Тэг: дихлорацетат

Активация митохондриального окисления путем ингибирования

PDK2 обращает вспять устойчивость к цисплатину при раке головы и шеи

Оригинал статьи: https://www.sci-hub.ru/10.1016/j.canlet.2015.11.023

Чон Лиел Рох a, *, Джин Янг Парк a, Ын Хе Ким a, Хе Джин Чан a, Минсу Квон b

a Отделение отоларингологии, Медицинский центр Асан, Медицинский колледж Университета Ульсан, Сеул, Республика Корея
b Отделение отоларингологии, Медицинская школа при больнице Национального университета Кёнсан, Чинджу, Республика Корея

Автор переписки: Тел: +82 2 3010 3965; факс: +82 2 489 2773. Адрес электронной почты: rohjl@amc.seoul.kr (J.-L. Roh).

Получено: 9 сентября 2015 г.
Пересмотрено: исправленная форма 13 ноября 2015 г.
Принято: 14 ноября 2015 г

Аннотация

Дихлорацетат (ДХА), сиротский препарат, способствующий переходу от гликолиза к окислительному фосфорилированию, был повторно использован для лечения рака. В настоящем исследовании изучалось, может ли DCA преодолеть резистентность к цисплатину при раке головы и шеи (РГШ). Были использованы две устойчивые к цисплатину линии клеток РГШ (AMC-HN4R и -HN9R), их родительские линии и другие линии клеток РГШ человека. Эффект DCA, отдельно и в комбинации с цисплатином, оценивали путем измерения клеточного цикла, жизнеспособности, гибели, продукции реактивных форм кислорода (ROS), мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) и экспрессии белков в доклинических моделях опухолевых ксенотрансплантатов мыши. Увеличение гликолиза коррелировало со снижением чувствительности к цисплатину и уменьшалось под действием DCA. Устойчивые к цисплатину клетки сверхэкспрессировали киназу пируватдегидрогеназы 2 (PDK2). DCA индуцировал гибель клеток HNC путем снижения ΔΨm и стимулирования производства митохондриальной ROS. Этот эффект снижался антиоксидантом N-ацетил-л-цистеином или ингибированием апоптоза, опосредованного каспазой. Активация митохондриального окисления глюкозы под действием DCA в конечном итоге активировала нижележащие митохондриальные апоптотические сигналы, что привело к гибели химиорезистентных раковых клеток. Таким образом, DCA значительно сенсибилизировал устойчивые клетки HNC к цисплатину in vitro и in vivo. Высокий гликолиз и сверхэкспрессия PDK2 тесно связаны с устойчивостью клеток НЯК к цисплатину; последняя может быть преодолена с помощью DCA.

Ключевые слова: Рак головы и шеи, устойчивость к цисплатину, PDK2, дихлорацетат, ремоделирование митохондрий
Сокращения: РГШ, рак головы и шеи; ДХА, дихлорацетат; CDDP, цисплатин; OXPHOS, окислительное фосфорилирование; PDK2, киназа 2 пируватдегидрогеназы; PDHE1α, изоформа E1α пируватдегидрогеназы; ROS, реактивные виды кислорода; ΔΨm, мембранный потенциал митохондрий; NAC, N-ацетил-цистеин; DCF-DA, 2′,7′- дихлорфлуоресцеин диацетат; PARP, поли(АДФ-рибоза) полимераза; siRNA, короткая интерферирующая РНК; 18F-FDG, 18F-фтордезоксиглюкоза; PET, позитронно-эмиссионная томография; SUV, стандартизированное значение поглощения; MTV, метаболический объем опухоли; TUNEL, терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза-опосредованное мечение ник-конца ДУТФ.

© 2015 Elsevier Ireland Ltd. Все права защищены.

ВВЕДЕНИЕ

Рак головы и шеи (РГШ) является восьмым по распространенности раком во всем мире, ежегодно диагностируется более полумиллиона новых случаев [1]. Опухоли возникают в верхних отделах пищеварительного тракта, включая ротовую или носовую полость, глотку и гортань, и метастазируют в регионарные лимфатические узлы и отдаленные участки. Современный стандарт лечения ГНК включает мультимодальный подход, включающий хирургию, химиотерапию и радиотерапию, особенно при распространенном ГНК. Наряду с недавним интересом к стратегиям сохранения органов, нехирургические методы, такие как радиотерапия в сочетании с химиотерапией, все чаще используются в качестве первой линии терапии при НЯК [2]. В настоящее время системная химиотерапия является центральным компонентом нескольких лечебных подходов, включая комбинацию с окончательной лучевой терапией или индукционным лечением, превышающим резервирование только для паллиации [3]. Цисплатин, платиновое производное цис-диамминдихлорплатина (II) (CDDP), остается химиотерапевтическим препаратом первой линии в нехирургических методах лечения НЯК, несмотря на последние достижения в области таргетной терапии [4]. Однако за последние три десятилетия, несмотря на диагностические и терапевтические достижения, общая выживаемость при НЯК существенно не изменилась, что является результатом стойкой резистентности раковых клеток к терапии, включая цисплатин и облучение [2].

Метаболические изменения являются общей чертой раковых клеток: сдвиг в генерации клеточной энергии от митохондриального окислительного фосфорилирования к аэробному гликолизу обеспечивает биосинтетическое преимущество раковых клеток [5]. Увеличение гликолиза в раковых клетках, называемое эффектом Варбурга, обычно связано с фенотипическими изменениями, включая адаптацию к гипоксии и недостатку питательных веществ, устойчивость к окислительному стрессу и апоптотическим стимулам, а также повышенный синтез биомассы [6]. Дерегулированный метаболизм связан с устойчивостью к лечению при терапии рака [7]. В гликолитическом пути повышение уровня транспортера глюкозы (GLUT), гексокиназы (HK), пируваткиназы M2 (PKM2), киназы пируватдегидрогеназы (PDK), лактатдегидрогеназы-A (LDHA), синтеза жирных кислот (FASN) и глутаминазы, среди прочих, связано с устойчивостью к противораковым препаратам [7]. Имеются данные о том, что регулирование метаболизма раковых клеток может улучшить терапию и преодолеть устойчивость к химиотерапии или радиотерапии [8,9].

Дихлорацетат (ДХА), сиротский препарат для лечения молочнокислого ацидоза, сдвигает метаболизм раковых клеток с гликолиза на окислительное фосфорилирование [10]. DCA избирательно ингибирует PDK, который активируется во многих видах рака, что приводит к активации пируватдегидрогеназы (PDH), комплекса ферментов, которые превращают цитозольный пируват в митохондриальный ацетил-КоА. Ингибирование PDK с помощью малой интерферирующей РНК (siRNA) или лечение DCA изменяет биоэнергетику рака и восстанавливает митохондрий-зависимый апоптоз в раковых клетках [11]. DCA эффективен в лечении рака с агрессивным фенотипом in vitro и in vivo[12,13], а также преодолевает резистентность к сорафенибу в гепатоцеллюлярной карциноме путем активации митохондриального окислительного фосфорилирования [14]. Таким образом, DCA может быть подходящим противораковым препаратом для повышения эффективности химиотерапии и преодоления резистентности к химиотерапевтическим средствам при раке человека; однако, хотя DCA широко изучался при раке, он редко тестировался на клетках НЯК [15], особенно в условиях резистентности к химиотерапевтическим средствам. Необходимо дальнейшее изучение механизмов действия DCA и синергизма с традиционными химиотерапевтическими препаратами. Здесь мы показываем, что DCA смещает биоэнергетику НЯК в сторону митохондриального окисления глюкозы и приводит к накоплению в клетках митохондриальных реактивных форм кислорода (mROS), тем самым сенсибилизируя химиорезистентные клетки НЯК к цисплатину in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Культура клеток и создание цисплатин-устойчивых клеток НГШ
Клетки рака головы и шеи человека (РГШ) AMC-HN2, -HN3, -HN4, -HN5, -HN9 и -HN10 выращивали в минимальной основной среде Орла (Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, USA); Клетки SNU-1041, -1066 и -1076 выращивали в среде Roswell Park Memorial Institute (Life TechnologiesTM ); а клетки UMSCC1 выращивали в модифицированной среде Дульбекко Eagle (Life TechnologiesTM ). Среда была дополнена 10% фетальной бычьей сывороткой. Все линии раковых клеток были подтверждены путем профилирования ДНК (короткие тандемные повторы, STR), предоставленной Корейским банком клеточных линий. Клетки инкубировали при 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2.

Устойчивые к цисплатину клетки AMC-HN4 и HN9 (HN4R и HN9R) были получены из родительских чувствительных к цисплатину клеток AMC-HN4 и HN9, соответственно, путем воздействия возрастающих концентраций цисплатина (цис-платина (II) диамин дихлорид [CDDP]; Sigma-Aldrich, Луис, МО, США) [16]. Устойчивость к цисплатину в созданных клеточных линиях оценивали с помощью анализа жизнеспособности клеток и сравнивали с родительскими клетками.

Анализ клеточного цикла и гибели клеток
Для анализа клеточного цикла клетки подвергали воздействию ДКА в течение 72 ч. Затем клетки трипсинизировали, фиксировали на ночь в ледяном этаноле и окрашивали в течение 30 мин йодистым пропидием (Sigma-Aldrich) при температуре 37 °С. Содержание клеточной ДНК измеряли с помощью проточного цитометра FACScalibur (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США). Для анализа клеточной гибели клетки культивировали с цисплатином и DCA, отдельно или в комбинации, или эквивалентным количеством ДМСО (транспортный контроль). Через 72 часа клетки собирали, промывали ледяным PBS и ресуспендировали в буфере для связывания. Клетки окрашивали аннексином V-FITC (флуоресцеин изотиоцианат) и йодистым пропидием с использованием набора для выявления апоптоза аннексином V-FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), а затем анализировали методом проточной цитометрии. Все данные анализировали с помощью программного обеспечения Cell Quest (BD Biosciences). Статистическую значимость между различными группами лечения оценивали с помощью двуххвостового U-теста Манна-Уитни или t-теста Стьюдента.

Для анализа активности каспазы клетки HN4R и HN9R, посеянные в 96-луночный планшет, подвергали воздействию 100 мкл среды, содержащей цисплатин и DCA отдельно или в комбинации, в течение 72 ч, с или без 3 мМ NAC или 50 мкМ Z-VAD-fmk (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) перед воздействием 30 мМ DCA. Анализы проводили в трех лунках с использованием флуориметрического Homogeneous Caspase Assay (Roche Life Science, Базель, Швейцария). Добавляли рабочий раствор субстрата, и планшет инкубировали в темноте при 37 °C в течение 2-8 ч или при комнатной температуре в течение ночи. Поглощение в каждой лунке измеряли при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны эмиссии 520 нм с помощью микропланшетного ридера SpectraMax M2.

Для измерения мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) клетки HN4R и HN9R, посеянные в 96-луночный планшет, подвергались воздействию 100 мкл среды, содержащей цисплатин и DCA отдельно или в комбинации в течение 36 ч. Клетки окрашивались 200 нМ тетраметилродамин этилового эфира (TMRE, Life Technologies TM ) в течение 20 мин и затем анализировались методом проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) каждой группы лечения была нормализована по отношению к контрольной группе.

Доклинические исследования
Все процедуры исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных нашего учреждения. Шестинедельные атимичные самцы мышей BALB/c (nu/nu) были приобретены у Central Lab Animal Inc. (Сеул, Республика Корея). Клетки AMC-HN4R или HN9R (5 x 10 6 ) вводили подкожно во фланг. Объем опухоли и вес тела измеряли каждые 3 дня. Опухоли измеряли с помощью штангенциркуля, а объем рассчитывали как (длина х ширина2 )/2. Лечение начиналось, когда клеточные имплантаты становились пальпируемыми узелками (= день 0). Мыши были рандомизированы на четыре группы лечения: транспортное средство, DCA, цисплатин и DCA плюс цисплатин.

Мышей лечили питьевой водой с добавлением 0,5 г/л DCA, или внутривенным введением 5 мг/кг цисплатина один раз в неделю, или комбинацией DCA и цисплатина по одинаковым графикам. Мышей приносили в жертву на 24-й день, опухоли выделяли и анализировали с помощью иммуноблотинга и in situ терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы-опосредованного мечения никкеля ДУТФ (TUNEL) (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Количество апоптотических телец подсчитывали вслепую в десяти случайно выбранных полях высокой мощности. Статистическую значимость между различными группами лечения оценивали с помощью двуххвостового U-теста Манна-Уитни или t-теста Стьюдента.

Результаты

Увеличение гликолиза в клетках HNC связано с резистентностью к цисплатину и обратимо под действием DCA
Все клеточные линии, использованные в нашем исследовании, были человеческими HNC. Цитотоксический эффект DCA оценивался в клетках HNC с помощью исключения трипанового синего, окрашивания кристаллическим фиолетовым и МТТ. DCA, протестированный в концентрации до 30 мМ в течение 72 ч, заметно подавлял рост клеток HNC (МТТ-тест, рис. 1А). Биоэнергетика клеток НЯК изменялась под действием ДКА: клеточный гликолиз значительно уменьшался, а окислительное фосфорилирование увеличивалось (рис. 1В). Изменение биоэнергетики варьировалось между линиями клеток НЯК и было значительно связано с чувствительностью к цисплатину: клетки НЯК с высоким гликолизом демонстрировали устойчивость к цисплатину (R2 = 0,859, P < 0,001; рис. 1С ). Кроме того, при воздействии DCA раковые клетки с наибольшим изменением биоэнергетики, скорее всего, становились более апоптотичными (R2 = 0,769, P = 0,002; рис. 1D ). Это позволяет предположить, что DCA вызывает специфический для раковых клеток апоптоз путем снижения гликолиза в клетках HNC.

Рис. 1. Повышенный гликолиз в клетках HNC коррелирует со снижением чувствительности к цисплатину и уменьшается под действием дихлорацетата (DCA). (А) DCA индуцировал гибель клеток в клетках HNC. Цитотоксичность оценивалась с помощью МТТ-анализа после воздействия различных концентраций ДХА в течение 72 ч. (B) Изменение биоэнергетики под воздействием ДХА в клетках HNC. Измерения гликолиза и OXPHOS (%) были описаны в разделе «Материалы и методы». (C) Корреляция между гликолизом и IC50 цисплатина в группе клеточных линий HNC. IC50 рассчитывали с помощью МТТ-анализа в трех независимых экспериментах, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. Корреляция оценивалась с помощью линейной регрессии. (D) Корреляция между биоэнергетическими изменениями и апоптозом в клетках HNC. В анализе апоптоза измеряли аннексин V-положительные апоптотические фракции после воздействия 20 мМ DCA в течение 72 часов.

Экспрессия PDK2 связана с устойчивостью к цисплатину в HNC
Цитотоксическое действие цисплатина было проверено на культивируемых клеточных линиях HN4-cisR и HN9-cisR и родительских раковых клетках (рис. 2А). Устойчивые к цисплатину клетки HN4-cisR и HN9-cisR показали 12-кратное и 18-кратное увеличение IC50, соответственно, по сравнению с соответствующими родительскими линиями. Вестерн-блот анализ показал, что HK2 и PDK2 были высоко экспрессированы в клетках HN4-cisR и HN9-cisR по сравнению с соответствующими родительскими клетками, в то время как экспрессия PDHE1α была низкой в клетках, устойчивых к цисплатину (рис. 2B). Уровень экспрессии мРНК PDK2 также был выше в резистентных клетках, чем в чувствительных (P < 0,01) (рис. 2C). DCA подавлял рост цисплатин-резистентных клеток HNC в той же степени, что и цисплатин-чувствительных клеток HNC (рис. 2D). Вестерн-блот анализ показал, что DCA значительно снизил уровень PDK2 и фосфо-PDHE1α (pPDHE1α), но повысил уровень проапоптотических белков, включая расщепленный PARP (cPARP) и PUMA, а также p21 в HN4-cisR и HN9-cisR (рис. 2E). Это говорит о том, что DCA может эффективно подавлять рост цисплатин-резистентных клеток HNC, а также чувствительных к цисплатину клеток HNC.

Рис. 2. Экспрессия PDK2 связана с устойчивостью к цисплатину в НЯК. (А) Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью МТТ-анализа после воздействия цисплатина в течение 72 ч. (B) Вестерн-блот анализ показывает различные уровни белков гексокиназы 2 (HK2), киназы пируватдегидрогеназы 2 (PDK2), пируватдегидрогеназы (PDH) E1α (PDHE1α) и лактатдегидрогеназы-A (LDHA) в необработанных клетках HN4 (HN4R) и HN9 (HN9R), устойчивых к цисплатину, и в их родительских клетках. (C) Изменение уровня экспрессии гена PDK2 между клетками, устойчивыми к цисплатину (cis-R), и их родительскими клетками. * обозначает P <0,01 относительно родительских клеток HNC. (D) Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-анализа после воздействия 15 и 30 мМ DCA в течение 72 ч. Столбики ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. (E) Вестерн-блот анализ выявляет изменения в уровнях расщепленного PARP, PUMA, p21, PDK2, phosho-PDHE1α (pPDHE1α) и PDHE1α в цисплатин-устойчивых клетках HN4R и HN9R, подвергнутых воздействию ДКА в течение 24 ч. Уровень β-актина оценивался в качестве контроля загрузки.

DCA индуцирует накопление ROS в клетках HNC
Изменение клеточной ROS под воздействием DCA оценивалось методом проточной цитометрии с использованием редокс-чувствительного флуоресцентного зонда DCF-DA. Воздействие DCA вызвало значительное повышение уровня ROS в клетках HNC (P < 0,01), которое блокировалось совместным воздействием NAC или ингибитором SOD диэтил-дитиокарбаматом (рис. 3A). Гликолиз значительно увеличился в цисплатин-устойчивых клетках HNC по сравнению с родительскими клетками (P < 0,01), но DCA вызвал значительное снижение гликолиза и увеличение окислительного фосфорилирования как в чувствительных к цисплатину, так и в цисплатин-устойчивых клетках HNC (P < 0,01) (рис. 3B). Мембранный потенциал митохондрий (ΔΨm) измеряли с помощью TMRM, чувствительного к напряжению митохондрий красителя на основе родамина, а митохондриальную ROS (mROS, супероксид митохондрий) измеряли с помощью MitoSOX red. В клетках HNC, обработанных DCA, наблюдалось снижение ΔΨm и увеличение mROS (P < 0,01) (рис. 3C). Изменение ΔΨm в цисплатин-устойчивых клетках HNC при воздействии DCA блокировалось предварительной обработкой NAC (рис. 3Д). Это говорит о том, что DCA может вызывать накопление ROS в клетках HNC путем активации окислительного фосфорилирования.

Рис. 3. DCA индуцирует внутриклеточное накопление ROS в клетках HNC. (A) Повышение уровня ROS под действием DCA. Устойчивые к цисплатину клетки HN4R и HN9R подвергали воздействию 15 или 30 мМ DCA в течение 24 ч. Клетки также предварительно обрабатывали ингибитором ROS N-ацетил-цистеином(NAC, 3 мМ) или ингибитором супероксиддисмутазы (iSOD) диэтил-дитиокарбаматом (10 мкМ). Уровни ROS измерялись методом проточной цитометрии с использованием DCF-DA и показаны как изменения в разах по сравнению с контрольным (базальным) уровнем. Все значения являются средними ± S.E. трех независимых экспериментов. * обозначает P <0,01 относительно контроля, и ** обозначает P <0,01 относительно 30 мМ DCA. (B) Изменение биоэнергетики под действием ДКА в клетках HNC. * обозначает P <0,05 по сравнению с контролем, и ** обозначает P <0,01 по сравнению с родительскими клетками, чувствительными к цисплатину. (C) Изменение реактивных форм кислорода (ROS, т.е. супероксид), измеренных с помощью mitoSOX, и мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm, красное окрашивание) при воздействии 20 мМ DCA по сравнению с необработанным контролем (ctr). Произвольные единицы флуоресценции (AFU) в контрольных и обработанных ДКА клетках. (D) Изменения ΔΨm в клетках HN4R и HN9R после 36 ч воздействия ДКА. ΔΨm измеряли с помощью тетраметилродамин этилового эфира и анализировали методом проточной цитометрии. Средняя интенсивность флуоресценции в каждой группе лечения была нормализована по отношению к контрольной группе. Планки ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. * обозначает P <0,01 по сравнению с контролем. ** обозначает P <0,01 по сравнению с DCA или DCA плюс NAC.

ДКА способствует остановке клеточного цикла и апоптозу в клетках HNC
Клоногенный анализ привел к заметному снижению числа колоний HN4-cisR и HN9-cisR при воздействии ДКА (P < 0,01) (рис. 4A ). Проточная цитометрия с окрашиванием йодистым пропидием показала значительное изменение клеточного цикла в клетках HNC: вогонин увеличил популяцию апоптотических клеток sub-G1 (P < 0,05), и этот эффект блокировался при совместном воздействии с NAC (рис. 4B ). Вестерн-блот анализ показал, что DCA снижал pPDHE1α, но увеличивал cPARP, p21, фосфо-p53 и расщепленную каспазу-3 (cCasp3) в зависимости от времени (рис. 4C ). Активация PDHE1α путем нокдауна PDK2 в клетках AMC-HN4-cisR не привела к значительному увеличению проапоптотических белков cPARP и cCasp3 (рис. 4D ); однако нокдаун PDHE1α снизил экспрессию p21 и фосфорилирование p53. Проточная цитометрия с использованием йодистого пропидия и окрашивания аннексином-V показала эффективную индукцию апоптоза и гибели клеток в цисплатин-устойчивых клетках HNC под действием DCA; эффект снижался при совместном воздействии DCA и антиоксиданта NAC или пан-каспазного ингибитора Z-VAD-fmk (рис. 4E). Это было подтверждено измерением активности каспазы, которая значительно увеличивалась под действием ДКА в зависимости от концентрации (рис. 4F).

Рис. 4. DCA индуцирует гибель клеток и изменения клеточного цикла в клетках HNC. (A) Клоногенный анализ устойчивых к цисплатину раковых клеточных линий, подвергнутых воздействию DCA. Раковые клетки AMC-HN4R и HN9R подвергались воздействию DCA в течение 72 ч. Столбики ошибок представляют собой средние квадратичные значения трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился в трех экземплярах. * обозначает P <0,01. (B) Анализ клеточного цикла при воздействии ДКА. Клетки AMC-HN4R, подвергнутые воздействию DCA в течение 72 ч, окрашивали йодистым пропидием и подвергали проточному цитометрическому анализу. * обозначает P <0,05. (C) Вестерн-блот анализ выявил изменения в уровнях расщепленного PARP (cPARP), p21WAF1, фосфо-p53-ser 15 (pp53), расщепленной каспазы 3 (cCasp3), pPDHE1α и PDHE1α. Клеточные экстракты были получены после воздействия на клетки AMC-HN4R 30 мМ DCA. (D) Влияние DCA и генетического ингибирования PDK2 и PDHE1α на проапоптотические белки, расщепленный PARP и расщепленную каспазу 3, а также на p21WAF1. Белки были измерены с помощью Вестерн-блот анализа в клетках AMC-HN4R, подвергнутых воздействию 30 мМ DCA. Раковые клетки были трансфицированы скремблированной siRNA (scr), PDK2 siRNA или PDHE1α siRNA в течение 48 ч до воздействия 30 мМ DCA. (E) Анализ апоптоза в клетках AMC-HN4R и HN9R, подвергнутых воздействию ДКА. Клетки подвергали воздействию ДКА в течение 72 ч, после чего измеряли апоптотические фракции, позитивные по аннексину V. (F) Повышение активности каспазы при обработке ДКА. Столбики ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех повторов. * и ** обозначают P <0,01 относительно контроля и 30 мМ DCA, соответственно. Перед воздействием 30 мМ ДКА клетки также предварительно обрабатывали 3 мМ NAC или 50 мкМ пан-каспазного ингибитора Z-VAD-fmk.

DCA сенсибилизирует цисплатин-устойчивые клетки HNC к цисплатину in vitro и in vivo
Цисплатин (10 мкМ) не вызывал значительной цитотоксичности или экспрессии апоптотических белков в цисплатин-устойчивых линиях HNC HN4-cisR и HN9-cisR по сравнению с родительскими чувствительными к цисплатину линиями HN4 и HN9 (рис.

5А).

5A); однако DCA вызывал заметное снижение выживаемости в цисплатин-устойчивых клетках HNC (P < 0,05), которое блокировалось предварительной обработкой NAC. DCA индуцировал экспрессию апоптотических белков и увеличивал цисплатин-индуцированную цитотоксичность и экспрессию апоптотических белков в клетках HN4-cisR (рис.

B

). В комбинации DCA увеличивал цитотоксичность цисплатина в клетках HN4-cisR за счет повышения активности каспаз до степени, превышающей сумму эффектов каждого из агентов в отдельности (CI < 1, P < 0,01), которые ослаблялись при глушении гена PDHE1α (рис. 5C). Уровень ΔΨm был выше в клетках HN4-cisR, устойчивых к цисплатину, чем в чувствительных к цисплатину родительских клетках HN4 (ΔΨm, средняя интенсивность флуоресценции [MFI]: 1 ± 0 против 0,54 ± 0,09, P < 0,001) и снижался под действием DCA или комбинации цисплатина и DCA, что ослаблялось глушением гена PDHE1α (рис. 5D).

Рис. 5. DCA сенсибилизировал цисплатин-резистентные клетки HNC к цисплатину. (А) Жизнеспособность клеток оценивали по исключению трипанового синего после воздействия цисплатина (CDDP), DCA или их комбинации. Цитотоксический эффект DCA блокировался антиоксидантом N-ацетил-цистеином(NAC, 3 мМ). Планки ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. * обозначает P <0,01 по сравнению с контролем, и ** обозначает P <0,01 по сравнению с предварительной обработкой NAC. (B) Вестерн-блоттинг, показывающий увеличение чувствительности к цисплатину (CDDP) под действием DCA. Устойчивые к цисплатину клетки AMC-HN4R обрабатывали DCA, цисплатином или обоими препаратами в течение 72 ч. (C) Повышение уровня каспаз после 72-часового воздействия DCA, цисплатина и PDHE1α siRNA. Клетки HN4R подвергались воздействию DCA, цисплатина или комбинации обоих препаратов, после чего измерялась активность каспазы.(D) Изменения ΔΨm в клетках HN4R после 36-часового воздействия DCA, цисплатина или комбинации обоих препаратов. ΔΨm измеряли с помощью этилового эфира тетраметилродамина и анализировали методом проточной цитометрии. Медиана интенсивности флуоресценции в каждой группе лечения была нормализована по отношению к контрольной группе. Планки ошибок представляют собой среднюю квадратичную ошибку трех независимых экспериментов, каждый из которых проводился с использованием трех экземпляров образцов. * и ** означают P <0,01 по сравнению с контролем и скремблированной (scr) siRNA, соответственно. *** обозначает P <0,01 по сравнению с DCA или цисплатином.

Эти результаты были далее изучены на мышиных моделях опухолевых ксенотрансплантатов in vivo. Атимичные мыши BALB/c, несущие опухоли AMC-HN4-cisR или HN9-cisR, получали DCA, цисплатин, DCA плюс цисплатин или транспортное средство. Комбинация цисплатина и DCA синергетически подавляла рост опухоли (рис. 6A). Визуализация роста опухоли in vivo проводилась с помощью ПЭТ с 18 F-ФДГ на 21 день лечения. Очаговые поглощения 18 F-ФДГ наблюдались в местах имплантации опухоли, где измерялось максимальное стандартизированное поглощение (SUVmax) и метаболический объем опухоли при SUV 2.0 (MTV2.0). SUVmax не отличался между группами лечения (P > 0,1), но MTV2.0 был значительно ниже в группах, получавших DCA и комбинацию, чем в других группах (P < 0,05) (рис. 6B). Анализ апоптоза in situ показал, что TUNEL-положительные апоптотические тельца чаще встречались в опухолях, получавших DCA и цисплатин плюс DCA, чем в опухолях, получавших транспортное средство (P < 0,01) (рис. 6C). Вестерн-блот анализ опухолевых тканей показал, что уровень апоптотических белков увеличился в большей степени в клетках HN4-cisR, обработанных комбинацией цисплатина и DCA, чем в опухолях, обработанных одним агентом (рис. 6D).

Рис. 6. DCA сенсибилизирует цисплатин-резистентные клетки HNC к цисплатину in vivo. (A) Противоопухолевый эффект DCA и цисплатина в модели опухолевого ксенотрансплантата на мышах. Голым мышам вводили 5 ×106 клеток AMC-HN4R и HN9R во фланг. Лечение транспортным средством, цисплатином (CDDP), DCA или комбинацией цисплатина и вогонина начиналось после того, как имплантированные опухолевые клетки образовывали пальпируемые узелки. Каждая группа включала десять мышей. Столбики ошибок представляют S.E. * и ** обозначают P <0,05 и P <0,01 по сравнению с контролем (ctr), соответственно. (B) Визуализация опухоли in vivo с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) с 18F-фтордезоксиглюкозой. ПЭТ-сканирование проводилось через 3 недели после начала лечения. Максимальный стандартизированный объем поглощения (SUVmax) и метаболический объем опухоли (MTV2.0) были получены в опухолях (стрелки), и средние значения сравнивались между различными группами лечения. * и ** обозначают P <0,05 и P <0,01 по сравнению с контролем, соответственно. (C) Количественная оценка по результатам анализа TUNEL in situ в срезах опухолей из каждой группы. TUNEL-позитивные апоптотические тельца подсчитывали вслепую в десяти случайно выбранных мощных полях. Столбики ошибок представляют S.E. Двухсторонний t-тест Стьюдента, * обозначает P <0,01. (D) Вестерн-блот анализ расщепленного PARP, фосфо-p53-ser15, расщепленной каспазы 3 и белков PDHE1α, полученных из опухолей, обработанных транспортным средством, DCA, цисплатином или комбинацией обоих препаратов. β-актин служил в качестве внутреннего контроля нагрузки.

Обсуждение

Повышенный гликолиз, который часто встречается при раке, тесно связан с нарушением митохондрий или дефектным окислительным фосфорилированием и способствует терапевтической резистентности [18,19]. Аэробный гликолиз был связан с устойчивостью к химиотерапии [20] или радиотерапии [21]. В настоящем исследовании клеточные линии, устойчивые к цисплатину, показали повышенный гликолиз, что указывает на биохимическую связь между гликолизом и химиорезистентностью. Устойчивые к лекарствам клетки испытывают большую потребность в АТФ, чем нормальные клетки, для поддержания клеточного гомеостаза и активации путей выживания, которые позволяют избежать гибели клеток при генотоксическом стрессе [20]. Устойчивые раковые клетки увеличивают гликолиз для быстрой выработки АТФ, чтобы удовлетворить внутриклеточные потребности. Это было четко обнаружено в наших клетках, устойчивых к цисплатину, по сравнению с родительскими чувствительными клетками, что указывает на то, что лекарственная устойчивость в HNC напрямую связана с увеличением гликолиза. Это означает, что изменение биоэнергетики раковых клеток в сторону увеличения гликолиза связано с химиорезистентностью [14,22]. Таким образом, уровень гликолиза в раковых клетках человека может быть биомаркером химиорезистентности и требует клинического подтверждения в раковых тканях человека.

В настоящем исследовании показано, что DCA смещает генерацию энергии с гликолиза на митохондриальное окисление глюкозы в HNC. Это вызванное DCA изменение метаболического сдвига в сторону гликолиза устраняет пролиферативное преимущество раковых клеток и в конечном итоге приводит к их гибели [23]. DCA, являясь структурным аналогом пирувата, ингибирует PDK и реактивирует PDH, фермент, входящий в комплекс, который преобразует пируват в ацетил-КоА, основной субстрат цикла Кребса [10,23]. Поскольку большинство типов рака создают гипоксическую среду, раковые клетки полагаются на анаэробный гликолиз в качестве основного источника энергии. Активация гипоксия-индуцибельного фактора (HIF) индуцирует митохондриальную PDK [24]. Митохондриальная активность PDH в раке блокируется PDK, что приводит к снижению доступности ацетил-КоА для митохондриального окисления глюкозы [24]. Повышенная экспрессия PDK связана с лекарственной устойчивостью при раке [25,26]. Регуляция PDK2 в результате митохондриальных мутаций и стабилизации HIF1α также наблюдается в клетках HNC [27]. В настоящем исследовании также была подтверждена связь между сверхэкспрессией PDK2 и устойчивостью к цисплатину в клетках HNC. Эти данные указывают на важность PDK как новой молекулярной мишени в терапии рака [10]. Предыдущие данные показали, что генетическое или фармакологическое ингибирование PDK изменяет биоэнергетику рака и восстанавливает митохондрий-зависимый апоптоз в раковых клетках [11,13]. Поэтому ДКК эффективен для преодоления резистентности к лечению в раковых опухолях с агрессивным фенотипом in vitro и in vivo[12-14].

Активация PDH под действием DCA вызывает накопление mROS в раковых клетках. В раковых клетках снижен митохондриальный метаболизм глюкозы, что приводит к снижению активности электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) и уменьшению mROS [10], [28]. Митохондриальное ремоделирование ΔΨm гиперполяризации и снижение выработки mROS в раковых клетках приводит к устойчивости к апоптозу при генотоксическом стрессе. В устойчивых раковых клетках с более гликолитическим фенотипом HK2 приводит к транслокации на внешнюю митохондриальную мембрану и увеличению ΔΨm [29]. Ингибирование гликолиза и транслокации HK2 снижает ΔΨm рака и отменяет устойчивость к апоптозу [29]. В настоящем исследовании повышенная экспрессия HK2 и PDK2 и мембранный потенциал митохондрий также были обнаружены в устойчивых к цисплатину раковых клетках. DCA заставляет пируват поступать в митохондрии через активацию PDH, регулятора митохондриального окисления глюкозы, снижает ΔΨm и увеличивает mROS [13]. В настоящем исследовании DCA просто отменил повышенное митохондриальное ремоделирование в клетках HNC, устойчивых к цисплатину, что способствовало гибели раковых клеток. Активация митохондриального окисления глюкозы под действием DCA вызвала mROS и активацию митохондриальной сигнализации, что привело к активации p53 и связанных с ним проапоптотических путей и к гибели устойчивых к химиотерапии раковых клеток. В нашем исследовании фармакологическое ингибирование выработки mROS или каспаза-опосредованного апоптоза ослабляло цитотоксический эффект DCA в клетках HNC, что подтверждает известные механизмы действия препарата.

Доклинические и клинические исследования поддерживают применение ДКА у онкологических больных и у пациентов с молочнокислым ацидозом, связанным с митохондриальными заболеваниями [10,23]. В ряде исследований продемонстрировано цитотоксическое действие DCA, отдельно или в комбинации с другими препаратами, на различные опухоли, полученные из всех трех зародышевых слоев [23]. Предыдущее исследование показало, что глиобластома, один из самых агрессивных видов рака человека, сверхэкспрессирует PDK2 в раковых тканях, взятых у 49 пациентов, и регрессирует у пяти пациентов после лечения ДКА, что доказывает клиническую пользу ДКА в резистентных раковых опухолях [13]. В недавнем исследовании, посвященном HNC, сравнивался эффект DCA на трех клеточных линиях плоскоклеточной карциномы полости рта (OSCC) [15]. Клетки OSCC с дефицитом митохондриального окислительного фосфорилирования (т.е. высоким гликолизом) были более чувствительны к DCA, чем другие [15,30]. Настоящее исследование подтвердило, что клетки HNC с высокими биоэнергетическими изменениями были более чувствительны к DCA. Фактически, поскольку химиорезистентные раковые клетки имеют тенденцию к высокому гликолизу, эти клетки могут быть мишенью для ингибиторов метаболизма [31]. Таким образом, DCA является хорошим кандидатом для лечения раковых клеток с агрессивным фенотипом, включая химиорезистентные клетки HNC. Однако, поскольку потенциальные противораковые эффекты DCA все еще спорны, особенно в опухолях в условиях гипоксии, необходимы дальнейшие доклинические и клинические исследования DCA и рака [32]. Недавний систематический обзор показал, что DCA синергирует со многими стандартными противораковыми препаратами, а клинические испытания на ранней стадии свидетельствуют о том, что хронический DCA безопасен и хорошо переносится при пероральном приеме 12,5 мг/кг дважды в день [23].

 заключение, наши данные свидетельствуют о том, что высокий уровень гликолиза и сверхэкспрессия PDK тесно связаны с устойчивостью к цисплатину в клетках HNC. DCA переключает биоэнергетику клеток НЯК на митохондриальное окислительное фосфорилирование. Это приводит к снижению ΔΨm и увеличению mROS, тем самым сенсибилизируя химиорезистентные клетки НЯК к цисплатину in vitro и in vivo. Эти данные дают основания для дальнейших доклинических и клинических исследований DCA, перспективного противоракового препарата, при НЯК с агрессивным фенотипом. Однако наше заключение следует принимать во внимание с осторожностью при противоположном сценарии. Дефектное митохондриальное окислительное фосфорилирование было связано с чувствительностью раковых клеток к состоянию низкой глюкозы, что может быть использовано в качестве биомаркера для терапии рака [37]. Раковая клетка также приспособлена для обеспечения пролиферации путем поглощения и включения питательных веществ в биомассу, а не для эффективного производства АТФ [38]. Поэтому доклинические и клинические эффекты DCA на HNC и другие виды рака должны быть изучены далее.

Долгосрочная стабилизация метастатической меланомы с помощью дихлорацетата натрия

Акбар Хан, Дуг Эндрюс, Джилл Шейнхаус, Аннеке С. Блэкберн

Акбар Хан, Дуглас Эндрюс, Medicor Cancer Centres Inc., Торонто, Онтарио M2N 6N4, Канада

Джилл Шейнхаус, Insight Naturopathic Clinic, Торонто, ON M4P 1N9, Канада

Аннеке С. Блэкберн, Школа медицинских исследований Джона Кертина, Австралийский национальный университет, Канберра, ACT 2601, Австралия 

Вклад авторов: Хан А. лечил пациента и написал большую часть отчета о случае; Эндрюс Д. помогал в разработке протокола натурального лечения для снижения побочных эффектов DCA и написал часть отчета о случае; Шейнхаус Дж. лечил пациента с помощью натуральной терапии; Блэкберн А.С. интерпретировал отчет о случае в контексте литературы по исследованиям DCA in vitro и in vivo, написал части введения и обсуждения, а также просмотрел рукопись в целом.

Заявление об информированном согласии: Пациентка, описанная в данной рукописи, дала согласие на публикацию своего случая анонимно. 

Заявление о конфликте интересов: Один из авторов (Хан) проводит терапию дихлорацетатом для онкологических больных через онкологические центры Medicor Cancer Centres за плату и без получения прибыли. Клиника принадлежит члену семьи этого автора. Другим авторам нечего раскрывать.

Открытый доступ: эта статья является статьей открытого доступа, которая была выбрана внутренним редактором и полностью проверена внешними рецензентами. Она распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0), которая позволяет другим распространять, перерабатывать, адаптировать, строить на основе этой работы некоммерческие работы и лицензировать свои производные работы на других условиях, при условии, что оригинальная работа должным образом цитируется и использование является некоммерческим. См.: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Источник рукописи: приглашенная рукопись

Адрес для корреспонденции: Акбар Хан, доктор медицины, медицинский директор, 
Medicor Cancer Centres Inc., 4576 Yonge St., Suite 301, Toronto, 
ON M2N 6N4, Canada. akhan@medicorcancer.com
Телефон: +1-416-2270037
Факс: +1-416-2271915

  Получено:  30 января 2017 г.
  Начало рецензирования:  12 февраля 2017 г.
  Первое решение:  28 марта 2017 г.
  Исправлено:  5 мая 2017 г.
  Принято:  30 мая 2017 г.
  Статья в печати:  31 мая 2017 г.
  Опубликовано онлайн:  10 августа 2017 г.

Абстрактный

Дихлорацетат натрия (DCA) изучается как метаболическая терапия рака с 2007 года на основе публикации Bonnet et al, демонстрирующей, что DCA может вызывать апоптоз (запрограммированную гибель клеток) в клетках рака молочной железы, легких и мозга человека. Классически реакция рака на медикаментозную терапию в исследованиях на людях измеряется с помощью определений Критериев оценки ответа для солидных опухолей, которые определяют «ответ» по степени уменьшения опухоли или исчезновения опухоли при визуализации, однако стабилизация заболевания также является полезным клиническим результатом. Было показано, что DCA может функционировать как цитостатический агент in vitro и in vivo, не вызывая апоптоза. Представлен случай 32-летнего мужчины, у которого терапия DCA без сопутствующей традиционной терапии привела к регрессии и стабилизации рецидивирующей метастатической меланомы в течение более 4 лет с незначительными побочными эффектами. Этот случай демонстрирует, что DCA можно использовать для уменьшения объема заболевания и поддержания долгосрочной стабильности у пациентов с запущенной меланомой.

Ключевые слова: Дихлорацетат; Рак; BRAF; Меланома; Цитостатики

© Автор(ы) 2017. Опубликовано Baishideng Publishing Group Inc. Все права защищены.

Основная подсказка: Дихлорацетат натрия (DCA) изучается как метаболическая терапия рака с 2007 года. Было показано, что терапия DCA может привести к классическому ответу, который измеряется уменьшением или исчезновением опухолей при визуализации. Однако DCA может также остановить рост раковых клеток, не вызывая апоптоза (цитостатический эффект). Это может привести к долгосрочной стабилизации метастатического рака. Мы представляем случай пероральной терапии DCA, которая привела к уменьшению и стабилизации метастатической меланомы у 32-летнего мужчины в течение более 4 лет, с небольшими побочными эффектами.

Хан А., Эндрюс Д., Шейнхаус Дж., Блэкберн А.К. Долгосрочная стабилизация метастатической меланомы с помощью дихлорацетата натрия.
World J Clin Oncol 2017; 8(4): 371-377

Доступно по адресу: URL: http://www.wjgnet.com/2218-4333/full/v8/i4/371.htm
DOI: http://dx.doi.org/10.5306/wjco.v8.i4.371

ВВЕДЕНИЕ

Дихлорацетат натрия (DCA) привлек внимание медицинского сообщества в 2007 году, когда Боннет и др.  опубликовали первое исследование in vitro и in vivo, иллюстрирующее ценность DCA как метаболической терапии рака посредством его ингибирующего действия на митохондриальный фермент пируватдегидрогеназу киназу. Ранее Стакпул и др. опубликовали несколько исследований DCA для лечения врожденного лактатацидоза при митохондриальных заболеваниях. Эти исследования показали, что пероральный DCA является безопасным препаратом для использования человеком. Было отмечено, что DCA не оказывает почечной, легочной, костномозговой и сердечной токсичности . Большинство побочных эффектов DCA были умеренными, причем наиболее серьезным из них была обратимая периферическая невропатия . Также сообщалось об обратимом делирии. Повышение уровня печеночных ферментов (бессимптомное и обратимое) было отмечено у небольшого процента пациентов. Предшествующие исследования митохондриальных расстройств на людях позволили быстро перевести DCA на использование человеком в качестве не по назначению терапии рака. В настоящее время опубликовано несколько отчетов о клинических испытаниях с использованием DCA в качестве терапии рака, подтверждающих его профиль безопасности и указывающих на растущее признание потенциальной полезности DCA в онкологической клинике . Одним из ограничений этих исследований с участием пациентов на поздней стадии является то, что они сообщали только о лечении в течение коротких периодов времени.

В публикации Бонне 2007 года  было показано, что лечение DCA снижает потенциал митохондриальной мембраны, что селективно способствует апоптозу в раковых клетках человека. Ингибирование аэробного гликолиза (эффект Варбурга) и активация митохондриальных калиевых ионных каналов были идентифицированы как механизмы действия DCA. Дальнейшие исследования DCA in vitro подтвердили противораковую активность против широкого спектра типов рака, которые были недавно рассмотрены Канкотией и Стэкпулом . Кроме того, DCA также способен усиливать апоптоз в сочетании с другими агентами . Также были предложены другие противораковые действия DCA, включая ингибирование ангиогенеза  , изменение экспрессии HIF1-α , изменение регуляторов pH клеток V-АТФазы и MCT1, а также других регуляторов выживания клеток, таких как p53 и PUMA . Однако во многих исследованиях in vitro используются неоправданно высокие концентрации DCA, которые клинически недостижимы, в попытке продемонстрировать цитотоксическую активность.. В других исследованиях использовались более скромные концентрации DCA, что показало, что DCA может быть цитостатическим. Во втором отчете 2010 года о его противораковой активности in vivo было обнаружено, что DCA сам по себе является цитостатическим в метастатической модели рака молочной железы , ингибируя пролиферацию, не вызывая апоптоз. Это предполагает роль DCA как стабилизатора рака, аналогичного ингибиторам ангиогенеза.

В ответ на отчет 2007 года о противораковом действии DCA Хан начал использовать DCA для лечения онкологических больных с коротким прогнозом или тех, кто перестал реагировать на традиционные методы лечения рака. В сотрудничестве с врачом-натуропатом (Эндрюс) был разработан протокол натурального лечения для решения проблемы ограничивающей дозу неврологической токсичности DCA. Он состоял из 3 лекарств: ацетил L-карнитин , R-альфа-липоевая кислота и бенфотиамин для профилактики нейропатии и энцефалопатии. У более чем 300 пациентов с поздней стадией рака наблюдательные данные показали, что терапия DCA принесла пользу в 60% -70% случаев. Риск нейропатии при сочетании натуральных нейропротекторных лекарств с DCA составлял приблизительно 20% при дозировке 20-25 мг/кг в день в течение 2 недель приема/1 недели перерыва (клинические наблюдательные данные опубликованы онлайн на сайте www.medicorcancer.com). Здесь представлен отчет о случае пациента, иллюстрирующий как апоптотический, так и антипролиферативный эффект хронического лечения DCA в течение более четырех лет.

ОТЧЕТ О ДЕЛЕ

32-летний ранее здоровый светлокожий мужчина изначально заметил, что родинка на его левой икре начала меняться в 2006 году. Он обратился к врачу, и родинка была удалена. Был поставлен патологический диагноз меланомы. Была проведена диссекция сторожевого узла, которая оказалась отрицательной на метастатическое заболевание. В 2007 году пациент отметил увеличение левых паховых лимфатических узлов и небольшие меланоцитарные поражения на коже левой ноги. Он прошел лечение интерфероном альфа в рамках клинического испытания в региональной онкологической больнице, что привело к уменьшению узлов и разрешению кожных метастазов. Интерферон был отменен через 9 месяцев из-за побочных эффектов.
Пациент оставался в хорошем состоянии до 2010 года, когда появился новый кожный метастаз левой ноги. Он был хирургически удален. В конце 2011 года был обнаружен еще один новый кожный метастаз на левой ноге в рубце от первоначальной операции по удалению меланомы. Была проведена биопсия, и был подтвержден диагноз рецидивирующей меланомы. Затем ему сделали широкое иссечение и пересадку кожи.
В марте 2012 года у пациента диагностировали рецидив в кожном лоскуте левой ноги. Он был иссечен, и была проведена новая процедура пересадки кожи. Патология выявила положительные края иссеченного метастаза, поэтому была проведена повторная резекция, снова с положительными краями. В то же время игольчатая биопсия левого пахового лимфатического узла подтвердила наличие BRAF-положительной метастатической меланомы. Компьютерная томография (КТ), проведенная в марте 2012 года, не выявила никаких признаков отдаленных метастазов. Самый большой левый паховый узел имел диаметр 8 мм, что было сообщено как «незначительный по критериям размера» (рисунок 1).
В апреле 2012 года пациент обратился к врачу-натуропату (Shainhouse) и начал терапию следующими пероральными натуральными противораковыми средствами: активное гексозо-коррелированное соединение или AHCC (экстракт гриба) , корень одуванчика  , куркумин и корень астрагала  . Также была начата парентеральная терапия, которая состояла из внутривенного витамина С два раза в неделю и подкожного экстракта омелы европейской. Пациент также перешел на веганскую диету.
В мае 2012 года пациент посетил клинику автора (Khan), желая получить дополнительные нетрадиционные методы лечения. Обсуждалась терапия DCA, но пациент решил сначала провести адекватную пробу натуральных противораковых методов лечения (прописанных Shainhouse). В мае 2012 года была проведена повторная КТ (всего через 1 месяц естественной терапии), которая выявила умеренное увеличение множественных паховых и наружных подвздошных узлов размерами от 10 мм × 11 мм до 14 мм × 15 мм.
В июле 2012 года КТ-сканирование было повторено для оценки естественной противораковой терапии пациента. В то время левые паховые и наружные подвздошные узлы снова увеличились и имели размер от 13 мм × 16 мм до 22 мм × 20 мм (рисунок 2). ПЭТ-сканирование также было проведено в рамках подготовки к участию в клиническом исследовании в Бостоне, штат Массачусетс (США), и подтвердило повышенное поглощение глюкозы в левых паховых узлах. Появилась новая слабая (2/10) ноющая боль в левой паховой области. Обследование выявило 20-миллиметровый безболезненный левый паховый лимфатический узел и два небольших кожные метастаза в пределах кожного трансплантата левой голени.

Рисунок 1. Компьютерная томография от марта 2012 г. до естественной терапии и до терапии дихлорацетатом. Самый большой узел имел диаметр 8 мм.Рисунок 2. Компьютерная томография от июля 2012 г. после 3 месяцев только естественной терапии, непосредственно перед началом терапии дихлорацетатом. Самый большой узел имел размеры 22 мм × 20 мм.

Таким образом, у пациента диагностировали прогрессирование заболевания. В этот момент он решил начать терапию DCA. Он начал принимать DCA перорально по 500 мг 3 раза в день, что было эквивалентно 17 мг/кг в день (производитель: Tokyo Chemical Industry, США) в дополнение к поддержанию других натуральных методов лечения. Цикл лечения DCA составлял 2 недели приема и 1 неделю перерыва. Чтобы свести к минимуму возникновение побочных эффектов DCA, были назначены 3 дополнительных натуральных препарата: пероральный ацетил L-карнитин по 500 мг 3 раза в день, пероральный бенфотиамин по 80 мг два раза в день и пероральная R-альфа-липоевая кислота по 150 мг 3 раза в день. Эти добавки принимались ежедневно (без цикла). Были проведены рутинные базовые анализы крови (таблица 1). Все они были в норме, за исключением низкого уровня креатинина, который считался незначительным.
В ноябре 2012 года, через 4 месяца после добавления DCA к его первоначальной естественной противораковой терапии, пациент прошел повторную оценку. Он чувствовал себя в целом хорошо. Было сообщено, что два новых симптома начались только после начала терапии DCA: слегка сниженная чувствительность кончиков пальцев рук и ног и слегка сниженная способность концентрироваться в течение 2 недель, в течение которых он принимал DCA. Легкая потеря чувствительности не ухудшалась и ощущалась как легкая невропатия, связанная с DCA. Сообщалось, что как онемение, так и снижение концентрации прошли в течение недель, когда пациент не принимал DCA. Анализ крови от октября 2012 года не показал существенных изменений (таблица 1). КТ в августе 2012 года и ноябре 2012 года выявили значительную регрессию всех ранее увеличенных лимфатических узлов. Самый большой узел был 10 мм, и не было никаких признаков внутригрудного или внутрибрюшного заболевания, а также никаких метастазов в кости (рисунок 3).
Пациент продолжал чувствовать себя хорошо на терапии DCA и не заметил никаких новых метастазов в коже или нового увеличения паховых узлов. Он продолжал проходить частый клинический мониторинг у своего врача-натуропата (Шейнхаус) и ежегодное последующее наблюдение у своего лечащего врача (Хан). Перечисленные натуральные противораковые терапии (назначенные Шейнхаусом) и терапия DCA продолжались до 2016 года. Результаты анализа крови в июне 2016 года продолжали быть нормальными (таблица 1). КТ была повторена в августе 2016 года, не показав никаких признаков метастатической меланомы, после полных 4 лет непрерывной терапии DCA в сочетании с натуральной противораковой терапией (рисунок 4). К декабрю 2016 года пациент сообщил об увеличении стресса, связанного с работой, и снижении соблюдения режима приема лекарств. В то время он заметил новую паховую массу слева. Была получена ультразвуковая визуализация, которая выявила новый конгломерат увеличенных лимфатических узлов размером 40 мм × 25 мм × 23 мм, с цветным допплером, показывающим кровоток внутри массы. Это было интерпретировано как повторный рост меланомы, примерно после четырех с половиной лет непрерывной терапии DCA. Было проведено дальнейшее обследование, включая ПЭТ/КТ, которое подтвердило рецидив заболевания в 3 левых паховых узлах (SUV max в диапазоне от 13 до 17,8).

Рисунок 3. Компьютерная томография от ноября 2012 г. после 4 месяцев терапии дихлорацетатом. Самый большой узел размером 10 мм.Рисунок 4. Компьютерная томография после 4 лет терапии дихлорацетатом без сопутствующих традиционных методов лечения рака. Сканирование показывает отсутствие повторного роста рака. Все узлы имеют размер менее 10 мм.

Вкратце, пациент получал традиционную терапию рецидивирующей меланомы 3 стадии в течение 6 лет, состоящую из первичной хирургической резекции с лимфодиссекцией, интерферона альфа и хирургической резекции рецидивирующих кожных метастазов 5 раз. Затем пациент получал только естественную противораковую терапию (назначенную Шейнхаусом) в течение 3 месяцев без ответа, о чем свидетельствовало устойчивое прогрессирование заболевания на серийных КТ-сканированиях. Наконец, пациент добавил пероральную терапию DCA к естественной противораковой терапии с 3 сопутствующими нейропротекторными препаратами (липоевая кислота, ацетил L-карнитин и бенфотиамин) и без сопутствующих традиционных методов лечения рака. Результатом стала полная радиологическая ремиссия, продолжавшаяся более 4 лет, за которой последовал рецидив. Во время курса терапии DCA у пациента наблюдались незначительные побочные эффекты, состоящие из легкой невропатии и небольшого снижения концентрации. У пациента сохранялась функция ECOG уровня 0, и он мог работать полный рабочий день.

Таблица 1 Анализ крови до терапии дихлорацетатом натрия

1 Указывает на аномальное значение. DCA: Дихлорацетат; LDH: Лактатдегидрогеназа; GGT: Гамма-глутамилтрансфераза; AST: Аспартатаминотрансфераза; ALT: Аланинаминотрансфераза.

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование перорального DCA у пациента с метастатической меланомой, описанное здесь, демонстрирует уменьшение опухоли и долгосрочную стабильность заболевания в соответствии с клиническим статусом и КТ-визуализацией. Стабильность заболевания сохранялась более 4 лет при приеме DCA в отсутствие какой-либо сопутствующей традиционной терапии, с выживаемостью с момента первоначальной постановки диагноза 10 лет. Согласно статистике рака SEER Национального института рака, выживаемость этого пациента, у которого не было признаков отдаленных метастазов, не является примечательной (62,9% 5-летняя выживаемость при меланоме с распространением на региональные лимфатические узлы, https://seer.cancer.gov/statfacts/html/melan.html). Примечательно то, что в ситуации, когда вовлеченные лимфатические узлы явно увеличивались, добавление пероральной терапии DCA было эффективным для уменьшения увеличивающихся узлов (рисунки 2 и 3) и достижения ремиссии, продолжавшейся более 4 лет. Возможно, что естественные противораковые терапии, которые получал пациент, синергизировались с DCA, но также очевидно, что эти естественные терапии сами по себе не могут объяснить регрессию заболевания. Сообщалось, что DCA оказывает как апоптотический, так и цитостатический эффект, что согласуется с клиническим течением регрессии (апоптотический) и длительной ремиссией (цитостатический) у этого пациента. Рецидив через 4 года совпал с уменьшением соблюдения режима лечения, что предполагает, что этот метод лечения рака с помощью DCA требует постоянного поддержания метаболического давления. Несмотря на рецидив, пациент оставался клинически здоровым и планировал начать прием новых иммунотерапевтических препаратов. Еще предстоит выяснить, сможет ли изменение терапии снова достичь регрессии или стабильности заболевания.
Помимо поддержания ремиссии в течение более 4 лет, этот случай иллюстрирует, что DCA может хорошо переноситься онкологическим пациентом в течение длительного периода времени по сравнению со всеми опубликованными клиническими испытаниями DCA по раку. Примечательно, что этот пациент смог переносить 17 мг/кг в день в режиме 2 недели приема/1 неделя перерыва в течение 4 лет с минимальными побочными эффектами. Это похоже на наш предыдущий отчет о случае хронического использования DCA при раке толстой кишки , где пациент смог переносить 16 мг/кг в день (но не 25 мг/кг в день) в том же режиме, но контрастирует с клиническими испытаниями DCA, которые рекомендуют более низкую дозу 10-12,5 мг/кг в день, вводимую непрерывно. Перерыв в 1 неделю или нейропротекторные добавки могут способствовать способности пациентов в отчетах о случаях переносить более высокую дозу. Генетические полиморфизмы в GSTZ1, ферменте печени, который метаболизирует DCA, также могут способствовать дозе DCA, которая может быть переносима. В испытаниях сообщалось о различных уровнях препарата, но не все из них рассматривали этот фармакогенетический аспект терапии DCA , и необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, является ли это существенным фактором переносимости DCA. На момент написания этой статьи продолжается исследование DCA с множественной миеломой у людей, в котором изучаются как генотипы GSTZ1, так и уровни препарата, чтобы внести свой вклад в наше понимание этих проблем (Реестр клинических испытаний Австралии и Новой Зеландии #ACTRN12615000226505, http://www.anzctr.org.au).
Этот отчет о случае показывает, что хроническая терапия DCA может использоваться без снижения качества жизни по сравнению с традиционными методами лечения меланомы, такими как интерферон. Чтобы определить оптимальный протокол для максимально переносимого острого или хронического лечения с помощью DCA, необходимы испытания на людях. Но что еще важнее, все еще остается выяснить, какая доза требуется для целевых эффектов, которые будут эффективны против рака. Эта информация необходима перед инвестированием в более крупные долгосрочные исследования результатов для пациентов. DCA заслуживает дальнейшего изучения в клинических испытаниях как нетоксичная терапия рака из-за своей скромной стоимости и низкой токсичности, а также заслуживает рассмотрения в качестве терапии рака не по назначению.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Хумайру Хан за ее помощь, а также пациентку за ее поддержку и согласие опубликовать ее случай.

КОММЕНТАРИИ 

Характеристика случая
У 32-летнего мужчины на ноге обнаружилось пигментное пятно.

Клинический диагноз
У пациентки диагностирована меланома.

Лабораторный диагноз:
Меланома подтверждена эксцизионной биопсией.

Диагностика с помощью визуализации:
подтверждено наличие увеличенного пахового узла в меланоме (биопсия иглой).

Патологический диагноз:
Меланома, BRAF-положительный.

Лечение
Иссечение первичного очага с пересадкой кожи, иссечение сторожевого узла, множественные иссечение рецидивирующих кожных метастазов. Традиционная терапия прекращена и начаты натуральные противораковые терапии (AHCC, корень одуванчика, куркумин, корень астрагала, внутривенно витамин С, подкожно европейская омела). Прогрессирование через 3 месяца, добавлен дихлорацетат (DCA). Регресс и ремиссия после добавления DCA, продолжающиеся более 4 лет.

Сопутствующие отчеты
Отчеты компьютерной томографии демонстрируют течение заболевания и реакцию на терапию.

Объяснение термина 
DCA: Дихлорацетат натрия; RECIST: Критерии оценки ответа на солидные опухоли; ECOG: Восточная кооперативная онкологическая группа; SEER: Наблюдение, эпидемиология и конечные результаты.

Опыт и уроки
DCA может действовать как проапоптотический и цитостатический препарат и, таким образом, может достигать регрессии, а также долгосрочной стабилизации метастатического рака без серьезных побочных эффектов, как показано на примере этого случая меланомы.

Рецензирование
Доктор Хан описал 32-летнего мужчину, который получал терапию DCA с другими препаратами от натуропатов и поддерживался в состоянии стабилизации (метастатическая меланома) более 4 лет. Это интересный случай.

ССЫЛКИ

1 Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, Puttagunta L, Bonnet S, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED. Ось митохондриального канала K+ подавляется при раке, а ее нормализация способствует апоптозу и подавляет рост рака. Cancer Cell 2007; 11: 37-51 [PMID: 17222789 DOI: 10.1016/ j.ccr.2006.10.020]
2 Stacpoole PW, Kurtz TL, Han Z, Langaee T. Роль дихлорацетата в лечении генетических митохондриальных заболеваний. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60: 1478-1487 [PMID: 18647626 DOI: 10.1016/ j.addr.2008.02.014]
3 Stacpoole PW, Gilbert LR, Neiberger RE, Carney PR, Valenstein E, Theriaque DW, Shuster JJ. Оценка длительного лечения детей с врожденным лактоацидозом дихлорацетатом. Педиатрия 2008; 121: e1223-e1228 [PMID: 18411236 DOI: 10.1542/ peds.2007-2062]
4 Stacpoole PW, Kerr DS, Barnes C, Bunch ST, Carney PR, Fennell EM, Felitsyn NM, Gilmore RL, Greer M, Henderson GN, Hutson AD, Neiberger RE, O'Brien RG, Perkins LA, Quisling RG, Shroads AL, Shuster JJ, Silverstein JH, Theriaque DW, Valenstein E. Контролируемое клиническое исследование дихлорацетата для лечения врожденного лактоацидоза у детей. Педиатрия 2006; 117: 1519-1531 [PMID: 16651305 DOI: 10.1542/peds.2005-1226]
5 Berendzen K, Theriaque DW, Shuster J, Stacpoole PW. Терапевтический потенциал дихлорацетата при дефиците пируватдегидрогеназного комплекса. Mitochondrion 2006; 6: 126-135 [PMID: 16725381 DOI: 10.1016/j.mito.2006.04.001]
6 Kaufmann P, Engelstad K, Wei Y, Jhung S, Sano MC, Shungu DC, Millar WS, Hong X, Gooch CL, Mao X, Pascual JM, Hirano M, Stacpoole PW, DiMauro S, De Vivo DC. Дихлорацетат вызывает токсическую невропатию при MELAS: рандомизированное контролируемое клиническое исследование. Neurology 2006; 66: 324-330 [PMID: 16476929 DOI: 10.1212/01. wnl.0000196641.05913.27]
7 Brandsma D, Dorlo TP, Haanen JH, Beijnen JH, Boogerd W. Тяжелая энцефалопатия и полинейропатия, вызванная дихлорацетатом. J Neurol 2010; 257: 2099-2100 [PMID: 20632025 DOI: 10.1007/ s00415-010-5654-9]
8 Микелакис Э.Д., Сутендра Г., Дромпарис П., Вебстер Л., Хароми А., Нивен Э., Магуайр К., Гаммер Т.Л., Макки Дж.Р., Фултон Д., Абдулкарим Б., Макмертри М.С., Петрук К.С. Метаболическая модуляция глиобластомы дихлорацетатом. Sci Transl Med 2010; 2: 31ra34 [PMID: 20463368 DOI: 10.1126/scitranslmed.3000677]
9 Данбар EM, Коутс BS, Шроудс AL, Лангаи T, Лью A, Фордер JR, Шустер JJ, Вагнер DA, Стэкпул PW. Фаза 1 испытания дихлорацетата (DCA) у взрослых с рецидивирующими злокачественными опухолями мозга. Invest New Drugs2014; 32: 452-464 [PMID: 24297161 DOI: 10.1007/ s10637-013-0047-4]
10Garon EB, Christofk HR, Hosmer W, Britten CD, Bahng A, Crabtree MJ, Hong CS, Kamranpour N, Pitts S, Kabbinavar F, Patel C, von Euw E, Black A, Michelakis ED, Dubinett SM, Slamon DJ. Дихлорацетат следует рассматривать с химиотерапией на основе платины при гипоксических опухолях, а не как единственный агент при распространенном немелкоклеточном раке легких. J Cancer Res Clin Oncol 2014; 140: 443-452 [PMID: 24442098 DOI: 10.1007/s00432-014-1583-9]
11 Chu QS, Sangha R, Spratlin J, Vos LJ, Mackey JR, McEwan AJ, Venner P, Michelakis ED. Открытое исследование фазы I с однокомпонентным методом и повышением дозы дихлорацетата (DCA) у пациентов с запущенными солидными опухолями. Invest New Drugs 2015; 33: 603-610 [PMID: 25762000 DOI: 10.1007/s10637-015-0221-y]
12 Канкотия С., Стэкпул П. У. Дихлорацетат и рак: новый дом для орфанного препарата? Biochim Biophys Acta 2014; 1846: 617-629 [PMID: 25157892 DOI: 10.1016/j.bbcan.2014.08.005]
13 Сан Р. К., Борд П. Г., Блэкберн А. К. Нацеливание метаболизма с помощью триоксида мышьяка и дихлорацетата в клетках рака молочной железы. Mol Cancer 2011; 10: 142 [PMID: 22093145 DOI: 10.1186/1476-4598-10-142]
14 Stockwin LH, Yu SX, Borgel S, Hancock C, Wolfe TL, Phillips LR, Hollingshead MG, Newton DL. Дихлорацетат натрия селективно воздействует на клетки с дефектами в митохондриальной ЭТЦ. Int J Cancer 2010; 127: 2510-2519 [PMID: 20533281 DOI: 10.1002/ijc.25499]
15 Gang BP, Dilda PJ, Hogg PJ, Blackburn AC. Нацеливание на два аспекта метаболизма при лечении рака молочной железы. Cancer Biol Ther 2014; 15: 1533-1541 [PMID: 25482950 DOI: 10.4161/15384047.2014.955992]
16 Sutendra G, Dromparis P, Kinnaird A, Stenson TH, Haromy A, Parker JM, McMurtry MS, Michelakis ED. Активация митохондрий путем ингибирования PDKII подавляет сигнализацию HIF1a и ангиогенез при раке. Oncogene 2013; 32: 1638-1650 [PMID: 22614004 DOI: 10.1038/onc.2012.198]
17 Cairns RA, Bennewith KL, Graves EE, Giaccia AJ, Chang DT, Denko NC. Фармакологически повышенная гипоксия опухоли может быть измерена с помощью позитронно-эмиссионной томографии с 18F-фторазомицин арабинозидом и усиливает реакцию опухоли на гипоксический цитотоксин PR-104. Clin Cancer Res 2009; 15: 7170-7174 [PMID: 19920111 DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-09-1676]
18 Anderson KM, Jajeh J, Guinan P, Rubenstein M. In vitro эффекты дихлорацетата и CO2 на гипоксические клетки HeLa. Anticancer Res 2009; 29: 4579-4588 [PMID: 20032407]
19 Sun RC, Fadia M, Dahlstrom JE, Parish CR, Board PG, Blackburn AC. Изменение гликолитического фенотипа дихлорацетатом подавляет рост метастатических клеток рака молочной железы in vitro и in vivo. Breast Cancer Res Treat 2010; 120: 253-260 [PMID: 19543830 DOI: 10.1007/ s10549-009-0435-9]
20De Grandis D. Ацетил-L-карнитин для лечения периферической нейропатии, вызванной химиотерапией: краткий обзор. CNS Drugs 2007; 21 Suppl 1: 39-43; обсуждение 45-46 [PMID: 17696592]
21 Maestri A, De Pasquale Ceratti A, Cundari S, Zanna C, Cortesi E, Crinò L. Пилотное исследование эффекта ацетил-L-карнитина при периферической нейропатии, вызванной паклитакселом и цисплатином. Tumori 2005; 91: 135-138 [PMID: 15948540]
22 Evans JD, Jacobs TF, Evans EW. Роль ацетил-L-карнитина в лечении диабетической периферической нейропатии. Ann Pharmacother 2008; 42: 1686-1691 [PMID: 18940920 DOI: 10.1345/aph.1L201]
23 Mijnhout GS, Kollen BJ, Alkhalaf A, Kleefstra N, Bilo HJ. Альфа-липоевая кислота при симптоматической периферической нейропатии у пациентов с диабетом: метаанализ рандомизированных контролируемых исследований. Int J Endocrinol 2012; 2012: 456279 [PMID: 22331979 DOI: 10.1155/2012/456279]
24 Liu F, Zhang Y, Yang M, Liu B, Shen YD, Jia WP, Xiang KS. [Лечебный эффект альфа-липоевой кислоты на периферическую нейропатию при диабете 2 типа: клиническое исследование]. Zhonghua Yixue Zazhi 2007; 87: 2706-2709 [PMID: 18167250]
25 Ziegler D, Hanefeld M, Ruhnau KJ, Meissner HP, Lobisch M, Schütte K, Gries FA. Лечение симптоматической диабетической периферической нейропатии антиоксидантной альфа-липоевой кислотой. 3-недельное многоцентровое рандомизированное контролируемое исследование (исследование ALADIN). Diabetologia 1995; 38: 1425-1433 [PMID: 8786016]
26 Winkler G, Kempler P. [Патомеханизм диабетической нейропатии: предпосылки патогенез-ориентированной терапии]. Orv Hetil 2010; 151: 971-981 [PMID: 20519180 DOI: 10.1556/OH.2010.28898]
27 Ang CD, Alviar MJ, Dans AL, Bautista-Velez GG, Villaruz-Sulit MV, Tan JJ, Co HU, Bautista MR, Roxas AA. Витамин B для лечения периферической нейропатии. Cochrane Database Syst Rev 2008; (3): CD004573 [PMID: 18646107 DOI: 10.1002/14651858.CD004573. pub3]
28 Winkler G, Pál B, Nagybéganyi E, Ory I, Porochnavec M, Kempler P. Эффективность различных режимов дозировки бенфотиамина при лечении болезненной диабетической невропатии. Arzneimittelforschung 1999; 49: 220-224 [PMID: 10219465 DOI: 10.1055/s-0031-1300405]
29 Ignacio RM, Kim CS, Kim YD, Lee HM, Qi XF, Kim SK. Терапевтический эффект активного гексозо-коррелированного соединения (AHCC) в сочетании с CpG-ODN (олигодезоксинуклеотидом) в мышиной модели меланомы B16. Cytokine 2015; 76: 131-137 [PMID: 26082022 DOI: 10.1016/j.cyto.2015.06.002]
30 Chatterjee SJ, Ovadje P, Mousa M, Hamm C, Pandey S. Эффективность экстракта корня одуванчика в индукции апоптоза в клетках меланомы человека, устойчивых к лекарственным препаратам. Evid Based Complement Alternat Med 2011; 2011: 129045 [PMID: 21234313 DOI: 10.1155/2011/129045]
31Mirzaei H, Naseri G, Rezaee R, Mohammadi M, Banikazemi Z, Mirzaei HR, Salehi H, Peyvandi M, Pawelek JM, Sahebkar A. Куркумин: новый кандидат для терапии меланомы? Int J Cancer 2016; 139: 1683-1695 [PMID: 27280688 DOI: 10.1002/ijc.30224]
32 Huang XY, Zhang SZ, Wang WX. Повышение противоопухолевой эффективности при комбинированном применении астрагала и птеростильбена при меланоме. Asian Pac J Cancer Prev 2014; 15: 1163-1169 [PMID: 24606435]
33 Wagner SC, Markosian B, Ajili N, Dolan BR, Kim AJ, Alexandrescu DT, Dasanu CA, Minev B, Koropatnick J, Marincola FM, Riordan NH. Внутривенная аскорбиновая кислота как адъювант иммунотерапии интерлейкином-2. J Transl Med 2014; 12: 127 [PMID: 24884532 DOI:10.1186/1479-5876-12-127]
34 Horneber MA, Bueschel G, Huber R, Linde K, Rostock M. Терапия омелой в онкологии. Cochrane Database Syst Rev 2008; (2): CD003297 [PMID: 18425885 DOI: 10.1002/14651858.CD003297.pub2]
35 Delaney LM, Ho N, Morrison J, Farias NR, Mosser DD, Coomber BL. Дихлорацетат влияет на пролиферацию, но не на выживаемость клеток колоректального рака человека. Apoptosis 2015; 20: 63-74 [PMID: 25344893 DOI: 10.1007/s10495-014-1046-4]
36 Abildgaard C, Dahl C, Basse AL, Ma T, Guldberg P. Биоэнергетическая модуляция с помощью дихлорацетата снижает рост клеток меланомы и усиливает их ответ на ингибирование BRAFV600E. J Transl Med 2014; 12: 247 [PMID: 25182332 DOI: 10.1186/s12967-014-0247-5]
37 Хан А., Эндрюс Д., Блэкберн А. С. Долгосрочная стабилизация рака толстой кишки 4 стадии с использованием терапии дихлорацетатом натрия. World J Clin Cases 2016; 4: 336-343 [PMID: 27803917]
38 Ценг Х. Ф., Блэкберн А. С., Борд П. Г., Андерс М. В. Полиморфизм и зависящая от вида инактивация дзета-глутатионтрансферазы дихлорацетатом. Chem Res Toxicol 2000; 13: 231-236 [PMID: 10775321]

Дихлорацетат (ДХА) и рак: обзор клинического применения

Лаборатория доклинических и трансляционных исследований, IRCCS-CROB, Реферальный онкологический центр Базиликаты, Рионеро-ин-Вультуре (Pz), 85028, Италия
2 Кафедра клинической и экспериментальной медицины, Университет Фоджи, Фоджа 71121, Италия

Корреспонденцию следует направлять Тициане Татарани; tiziana.tataranni@crob.it

Приглашенный редактор: Канхайя Сингх

Авторские права © 2019 Тициана Татаранни и Клаудия Пикколи. Это статья открытого доступа, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.

Получено:  24 июля 2019 г.
Изменено:  12 сентября 2019 г.
Принято:  11 октября 2019 г.
Опубликовано онлайн:  14 ноября 2019 г.

Обширный объем литературы описывает противораковые свойства дихлорацетата (DCA), но его эффективное клиническое применение в терапии рака по-прежнему ограничивается клиническими испытаниями. Возникновение побочных эффектов, таких как нейротоксичность, а также подозрение на канцерогенность DCA по-прежнему ограничивают клиническое применение DCA. Однако в последние годы число отчетов, поддерживающих использование DCA против рака, возросло также из-за большого интереса к нацеливанию на метаболизм опухолевых клеток. Анализ механизма действия DCA помог понять основы его селективной эффективности против раковых клеток. Успешное совместное введение DCA с традиционной химиотерапией, радиотерапией, другими препаратами или природными соединениями было протестировано на нескольких моделях рака. Новые системы доставки лекарств и многофункциональные соединения, содержащие DCA и другие препараты, по-видимому, улучшают биодоступность и кажутся более эффективными благодаря синергетическому действию нескольких агентов. Распространение отчетов, поддерживающих эффективность DCA в терапии рака, побудило провести дополнительные исследования, которые позволили найти другие потенциальные молекулярные мишени DCA. Интересно, что DCA может существенно влиять на фракцию стволовых клеток рака и способствовать искоренению рака. В совокупности эти результаты дают весомое обоснование для новых клинических трансляционных исследований DCA в терапии рака.

ВВЕДЕНИЕ

Рак является одной из основных причин смерти во всем мире. Несмотря на значительный прогресс в диагностических и терапевтических подходах, его искоренение по-прежнему представляет собой проблему. Слишком много факторов ответственны за неудачу терапии или рецидив, поэтому существует острая необходимость в поиске новых подходов к его лечению. Помимо типичных известных свойств, характерных для злокачественных клеток, включая аномальную пролиферацию, дерегуляцию апоптоза и клеточного цикла [1, 2] , раковые клетки также демонстрируют особую метаболическую машину, которая предлагает еще один многообещающий подход к терапии рака [3–5] . Наша группа уже предположила важность метаболической характеристики раковых клеток для прогнозирования эффективности метаболического лечения [6] . Лекарства, способные влиять на метаболизм рака, уже рассматриваются, показывая обнадеживающие результаты с точки зрения эффективности и переносимости [7] . В последнее десятилетие малая молекула DCA, уже используемая для лечения острого и хронического лактоацидоза, врожденных ошибок митохондриального метаболизма и диабета [8] , в основном предназначалась в качестве противоракового препарата. DCA представляет собой водорастворимую молекулу кислоты массой 150 Да, аналог уксусной кислоты, в которой два из трех атомов водорода метильной группы заменены атомами хлора (рисунок 1(a)) [9] . Введение DCA в дозах от 50 до 200 мг/кг/умер связано с уменьшением объема опухолевой массы, скорости пролиферации и распространения метастазов в нескольких доклинических моделях [10] . Наша группа уже наблюдала обратную корреляцию между способностью DCA убивать раковые клетки и их митохондриальной дыхательной способностью в карциномах ротовых клеток [11] . Более того, недавно мы описали способность DCA влиять на митохондриальную функцию и замедлять прогрессирование рака в модели рака поджелудочной железы [12] . На сегодняшний день доступны последовательные данные клинических испытаний и отчеты о случаях, описывающие введение DCA у онкологических больных [13–16] , но, несмотря на растущий объем литературы, подтверждающей эффективность DCA против рака, он пока не используется в клинической практике. Целью этого обзора является обобщение последних отчетов, предполагающих использование DCA в терапии рака в сочетании с химиотерапевтическими агентами, радиотерапией и другими химическими или природными соединениями, демонстрирующими противораковые свойства. Кроме того, мы описали данные о новых целевых фармакологических формулах DCA, способных избегать побочных эффектов и улучшать биодоступность и эффективность препарата, что еще больше поощряет его возможное клиническое применение. Наконец, мы рассмотрели последние результаты, предполагающие другие потенциальные механизмы действия DCA, включая новые данные о его способности влиять на фракцию стволовых клеток рака.

Рисунок 1: (a) Химическая структура DCA. (b) Механизм действия DCA: PDK: пируватдегидрогеназная киназа; PDH: пируватдегидрогеназа. Черные пунктирные линии — биохимические процессы, ингибируемые DCA; Красные стрелки — метаболические пути, активируемые DCA.

DCA и рак: механизм действия

Потенциальная эффективность DCA в терапии рака обусловлена ​​метаболическими свойствами раковых клеток, которые обычно характеризуются повышенной гликолитической активностью и сниженным митохондриальным окислением независимо от доступности кислорода, хорошо известный эффект Варбурга [17] . Чрезмерный гликолиз и возникающее в результате перепроизводство лактата вызывают состояние метаболического ацидоза в микроокружении опухоли [ 18] . Лактат, образующийся в результате гликолиза, поглощается окружающими клетками для поддержки роста опухоли и ингибирует механизмы апоптотической гибели клеток [19, 20] . Несколько ферментов, участвующих в гликолизе, регулируют апоптоз, и их сверхэкспрессия в раковых клетках способствует подавлению апоптоза [21] . В этой ситуации соли DCA избирательно воздействуют на раковые клетки, переключая их метаболизм с гликолиза на окислительное фосфорилирование путем ингибирования киназы пируватдегидрогеназы (PDK), ингибитора пируватдегидрогеназы (PDH) [10] . Активация PDH способствует митохондриальному окислению пирувата и нарушает метаболическое преимущество раковых клеток. Мутации митохондриальной ДНК, часто возникающие при опухолеобразовании и приводящие к дисфункции дыхательной цепи [22, 23] , делают злокачественные клетки неспособными поддерживать клеточную потребность в энергии. Кроме того, снижая выработку лактата, DCA противодействует ацидозному состоянию микроокружения опухоли, способствуя ингибированию роста опухоли и ее распространению [24] . Доставка пирувата в митохондрии вызывает ремоделирование органелл, что приводит к увеличению оттока цитохрома c и других факторов, индуцирующих апоптоз, и повышению уровня ROS с последующим снижением жизнеспособности раковых клеток [9] (рисунок 1(b)).

Побочные эффекты и ограничения при использовании DCA

Клиническое применение DCA доступно как в пероральных, так и в парентеральных формулах, а дозы варьируются от 10 до 50 мг/кг/смерть [25] . Никакие доказательства тяжелой гематологической, печеночной, почечной или сердечной токсичности не подтверждают безопасность DCA [26] . Распространенные желудочно-кишечные побочные эффекты часто возникают у определенного процента пациентов, получавших лечение DCA [15] . Наиболее известным ограничением для введения DCA, наблюдавшимся как в доклинических, так и в клинических исследованиях, является периферическая невропатия [27] . Избирательность повреждения нервной системы, вызванного DCA, может быть связана с отсутствием хорошо оснащенного аппарата, способного справиться с более устойчивым окислительным фосфорилированием в клетках, продуцирующих АТФ в основном посредством гликолиза [28] . Возникающая в результате перегрузка митохондрий ставит под угрозу эффективность антиоксидантных систем, неспособных противостоять чрезмерному количеству ROS. В этой ситуации современное введение антиоксидантов должно представлять собой дополнительную стратегию для минимизации невропатии, вызванной DCA [27] . Экспрессия и активность глутатионтрансферазы zeta1 (GSTZ1), первого фермента, ответственного за клиренс DCA, могут влиять на сущность повреждения. Несинонимичные функциональные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в гене человека GSTZ1 приводят к появлению различных гаплотипов, которые отвечают за различную кинетику и динамику DCA. Была продемонстрирована четкая связь между гаплотипом GSTZ1 и клиренсом DCA. На этой основе персонализированная дозировка DCA, основанная не только на массе тела, может минимизировать или предотвратить побочные эффекты у пациентов, хронически принимающих этот препарат [29] . Возникновение нейропатии связано с хроническим пероральным приемом DCA и является обратимым эффектом, ограниченным временем лечения [30] . Внутривенный путь снижает, OH Cl Cl O (a) Раковые клетки Раковые клетки Смерть раковых клеток Лактат Опухоль Микросреда Лактат Пируват Гликолиз PDK DCA PDH Окислительное фосфорилирование Апоптоз восстановление Цитохром c Глюкоза (b) Рисунок 1: (a) Химическая структура DCA. (b) Механизм действия DCA: PDK: пируватдегидрогеназная киназа; PDH: пируватдегидрогеназа. Черные пунктирные линии, биохимические процессы, ингибируемые DCA; Красные стрелки, метаболические пути, активируемые DCA. 2 Окислительная медицина и клеточная продолжительность жизни, следовательно, потенциал нейротоксичности и позволяют достижению более высоких концентраций препарата обойти пищеварительную систему [13] .
Поскольку DCA входит в число побочных продуктов дезинфекции воды, обнаруженных в низких концентрациях в питьевой воде, его потенциальная канцерогенность находится на стадии оценки. Исследования, проведенные на мышах, связывают воздействие DCA в раннем возрасте с увеличением частоты возникновения гепатоцеллюлярных опухолей [31]. Вполне возможно, что постоянные изменения в метаболизме клеток, вызванные DCA, могут вызывать эпигенетические эффекты. Длительная индукция PDH и других окислительных путей, связанных с метаболизмом глюкозы, может способствовать увеличению активных форм кислорода и митохондриального стресса [27] . Однако в клинических исследованиях не сообщается о каких-либо доказательствах канцерогенного эффекта при введении DCA в терапии рака.

Синергетический эффект DCA и химиотерапевтических агентов

Комбинирование различных препаратов является общепринятой стратегией для получения синергического полезного эффекта в терапии рака, снижения дозировки препаратов, минимизации рисков токсичности и преодоления лекарственной устойчивости. Совместное введение DCA и традиционных химиотерапевтических агентов было предназначено и протестировано на нескольких моделях рака (таблица 1). Лечение DCA, по-видимому, повышает эффективность химиотерапии, вызывая биохимические и метаболические изменения, что приводит к значительным изменениям энергетического баланса раковых клеток. Исследование, проведенное при немелкоклеточном раке легких (НМРЛ), показало как in vitro, так и in vivo, что совместное введение DCA с паклитакселом повышает эффективность гибели клеток за счет ингибирования аутофагии [32] . Эффективная комбинация DCA и доксорубицина (DOX) была протестирована на клетках HepG2, продемонстрировав способность DCA нарушать клеточную антиоксидантную защиту, тем самым способствуя окислительному повреждению, в свою очередь, вызванному лечением DOX [33] . Существует сильная связь между сверхэкспрессией PDK и химиорезистентностью; таким образом, можно предположить, что ингибирование PDK может помочь повторно сенсибилизировать раковые клетки к препаратам. Сверхэкспрессия изоформы PDK2 была связана с резистентностью к паклитакселу при НМРЛ. Интересно, что комбинация DCA с паклитакселом была более эффективна в уничтожении резистентных клеток, чем лечение паклитакселом или DCA по отдельности [34] . Подобно НМРЛ, интересное исследование in vivo, проведенное при распространенном раке мочевого пузыря, показало повышенную экспрессию изоформы PDK4 при высокой степени злокачественности по сравнению с раком низкой степени злокачественности, а совместное лечение DCA и цисплатином значительно уменьшило объемы опухоли по сравнению с DCA или цисплатином по отдельности [35]. Недавнее исследование подтвердило способность DCA устранять химиорезистентность, связанную с PDK4, также при гепатоцеллюлярной карциноме человека (ГЦК) [36] .

Таблица 1: Список отчетов, предполагающих положительный эффект совместного применения DCA и химиотерапии при нескольких типах рака.

Синергетический эффект DCA и других потенциальных противораковых препаратов

Последовательный объем литературы предполагает положительные эффекты совместного введения DCA с соединениями, которые в настоящее время используются для лечения других заболеваний, но демонстрируют противораковые свойства в нескольких моделях рака (таблица 2). Современное введение DCA и антибиотика салиномицина, недавно заново открытого за его цитотоксические свойства как потенциального противоракового препарата, было протестировано на линиях клеток колоректального рака. Их лечение, по-видимому, оказывает синергический цитотоксический эффект, ингибируя экспрессию белков, связанных с множественной лекарственной устойчивостью [37] . Раковые клетки, лишенные метаболических ферментов, участвующих в метаболизме аргинина, могут привести к чувствительности к лечению аргиназой. Интересно, что совместное введение рекомбинантной аргиназы и DCA оказывает антипролиферативный эффект при тройном негативном раке молочной железы из-за активации p53 и индукции остановки клеточного цикла [38] . Ингибиторы COX2, в основном используемые в качестве противовоспалительных препаратов, недавно были предложены в качестве противоопухолевых препаратов из-за их антипролиферативной активности. Интригующее исследование, проведенное на клетках рака шейки матки, показало неспособность DCA убивать клетки рака шейки матки, сверхэкспрессирующие COX2, и продемонстрировало, что ингибирование COX2 целекоксибом делает клетки рака шейки матки более чувствительными к DCA как в экспериментах in vitro, так и in vivo [39] . Поскольку DCA способствует окислительному фосфорилированию за счет снижения гликолитической активности, сочетание DCA с другими препаратами, усиливающими состояние зависимости от глюкозы, может быть многообещающей стратегией. Такой подход был опробован при раке головы и шеи, при котором введение пропранолола, неселективного бета-блокатора, способного влиять на митохондриальный метаболизм опухолевых клеток, вызывало гликолитическую зависимость и энергетический стресс, делая клетки более уязвимыми для лечения DCA [40] . Аналогичные результаты были получены в клетках меланомы, в которых введение ингибиторов рецептора ретиноевой кислоты β (RARβ) вызывало сенсибилизацию к DCA [41] . Положительный эффект совместного введения DCA с метформином, гипогликемическим препаратом, широко используемым для лечения диабета, был продемонстрирован в доклинической модели глиомы [42] , а также в низкометастатическом варианте карциномы легких Льюис (LLC) [43] . Цзян и его коллеги исследовали эффекты фенформина, аналога метформина, и DCA в глиобластоме, продемонстрировав, что одновременное ингибирование комплекса I и PDK фенформином и DCA, соответственно, снижало самообновление и жизнеспособность стволовых клеток глиомы (GSC), что предполагает их возможное использование для воздействия на фракцию стволовых клеток рака [44] .

Таблица 2: Список препаратов, основная функция которых была протестирована в сочетании с DCA на нескольких моделях рака.

Совместное использование DCA и натуральных соединений

Клиническое применение природных соединений представляет собой многообещающий новый подход к лечению ряда заболеваний [45] . Все больше литературы подтверждает обнаружение среди природных соединений биологически активных веществ, выделенных растениями, грибами, бактериями или морскими организмами, которые оказывают благотворное воздействие на здоровье человека [46–48] . Предположение о природных соединениях или их производных, по-видимому, представляет собой обнадеживающий подход к предотвращению возникновения или рецидива рака, и это обычно называется химиопрофилактикой [49] . Более того, природные вещества оказывают благотворное воздействие при терапии рака при совместном введении с другими препаратами, демонстрируя их способность преодолевать лекарственную устойчивость, увеличивать противораковый потенциал и снижать дозы лекарств и токсичность [50, 51] . Интересно, что недавно было предложено совместное введение DCA и природных соединений. В исследовании изучалось комбинированное действие DCA с куркумином, смешанным с эфирным маслом, соединением с полезными свойствами как для профилактики, так и для лечения рака [52] , демонстрирующим противораковый потенциал против HCC [53] . В частности, сочетание обоих соединений синергически снижало выживаемость клеток, способствуя апоптозу клеток и вызывая внутриклеточную генерацию ROS. Бетулин, природное соединение, выделенное из бересты, уже известно своим антипролиферативным и цитотоксическим действием против нескольких линий раковых клеток [54–56] . Исследование противоопухолевой активности производных бетулина in vitro при НМРЛ подтвердило его способность ингибировать in vivo и in vitro рост клеток рака легких, блокируя фазу G2/M клеточного цикла и вызывая активацию каспазы и фрагментацию ДНК. Интересно, что производное бетулина Bi-L-RhamBet было способно нарушать митохондриальную электрон-транспортную цепь (ETC), вызывая выработку ROS. Учитывая свойство DCA увеличивать общее окисление глюкозы в митохондриях через цикл Кребса и ETC, авторы объединили Bi-L-RhamBet с DCA, продемонстрировав его значительную потенцированную цитотоксичность [57] .

DCA и радиосенсибилизация

Радиотерапия представляет собой еще одну стратегию лечения рака и обеспечивает локальный подход путем введения высокоэнергетических лучей [58] . Основным эффектом облучения является индукция ROS с последующим повреждением ДНК, хромосомной нестабильностью и гибелью клеток путем апоптоза [59] . Однако некоторые опухоли демонстрируют или развивают радиорезистентность, которая является причиной неудачи радиотерапии и высокого риска рецидива опухоли или метастазирования [60] . Несколько факторов могут быть ответственны за радиорезистентность [61] . Среди них гипоксия, распространенное состояние микросреды опухоли, характеризующееся низким уровнем кислорода и сниженной генерацией видов ROS, может блокировать эффективность ионизирующего излучения [62] . Поэтому увеличение оксигенации опухоли таким образом, чтобы способствовать значительному количеству ROS [63] или напрямую индуцировать выработку ROS, может представлять собой стратегию повышения радиосенсибилизации [64 , 65] . В этой ситуации введение DCA, которое, как известно, индуцирует выработку ROS [11, 66] , может представлять собой стратегию преодоления радиорезистентности опухоли. Более того, известно, что метаболические изменения, характерные для развития рака, влияют на радиочувствительность [67, 68] . Следовательно, нацеливание на промежуточные продукты метаболизма рака может представлять собой стратегию улучшения селективного ответа рака на облучение [69] . Эффективность DCA для повышения радиочувствительности уже была продемонстрирована как на клетках глиобластомы [70] , так и на плоскоклеточной карциноме пищевода [71] . Совсем недавно было продемонстрировано, что DCA повышает радиочувствительность в клеточной модели медуллобластомы, смертельной опухоли мозга у детей, вызывая изменения метаболизма ROS и функции митохондрий и подавляя способность к восстановлению ДНК [72] . Поскольку роль иммунотерапии в восстановлении иммунной защиты против прогрессирования опухоли и метастазирования привлекает большое внимание в последние годы [73] , Гупта и Двараканат представили современное состояние возможных эффектов гликолитических ингибиторов, включая DCA, на радиосенсибилизацию опухоли, сосредоточив свое внимание на взаимодействии между метаболическими модификаторами и иммунной модуляцией в процессах радиосенсибилизации [74] . Интересно, что они сообщили о способности DCA способствовать иммунной стимуляции посредством ингибирования накопления лактата, что еще больше поддерживает его использование в качестве адъюванта радиотерапии.

DCA и новые лекарственные формы

Растет интерес к разработке новых лекарственных форм для улучшения доставки лекарств, повышения эффективности и снижения доз и, следовательно, нежелательных эффектов. В этой ситуации системы доставки лекарств (СДЛ) представляют собой новый рубеж в современной медицине [75] . СДЛ предлагают возможность создания гибрида металлоорганических каркасов (МОФ), сочетающего биосовместимость органической системы с высокими нагрузками неорганической фракции [76] . Несколько линий доказательств предполагают эффективную функционализацию наночастиц с помощью ДКА. Лазаро и коллеги [77] исследовали различные протоколы для функционализации ДКА наночастиц терефталата циркония (Zr) (UiO-66). Они продемонстрировали цитотоксичность и селективность тех же СДЛ против различных линий раковых клеток. Более того, они исключили возможную реакцию иммунной системы на ДКА-МОФ in vitro. Та же группа позже показала возможность загрузки Zr MOF вторым противораковым препаратом, таким как 5-фторурацил (5-FU), чтобы воспроизвести синергический эффект двух препаратов [78] . MOF на основе циркония, загруженный DCA, также был предназначен в качестве привлекательной альтернативы UiO-66, показывая селективную цитотоксичность in vitro по отношению к нескольким линиям раковых клеток и хорошую переносимость иммунной системой нескольких видов [79] . Недавно Štarha et al. [80] впервые синтезировали и охарактеризовали полусэндвич-комплексы, содержащие рутений или осмий и DCA (рисунок 2(a)). Оба комплекса Ru-dca и Os-DCA были проверены на линиях клеток карциномы яичников, продемонстрировав большую цитотоксичность, чем цисплатин в отдельности. Оба комплекса были способны индуцировать высвобождение цитохрома c (Cytc) из митохондрий, косвенный показатель активации апоптосомы, и, по-видимому, были менее токсичными по отношению к здоровым первичным гепатоцитам человека, что указывает на селективность в отношении рака по сравнению с нераковыми клетками. Многообещающие результаты были также получены в клетках рака молочной железы с тройным негативом [81] . Конъюгат рения (I)-DCA продемонстрировал эффективное проникновение в раковые клетки и селективное накопление в митохондриях, вызывая митохондриальную дисфункцию и метаболические нарушения [82] . В последние годы было разработано несколько многоактивных препаратов для современного нацеливания на различные внутриклеточные пути с использованием одной формулы. Безопасная, простая, воспроизводимая наноформула комплекса доксорубицинDCA (рисунок 2(b)) была успешно испытана на модели меланомы у мышей, показав увеличение способности к загрузке препарата, снижение побочных эффектов и усиление терапевтического эффекта [83] . Были синтезированы противоопухолевые пролекарства Pt (IV) двойного действия китеплатина с аксиальными лигандами DCA (рисунок 2(c)), охарактеризованы и протестированы на различных линиях опухолевых клеток и in vivo [84]. Для преодоления резистентности рака были предложены тройные производные Pt (IV) цисплатина в качестве новых мощных противораковых агентов, способных конъюгировать действие цисплатина, ингибиторов циклооксигеназы и DCA (рисунок 2(d)) [85] . Новый комплекс, содержащий DCA, платину и биотин (DPB), был успешно испытан, демонстрируя многогранные противоопухолевые свойства (рисунок 2(e)). Авторы продемонстрировали способность такого пролекарства влиять на энергетический метаболизм, способствовать апоптозу и взаимодействовать с ДНК. Высокая селективность биотина в отношении раковых клеток сводит к минимуму пагубное воздействие на нормальные клетки и улучшает лечебный эффект на опухоли [86] . Характеристики и экспериментальные доказательства основных классов соединений обобщены в таблице 3.

Таблица 3: Свойства основных классов лекарственных форм DCA, протестированные на линиях раковых клеток и моделях in vivo с соответствующими экспериментальными доказательствами.

Рисунок 2: Новые лекарственные формы, содержащие DCA. (a) Схематическое изображение комплексов Os-DCA и Ru-DCA [81]. (b) Комплекс доксорубицин (DOX)-DCA [83]. (c) Пролекарства Pt двойного действия китеплатина и DCA [84]. (d) Примеры производных Pt(IV) тройного действия цисплатина, содержащих DCA (красный), производные цисплатина (черный) и ингибиторы COX (зеленый) [85]. (e) Химическая структура DPB, содержащего DCA (красный), биотин (синий) и комплекс платины (Pt) (черный) [86].

Другие предлагаемые механизмы действия DCA

Метаболический сдвиг от гликолиза к окислению глюкозы из-за ингибирования PDK и последующей активации PDH является наиболее известным и общепринятым молекулярным эффектом введения DCA. Последующие биохимические изменения, включая увеличение ROS и изменение потенциала митохондриальной мембраны, могут быть ответственны за остановку пролиферации и гибель раковых клеток, тем самым объясняя полезный потенциал DCA в лечении рака [9] . Однако молекулярные промежуточные продукты, активируемые после введения DCA, до сих пор неизвестны. Вполне возможно, что такая малая молекула может напрямую или косвенно влиять на другие клеточные и молекулярные мишени (рисунок 3), демонстрируя другие механизмы действия, чтобы объяснить ее эффективность также в клеточных моделях, где она не производит ожидаемого метаболического сдвига [12] . Протеомный подход, примененный к клеткам рака легких, продемонстрировал способность DCA увеличивать концентрацию каждого промежуточного продукта TCA, при этом он не влиял на поглощение глюкозы или гликолитический процесс от глюкозы до пирувата [87] . В попытке пролить свет на механизм действия DCA, Дюбуа и коллеги использовали подход, основанный на метаболомике, на нескольких линиях клеток рака яичников, обработанных DCA, и обнаружили общее заметное истощение внутриклеточного пантотената, предшественника CoA, а также сопутствующее увеличение CoA, что предполагает способность DCA увеличивать биосинтез CoA de novo. Поскольку высокие концентрации CoA оказались токсичными для клеток, этот метаболический эффект может быть ответственен за токсичность раковых клеток, опосредованную DCA [88] . Совсем недавно работа Эль Сайеда и соавторов представила новую основанную на доказательствах гипотезу, предполагающую, что эффективность DCA против рака может быть обусловлена ​​его способностью противодействовать ацетату [89] , который, как известно, является энергетическим субстратом для глиобластомы и метастазов в мозг, способным усиливать синтез ДНК, РНК и белка, а также посттрансляционные модификации, тем самым способствуя пролиферации клеток и прогрессированию рака. Более того, высокие уровни ацетата связаны с устойчивостью к противораковым препаратам [90] . Было показано, что DCA способен обращать вспять метаболические изменения, вызванные ацетатом, восстанавливая физиологические уровни сывороточного лактата и свободных жирных кислот, а также концентрацию калия и фосфора. По мнению авторов, благодаря структурному сходству с ацетатом, DCA может ингибировать метаболические эффекты, вызванные ацетатом, ответственные за рост раковых клеток и химиорезистентность [89] . Другим возможным дополнительным эффектом DCA может быть модуляция pH. Известно, что модуляция уровня pH влияет на процессы пролиферации и апоптоза [91] , а также на чувствительность к химиотерапии [92].Обработка DCA может как увеличивать, так и уменьшать внутриклеточный pH. Вторичным эффектом перенаправления пирувата в митохондрии с помощью DCA будет снижение лактата и последующее увеличение внутриклеточного pH. С другой стороны, DCA способен уменьшать экспрессию монокарбоксилатных транспортеров и V-АТФазы с последующим снижением pH, и это особенно происходит в опухолевых клетках, экспрессирующих большее количество этих переносчиков по сравнению с нормальными аналогами [93] . Учитывая способность вызывать быстрое внутриклеточное закисление опухоли, Albatany et al. [94] предположили о возможном использовании DCA в качестве трекера при визуализации in vivo мышиной модели глиобластомы и поддержали терапевтическое использование DCA, поскольку известно, что внутриклеточное закисление вызывает активацию каспазы и фрагментацию ДНК раковых клеток [95] . Животные модели позволяют идентифицировать возможную дополнительную молекулярную мишень DCA. Эксперименты, проведенные на крысах, подчеркнули способность DCA ингибировать экспрессию почечного котранспортера Na-K-2Cl (NKCC) в почках крыс [96] . Поскольку NKCC является важным биомаркером регуляции внеклеточного и внутриклеточного ионного гомеостаза и участвует в прогрессировании клеточного цикла, он играет важную роль в пролиферации раковых клеток, апоптозе и инвазии. Белкахла и др. [97] исследовали взаимодействие между таргетингом метаболизма и экспрессией транспортеров ABC, ответственных за экспорт лекарств из клеток и последующую множественную лекарственную устойчивость, и обнаружили, что лечение DCA способно снизить экспрессию генов и белков транспортеров ABC в нескольких опухолевых клетках, экспрессирующих дикий тип p53, как in vitro, так и in vivo [98] . Уже была продемонстрирована способность DCA вызывать дифференциацию посредством модуляции взаимодействия PKM2/Oct4 в клетках глиомы [99] . Полученное снижение уровней транскрипции Oct4 было связано с уменьшением фенотипа стволовости и значительным повышением чувствительности к клеточному стрессу. Это наблюдение позволяет предположить потенциальную роль DCA против раковых стволовых клеток (CSC).

Рисунок 3: Другие предлагаемые механизмы действия DCA. Основной механизм действия DCA заключается в ингибировании пируватдегидрогеназной киназы (PDK), что приводит к активации пируватдегидрогеназы (PDH) и содействует окислительному фосфорилированию (1). DCA также увеличивает концентрацию промежуточных продуктов каждого цикла Кребса (2) [87]. DCA вызывает токсичность клеток посредством синтеза CoA de novo (3) [88]. DCA может противодействовать ацетату (4) [90]. DCA модулирует внутриклеточное закисление (5) [93, 94]. DCA ингибирует котранспортер Na-K-2Cl (6) [96]. DCA подавляет экспрессию генов и белков транспортеров ABC (7) [97]. DCA снижает экспрессию генов, связанных с самообновлением, и влияет на фракцию стволовых клеток рака (8) [99].

DCA и раковые стволовые клетки

Растет интерес к таргетированию раковых стволовых клеток (CSC), которые, по-видимому, являются основной причиной рецидива опухоли [100] . CSC обладают способностью к самообновлению с нормальными стволовыми клетками и могут давать начало дифференцирующимся клеткам, ответственным за возникновение опухоли, а также злокачественную прогрессию [101] . Низкая скорость пролиферации и специфический метаболический профиль способствуют тому, что CSC становятся устойчивыми к традиционной химиотерапии [102] . Возникла острая необходимость в разработке новых терапевтических средств, способных влиять на жизнеспособность раковых стволовых клеток [103] с целью полного уничтожения опухолевой массы. Обширный объем литературы фокусирует внимание на метаболическом фенотипе CSC, которые, по-видимому, отличаются от дифференцированных раковых клеток и могут представлять собой терапевтическую мишень [104–108] . В этой ситуации была выдвинута гипотеза о возможной чувствительности фракции CSC к DCA, которая была протестирована на различных моделях рака. Эмбриональные стволовые клетки карциномы представляют собой одну из наиболее подходящих моделей для изучения поддержания и дифференциации CSC, а также идентификации препаратов и молекул, способных модулировать эти процессы [109] . Исследования, проведенные на эмбриональных стволовых клетках (ESC), представляют собой предварительные важные доказательства, подтверждающие возможную эффективность DCA [110] . Интересно, что обработка ESC DCA способствует потере плюрипотентности и сдвигает их в сторону более активного окислительного метаболизма, что сопровождается значительным снижением экспрессии HIF1a и p53 [111] . Вега-Наредо и др. [112] описали важность митохондриального метаболизма в управлении стволовостью и дифференциацией в такой модели. Они охарактеризовали метаболический профиль фракции стволовых клеток и предположили меньшую восприимчивость фенотипа ствола к митохондриально-направленной терапии. Принуждение CSC к окислительному метаболизму путем обработки DCA позволило перейти от стволовости к дифференциации. Несколько отчетов подтверждают существование CSC в глиоме [113, 114] , и эффективность DCA для поражения CSC была широко оценена при таком типе рака, который так трудно лечить обычными методами и который характеризуется низкими показателями выживаемости. Еще в 2010 году Микелакис и коллеги предположили, как in vitro, так и in vivo, способность DCA вызывать апоптоз фракции стволовых клеток рака [26] . Модель глиомы на крысах, повторяющая несколько особенностей человеческой глиобластомы, подтвердила эффективность DCA для потенцирования апоптоза CSC глиомы, характеризующегося значительной сверхстимуляцией гликолитического пути по сравнению с нормальными стволовыми клетками [115]. Кроме того, Цзян и др. исследовали влияние DCA на небольшую популяцию стволовых клеток глиомы (GSC), выделенных из глиобластомы, продемонстрировав снижение свойств самообновления и увеличение процента гибели клеток [44] . Более того, тест in vivo на мышах с ксенотрансплантатами, полученными из GSC, обработанных DCA, показал значительное увеличение общей выживаемости. Лечение DCA также было протестировано на фракции стволовых клеток меланомы, и полученная биоэнергетическая модуляция смогла противодействовать протуморогенному действию ингибитора c-Met [116] . Совсем недавно проведенная работа на гепатоцеллюлярной карциноме человека выявила сверхэкспрессию PDK4 в сферах, происходящих из раковых клеток, с определенным фенотипом, подобным стволовому. Интересно, что лечение DCA смогло снизить жизнеспособность как раковых дифференцированных клеток, так и раковых стволовых клеток и обратить вспять химиорезистентность к традиционной терапии [36] . Наша группа недавно испытала способность DCA снижать экспрессию маркеров стволовых клеток рака CD24/CD44/EPCAM в клеточной линии рака поджелудочной железы, а также нарушать образование и жизнеспособность сфероидов [12] , что дополнительно подтверждает данные, полученные в других моделях рака. Наряду с химиорезистентностью, радиорезистентность также представляет собой ограничение эффективного лечения рака, и CSC, по-видимому, ответственны за такую ​​рефрактерность [117] . Сан и др. продемонстрировали способность DCA повышать радиочувствительность клеток медуллобластомы, влияя на стволоподобные клоны, снижая процент экспрессии CD133-позитивных клеток и уменьшая образование сфер [72] . Более того, в той же клеточной модели они показали измененный механизм репарации ДНК, вызванный DCA, способный объяснить повышенную эффективность радиотерапии.

Выводы

Нацеливание на метаболизм раковых клеток представляет собой новый фармакологический подход к лечению рака. Способность DCA переключать метаболизм с гликолиза на окислительное фосфорилирование увеличила интерес к этому препарату, уже известному своими противораковыми свойствами. Накопленные за последние годы доказательства подтверждают способность DCA преодолевать химио- и радиорезистентность при нескольких типах рака и позволяют выдвинуть гипотезу о дополнительных клеточных мишенях, способных объяснить его способность убивать раковые клетки. Необходимо разработать дальнейшие клинические исследования, которые в настоящее время ограничены пациентами с плохим прогнозом и запущенными рецидивирующими новообразованиями, уже не поддающимися другим традиционным методам лечения. Его потенциальная эффективность против раковых стволовых клеток, а также разработка новых лекарственных форм приближают нас к достижению эффективного клинического применения DCA.

Конфликты интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана Текущими исследовательскими фондами Министерства здравоохранения Италии в IRCCS-CROB, Рионеро-ин-Вультуре, Потенца, Италия.