снижение концентрации прошли в течение недель, когда пациент не принимал DCA. Анализ крови от октября 2012 года не показал существенных изменений (таблица 1). КТ в августе 2012 года и ноябре 2012 года выявили значительную регрессию всех ранее увеличенных лимфатических узлов. Самый большой узел был 10 мм, и не было никаких признаков внутригрудного или внутрибрюшного заболевания, а также никаких метастазов в кости (рисунок 3).
Пациент продолжал чувствовать себя хорошо на терапии DCA и не заметил никаких новых метастазов в коже или нового увеличения паховых узлов. Он продолжал проходить частый клинический мониторинг у своего врача-натуропата (Шейнхаус) и ежегодное последующее наблюдение у своего лечащего врача (Хан). Перечисленные натуральные противораковые терапии (назначенные Шейнхаусом) и терапия DCA продолжались до 2016 года. Результаты анализа крови в июне 2016 года продолжали быть нормальными (таблица 1). КТ была повторена в августе 2016 года, не показав никаких признаков метастатической меланомы, после полных 4 лет непрерывной терапии DCA в сочетании с натуральной противораковой терапией (рисунок 4). К декабрю 2016 года пациент сообщил об увеличении стресса, связанного с работой, и снижении соблюдения режима приема лекарств. В то время он заметил новую паховую массу слева. Была получена ультразвуковая визуализация, которая выявила новый конгломерат увеличенных лимфатических узлов размером 40 мм × 25 мм × 23 мм, с цветным допплером, показывающим кровоток внутри массы. Это было интерпретировано как повторный рост меланомы, примерно после четырех с половиной лет непрерывной терапии DCA. Было проведено дальнейшее обследование, включая ПЭТ/КТ, которое подтвердило рецидив заболевания в 3 левых паховых узлах (SUV max в диапазоне от 13 до 17,8).

Рисунок 3. Компьютерная томография от ноября 2012 г. после 4 месяцев терапии дихлорацетатом. Самый большой узел размером 10 мм.Рисунок 4. Компьютерная томография после 4 лет терапии дихлорацетатом без сопутствующих традиционных методов лечения рака. Сканирование показывает отсутствие повторного роста рака. Все узлы имеют размер менее 10 мм.

Вкратце, пациент получал традиционную терапию рецидивирующей меланомы 3 стадии в течение 6 лет, состоящую из первичной хирургической резекции с лимфодиссекцией, интерферона альфа и хирургической резекции рецидивирующих кожных метастазов 5 раз. Затем пациент получал только естественную противораковую терапию (назначенную Шейнхаусом) в течение 3 месяцев без ответа, о чем свидетельствовало устойчивое прогрессирование заболевания на серийных КТ-сканированиях. Наконец, пациент добавил пероральную терапию DCA к естественной противораковой терапии с 3 сопутствующими нейропротекторными препаратами (липоевая кислота, ацетил L-карнитин и бенфотиамин) и без сопутствующих традиционных методов лечения рака. Результатом стала полная радиологическая ремиссия, продолжавшаяся более 4 лет, за которой последовал рецидив. Во время курса терапии DCA у пациента наблюдались незначительные побочные эффекты, состоящие из легкой невропатии и небольшого снижения концентрации. У пациента сохранялась функция ECOG уровня 0, и он мог работать полный рабочий день.

Таблица 1 Анализ крови до терапии дихлорацетатом натрия

1 Указывает на аномальное значение. DCA: Дихлорацетат; LDH: Лактатдегидрогеназа; GGT: Гамма-глутамилтрансфераза; AST: Аспартатаминотрансфераза; ALT: Аланинаминотрансфераза.

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование перорального DCA у пациента с метастатической меланомой, описанное здесь, демонстрирует уменьшение опухоли и долгосрочную стабильность заболевания в соответствии с клиническим статусом и КТ-визуализацией. Стабильность заболевания сохранялась более 4 лет при приеме DCA в отсутствие какой-либо сопутствующей традиционной терапии, с выживаемостью с момента первоначальной постановки диагноза 10 лет. Согласно статистике рака SEER Национального института рака, выживаемость этого пациента, у которого не было признаков отдаленных метастазов, не является примечательной (62,9% 5-летняя выживаемость при меланоме с распространением на региональные лимфатические узлы, https://seer.cancer.gov/statfacts/html/melan.html). Примечательно то, что в ситуации, когда вовлеченные лимфатические узлы явно увеличивались, добавление пероральной терапии DCA было эффективным для уменьшения увеличивающихся узлов (рисунки 2 и 3) и достижения ремиссии, продолжавшейся более 4 лет. Возможно, что естественные противораковые терапии, которые получал пациент, синергизировались с DCA, но также очевидно, что эти естественные терапии сами по себе не могут объяснить регрессию заболевания. Сообщалось, что DCA оказывает как апоптотический, так и цитостатический эффект, что согласуется с клиническим течением регрессии (апоптотический) и длительной ремиссией (цитостатический) у этого пациента. Рецидив через 4 года совпал с уменьшением соблюдения режима лечения, что предполагает, что этот метод лечения рака с помощью DCA требует постоянного поддержания метаболического давления. Несмотря на рецидив, пациент оставался клинически здоровым и планировал начать прием новых иммунотерапевтических препаратов. Еще предстоит выяснить, сможет ли изменение терапии снова достичь регрессии или стабильности заболевания.
Помимо поддержания ремиссии в течение более 4 лет, этот случай иллюстрирует, что DCA может хорошо переноситься онкологическим пациентом в течение длительного периода времени по сравнению со всеми опубликованными клиническими испытаниями DCA по раку. Примечательно, что этот пациент смог переносить 17 мг/кг в день в режиме 2 недели приема/1 неделя перерыва в течение 4 лет с минимальными побочными эффектами. Это похоже на наш предыдущий отчет о случае хронического использования DCA при раке толстой кишки , где пациент смог переносить 16 мг/кг в день (но не 25 мг/кг в день) в том же режиме, но контрастирует с клиническими испытаниями DCA, которые рекомендуют более низкую дозу 10-12,5 мг/кг в день, вводимую непрерывно. Перерыв в 1 неделю или нейропротекторные добавки могут способствовать способности пациентов в отчетах о случаях переносить более высокую дозу. Генетические полиморфизмы в GSTZ1, ферменте печени, который метаболизирует DCA, также могут способствовать дозе DCA, которая может быть переносима. В испытаниях сообщалось о различных уровнях препарата, но не все из них рассматривали этот фармакогенетический аспект терапии DCA , и необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, является ли это существенным фактором переносимости DCA. На момент написания этой статьи продолжается исследование DCA с множественной миеломой у людей, в котором изучаются как генотипы GSTZ1, так и уровни препарата, чтобы внести свой вклад в наше понимание этих проблем (Реестр клинических испытаний Австралии и Новой Зеландии #ACTRN12615000226505, http://www.anzctr.org.au).
Этот отчет о случае показывает, что хроническая терапия DCA может использоваться без снижения качества жизни по сравнению с традиционными методами лечения меланомы, такими как интерферон. Чтобы определить оптимальный протокол для максимально переносимого острого или хронического лечения с помощью DCA, необходимы испытания на людях. Но что еще важнее, все еще остается выяснить, какая доза требуется для целевых эффектов, которые будут эффективны против рака. Эта информация необходима перед инвестированием в более крупные долгосрочные исследования результатов для пациентов. DCA заслуживает дальнейшего изучения в клинических испытаниях как нетоксичная терапия рака из-за своей скромной стоимости и низкой токсичности, а также заслуживает рассмотрения в качестве терапии рака не по назначению.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентку за ее поддержку и согласие опубликовать ее случай.

КОММЕНТАРИИ 

Характеристика случая
У 32-летнего мужчины на ноге обнаружилось пигментное пятно.

Клинический диагноз
У пациентки диагностирована меланома.

Лабораторный диагноз:
Меланома подтверждена эксцизионной биопсией.

Диагностика с помощью визуализации:
подтверждено наличие увеличенного пахового узла в меланоме (биопсия иглой).

Патологический диагноз:
Меланома, BRAF-положительный.

Лечение
Иссечение первичного очага с пересадкой кожи, иссечение сторожевого узла, множественные иссечение рецидивирующих кожных метастазов. Традиционная терапия прекращена и начаты натуральные противораковые терапии (AHCC, корень одуванчика, куркумин, корень астрагала, внутривенно витамин С, подкожно европейская омела). Прогрессирование через 3 месяца, добавлен дихлорацетат (DCA). Регресс и ремиссия после добавления DCA, продолжающиеся более 4 лет.

Сопутствующие отчеты
Отчеты компьютерной томографии демонстрируют течение заболевания и реакцию на терапию.

Объяснение термина 
DCA: Дихлорацетат натрия; RECIST: Критерии оценки ответа на солидные опухоли; ECOG: Восточная кооперативная онкологическая группа; SEER: Наблюдение, эпидемиология и конечные результаты.

Опыт и уроки
DCA может действовать как проапоптотический и цитостатический препарат и, таким образом, может достигать регрессии, а также долгосрочной стабилизации метастатического рака без серьезных побочных эффектов, как показано на примере этого случая меланомы.

Рецензирование
Доктор Хан описал 32-летнего мужчину, который получал терапию DCA с другими препаратами от натуропатов и поддерживался в состоянии стабилизации (метастатическая меланома) более 4 лет. Это интересный случай.

ССЫЛКИ

1 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED. Ось митохондриального канала K+ подавляется при раке, а ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака. Cancer Cell 2007; 11: 37-51 [PMID: 17222789 DOI: 10.1016/ j.ccr.2006.10.020]
2 Stacpoole PW, Kurtz TL, Han Z, Langaee T. Роль дихлорацетата в лечении генетических митохондриальных заболеваний. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60: 1478-1487 [PMID: 18647626 DOI: 10.1016/ j.addr.2008.02.014]
3 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE, Carney PR, Valenstein E, Theriaque DW, Shuster JJ. Оценка длительного лечения детей с врожденным лактоацидозом дихлорацетатом. Педиатрия 2008; 121: e1223-e1228 [PMID: 18411236 DOI: 10.1542/ peds.2007-2062]
4 Stacpoole PW, Kerr DS, Barnes C, Bunch ST, Carney PR, Fennell EM, Felitsyn NM, Gilmore RL, Greer M, Henderson GN, Hutson AD, Neiberger RE, O'Brien RG, Perkins LA, Quisling RG, Shroads AL, Shuster JJ, Silverstein JH, Theriaque DW, Valenstein E. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактоацидоза у детей. Педиатрия 2006; 117: 1519-1531 [PMID: 16651305 DOI: 10.1542/peds.2005-1226]
5 Berendzen K, Theriaque DW, Shuster J, Stacpoole PW. Терапевтический потенциал дихлорацетата при дефиците пируватдегидрогеназного комплекса. Mitochondrion 2006; 6: 126-135 [PMID: 16725381 DOI: 10.1016/j.mito.2006.04.001]
6 Kaufmann P, Engelstad K, Wei Y, Jhung S, Sano MC, Shungu DC, Millar WS, Hong X, Gooch CL, Mao X, Pascual JM, Hirano M, Stacpoole PW, DiMauro S, De Vivo DC. Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование. Neurology 2006; 66: 324-330 [PMID: 16476929 DOI: 10.1212/01. wnl.0000196641.05913.27]
7 Brandsma D, Dorlo TP, Haanen JH, Beijnen JH, Boogerd W. Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом. J Neurol 2010; 257: 2099-2100 [PMID: 20632025 DOI: 10.1007/ s00415-010-5654-9]
8 Микелакис Э.Д., Сутендра Г., Дромпарис П., Вебстер Л., Хароми А., Нивен Э., Магуайр К., Гаммер Т.Л., Макки Дж.Р., Фултон Д., Абдулкарим Б., Макмертри М.С., Петрук К.С. Метаболическая модуляция глиобластомы дихлорацетатом. Sci Transl Med 2010; 2: 31ra34 [PMID: 20463368 DOI: 10.1126/scitranslmed.3000677]
9 Данбар EM, Коутс BS, Шроудс AL, Лангаи T, Лью A, Фордер JR, Шустер JJ, Вагнер DA, Стэкпул PW. Фаза 1 испытания дихлорацетата (DCA) у взрослых с рецидивирующими злокачественными опухолями мозга. Invest New Drugs2014; 32: 452-464 [PMID: 24297161 DOI: 10.1007/ s10637-013-0047-4]
10Garon EB, Christofk HR, Hosmer W, Britten CD, Bahng A, Crabtree MJ, Hong CS, Kamranpour N, Pitts S, Kabbinavar F, Patel C, von Euw E, Black A, Michelakis ED, Dubinett SM, Slamon DJ. Дихлорацетат следует рассматривать с химиотерапией на основе платины при гипоксических опухолях, а не как единственный агент при распространенном немелкоклеточном раке легких. J Cancer Res Clin Oncol 2014; 140: 443-452 [PMID: 24442098 DOI: 10.1007/s00432-014-1583-9]
11 Chu QS, Sangha R, Spratlin J, Vos LJ, Mackey JR, McEwan AJ, Venner P, Michelakis ED. Открытое исследование фазы I с однокомпонентным методом и повышением дозы дихлорацетата (DCA) у пациентов с запущенными солидными опухолями. Invest New Drugs 2015; 33: 603-610 [PMID: 25762000 DOI: 10.1007/s10637-015-0221-y]
12 Канкотия С., Стэкпул П. У. Дихлорацетат и рак: новый дом для орфанного препарата? Biochim Biophys Acta 2014; 1846: 617-629 [PMID: 25157892 DOI: 10.1016/j.bbcan.2014.08.005]
13 Сан Р. К., Борд П. Г., Блэкберн А. К. Нацеливание метаболизма с помощью триоксида мышьяка и дихлорацетата в клетках рака молочной железы. Mol Cancer 2011; 10: 142 [PMID: 22093145 DOI: 10.1186/1476-4598-10-142]
14 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, Phillips LR, Hollingshead MG, Newton DL. Дихлорацетат натрия селективно воздействует на клетки с дефектами в митохондриальной ЭТЦ. Int J Cancer 2010; 127: 2510-2519 [PMID: 20533281 DOI: 10.1002/ijc.25499]
15 Gang BP, Dilda PJ, Hogg PJ, Blackburn AC. Нацеливание на два аспекта метаболизма при лечении рака молочной железы. Cancer Biol Ther 2014; 15: 1533-1541 [PMID: 25482950 DOI: 10.4161/15384047.2014.955992]
16 Sutendra G, Dromparis P, Kinnaird A, Stenson TH, Haromy A, Parker JM, McMurtry MS, Michelakis ED. Активация митохондрий путем ингибирования PDKII подавляет сигнализацию HIF1a и ангиогенез при раке. Oncogene 2013; 32: 1638-1650 [PMID: 22614004 DOI: 10.1038/onc.2012.198]
17 Cairns RA, Bennewith KL, Graves EE, Giaccia AJ, Chang DT, Denko NC. Фармакологически повышенная гипоксия опухоли может быть измерена с помощью позитронно-эмиссионной томографии с 18F-фторазомицин арабинозидом и усиливает реакцию опухоли на гипоксический цитотоксин PR-104. Clin Cancer Res 2009; 15: 7170-7174 [PMID: 19920111 DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-09-1676]
18 Anderson KM, Jajeh J, Guinan P, Rubenstein M. In vitro эффекты дихлорацетата и CO2 на гипоксические клетки HeLa. Anticancer Res 2009; 29: 4579-4588 [PMID: 20032407]
19 Sun RC, Fadia M, Dahlstrom JE, Parish CR, Board PG, Blackburn AC. Изменение гликолитического фенотипа дихлорацетатом подавляет рост метастатических клеток рака молочной железы in vitro и in vivo. Breast Cancer Res Treat 2010; 120: 253-260 [PMID: 19543830 DOI: 10.1007/ s10549-009-0435-9]
20De Grandis D. Ацетил-L-карнитин для лечения периферической нейропатии, вызванной химиотерапией: краткий обзор. CNS Drugs 2007; 21 Suppl 1: 39-43; обсуждение 45-46 [PMID: 17696592]
21 Maestri A, De Pasquale Ceratti A, Cundari S, Zanna C, Cortesi E, Crinò L. Пилотное исследование эффекта ацетил-L-карнитина при периферической нейропатии, вызванной паклитакселом и цисплатином. Tumori 2005; 91: 135-138 [PMID: 15948540]
22 Evans JD, Jacobs TF, Evans EW. Роль ацетил-L-карнитина в лечении диабетической периферической нейропатии. Ann Pharmacother 2008; 42: 1686-1691 [PMID: 18940920 DOI: 10.1345/aph.1L201]
23 Mijnhout GS, Kollen BJ, Alkhalaf A, Kleefstra N, Bilo HJ. Альфа-липоевая кислота при симптоматической периферической нейропатии у пациентов с диабетом: метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. Int J Endocrinol 2012; 2012: 456279 [PMID: 22331979 DOI: 10.1155/2012/456279]
24 Liu F, Zhang Y, Yang M, Liu B, Shen YD, Jia WP, Xiang KS. [Лечебный эффект альфа-липоевой кислоты на периферическую нейропатию при диабете 2 типа: клиническое исследование]. Zhonghua Yixue Zazhi 2007; 87: 2706-2709 [PMID: 18167250]
25 Ziegler D, Hanefeld M, Ruhnau KJ, Meissner HP, Lobisch M, Schütte K, Gries FA. Лечение симптоматической диабетической периферической нейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой. 3-недельное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN). Diabetologia 1995; 38: 1425-1433 [PMID: 8786016]
26 Winkler G, Kempler P. [Патомеханизм диабетической нейропатии: предпосылки патогенез-ориентированной терапии]. Orv Hetil 2010; 151: 971-981 [PMID: 20519180 DOI: 10.1556/OH.2010.28898]
27 Ang CD, Alviar MJ, Dans AL, Bautista-Velez GG, Villaruz-Sulit MV, Tan JJ, Co HU, Bautista MR, Roxas AA. Витамин B для лечения периферической нейропатии. Cochrane Database Syst Rev 2008; (3): CD004573 [PMID: 18646107 DOI: 10.1002/14651858.CD004573. pub3]
28 Winkler G, Pál B, Nagybéganyi E, Ory I, Porochnavec M, Kempler P. Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии. Arzneimittelforschung 1999; 49: 220-224 [PMID: 10219465 DOI: 10.1055/s-0031-1300405]
29 Ignacio RM, Kim CS, Kim YD, Lee HM, Qi XF, Kim SK. Терапевтический эффект активного гексозо-коррелированного соединения (AHCC) в сочетании с CpG-ODN (олигодезоксинуклеотидом) в мышиной модели меланомы B16. Cytokine 2015; 76: 131-137 [PMID: 26082022 DOI: 10.1016/j.cyto.2015.06.002]
30 Chatterjee SJ, Ovadje P, Mousa M, Hamm C, Pandey S. Эффективность экстракта корня одуванчика в индукции апоптоза в клетках меланомы человека, устойчивых к лекарственным препаратам. Evid Based Complement Alternat Med 2011; 2011: 129045 [PMID: 21234313 DOI: 10.1155/2011/129045]
31Mirzaei H, Naseri G, Rezaee R, Mohammadi M, Banikazemi Z, Mirzaei HR, Salehi H, Peyvandi M, Pawelek JM, Sahebkar A. Куркумин: новый кандидат для терапии меланомы? Int J Cancer 2016; 139: 1683-1695 [PMID: 27280688 DOI: 10.1002/ijc.30224]
32 Huang XY, Zhang SZ, Wang WX. Повышение противоопухолевой эффективности при комбинированном применении астрагала и птеростильбена при меланоме. Asian Pac J Cancer Prev 2014; 15: 1163-1169 [PMID: 24606435]
33 Wagner SC, Markosian B, Ajili N, Dolan BR, Kim AJ, Alexandrescu DT, Dasanu CA, Minev B, Koropatnick J, Marincola FM, Riordan NH. Внутривенная аскорбиновая кислота как адъювант иммунотерапии интерлейкином-2. J Transl Med 2014; 12: 127 [PMID: 24884532 DOI:10.1186/1479-5876-12-127]
34 Horneber MA, Bueschel G, Huber R, Linde K, Rostock M. Терапия омелой в онкологии. Cochrane Database Syst Rev 2008; (2): CD003297 [PMID: 18425885 DOI: 10.1002/14651858.CD003297.pub2]
35 Delaney LM, Ho N, Morrison J, Farias NR, Mosser DD, Coomber BL. Дихлорацетат влияет на пролиферацию, но не на выживаемость клеток колоректального рака человека. Apoptosis 2015; 20: 63-74 [PMID: 25344893 DOI: 10.1007/s10495-014-1046-4]
36 Abildgaard C, Dahl C, Basse AL, Ma T, Guldberg P. Биоэнергетическая модуляция с помощью дихлорацетата снижает рост клеток меланомы и усиливает их ответ на ингибирование BRAFV600E. J Transl Med 2014; 12: 247 [PMID: 25182332 DOI: 10.1186/s12967-014-0247-5]
37 Хан А., Эндрюс Д., Блэкберн А. С. Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии дихлорацетатом натрия. World J Clin Cases 2016; 4: 336-343 [PMID: 27803917]
38 Ценг Х. Ф., Блэкберн А. С., Борд П. Г., Андерс М. В. Полиморфизм и зависящая от вида инактивация дзета-глутатионтрансферазы дихлорацетатом. Chem Res Toxicol 2000; 13: 231-236 [PMID: 10775321]